KR100314496B1

KR100314496B1 - 항혈전성이 있는 헤파린 유도체, 그의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR100314496B1
Application number: KR1019990014003A
Authority: KR
Inventors: 변영로; 이용규
Original assignee: 윤동진; 주식회사 메디프렉스
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2001-11-22
Also published as: US20020013292A1; US6245753B1; US6589943B2; KR19990087944A

Abstract

본 발명은 항혈전 특성을 갖는 양친성 헤파린 유도체, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 환자의 치료에 주사용 항혈전제로 널리 사용되고 있는 헤파린에 소수성 개질물질을 공유결합시켜, 헤파린을 양친성화시킴으로써 유기용매에 대한 용해도를 증가시키거나, 위장막 흡수를 증가시킨 양친성 헤파린 유도체, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

본 발명에서는 이러한 양친성 헤파린 유도체를 제조하기 위하여, 인체에 영향을 주지 않는 소수성 개질물질을 헤파린과 화학적으로 공유결합시킨다.

이러한 헤파린 유도체는 혈액과 접촉하는 모든 의료기기 및 인공장기의 표면개질에 사용하는 서방형 항혈전제로 사용할 수 있고, 경구용 항혈전제로 사용할 수 있으며, 타약물의 경구투여를 가능케하는 경구용 약물전달매체로 사용할 수 있다.

Description

항혈전성이 있는 헤파린 유도체, 그의 제조방법 및 용도 {Non-thrombogenic heparin derivatives, process for preparation and use thereof}

본 명세서에서 사용되는 '양친성'이라는 용어는 소수성과 친수성의 양쪽 성질을 모두 가지는 것을 의미한다. 즉, 양친성 물질은 물에 용해되며, 동시에 물과 유기 용매의 혼합용매에도 용해되는 물질이다.

환자의 치료시 항혈전제로 널리 사용되고 있는 기존의 헤파린은 강한 친수성과 높은 음이온 밀도에 의하여 주사제로만 사용되어 왔다. 이러한 종래의 헤파린은 경구투여로 사용할 수 없기 때문에 환자들이 병원에 입원했을 때에만 사용할 수 있었을 뿐아니라, 헤파린을 정맥주사를 통해 계속적으로 환자에게 투여해야 했으므로 환자에게 고통을 주는 문제점이 있었다. 또한, 헤파린이 유기용매에 용해되지 못하므로 의료기기 및 인공장기의 항혈전성을 높이기 위한 표면개질에 있어서 복잡한 방법이 사용되어야 하는 문제점이 있었다.

따라서 헤파린을 개질시켜 양친성으로 하여 경구제제화 한다면, 환자가 주사투여로 인해 고통받는 것을 줄일 수 있을 뿐만아니라, 양친성화시키면 헤파린의 유기용매에 대한 용해도를 증가시킬 수 있으므로 헤파린을 여러 종류의 고분자 재료와 함께 녹여 헤파린을 혈액과 접촉하는 모든 의료기기 및 인공장기에 사용할 수 있어 이들 의료기기 및 인공장기의 사용시 헤파린의 정맥주사가 불필요하게 된다.

그래서 종래에도 상기한 바와 같은 문제점을 해결하려는 노력이 있었던 바, 리베라 등(Rivera TM, Leone-Bay A, Paton DR, Leipold FR, Oral delivery of heparin in combination with sodium N-[8-(2-hydroxybenzyl)amino]carpylate, Pharmaceutical Research, vol. 14, p1830-1834, 1997)은 N-[8-(2-하이드록시벤조일)아미노]카르필레이트를 헤파린과 혼합하는 제제를 사용하여 저분자량의 헤파린의 위장흡수를 높이는 방법을 제시하였다. 그러나, 이 경우에는 헤파린이 유도체로 합성된 것이 아니고 흡수 증강제와 물리적으로 혼합된 것이었다.

또한, 린하트 등(Jian Liu, Azra Pervin, Cidy M. Gallo, Umesh R. Desai, Conrneliu L. Van Gorp, and Robert J. Linhart, New approaches for the preparation of hydrophobic heparin derivatives, J. Pharm. Sci., 83(7), 1034-1039, 1994)은 알킬사슬을 헤파린 핵단백질부분의 아민그룹에 결합시켰다. 이때, 헤파린은 분자량이 백만 정도되는 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 비만세포 (mast cell)에서 생합성된 후, 조직 내에 존재하는 엔도글리큐로니다제 (endoglycuronidase)와 프로테아제(protease)에 의하여 분자량 5,000 내지 20,000 정도의 글리코아미노글리칸(glycoaminoglycan)으로 생성되며, 여기서 약 10 % 정도의 헤파린이 일부분에 핵단백질이라고 하는 단백질 그룹을 함유하고 있다. 한편 알킬사슬은 탄소수가 8, 10, 12 또는 18 로 각각 되어 있었다. 이들 헤파린의 경우 소수성 성질은 나타내었으나, 미약한 항혈전성도를 나타내었다.

그 외에 헤파린을 저분자량으로 분리한 후 이를 O-아실레이션(O-acylation)하여 소수화시키는 방법이 바르쥬 등(Barzu T, Desmouliere A, Herbert JM, Level M, Herault JP, Petitou M, Lormeay JC, gabbiani G, Pascal M, O-acylated heparin derivatives with low anticoagulant activity decrease proliferation and increase alpha-smooth muscle actin expression in cultured arterial smooth muscle cells, Eur. J. Pharmacol., 219,225-233, 1992)에 의해 시도되었으나, 소수화된 헤파린은 낮은 항혈전성도를 나타내었다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 소수성 개질물질을 헤파린과 공유결합시킨 양친성 헤파린 유도체, 그의 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 항혈전 특성을 갖는 양친성 헤파린 유도체를 제조하는데 있어서 헤파린의 작용기 중에서 아민그룹과 소수성 개질물질의 일정 작용기를 공유결합시켜, 헤파린의 항혈전성을 감소시키지 않으면서 반응을 유도하여 공유결합을 갖는 양친성 헤파린 유도체를 제공한다. 또한, 소수성 개질물질로서는 생체에 적용 가능한 물질을 사용할 수 있는 바, 바람직하게 담즙산, 스테롤 또는 알카노익산을 사용할 수 있다.

도 1 은 헤파린(a)과 DOCA-헤파린 유도체(b)의 적외선 분광분석 스펙트럼이다.

도 2a 는 개질되지 않은 헤파린의 역상 크로마토그래피이다.

도 2b 는 실시예 1 에서 제조된 DOCA(7%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2c 는 실시예 2 에서 제조된 DOCA(9.6%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2d 는 실시예 3 에서 제조된 DOCA(14%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2e 는 실시예 5 에서 제조된 DOCA(24%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2f 는 실시예 21 에서 제조된 콜레스테롤(10%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2g 는 실시예 25 에서 제조된 러릭산(7.56%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 2h 는 실시예 26 에서 제조된 팔미틱산(8.25%)-헤파린 유도체의 역상 크로마토그래피이다.

도 3 은 헤파린 유도체의 생화학적 활성도를 나타낸다 (■은 DOCA, ●은 콜레스테롤, ▼은 팔미틱산, ▲은 러릭산의 aPPT분석에 의한 결과이며, □은 DOCA, ○은 콜레스테롤, ▽은 팔미틱산, △은 러릭산의 FXa분석에 의한 결과이다).

도 4a 는 저분자량(평균 