JP3927118B2 - 疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、特定の有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体(hydrophobic multicomponent heparin conjugates)、その製造方法及び用途に関するものである。より詳細には、患者の治療において注射用抗血栓剤として広く使用されているヘパリンに高分子及び疎水性物質を共有結合させ、ヘパリンを疎水性化させることによって特定有機溶媒に対する溶解度は増加した反面、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
血管壁(vascular wall)の血栓抵抗性(thromboresistence)は、血小板及び血漿凝固システム(platelets and the plasma coagulation system)と両立可能な内皮性内膜(endothelial lining)を必要とする。人工血管物質とは異なり、内皮性内膜は、一般的に凝固過程でセリンプロテアーゼ(serine proteases)の活性を誘導しない。しかし、血液の凝固能力(coagulability)が増加すると、内皮(endothelium)はトロンビンのような凝固因子(coagulation factors)を不活性化させる。一般的に、トロンビンの流入部位は内皮細胞表面であると明らかにされていて(ビー.アウブレイ(B. Awbrey)等, J. Biol. Chem., 1979年、第254巻、P.4092-4095)、内皮細胞に存在するグリコースアミノグリカン層(glycosaminoglycan layer)もまたトロンビンの結合部位を持っていると報告されている。上記のトロンビンの結合部位にセリンプロテアーゼ等の酵素が結合すると血漿内の抗トロンビンIII(antithrombin III)の作用によって不活性化されると報告されている(シー.ブッシュ(C. Busch)等, J. Clin. Invest., 1982年、第69巻、P.726-729 ；エム.ドライジスキ(M. Dryjski)等, Thromb. Res., 1983年、第32巻、P.355-363)。
【０００３】
また、抗トロンビンIII結合による類似構造がヘパリン分子に存在すると報告された(ジェー.エイ.マルクム(J.A. Marcum)等, J. Clin. Invest., 1984年、第74巻、P.341-350 ；ジェー.エイ.マルクム(J.A. Marcum)等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1985年、第126巻、P.365-372)後、これらを利用して、内皮様血栓抵抗性(endothelium-like thromboresistent properties)を付与するために固体表面内にまたは表面上にヘパリンを導入する方法が開発され、すでに商用化されている。このようにヘパリンを利用した効果的な抗血栓抵抗性人工表面の利用可能性は、医療技術の発展に広範囲に利用されるものと期待されている。
【０００４】
このような研究の一環として、ヘパリンを使用して高分子表面の血液適合性(blood compatibility)を向上させるための方法が多様に開発された。グローデ(Grode)等は、 塩化シアヌル(cyanuric chloride)と放射線結合方法(radiation grafting)を利用してヘパリン-シリコンゴム(heparin-silicon rubber)を合成した(グローデ(Grode)等, J. Biomed. Mater. Res. Symp., 1972年、第3巻、P.77-84)。メリル(Merrill)等もまたグルタアルデヒド交差結合(glutaldehyde crosslinking)を通してヘパリンと共有結合を形成するポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol)を合成した(メリル(Merrill)等, J. Appl. Physiol., 1970年、第29巻、P.723-728)。エリクソン(Eriksson)及びギレルグ(Gillerg)は、ポリプロピレン(polypropylene)表面に付着した交差結合されたヘパリン単層(cross-linked heparin monolayer)を開発した(エリクソン及びギレルグ(Eriksson and Gillerg), J. Biomed. Mater. Res., 1967年、第1巻、P.301-312)。これは、陰イオンヘパリン(anionic heparin)を連続したヘパリン交差結合でつないだ後、陽イオン界面活性剤(cationic surfactant)によりポリプロピレン表面に吸着させたものである。
【０００５】
ゴーセン(Goosen)及びセフトン(Sefton)は、ヘパリン化されたスチレン-ブタジエン-スチレン エラストマー(heparinized styrene-butadiene-styrene elastomer)を合成した(ゴーセンとセフトン(Goosen and Sefton), Thromb. Res., 1980年、第20巻、P.543-554)。また、ミユラ(Miyura)等は、ヘパリンをセファロース(Sepharose)またはポリヒドロキシメタクリレート(polyhydroxymethacrylate)に固定させることによって血漿の再石灰化(plasma recalcification)期間を延長させる方法を考案した(ミユラ(Miyura)等, J. Biomed. Mater. Res.,1980年、第14巻、P.619-630)。
【０００６】
この他にも、ジャコブス(Jacobs)等は、ヘパリンとプロスタグラジンE1(prostaglandin E1)の共有結合複合体を合成した(ジャコブス(Jacobs)等, J. Biomed. Mater. Res., 1989年、第23巻、P.611-630)。上記ヘパリン複合体は、ジアミノ-終結ポリエチレン酸化物(diamino-terminated polyethylene oxides)を通してウレタン(urethane)に固定され、このように固定された複合体がトロンビン形成過程を抑制するのにとても効果的であることを確認した。ヘンニンク(Hennink)等は、人間血漿アルブミン(human serum albumin)とヘパリンの共有結合複合体を開発した(ヘンニンク(Hennink)等, Thromb. Res., 1983年、第29巻、P.1-13)。上記複合体は、前吸着(preadsorption)または血液と接触する表面との共有結合により高分子表面の血液適合性を向上させる。
【０００７】
ナガオカ(Nagaoka)等は、高分子表面に付着したポリエチレンオキシド親水性スペーサー(polyethylene oxide [PEO] hydrophilic spacer)が血漿蛋白質の吸着と動力学的反発(dynamic repulsion)による血小板の付着抑制効果を示す30回余りの動物実験結果を発表した(ナガオカ(Nagaoka)等, Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1987年、第10巻、P.76-78)。ヘパリン化された表面での上記スペーサーの血小板付着抑制効果は、キム(Kim)及びエベルト(Ebert)により証明された(キム及びエベルト(Kim and Ebert),Thromb. Res., 1982年、第26巻、P.43-57)。これらは、固定化されたヘパリンの抗凝固(anticoagulant activity)活性がスペーサーの長さが長くなるほど増加することを明らかにした。
【０００８】
また、タイ(Tay)等は、1) PEOのように長さの長いスペーサーの使用は、ヘパリンをポリビニルアルコールに対する強い結合より抗トロンビンIII及びトロンビンにさらに結合しやすくする。 2) 末端基(end groups)を通してポリビニルアルコールに連結されたヘパリンがヘパリン大分子(heparin macromolecules)の非末端性ユニット(nonterminal units)上のアミノ基(amino groups)により結合された場合よりさらに結合することが容易である。 3) 表面上のヘパリンユニットのかたまりが抗トロンビンIII及びトロンビンの接近を制限する。ことを明らかにした(タイ(Tay)等, Biomaterials, 1989年、第10巻、P.11-15)。
【０００９】
スチマー(Schmer)は、ヘパリンをチオホスゲン(thiophosgene)またはカルボジイミド(carbodiimide)のようなスペーサーを利用してアガロースに共有結合させ(スチマー(Schmer), Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1972年、第18巻、P.321-324)、スペーサー固定ヘパリンは、抗トロンビンIIIに対する向上された結合能力を持っていた。ダニシェフスカイ(Danishefsky)及びツゼング(Tzeng)は、アミノエチルスペーサー(aminoethyl spacer)を利用してヘパリン-アガロース(agarose)高分子を製造した(ダニシェフスカイ及びツゼング(Danishefsky and Tzeng), Thromb. Res., 1974年、第4巻、P.237-246)。また、パーク(Park)等は、PEO スペーサーを利用してヘパリンをバイオマ(Biomer)に固定させた(パーク(Park)等, J. Biomed. Mater. Res., 1988年、第22巻、P.977-992)、彼らは、固定されたヘパリンの抗凝固活性を最適化させるためには、スペーサーの長さが3,400ダルトン程度でなければならないと報告した。リン(Lin)等(リン(Lin)等, J. Biomed. Mater. Res., 1991年、第25巻、P.791-795)及びピアノ(Piao)等(ピアノ(Piao)等, Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1992年、第38巻、P.638-643)は、スペーサーの表面密度(surface density)を増幅させ抗凝固活性を最適化させるためにスペーサーの表面にヘパリンを固定化させた。
【００１０】
さらに、ヘパリンを利用したスペーサーシステムは、共重合体の合成にも使用されてきた。グレインジャー(Grainger)等は、PEO-PDMS-ヘパリン及びPDMS-PEO-ヘパリンのトライブロック共重合体(triblock copolymers)を合成した(グレインジャー(Grainger)等, J. Biomed. Mater. Res., 1988年、第22巻、P.231-249)。細分化されたポリウレタン表面(segmented polyurethane surface)にコーティングされた上記トライブロック共重合体は、低流量下でも非血栓形成能(nonthrombogenicity)を向上させた。ブリック(Vulic)等は、ポリウレタン-PEO-ヘパリンを合成する方法を報告した(ブリック(Vulic)等, J. Polym. Sci. A, Polym. Chem., 1988年、第26巻、P.381-391)、上記方法は、ヘパリンをポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合させ有機溶媒に溶解させた後、溶媒キャスティング方法(solvent casting method)で表面を改質する方法である。この方法は、コーティングが簡便な長所があるが、ヘパリンがポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合した物質を合成する方法が容易ではない短所がある。また、上記の物質を合成する過程で、ヘパリンの架橋を抑制するためには、過量のポリエチレンを使用しなければならないため効率が低く、過量の溶媒を使用しなければならない問題点がある。
【００１１】
以上のことを鑑みて、本発明者らは、このような問題点を克服するために、ヘパリンを多官能基を持った高分子と結合させた後、上記高分子に疎水性物質を結合させることによってヘパリンを疎水性高分子と結合した形態の物質に合成する方法を開発した。上記方法を利用して有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体を合成した。上記疎水性多重複合ヘパリン結合体が溶媒蒸発法により高分子や金属からなる全ての医療機器表面に手軽にコーティングでき、高い抗血栓性を示すことを確認して本発明を完成した。
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、血液と接触する全ての物質の表面を改質して抗血栓性を向上させるために、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途を提供することである。
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ヘパリンに高分子及び疎水性物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。
【００１５】
あわせて、本発明は、全ての医療機器または人工臓器の表面改質のためのコーティング剤としての疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ヘパリンに疎水性高分子物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１８】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、多重官能基(functional group)を含有した高分子をヘパリンに化学的に結合させたものである。この時、ヘパリンと高分子物質の結合比は多様に調節することができ、ヘパリンの官能基中、アミン基(amine group)を使用して高分子物質を結合させる。
【００１９】
ヘパリンは、カルボキシル基(carboxyl group)、ヒドロキシル基(hydroxyl group)、スルホン酸基(sulfonic acid group)及びアミン基の官能基を持っていて、この中でアミン基を除外した全ての官能基は、ヘパリンが抗血栓性を示す活性部位に存在するため、万一これらの官能基を高分子物質との化学結合に使用すればヘパリン-高分子結合体は抗血栓性特性を失うことになる。
【００２０】
上記多重官能基を含有した高分子は、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、合成高分子としては、ポリジエン系(poly[dienes])、ポリアルケン系(poly[alkenes])、ポリアセチレン系(poly[acetylenes])、ポリアクリル酸(poly[acrylic acid])及びその誘導体、ポリα-置換アクリル酸(poly[α-substituted acrylic acid])及びその誘導体、ポリビニルエーテル系(poly[vinyl ethers])、ポリビニルアルコール系(poly[vinyl alcohol])、ポリビニルハライド系(poly[vinyl halides])、ポリスチレン(poly[styrene])及びその誘導体、ポリオキシド系(poly[oxides])、ポリエーテル系(poly[ethers])、ポリエステル系(poly[esters])、ポリカルボナート系(poly[carbonates])、ポリアミド系(poly[amides])、ポリアミノ酸系(poly[amino acids])、ポリウレア系(poly[ureas])、ポリウレタン系(poly[urethanes])、ポリイミン系(poly[imines])、ポリスルファイド系(poly[sulfides])、ポリホスファート系(poly[phosphates])、ポリシロキサン系(poly[siloxanes])、ポリシルセスキオキサン系(poly[silsesquioxanes])、ポリ複素環系(poly[heterocyclics])、セルロース(cellulose)及びその誘導体、ポリサッカライド系(poly[saccharides])及びこれらの共重合体または誘導体等が使用できる。蛋白質としては、プロタミン(protamine)、ポリリジン(polylysine)、ポリアスパラギン酸(polyaspartic acid)、ポリグルタミン酸(polyglutamic acid)及びこれらの誘導体または共重合体が使用できる。また、生体高分子としては、多糖質(polysaccharide)、ゼラチン(gelatin)、コラーゲン(collagen)、アルギン酸塩(alginate)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、アルギン酸(alginic acid)、カラギナン(carrageenan)、コンドロイチン(chondroitin)、ペクチン(pectin)、キトサン(chitosan)及びこれらの誘導体または共重合体等が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２１】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリンに多重官能基を持った高分子を結合した後、未反応の高分子の官能基に疎水性物質を結合して製造する。結果的に、ヘパリン分子は、多重官能基を持ったいろいろな高分子と結合し、そこに疎水性物質が再び結合する形態を持つようになる。したがって、ヘパリンのアミン基と結合した高分子の官能基を除外した残りの結合に参与しない多量の官能基は、疎水性物質と反応するようになりこれによってヘパリンは、疎水性を持った巨大分子と結合するようになり本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体が疎水性を持つようになるのである。
【００２２】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、テトラヒドロフラン(tetrahydrofuran)とDMAC(dimethylacetamide)等の特定有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しないという特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法による合成が容易なだけではなく、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等によって、高分子や金属表面に容易にコーティングできる。また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、水溶液には溶解しないため、コーティング後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００２３】
合わせて、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体においてヘパリンは、基質にコーティングされた後にも固有の抗血栓性を維持するため、コーティングされた基質の表面で起きる可能性がある血液凝固を抑制し、コーティングされた表面の抗血栓性を高める効果を示す。一方、ヘパリンは多量の陰イオンを持っていてコーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させるため、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質が良く湿潤(wetting)されるように誘導する特性を持っている。このように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされた基質の表面特性は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できる長所を持っている。
【００２４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。
上記製造方法には、
1) 高分子を活性化させる段階、
2) ヘパリンに上記活性化された高分子を結合させる段階、
3) ヘパリンに結合された高分子の官能基に疎水性物質を結合させる段階が含まれる。
【００２５】
上記製造方法は、既存の先行技術のヘパリンにポリウレタン(polyurethan)及びポリエチレングリコール(polyethylene glycol)が結合されたトライブロックコポリマー(triblock copolymer)を製造する方式とは異なり、多重融合方法(multigrafting method)を利用してヘパリン-高分子-疎水性物質が結合した融合高分子(graft copolymer)を製造する方法であり、多段階工程(multistep process)で構成されている。また、疎水性高分子を利用する上記トライブロックコポリマーの製造方法とは異なり本発明の製造方法は、1個以上の官能基を持った多重官能性(multi-functinaol)高分子でありながら疎水性物質と結合後に疎水性をあらわすことができれば、高分子自体が疎水性を帯びるべき必要はない。構造的にも、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、上記トライブロックコポリマーと異なる形態を持っている。トライブロックコポリマーがポリウレタン鎖にPEGを結合させた後、PEG鎖端にヘパリンが結合された構造を持っている反面、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリン自体に多重官能基を持った高分子を結合させた後、高分子の官能基に疎水性物質が結合された構造を持っている。
【００２６】
段階1の高分子には、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、1個以上の官能基を含む多重官能基を持った高分子が好ましい。上記多重官能基を含有した高分子としては、ポリジエン系(poly[dienes])、ポリアルケン系(poly[alkenes])、ポリアセチレン系(poly[acetylenes])、ポリアクリル酸(poly[acrylic acid])及びその誘導体、ポリα-置換アクリル酸(poly[α-substituted acrylic acid])及びその誘導体、ポリビニルエーテル系(poly[vinyl ethers])、ポリビニルアルコール系(poly[vinyl alcohol])、ポリビニルハライド系(poly[vinyl halides])、ポリスチレン(poly[styrene])及びその誘導体、ポリオキシド系(poly[oxides])、ポリエーテル系(poly[ethers])、ポリエステル系(poly[esters])、ポリカルボナート系(poly[carbonates])、ポリアミド系(poly[amides])、ポリアミノ酸系(poly[amino acids])、ポリウレア系(poly[ureas])、ポリウレタン系(poly[urethanes])、ポリイミン系(poly[imines])、ポリスルファイド系(poly[sulfides])、ポリホスファート系(poly[phosphates])、ポリシロキサン系(poly[siloxanes])、ポリシルセスキオキサン系(poly[silsesquioxanes])、ポリ複素環系(poly[heterocyclics])、セルロース(cellulose)及びその誘導体、ポリサッカライド系(poly[saccharides])及びこれらの共重合体または誘導体等の高分子、プロタミン(protamine)、ポリリジン(polylysine)、ポリアスパラギン酸(polyaspartic acid)、ポリグルタミン酸(polyglutamic acid)及びこれらの誘導体または共重合体等の蛋白質、多糖質(polysaccharide)、ゼラチン(gelatin)、コラーゲン(collagen)、アルギン酸塩(alginate)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、アルギン酸(alginic acid)、カラギナン(carrageenan)、コンドロイチン(chondroitin)、ペクチン(pectin)、キトサン(chitosan)及びこれらの誘導体または共重合体等の生体高分子が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２７】
上記高分子物質を活性化させるために、本発明では好ましい実施例としてN,N-ジクロロヘキシルカルボジイミド(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC)を使用して高分子のカルボキシル基(COOH)を活性化させ、この他にも1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC]または4-p-アジドサリチルアミド-ブチルアミン[4-(p-azidosalicylamido)-butylamine, ASBA]が使用できる。
【００２８】
段階2で、ヘパリンの分子量は、1,000ないし1,000,000ダルトンであることが好ましい。組換えヘパリン(recombinant heparin)、ヘパリン誘導体(heparine derivative)及びヘパリン類似体(heparine analogue)もまた、同様な方法で使用できる。ヘパリンに活性化された高分子を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基(azide group)を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合(amide bond)及びウレタン結合(urethane bond)のような非分解性結合(non-degradable bond)またはエステル結合(ester bond)、アンハイドライド結合(anhydride bond)のような分解性結合(degradable bond)であることが好ましい。
【００２９】
段階3で疎水性物質は、高分子と結合した後、水に対する溶解度が100mg/ml以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持っている物質が好ましい。上記疎水性物質としては、オクタデシルアミン(octadecylamine, ODA)、アルカンアミン(alkanoic amine)、胆汁酸(bile acid)、ステロール(sterol)またはアルカン酸(alkanoic acid)等が使用できる。官能基を持ちながら官能基の結合後、疎水性を持っている物質はすべて使用できる。また、ヘパリンに結合した高分子の官能基に疎水性物質を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合及びウレタン結合のような非分解性結合またはエステル結合、アンハイドライド結合のような分解性結合であることが好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は、疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。前述したように、上記製造方法により合成した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しないため溶媒蒸発法、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等により高分子や金属表面に手軽にコーティングでき、水溶液には溶解しないためコーティングした後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００３１】
また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質は、血液凝固が抑制されコーティングされた表面の抗血栓性が優秀なだけではなく、コーティングされた表面の摩擦係数が顕著に減少し表面の水分吸収能力が増加する特性を持っている。
【００３２】
ゆえに、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質し、性能をより向上させ血栓による副作用を抑制可能なコーティング剤として有用に使用できる。
【００３３】
実施例
以下、本発明を実施する為の最良の態様を実施例により詳細に説明する。
【００３４】
但、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
< 実施例 1> ヘパリン、ポリアクリル酸及びオクタデシルアミン結合体の合成
<1-1> ポリアクリル酸(polyacrylic acid, PAA)の活性
5gのポリアクリル酸(polyacrylic acid, 以下「PAA」と略称する)を250mlのN,N-ジメチルホルムアミド(N,N-dimethylformamid, 以下「DMF」と略称する)に加えて溶解させた後、これを氷水槽に浸けて冷却させた。上記混合溶液に15.5gのN,N-ジクロロヘキシルカルボジイミド(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, 以下「DCC」と略称する)が溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。これを5分間撹拌してDCCを活性化させた後、8.7gのN-ヒドロキシルスクシンイミド(N-hydroxylsuccinimide, 以下「HOSU」と略称する)が溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。反応が進行するにつれて徐々にN,N-ジクロロヘキシルウレア(N,N-dicyclohexylurea, 以下「DCUrea」と略称する)が発生しながら沈殿が起きた。24時間反応を進行後、目の大きさ(pore size)0.2μmの膜(membrane)でろ過(filtering)してDCUreaを除去し、5℃で12時間上記混合溶液を放置した後、残存する微量のDCUrea再度同じ条件でろ過して完全に除去した。DMFを室温状態で溶媒蒸発(evaporation, 30℃)させて除去した上記混合溶液に500mlのメタノールを添加して5時間撹拌させた後、0.2μmの膜でろ過して未反応のDCCとHOSUを完全に除去した。上記混合溶液を室温で6時間真空乾燥させてメタノールを除去して8.7gの白色粉末の生成物を得た。
【００３６】
<1-2> ヘパリン-ポリアクリル酸-オクタデシルアミン結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA= 1:1:20, モル比)
上記実施例<1-1>から得た0.11gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、0.13gのオクタデシルアミン(octadecylamine, 以下「ODA」と略称する)が溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜(cellulose ester membrane)を使用した透析(dialysis)を実施し、未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmのろ過膜(filter membrane)でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて0.45gの白色粉末の生成物を得た。
【００３７】
<1-3> ヘパリン-PAA-ODA結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA=1:5:100, モル比)
上記実施例<1-1>から得た0.55gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、0.67gのODAが溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて1.1gの白色粉末の生成物を得た。
【００３８】
<1-4> ヘパリン-PAA-ODA結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA=1:10:200, モル比)
上記実施例<1-1>から得た1.11gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、1.35gのODAが溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて2.0gの白色粉末の生成物を得た。
【００３９】
< 実施例 2> ヘパリン、プロタミン及びデオキシコール酸結合体の合成
<2-1> デオキシコール酸(deoxycholic acid, DOCA)の活性
11.8gのデオキシコール酸(deoxycholic acid, 以下「DOCA」と略称する)を100mlのDMFに溶解させた後、氷水槽に浸けて冷却した。上記混合溶液に7.4gのDCCを溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、上記混合溶液に4.14gのHOSUが溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。反応の進行にしたがって徐々にDCUreaが沈殿した。24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、5℃で12時間上記反応溶液を放置した後、残存する微量のDCUreaを再度同様な条件でろ過して完全に除去した。DMFを室温状態で溶媒蒸発させて除去した反応溶液に100mlのアセトニトリル(acetonitrile)を添加して白色の固形物を沈殿させた。これを0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させて12.5gの活性化されたDOCAを得た。
【００４０】
<2-2> 疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)の合成
0.5gのプロタミン(protamine)を50mlの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例 <2-1>から得た活性化された0.27gのDOCAを溶解させた50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。これを室温で5時間放置して結合反応(coupling reaction)を進行させた。上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した後、100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化DOCAを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。プロタミンに残存する未反応アミノ基は、100mlの1.0wt%アセトアルデヒド(acetaldehyde)溶液と100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング(blocking)反応を遂行させて除去した。反応が終結後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去してこれを真空乾燥させてDOCAがプロタミンに部分的に結合した0.55gの疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)を得た。
【００４１】
<2-3> プロタミン-DOCAのエステル化反応(esterification)
上記実施例<2-2>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-DOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、これを1.5gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液に迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、0.84gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のDCUreaが沈殿した。室温で24時間反応させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去した後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得られた白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た。上記白色の固形物を室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)0.45gを得た。
【００４２】
<2-4> ヘパリン-プロタミン-DOCA結合体の合成
上記実施例<2-3>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-DOCAを100mlのDMFに溶解させた後、0.92gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下しながら混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応によって結合した生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。5時間反応が進行した後、上記反応溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン-DOCAを除去した。メタノール溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.05gの白色粉末の生成物を得た。
【００４３】
< 実施例 3> ヘパリン , プロタミン及びグリココール酸結合体の合成
<3-1>グリココール酸(glycocholic acid,GOCA)の活性
9.3gのグリココール酸(glycocholic acid, 以下「GOCA」と略称する)を100mlのDMFに加えて溶解させた後、ここに6.6gのDCCが溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、3.7gのHOSUが溶解した25mlのDMF溶液を上記混合溶液に添加した。エステル化反応が進行しながら徐々にDCUreaが発生し沈殿した。室温で24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、5℃で12時間放置して残存する微量のDCUreaを再結晶させ、これを同様な条件でろ過して完全に除去した。上記混合溶液を室温で15ml程度に濃縮した後、ここに100mlのアセトニトリルを添加して白色の固形物を沈殿させた。これを0.2μmの膜でろ過して白色の粉末を得た後、室温で5時間真空乾燥させて7.0gの活性化したOCAを得た。
【００４４】
<3-2> 疎水性プロタミン(プロタミン-GOCA)の合成
0.5gのプロタミンを50mlの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例<3-1>から得た活性化された0.31gのGOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去し、100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化GOCAを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。上記白色粉末を1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間ブロッキング反応を遂行して、プロタミンに残存する未反応のアミノ基を除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して真空乾燥し、GOCAがプロタミンに部分的に結合した0.6gの疎水性プロタミン-GOCAを得た。
【００４５】
<3-3> プロタミン-GOCAのエステル化反応
上記実施例<3-2>から得た0.5gのプロタミン-GOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、ここに1.5gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、0.84gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のDCUreaが沈殿した。室温で24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去して上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100μmのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン-GOCA 0.4gを得た。
【００４６】
<3-4> ヘパリン-プロタミン-GOCA結合体の合成
上記実施例<3-3>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.78gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。室温で5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。これから得た白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン-GOCAを除去した。メタノールを水で置換して 0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて0.9gの白色粉末の生成物を得た。
【００４７】
< 実施例 4> ヘパリン、ポリリジン及び DOCA 結合体の合成
<4-1> ポリリジン(polylysine, PLL)及びDOCAの結合体(PLL-DOCA)合成
1.0gのポリリジン(polylysine, 以下「PLL」と略称する)を50mlの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例<2-1>から得た0.98gの活性化されたDOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。これを100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のPLLを除去し、白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化DOCAを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。PLLに残存する未反応のアミノ基は1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてDOCAがPLLに部分的に結合した1.5gの疎水性PLL-DOCAを得た。
【００４８】
<4-2> PLL-DOCAのエステル化反応
上記実施例<4-1>から得た1.0gのPLL-DOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、2.0gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、1.12gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにつれて微量のDCUreaが発生した。室温で24時間反応を進行させた後、上記混合溶液を0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去した後、室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た。これを再び室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたPLL-DOCA 0.9gを得た。
【００４９】
<4-3> ヘパリン-PLL-DOCA 結合体の合成
上記実施例<4-2>から得た0.7gの活性化されたPLL-DOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに0.95gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は30分程度で完了した。室温で5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化PLL-DOCAを除去した。メタノールを水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して白色沈殿物を得た。上記白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.1gの白色粉末の生成物を得た。
【００５０】
< 実施例 5> ヘパリン、 PLL 及び GOCA 結合体の合成
<5-1> PLL及びGOCA結合体(PLL-GOCA)の合成
1.0gのPLLを50mlの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例<3-1>から得た0.98gの活性化されたGOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり混合した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のPLLを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化GOCAを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。PLLに残存する未反応のアミノ基は、1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてGOCAがPLLに部分的に結合した1.5gの疎水性PLL-GOCAを得た。
【００５１】
<5-2> PLL-GOCAのエステル化反応
上記実施例<5-1>から得た1.5gのPLL-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに1.45gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、1.67gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応の進行につれて微量のDCUreaが発生した。室温で24時間反応を進行させた後、上記混合溶液を0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、これを室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたPLL-GOCA 1.3gを得た。
【００５２】
<5-3> ヘパリン-PLL-GOCA結合体の合成
上記実施例<5-2>から得た1.0gの活性化されたPLL-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに0.95gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応により結合した生成物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。このような白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。上記白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化 PLL-GOCAを除去した。メタノールを水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.6gの白色粉末の生成物を得た。
【００５３】
< 実施例 6> 疎水性多重複合ヘパリン結合体分析
<6-1> FT-IR スペクトルを利用した構造分析
上記のように合成した疎水性多重複合ヘパリン結合体の構造を分析するために、FT-IRスペクトル(Infrared spectrum, Perkin Elmer Ltd.)を調査した結果、実施例<1-3>で合成したヘパリン/PAA/ODA結合体は、結合過程に存在するアミド(amide)結合であるC=O二重結合が赤外線分光分析スペクトルの1720cm-1で強く現れた。ヘパリンのヒドロキシ基は、3500cm-1で、ODAのメチル基は、2800ないし2900cm-1で吸収波長が確認された。
【００５４】
<6-2> 疎水性多重複合ヘパリン結合体のコーティング
上記実施例<1-3>で合成した25mgの疎水性多重複合ヘパリン結合体に1.0mlの混合溶媒(co-solvent, THF:N,N-dimethylacetamide, 1:1 v/v%)を加えて全体濃度が2.5wt%になるように溶解させた後、上記混合溶液を40℃で1時間超音波処理して透明な溶液を製造した。25℃でポリウレタン(polyurethane)で製造された血管カテーテル(angiocatheter, 直径2.5cm, 長さ5cm)及びガラス(0.5cm×0.5cm)を浸漬被覆(dipping coating)方法を利用して上記溶液で各々1回ずつ表面をコーティングした。疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされたカテーテル及びガラスを30分間室温で乾燥させた後、5時間室温で真空乾燥させ残存する溶媒を完全に除去した。この時、コーティングされたガラスやカテーテルの表面状態は、透明度が若干低下したが沈殿現象は何も観察されなかった。
【００５５】
<6-3> コーティングされた疎水性多重複合ヘパリン結合体の水溶液での剥離実験(Peeling test)
上記実施例<6-2>と同様な方法で実施例<1-3>の疎水性多重複合ヘパリン結合体をコーティング(2.5wt%)した各々のガラスとカテーテルを10mlのPBS 緩衝溶液(pH=7.5, I=0.15)が入ったチューブ(falcon tube)に入れ37℃、100rpmの条件で12時間、揺しながら反応させた。反応が終結した上記溶液に、アズールA(azure A)溶液(10mg/mlwater)を添加して染色反応(dye reaction)を行った結果(H.J. Conn,「Biological Stains」, The Williams and Wilkins Co., MD, p96-105, 1961)、染色溶液の色相変化は、発生しなかった。ゆえに、コーティング剤に使用した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体ヘパリン/PAA/ODAは、ガラスや高分子のような基質に対して優れた吸着性を持っているだけではなく、水溶液での膨張(swelling)現象による剥離(peeling)現象がまったく発生しないことを確認した。
【００５６】
<6-4> アズール A 実験
上記実施例<6-3>で剥離実験を経たガラスとカテーテルを5mlのアズール A溶液(10mg azure A/ml water)に各々浸漬(immersion)させた後、室温で5時間放置した。その結果、時間が経過するにしたがって本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質表面で色相変化が進行し、5時間後には染色溶液が赤紫色に変化した。しかし、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされていない対照群の場合には、いかなる色相変化も発生しなかった。したがって、基質の表面に疎水性多重複合ヘパリン結合体が安定的に吸着していてヘパリンの固有の抗血栓特性が維持されていることを確認した。
【００５７】
<6-5> 接触角(contact angle)分析
10mlの蒸溜水に上記実施例<6-2>と同様に疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング(2.5wt%)処理したカテーテル(5cm)及びコーティングされていないカテーテルを各々室温で5分間浸漬した。その結果、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング処理されたカテーテルでは水分分散現象(water spreading)が観察されたが、対照群に使用したコーティングされていないカテーテルでは、上記現象が減少し水分接触角が増加した。
【００５８】
<6-6> 血小板付着実験
血小板付着実験を行なうためにウサギから血小板欠乏血漿(platelet-poor-plasma, 以下「PPP」と略称する)を分離した。詳細には、体重が2.5 kgないし3.0kgのニュージーランド産ウサギ(日出科学商社)をエチルエーテル(ethyl ether)で痲酔した後、心臓穿孔方法(cardiac puncher method)で36mlの血液を採取した。この時、50ml注射器を使用した。血液凝固を抑制するために注射器内に3.8%クエン酸ナトリウム(sodium citrate)4mlを前もって入れておいた。これから採取した血液を4℃、1440rpmで10分間遠心分離して新鮮なウサギのPPPを得た。血漿内血小板の濃度は、コールターカウンター(Coulter counter, Coulter Electronics Ltd, UK)を利用して測定し、血小板の濃度が4.2×105cells/μlになるようにした。分離されたPPPは、製造後 3時間以内に実験に使用した。
【００５９】
このように分離された1mlの新鮮なウサギのPPPが入ったチューブに上記実施例<6-2>と同様に本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング(2.5wt%)されたガラス(0.5×0.5cm)及びコーティングされていない対照群ガラスを各々入れた後、37℃撹拌水槽に1時間放置した。1時間経過後、チューブからPPPを除去して各々のガラスをPBS緩衝溶液で3回洗浄してPPPを完全に除去した。上記各々のガラスに3mlの2.5%グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)を処理して血小板固定(platelet fixing)を4時間遂行後、エタノール(EtOH)水溶液を利用して下記のように3段階に分けて洗浄した。1段階; 5ml 50%EtOH 1時間、2段階; 5ml 80% EtOH 1時間、及び3段階; 5ml 100% EtOH 1時間。エタノールを除去した各々のガラスを液化窒素(liquid nitrogen)で処理した後、6時間冷凍乾燥(freeze drying)した。各々のガラスをSEMで観察して血小板の吸着を確認した結果、対照群ガラスに比べて本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスの血液的合成が大きく改善されたことを確認した。
【００６０】
<6-7> 血液凝固実験
血液凝固実験を行なうためにラットから全血溶液(whole blood)を分離した。詳細には、体重が250ないし300gのスプラグ-ダウリーラット(Sprague-Dawley rat, 大韓バイオリンク)をエチルエーテルで痲酔した後、心臓穿孔方法で3.6mlの血液を摂取した。この時、50ml注射器を使用し、血液凝固を抑制するために注射器内に3.8%クエン酸ナトリウム(sodium citrate)0.4mlを前もって入れておいた、摂取した血液は即時実験に使用した。
【００６１】
上記実施例<1-3>で合成した25mgの疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング(2.5wt%)された血管カテーテル(長さ1cm)及びコーティングされていない対照群血管カテーテルを各々上記のように分離されたラットの全血溶液に1時間浸けておいた後、1次蒸溜水で軽く洗浄してこれを即時写真撮影した。その結果、1時間経過後、対照群カテーテルの場合には、血液成分の凝塊現象(aggregation)が強く発生したが、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング処理されたカテーテルではこのような凝塊現象が全く発生しなかった。
【００６２】
産業上の利用の可能性
上記で詳しく見てきたように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等によって高分子や金属表面に簡単にコーティングすることができ、水溶液には溶解しないためコーティングした後、臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。また、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体は、基質にコーティングした後にも固有の抗血栓性を維持し、コーティングされた基質表面の血液凝固を抑制することによってコーティングされた表面の抗血栓性を高める反面、コーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させコーティングされた基質が良く湿潤(wetting)されるように誘導する特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できるコーティング剤として有用に使用できる。
【００６３】
本発明と同じ目的を実施するための他の態様を修正または設計する基礎として、上記の説明における発想及び特定の態様が容易に利用されうることは、同業者に理解されると思われる。このような同等の態様が添付の特許請求の範囲に記載されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないこともまた、同業者に理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、対照群のガラスである。
【図１Ｂ】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスである。
【図２】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質された血管カテーテル(angiocatheter)の血液的合成実験結果を示したものである。
(a) 対照群カテーテル
(b) 疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたカテーテル
技術分野
本発明は、特定の有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体(hydrophobic multicomponent heparin conjugates)、その製造方法及び用途に関するものである。より詳細には、患者の治療において注射用抗血栓剤として広く使用されているヘパリンに高分子及び疎水性物質を共有結合させ、ヘパリンを疎水性化させることによって特定有機溶媒に対する溶解度は増加した反面、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
血管壁(vascular wall)の血栓抵抗性(thromboresistence)は、血小板及び血漿凝固システム(platelets and the plasma coagulation system)と両立可能な内皮性内膜(endothelial lining)を必要とする。人工血管物質とは異なり、内皮性内膜は、一般的に凝固過程でセリンプロテアーゼ(serine proteases)の活性を誘導しない。しかし、血液の凝固能力(coagulability)が増加すると、内皮(endothelium)はトロンビンのような凝固因子(coagulation factors)を不活性化させる。一般的に、トロンビンの流入部位は内皮細胞表面であると明らかにされていて(ビー.アウブレイ(B. Awbrey)等, J. Biol. Chem., 1979年、第254巻、P.4092-4095)、内皮細胞に存在するグリコースアミノグリカン層(glycosaminoglycan layer)もまたトロンビンの結合部位を持っていると報告されている。上記のトロンビンの結合部位にセリンプロテアーゼ等の酵素が結合すると血漿内の抗トロンビンIII(antithrombin III)の作用によって不活性化されると報告されている(シー.ブッシュ(C. Busch)等, J. Clin. Invest., 1982年、第69巻、P.726-729 ；エム.ドライジスキ(M. Dryjski)等, Thromb. Res., 1983年、第32巻、P.355-363)。
【０００３】
また、抗トロンビンIII結合による類似構造がヘパリン分子に存在すると報告された(ジェー.エイ.マルクム(J.A. Marcum)等, J. Clin. Invest., 1984年、第74巻、P.341-350 ；ジェー.エイ.マルクム(J.A. Marcum)等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1985年、第126巻、P.365-372)後、これらを利用して、内皮様血栓抵抗性(endothelium-like thromboresistent properties)を付与するために固体表面内にまたは表面上にヘパリンを導入する方法が開発され、すでに商用化されている。このようにヘパリンを利用した効果的な抗血栓抵抗性人工表面の利用可能性は、医療技術の発展に広範囲に利用されるものと期待されている。
【０００４】
このような研究の一環として、ヘパリンを使用して高分子表面の血液適合性(blood compatibility)を向上させるための方法が多様に開発された。グローデ(Grode)等は、 塩化シアヌル(cyanuric chloride)と放射線結合方法(radiation grafting)を利用してヘパリン-シリコンゴム(heparin-silicon rubber)を合成した(グローデ(Grode)等, J. Biomed. Mater. Res. Symp., 1972年、第3巻、P.77-84)。メリル(Merrill)等もまたグルタアルデヒド交差結合(glutaldehyde crosslinking)を通してヘパリンと共有結合を形成するポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol)を合成した(メリル(Merrill)等, J. Appl. Physiol., 1970年、第29巻、P.723-728)。エリクソン(Eriksson)及びギレルグ(Gillerg)は、ポリプロピレン(polypropylene)表面に付着した交差結合されたヘパリン単層(cross-linked heparin monolayer)を開発した(エリクソン及びギレルグ(Eriksson and Gillerg), J. Biomed. Mater. Res., 1967年、第1巻、P.301-312)。これは、陰イオンヘパリン(anionic heparin)を連続したヘパリン交差結合でつないだ後、陽イオン界面活性剤(cationic surfactant)によりポリプロピレン表面に吸着させたものである。
【０００５】
ゴーセン(Goosen)及びセフトン(Sefton)は、ヘパリン化されたスチレン-ブタジエン-スチレン エラストマー(heparinized styrene-butadiene-styrene elastomer)を合成した(ゴーセンとセフトン(Goosen and Sefton), Thromb. Res., 1980年、第20巻、P.543-554)。また、ミユラ(Miyura)等は、ヘパリンをセファロース(Sepharose)またはポリヒドロキシメタクリレート(polyhydroxymethacrylate)に固定させることによって血漿の再石灰化(plasma recalcification)期間を延長させる方法を考案した(ミユラ(Miyura)等, J. Biomed. Mater. Res.,1980年、第14巻、P.619-630)。
【０００６】
この他にも、ジャコブス(Jacobs)等は、ヘパリンとプロスタグラジンE1(prostaglandin E1)の共有結合複合体を合成した(ジャコブス(Jacobs)等, J. Biomed. Mater. Res., 1989年、第23巻、P.611-630)。上記ヘパリン複合体は、ジアミノ-終結ポリエチレン酸化物(diamino-terminated polyethylene oxides)を通してウレタン(urethane)に固定され、このように固定された複合体がトロンビン形成過程を抑制するのにとても効果的であることを確認した。ヘンニンク(Hennink)等は、人間血漿アルブミン(human serum albumin)とヘパリンの共有結合複合体を開発した(ヘンニンク(Hennink)等, Thromb. Res., 1983年、第29巻、P.1-13)。上記複合体は、前吸着(preadsorption)または血液と接触する表面との共有結合により高分子表面の血液適合性を向上させる。
【０００７】
ナガオカ(Nagaoka)等は、高分子表面に付着したポリエチレンオキシド親水性スペーサー(polyethylene oxide [PEO] hydrophilic spacer)が血漿蛋白質の吸着と動力学的反発(dynamic repulsion)による血小板の付着抑制効果を示す30回余りの動物実験結果を発表した(ナガオカ(Nagaoka)等, Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1987年、第10巻、P.76-78)。ヘパリン化された表面での上記スペーサーの血小板付着抑制効果は、キム(Kim)及びエベルト(Ebert)により証明された(キム及びエベルト(Kim and Ebert),Thromb. Res., 1982年、第26巻、P.43-57)。これらは、固定化されたヘパリンの抗凝固(anticoagulant activity)活性がスペーサーの長さが長くなるほど増加することを明らかにした。
【０００８】
また、タイ(Tay)等は、1) PEOのように長さの長いスペーサーの使用は、ヘパリンをポリビニルアルコールに対する強い結合より抗トロンビンIII及びトロンビンにさらに結合しやすくする。 2) 末端基(end groups)を通してポリビニルアルコールに連結されたヘパリンがヘパリン大分子(heparin macromolecules)の非末端性ユニット(nonterminal units)上のアミノ基(amino groups)により結合された場合よりさらに結合することが容易である。 3) 表面上のヘパリンユニットのかたまりが抗トロンビンIII及びトロンビンの接近を制限する。ことを明らかにした(タイ(Tay)等, Biomaterials, 1989年、第10巻、P.11-15)。
【０００９】
スチマー(Schmer)は、ヘパリンをチオホスゲン(thiophosgene)またはカルボジイミド(carbodiimide)のようなスペーサーを利用してアガロースに共有結合させ(スチマー(Schmer), Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1972年、第18巻、P.321-324)、スペーサー固定ヘパリンは、抗トロンビンIIIに対する向上された結合能力を持っていた。ダニシェフスカイ(Danishefsky)及びツゼング(Tzeng)は、アミノエチルスペーサー(aminoethyl spacer)を利用してヘパリン-アガロース(agarose)高分子を製造した(ダニシェフスカイ及びツゼング(Danishefsky and Tzeng), Thromb. Res., 1974年、第4巻、P.237-246)。また、パーク(Park)等は、PEO スペーサーを利用してヘパリンをバイオマ(Biomer)に固定させた(パーク(Park)等, J. Biomed. Mater. Res., 1988年、第22巻、P.977-992)、彼らは、固定されたヘパリンの抗凝固活性を最適化させるためには、スペーサーの長さが3,400ダルトン程度でなければならないと報告した。リン(Lin)等(リン(Lin)等, J. Biomed. Mater. Res., 1991年、第25巻、P.791-795)及びピアノ(Piao)等(ピアノ(Piao)等, Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs., 1992年、第38巻、P.638-643)は、スペーサーの表面密度(surface density)を増幅させ抗凝固活性を最適化させるためにスペーサーの表面にヘパリンを固定化させた。
【００１０】
さらに、ヘパリンを利用したスペーサーシステムは、共重合体の合成にも使用されてきた。グレインジャー(Grainger)等は、PEO-PDMS-ヘパリン及びPDMS-PEO-ヘパリンのトライブロック共重合体(triblock copolymers)を合成した(グレインジャー(Grainger)等, J. Biomed. Mater. Res., 1988年、第22巻、P.231-249)。細分化されたポリウレタン表面(segmented polyurethane surface)にコーティングされた上記トライブロック共重合体は、低流量下でも非血栓形成能(nonthrombogenicity)を向上させた。ブリック(Vulic)等は、ポリウレタン-PEO-ヘパリンを合成する方法を報告した(ブリック(Vulic)等, J. Polym. Sci. A, Polym. Chem., 1988年、第26巻、P.381-391)、上記方法は、ヘパリンをポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合させ有機溶媒に溶解させた後、溶媒キャスティング方法(solvent casting method)で表面を改質する方法である。この方法は、コーティングが簡便な長所があるが、ヘパリンがポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合した物質を合成する方法が容易ではない短所がある。また、上記の物質を合成する過程で、ヘパリンの架橋を抑制するためには、過量のポリエチレンを使用しなければならないため効率が低く、過量の溶媒を使用しなければならない問題点がある。
【００１１】
以上のことを鑑みて、本発明者らは、このような問題点を克服するために、ヘパリンを多官能基を持った高分子と結合させた後、上記高分子に疎水性物質を結合させることによってヘパリンを疎水性高分子と結合した形態の物質に合成する方法を開発した。上記方法を利用して有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体を合成した。上記疎水性多重複合ヘパリン結合体が溶媒蒸発法により高分子や金属からなる全ての医療機器表面に手軽にコーティングでき、高い抗血栓性を示すことを確認して本発明を完成した。
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、血液と接触する全ての物質の表面を改質して抗血栓性を向上させるために、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途を提供することである。
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ヘパリンに高分子及び疎水性物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。
【００１５】
あわせて、本発明は、全ての医療機器または人工臓器の表面改質のためのコーティング剤としての疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ヘパリンに疎水性高分子物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１８】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、多重官能基(functional group)を含有した高分子をヘパリンに化学的に結合させたものである。この時、ヘパリンと高分子物質の結合比は多様に調節することができ、ヘパリンの官能基中、アミン基(amine group)を使用して高分子物質を結合させる。
【００１９】
ヘパリンは、カルボキシル基(carboxyl group)、ヒドロキシル基(hydroxyl group)、スルホン酸基(sulfonic acid group)及びアミン基の官能基を持っていて、この中でアミン基を除外した全ての官能基は、ヘパリンが抗血栓性を示す活性部位に存在するため、万一これらの官能基を高分子物質との化学結合に使用すればヘパリン-高分子結合体は抗血栓性特性を失うことになる。
【００２０】
上記多重官能基を含有した高分子は、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、合成高分子としては、ポリジエン系(poly[dienes])、ポリアルケン系(poly[alkenes])、ポリアセチレン系(poly[acetylenes])、ポリアクリル酸(poly[acrylic acid])及びその誘導体、ポリα-置換アクリル酸(poly[α-substituted acrylic acid])及びその誘導体、ポリビニルエーテル系(poly[vinyl ethers])、ポリビニルアルコール系(poly[vinyl alcohol])、ポリビニルハライド系(poly[vinyl halides])、ポリスチレン(poly[styrene])及びその誘導体、ポリオキシド系(poly[oxides])、ポリエーテル系(poly[ethers])、ポリエステル系(poly[esters])、ポリカルボナート系(poly[carbonates])、ポリアミド系(poly[amides])、ポリアミノ酸系(poly[amino acids])、ポリウレア系(poly[ureas])、ポリウレタン系(poly[urethanes])、ポリイミン系(poly[imines])、ポリスルファイド系(poly[sulfides])、ポリホスファート系(poly[phosphates])、ポリシロキサン系(poly[siloxanes])、ポリシルセスキオキサン系(poly[silsesquioxanes])、ポリ複素環系(poly[heterocyclics])、セルロース(cellulose)及びその誘導体、ポリサッカライド系(poly[saccharides])及びこれらの共重合体または誘導体等が使用できる。蛋白質としては、プロタミン(protamine)、ポリリジン(polylysine)、ポリアスパラギン酸(polyaspartic acid)、ポリグルタミン酸(polyglutamic acid)及びこれらの誘導体または共重合体が使用できる。また、生体高分子としては、多糖質(polysaccharide)、ゼラチン(gelatin)、コラーゲン(collagen)、アルギン酸塩(alginate)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、アルギン酸(alginic acid)、カラギナン(carrageenan)、コンドロイチン(chondroitin)、ペクチン(pectin)、キトサン(chitosan)及びこれらの誘導体または共重合体等が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２１】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリンに多重官能基を持った高分子を結合した後、未反応の高分子の官能基に疎水性物質を結合して製造する。結果的に、ヘパリン分子は、多重官能基を持ったいろいろな高分子と結合し、そこに疎水性物質が再び結合する形態を持つようになる。したがって、ヘパリンのアミン基と結合した高分子の官能基を除外した残りの結合に参与しない多量の官能基は、疎水性物質と反応するようになりこれによってヘパリンは、疎水性を持った巨大分子と結合するようになり本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体が疎水性を持つようになるのである。
【００２２】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、テトラヒドロフラン(tetrahydrofuran)とDMAC(dimethylacetamide)等の特定有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しないという特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法による合成が容易なだけではなく、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等によって、高分子や金属表面に容易にコーティングできる。また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、水溶液には溶解しないため、コーティング後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００２３】
合わせて、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体においてヘパリンは、基質にコーティングされた後にも固有の抗血栓性を維持するため、コーティングされた基質の表面で起きる可能性がある血液凝固を抑制し、コーティングされた表面の抗血栓性を高める効果を示す。一方、ヘパリンは多量の陰イオンを持っていてコーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させるため、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質が良く湿潤(wetting)されるように誘導する特性を持っている。このように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされた基質の表面特性は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できる長所を持っている。
【００２４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。
上記製造方法には、
1) 高分子を活性化させる段階、
2) ヘパリンに上記活性化された高分子を結合させる段階、
3) ヘパリンに結合された高分子の官能基に疎水性物質を結合させる段階が含まれる。
【００２５】
上記製造方法は、既存の先行技術のヘパリンにポリウレタン(polyurethan)及びポリエチレングリコール(polyethylene glycol)が結合されたトライブロックコポリマー(triblock copolymer)を製造する方式とは異なり、多重融合方法(multigrafting method)を利用してヘパリン-高分子-疎水性物質が結合した融合高分子(graft copolymer)を製造する方法であり、多段階工程(multistep process)で構成されている。また、疎水性高分子を利用する上記トライブロックコポリマーの製造方法とは異なり本発明の製造方法は、1個以上の官能基を持った多重官能性(multi-functinaol)高分子でありながら疎水性物質と結合後に疎水性をあらわすことができれば、高分子自体が疎水性を帯びるべき必要はない。構造的にも、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、上記トライブロックコポリマーと異なる形態を持っている。トライブロックコポリマーがポリウレタン鎖にPEGを結合させた後、PEG鎖端にヘパリンが結合された構造を持っている反面、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリン自体に多重官能基を持った高分子を結合させた後、高分子の官能基に疎水性物質が結合された構造を持っている。
【００２６】
段階1の高分子には、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、1個以上の官能基を含む多重官能基を持った高分子が好ましい。上記多重官能基を含有した高分子としては、ポリジエン系(poly[dienes])、ポリアルケン系(poly[alkenes])、ポリアセチレン系(poly[acetylenes])、ポリアクリル酸(poly[acrylic acid])及びその誘導体、ポリα-置換アクリル酸(poly[α-substituted acrylic acid])及びその誘導体、ポリビニルエーテル系(poly[vinyl ethers])、ポリビニルアルコール系(poly[vinyl alcohol])、ポリビニルハライド系(poly[vinyl halides])、ポリスチレン(poly[styrene])及びその誘導体、ポリオキシド系(poly[oxides])、ポリエーテル系(poly[ethers])、ポリエステル系(poly[esters])、ポリカルボナート系(poly[carbonates])、ポリアミド系(poly[amides])、ポリアミノ酸系(poly[amino acids])、ポリウレア系(poly[ureas])、ポリウレタン系(poly[urethanes])、ポリイミン系(poly[imines])、ポリスルファイド系(poly[sulfides])、ポリホスファート系(poly[phosphates])、ポリシロキサン系(poly[siloxanes])、ポリシルセスキオキサン系(poly[silsesquioxanes])、ポリ複素環系(poly[heterocyclics])、セルロース(cellulose)及びその誘導体、ポリサッカライド系(poly[saccharides])及びこれらの共重合体または誘導体等の高分子、プロタミン(protamine)、ポリリジン(polylysine)、ポリアスパラギン酸(polyaspartic acid)、ポリグルタミン酸(polyglutamic acid)及びこれらの誘導体または共重合体等の蛋白質、多糖質(polysaccharide)、ゼラチン(gelatin)、コラーゲン(collagen)、アルギン酸塩(alginate)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、アルギン酸(alginic acid)、カラギナン(carrageenan)、コンドロイチン(chondroitin)、ペクチン(pectin)、キトサン(chitosan)及びこれらの誘導体または共重合体等の生体高分子が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２７】
上記高分子物質を活性化させるために、本発明では好ましい実施例としてN,N-ジクロロヘキシルカルボジイミド(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC)を使用して高分子のカルボキシル基(COOH)を活性化させ、この他にも1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC]または4-p-アジドサリチルアミド-ブチルアミン[4-(p-azidosalicylamido)-butylamine, ASBA]が使用できる。
【００２８】
段階2で、ヘパリンの分子量は、1,000ないし1,000,000ダルトンであることが好ましい。組換えヘパリン(recombinant heparin)、ヘパリン誘導体(heparine derivative)及びヘパリン類似体(heparine analogue)もまた、同様な方法で使用できる。ヘパリンに活性化された高分子を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基(azide group)を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合(amide bond)及びウレタン結合(urethane bond)のような非分解性結合(non-degradable bond)またはエステル結合(ester bond)、アンハイドライド結合(anhydride bond)のような分解性結合(degradable bond)であることが好ましい。
【００２９】
段階3で疎水性物質は、高分子と結合した後、水に対する溶解度が100mg/ml以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持っている物質が好ましい。上記疎水性物質としては、オクタデシルアミン(octadecylamine, ODA)、アルカンアミン(alkanoic amine)、胆汁酸(bile acid)、ステロール(sterol)またはアルカン酸(alkanoic acid)等が使用できる。官能基を持ちながら官能基の結合後、疎水性を持っている物質はすべて使用できる。また、ヘパリンに結合した高分子の官能基に疎水性物質を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合及びウレタン結合のような非分解性結合またはエステル結合、アンハイドライド結合のような分解性結合であることが好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は、疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。前述したように、上記製造方法により合成した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しないため溶媒蒸発法、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等により高分子や金属表面に手軽にコーティングでき、水溶液には溶解しないためコーティングした後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００３１】
また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質は、血液凝固が抑制されコーティングされた表面の抗血栓性が優秀なだけではなく、コーティングされた表面の摩擦係数が顕著に減少し表面の水分吸収能力が増加する特性を持っている。
【００３２】
ゆえに、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質し、性能をより向上させ血栓による副作用を抑制可能なコーティング剤として有用に使用できる。
【００３３】
実施例
以下、本発明を実施する為の最良の態様を実施例により詳細に説明する。
【００３４】
但、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
< 実施例 1> ヘパリン、ポリアクリル酸及びオクタデシルアミン結合体の合成
<1-1> ポリアクリル酸(polyacrylic acid, PAA)の活性
5gのポリアクリル酸(polyacrylic acid, 以下「PAA」と略称する)を250mlのN,N-ジメチルホルムアミド(N,N-dimethylformamid, 以下「DMF」と略称する)に加えて溶解させた後、これを氷水槽に浸けて冷却させた。上記混合溶液に15.5gのN,N-ジクロロヘキシルカルボジイミド(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, 以下「DCC」と略称する)が溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。これを5分間撹拌してDCCを活性化させた後、8.7gのN-ヒドロキシルスクシンイミド(N-hydroxylsuccinimide, 以下「HOSU」と略称する)が溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。反応が進行するにつれて徐々にN,N-ジクロロヘキシルウレア(N,N-dicyclohexylurea, 以下「DCUrea」と略称する)が発生しながら沈殿が起きた。24時間反応を進行後、目の大きさ(pore size)0.2μmの膜(membrane)でろ過(filtering)してDCUreaを除去し、5℃で12時間上記混合溶液を放置した後、残存する微量のDCUrea再度同じ条件でろ過して完全に除去した。DMFを室温状態で溶媒蒸発(evaporation, 30℃)させて除去した上記混合溶液に500mlのメタノールを添加して5時間撹拌させた後、0.2μmの膜でろ過して未反応のDCCとHOSUを完全に除去した。上記混合溶液を室温で6時間真空乾燥させてメタノールを除去して8.7gの白色粉末の生成物を得た。
【００３６】
<1-2> ヘパリン-ポリアクリル酸-オクタデシルアミン結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA= 1:1:20, モル比)
上記実施例<1-1>から得た0.11gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、0.13gのオクタデシルアミン(octadecylamine, 以下「ODA」と略称する)が溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜(cellulose ester membrane)を使用した透析(dialysis)を実施し、未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmのろ過膜(filter membrane)でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて0.45gの白色粉末の生成物を得た。
【００３７】
<1-3> ヘパリン-PAA-ODA結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA=1:5:100, モル比)
上記実施例<1-1>から得た0.55gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、0.67gのODAが溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて1.1gの白色粉末の生成物を得た。
【００３８】
<1-4> ヘパリン-PAA-ODA結合体の合成(ヘパリン/PAA/ODA=1:10:200, モル比)
上記実施例<1-1>から得た1.11gの活性化されたPAAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.3gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから30分以内にヘパリンと活性化されたPAAが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。5時間経過後、1.35gのODAが溶解した350mlのTHF溶液を5分間にわたってゆっくり添加して室温で5時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。30分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて400mlのTHFと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のODAを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を12時間真空乾燥させて2.0gの白色粉末の生成物を得た。
【００３９】
< 実施例 2> ヘパリン、プロタミン及びデオキシコール酸結合体の合成
<2-1> デオキシコール酸(deoxycholic acid, DOCA)の活性
11.8gのデオキシコール酸(deoxycholic acid, 以下「DOCA」と略称する)を100mlのDMFに溶解させた後、氷水槽に浸けて冷却した。上記混合溶液に7.4gのDCCを溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、上記混合溶液に4.14gのHOSUが溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。反応の進行にしたがって徐々にDCUreaが沈殿した。24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、5℃で12時間上記反応溶液を放置した後、残存する微量のDCUreaを再度同様な条件でろ過して完全に除去した。DMFを室温状態で溶媒蒸発させて除去した反応溶液に100mlのアセトニトリル(acetonitrile)を添加して白色の固形物を沈殿させた。これを0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させて12.5gの活性化されたDOCAを得た。
【００４０】
<2-2> 疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)の合成
0.5gのプロタミン(protamine)を50mlの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例 <2-1>から得た活性化された0.27gのDOCAを溶解させた50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。これを室温で5時間放置して結合反応(coupling reaction)を進行させた。上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した後、100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化DOCAを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。プロタミンに残存する未反応アミノ基は、100mlの1.0wt%アセトアルデヒド(acetaldehyde)溶液と100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング(blocking)反応を遂行させて除去した。反応が終結後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去してこれを真空乾燥させてDOCAがプロタミンに部分的に結合した0.55gの疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)を得た。
【００４１】
<2-3> プロタミン-DOCAのエステル化反応(esterification)
上記実施例<2-2>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-DOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、これを1.5gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液に迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、0.84gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のDCUreaが沈殿した。室温で24時間反応させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去した後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得られた白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た。上記白色の固形物を室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン(プロタミン-DOCA)0.45gを得た。
【００４２】
<2-4> ヘパリン-プロタミン-DOCA結合体の合成
上記実施例<2-3>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-DOCAを100mlのDMFに溶解させた後、0.92gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下しながら混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応によって結合した生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。5時間反応が進行した後、上記反応溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン-DOCAを除去した。メタノール溶媒を水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.05gの白色粉末の生成物を得た。
【００４３】
< 実施例 3> ヘパリン , プロタミン及びグリココール酸結合体の合成
<3-1>グリココール酸(glycocholic acid,GOCA)の活性
9.3gのグリココール酸(glycocholic acid, 以下「GOCA」と略称する)を100mlのDMFに加えて溶解させた後、ここに6.6gのDCCが溶解した25mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、3.7gのHOSUが溶解した25mlのDMF溶液を上記混合溶液に添加した。エステル化反応が進行しながら徐々にDCUreaが発生し沈殿した。室温で24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、5℃で12時間放置して残存する微量のDCUreaを再結晶させ、これを同様な条件でろ過して完全に除去した。上記混合溶液を室温で15ml程度に濃縮した後、ここに100mlのアセトニトリルを添加して白色の固形物を沈殿させた。これを0.2μmの膜でろ過して白色の粉末を得た後、室温で5時間真空乾燥させて7.0gの活性化したOCAを得た。
【００４４】
<3-2> 疎水性プロタミン(プロタミン-GOCA)の合成
0.5gのプロタミンを50mlの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例<3-1>から得た活性化された0.31gのGOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去し、100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化GOCAを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。上記白色粉末を1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間ブロッキング反応を遂行して、プロタミンに残存する未反応のアミノ基を除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して真空乾燥し、GOCAがプロタミンに部分的に結合した0.6gの疎水性プロタミン-GOCAを得た。
【００４５】
<3-3> プロタミン-GOCAのエステル化反応
上記実施例<3-2>から得た0.5gのプロタミン-GOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、ここに1.5gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、0.84gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のDCUreaが沈殿した。室温で24時間反応を進行させた後、0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去して上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100μmのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン-GOCA 0.4gを得た。
【００４６】
<3-4> ヘパリン-プロタミン-GOCA結合体の合成
上記実施例<3-3>から得た0.5gの活性化されたプロタミン-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、ここに0.78gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。室温で5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。これから得た白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン-GOCAを除去した。メタノールを水で置換して 0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて0.9gの白色粉末の生成物を得た。
【００４７】
< 実施例 4> ヘパリン、ポリリジン及び DOCA 結合体の合成
<4-1> ポリリジン(polylysine, PLL)及びDOCAの結合体(PLL-DOCA)合成
1.0gのポリリジン(polylysine, 以下「PLL」と略称する)を50mlの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例<2-1>から得た0.98gの活性化されたDOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり添加した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。これを100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のPLLを除去し、白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化DOCAを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。PLLに残存する未反応のアミノ基は1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてDOCAがPLLに部分的に結合した1.5gの疎水性PLL-DOCAを得た。
【００４８】
<4-2> PLL-DOCAのエステル化反応
上記実施例<4-1>から得た1.0gのPLL-DOCAを80mlのDMFに加えて溶解させた後、2.0gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、1.12gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応が進行するにつれて微量のDCUreaが発生した。室温で24時間反応を進行させた後、上記混合溶液を0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去した後、室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た。これを再び室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたPLL-DOCA 0.9gを得た。
【００４９】
<4-3> ヘパリン-PLL-DOCA 結合体の合成
上記実施例<4-2>から得た0.7gの活性化されたPLL-DOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに0.95gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は30分程度で完了した。室温で5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化PLL-DOCAを除去した。メタノールを水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して白色沈殿物を得た。上記白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.1gの白色粉末の生成物を得た。
【００５０】
< 実施例 5> ヘパリン、 PLL 及び GOCA 結合体の合成
<5-1> PLL及びGOCA結合体(PLL-GOCA)の合成
1.0gのPLLを50mlの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例<3-1>から得た0.98gの活性化されたGOCAが溶解した50mlのDMF溶液をゆっくり混合した。室温で5時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去した。100mlの蒸溜水で3回洗浄して未反応のPLLを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を100mlのメタノールで洗浄して0.45μmの膜でろ過して未反応の活性化GOCAを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。PLLに残存する未反応のアミノ基は、1.0wt%アセトアルデヒドを含有した100mlの50%メタノール水溶液で1時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で3回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてGOCAがPLLに部分的に結合した1.5gの疎水性PLL-GOCAを得た。
【００５１】
<5-2> PLL-GOCAのエステル化反応
上記実施例<5-1>から得た1.5gのPLL-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに1.45gのDCCが溶解した10mlのDMF溶液を迅速に添加した。5分間撹拌してDCCを活性化させた後、1.67gのHOSUが溶解した10mlのDMF溶液を再び添加した。反応の進行につれて微量のDCUreaが発生した。室温で24時間反応を進行させた後、上記混合溶液を0.2μmの膜でろ過してDCUreaを除去し、これを室温で溶媒蒸発させてDMFを除去した。これから得た白色粉末を100mlのメタノールで2回洗浄して0.2μmの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で5時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたPLL-GOCA 1.3gを得た。
【００５２】
<5-3> ヘパリン-PLL-GOCA結合体の合成
上記実施例<5-2>から得た1.0gの活性化されたPLL-GOCAを100mlのDMFに溶解させた後、そこに0.95gのヘパリンが溶解した50mlの蒸溜水を5分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって30分以内に縮合反応により結合した生成物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。このような白色の沈殿物生成は、30分程度で完了した。5時間反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とDMFを除去して白色の粉末を得た。上記白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化 PLL-GOCAを除去した。メタノールを水で置換して0.45μmの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で12時間真空乾燥させて1.6gの白色粉末の生成物を得た。
【００５３】
< 実施例 6> 疎水性多重複合ヘパリン結合体分析
<6-1> FT-IR スペクトルを利用した構造分析
上記のように合成した疎水性多重複合ヘパリン結合体の構造を分析するために、FT-IRスペクトル(Infrared spectrum, Perkin Elmer Ltd.)を調査した結果、実施例<1-3>で合成したヘパリン/PAA/ODA結合体は、結合過程に存在するアミド(amide)結合であるC=O二重結合が赤外線分光分析スペクトルの1720cm-1で強く現れた。ヘパリンのヒドロキシ基は、3500cm-1で、ODAのメチル基は、2800ないし2900cm-1で吸収波長が確認された。
【００５４】
<6-2> 疎水性多重複合ヘパリン結合体のコーティング
上記実施例<1-3>で合成した25mgの疎水性多重複合ヘパリン結合体に1.0mlの混合溶媒(co-solvent, THF:N,N-dimethylacetamide, 1:1 v/v%)を加えて全体濃度が2.5wt%になるように溶解させた後、上記混合溶液を40℃で1時間超音波処理して透明な溶液を製造した。25℃でポリウレタン(polyurethane)で製造された血管カテーテル(angiocatheter, 直径2.5cm, 長さ5cm)及びガラス(0.5cm×0.5cm)を浸漬被覆(dipping coating)方法を利用して上記溶液で各々1回ずつ表面をコーティングした。疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされたカテーテル及びガラスを30分間室温で乾燥させた後、5時間室温で真空乾燥させ残存する溶媒を完全に除去した。この時、コーティングされたガラスやカテーテルの表面状態は、透明度が若干低下したが沈殿現象は何も観察されなかった。
【００５５】
<6-3> コーティングされた疎水性多重複合ヘパリン結合体の水溶液での剥離実験(Peeling test)
上記実施例<6-2>と同様な方法で実施例<1-3>の疎水性多重複合ヘパリン結合体をコーティング(2.5wt%)した各々のガラスとカテーテルを10mlのPBS 緩衝溶液(pH=7.5, I=0.15)が入ったチューブ(falcon tube)に入れ37℃、100rpmの条件で12時間、揺しながら反応させた。反応が終結した上記溶液に、アズールA(azure A)溶液(10mg/mlwater)を添加して染色反応(dye reaction)を行った結果(H.J. Conn,「Biological Stains」, The Williams and Wilkins Co., MD, p96-105, 1961)、染色溶液の色相変化は、発生しなかった。ゆえに、コーティング剤に使用した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体ヘパリン/PAA/ODAは、ガラスや高分子のような基質に対して優れた吸着性を持っているだけではなく、水溶液での膨張(swelling)現象による剥離(peeling)現象がまったく発生しないことを確認した。
【００５６】
<6-4> アズール A 実験
上記実施例<6-3>で剥離実験を経たガラスとカテーテルを5mlのアズール A溶液(10mg azure A/ml water)に各々浸漬(immersion)させた後、室温で5時間放置した。その結果、時間が経過するにしたがって本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質表面で色相変化が進行し、5時間後には染色溶液が赤紫色に変化した。しかし、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされていない対照群の場合には、いかなる色相変化も発生しなかった。したがって、基質の表面に疎水性多重複合ヘパリン結合体が安定的に吸着していてヘパリンの固有の抗血栓特性が維持されていることを確認した。
【００５７】
<6-5> 接触角(contact angle)分析
10mlの蒸溜水に上記実施例<6-2>と同様に疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング(2.5wt%)処理したカテーテル(5cm)及びコーティングされていないカテーテルを各々室温で5分間浸漬した。その結果、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング処理されたカテーテルでは水分分散現象(water spreading)が観察されたが、対照群に使用したコーティングされていないカテーテルでは、上記現象が減少し水分接触角が増加した。
【００５８】
<6-6> 血小板付着実験
血小板付着実験を行なうためにウサギから血小板欠乏血漿(platelet-poor-plasma, 以下「PPP」と略称する)を分離した。詳細には、体重が2.5 kgないし3.0kgのニュージーランド産ウサギ(日出科学商社)をエチルエーテル(ethyl ether)で痲酔した後、心臓穿孔方法(cardiac puncher method)で36mlの血液を採取した。この時、50ml注射器を使用した。血液凝固を抑制するために注射器内に3.8%クエン酸ナトリウム(sodium citrate)4mlを前もって入れておいた。これから採取した血液を4℃、1440rpmで10分間遠心分離して新鮮なウサギのPPPを得た。血漿内血小板の濃度は、コールターカウンター(Coulter counter, Coulter Electronics Ltd, UK)を利用して測定し、血小板の濃度が4.2×105cells/μlになるようにした。分離されたPPPは、製造後 3時間以内に実験に使用した。
【００５９】
このように分離された1mlの新鮮なウサギのPPPが入ったチューブに上記実施例<6-2>と同様に本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング(2.5wt%)されたガラス(0.5×0.5cm)及びコーティングされていない対照群ガラスを各々入れた後、37℃撹拌水槽に1時間放置した。1時間経過後、チューブからPPPを除去して各々のガラスをPBS緩衝溶液で3回洗浄してPPPを完全に除去した。上記各々のガラスに3mlの2.5%グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)を処理して血小板固定(platelet fixing)を4時間遂行後、エタノール(EtOH)水溶液を利用して下記のように3段階に分けて洗浄した。1段階; 5ml 50%EtOH 1時間、2段階; 5ml 80% EtOH 1時間、及び3段階; 5ml 100% EtOH 1時間。エタノールを除去した各々のガラスを液化窒素(liquid nitrogen)で処理した後、6時間冷凍乾燥(freeze drying)した。各々のガラスをSEMで観察して血小板の吸着を確認した結果、対照群ガラスに比べて本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスの血液的合成が大きく改善されたことを確認した。
【００６０】
<6-7> 血液凝固実験
血液凝固実験を行なうためにラットから全血溶液(whole blood)を分離した。詳細には、体重が250ないし300gのスプラグ-ダウリーラット(Sprague-Dawley rat, 大韓バイオリンク)をエチルエーテルで痲酔した後、心臓穿孔方法で3.6mlの血液を摂取した。この時、50ml注射器を使用し、血液凝固を抑制するために注射器内に3.8%クエン酸ナトリウム(sodium citrate)0.4mlを前もって入れておいた、摂取した血液は即時実験に使用した。
【００６１】
上記実施例<1-3>で合成した25mgの疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング(2.5wt%)された血管カテーテル(長さ1cm)及びコーティングされていない対照群血管カテーテルを各々上記のように分離されたラットの全血溶液に1時間浸けておいた後、1次蒸溜水で軽く洗浄してこれを即時写真撮影した。その結果、1時間経過後、対照群カテーテルの場合には、血液成分の凝塊現象(aggregation)が強く発生したが、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング処理されたカテーテルではこのような凝塊現象が全く発生しなかった。
【００６２】
産業上の利用の可能性
上記で詳しく見てきたように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法、浸漬被覆(dip coating)方法またはスプレー方法等によって高分子や金属表面に簡単にコーティングすることができ、水溶液には溶解しないためコーティングした後、臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。また、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体は、基質にコーティングした後にも固有の抗血栓性を維持し、コーティングされた基質表面の血液凝固を抑制することによってコーティングされた表面の抗血栓性を高める反面、コーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させコーティングされた基質が良く湿潤(wetting)されるように誘導する特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できるコーティング剤として有用に使用できる。
【００６３】
本発明と同じ目的を実施するための他の態様を修正または設計する基礎として、上記の説明における発想及び特定の態様が容易に利用されうることは、同業者に理解されると思われる。このような同等の態様が添付の特許請求の範囲に記載されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないこともまた、同業者に理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、対照群のガラスである。
【図１Ｂ】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスである。
【図２】 本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質された血管カテーテル(angiocatheter)の血液的合成実験結果を示したものである。
(a) 対照群カテーテル
(b) 疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたカテーテル
Claims (11)
- 合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体からなる群から選択される多重官能基を有する高分子の官能基にヘパリンが共有結合され、該高分子の他の官能基に疎水性物質が共有結合された疎水性ヘパリン結合体であって、
該疎水性物質は、前記高分子と結合した後の前記疎水性ヘパリン結合体の水に対する溶解度が１００ mg/ml 以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持つことを特徴とする、疎水性ヘパリン結合体。 - 前記合成高分子が、ポリジエン系(poly[dienes])、ポリアルケン系(poly[alkenes])、ポリアセチレン系(poly[acetylenes])、ポリアクリル酸(poly[acrylic acid])及びその誘導体、ポリα-置換アクリル酸(poly[α-substituted acrylic acid])及びその誘導体、ポリビニルエーテル系(poly[vinyl ethers])、ポリビニルアルコール系(poly[vinyl alchohol])、ポリビニルハライド系(poly[vinyl halides])、ポリスチレン(poly[styrene])及びその誘導体、ポリオキシド系(poly[oxides])、ポリエーテル系(poly[ethers])、ポリエステル系(poly[esters])、ポリカルボナート系(poly[carbonates])、ポリアミド系(poly[amides])、ポリアミノ酸系(poly[amino acids])、ポリウレア系(poly[ureas])、ポリウレタン系(poly[urethanes])、ポリイミン系(poly[imines])、ポリスルファイド系(poly[sulfides])、ポリホスファート系(poly[phosphates])、ポリシロキサン系(poly[siloxanes])、ポリシルセスキオキサン系(poly[silsesquioxanes])、ポリ複素環系(poly[heterocyclics])、セルロース(cellulose)及びその誘導体、及びこれらの共重合体または誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の疎水性ヘパリン結合体。
- 前記蛋白質が、プロタミン(protamine)、ポリリジン(polylysine)、ポリアスパラギン酸(polyaspartic acid)、ポリグルタミン酸(polyglutamic acid)及びこれらの誘導体または共重合体からなる群から選択される、請求項１に記載の疎水性ヘパリン結合体。
- 前記生体高分子が、多糖質(polysaccharide)、ゼラチン(gelatin)、コラーゲン(collagen)、アルギン酸塩 (alginate)、ヒアルロン酸(hyaluronic acid)、アルギン酸(alginic acid)、カラギナン(carrageenan)、コンドロイチン(chondroitin)、ペクチン(pectin)、キトサン(chitosan)及びこれらの誘導体または共重合体からなる群から選択される、請求項１に記載の疎水性ヘパリン結合体。
- 前記疎水性物質が、オクタデシルアミン(octadecylamine, ODA)、アルカンアミン(alkanoic amine)、胆汁酸(bile acid)、ステロール(sterol)、アルカン酸(alkanoic acid)及びこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の疎水性ヘパリン結合体。
- 前記ヘパリンが、ヘパリン、組換えヘパリン(recombinant heparin)、ヘパリン誘導体(heparin derivative)及びヘパリン類似体(heparin analogue)からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の疎水性ヘパリン結合体。
- １) ヘパリンに合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合物からなる群から選択される多重官能基を有する高分子を結合させる段階、および
２）前記ヘパリンに結合された前記多重官能基を有する高分子の官能基に疎水性物質を結合させる段階を含む、請求項１に記載の疎水性ヘパリン結合体の製造方法であって、
前記疎水性物質は、前記疎水性ヘパリン結合体の水に対する溶解度が１００ mg/ml 以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持つ疎水性物質である、疎水性ヘパリン結合体の製造方法。 - 前記段階１の前記ヘパリンと前記多重官能基を有する高分子との結合が、ヒドロキシル基 (hydroxyl group)、カルボキシル基(carboxyl group)、アミン基、チオール基 (thio group)及びアジド基(azide group)からなる群から選択される反応基を利用した共有結合である、請求項７に記載の製造方法。
- 前記段階２の前記多重官能基を有する高分子と前記疎水性物質との結合が、ヒドロキシル基 (hydroxyl group)、カルボキシル基(carboxyl group)、アミン基、チオール基 (thio group)及びアジド基(azide group)からなる群から選択される反応基を利用した共有結合である、請求項７又は８に記載の製造方法。
- 前記段階１及び前記段階２の結合が、アミド結合(amide bond)、ウレタン結合(urethane bond)のような非分解性結合(non-degradable bond)及びエステル結合(ester bond)、アンハイドライド結合(anhydride bond)のような分解性結合(degradable bond)からなる群から選択される共有結合である、請求項７〜９のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項１の疎水性ヘパリン結合体を利用してすべての医療機器及び人工臓器の表面を改質する際に使用するコーティング剤。
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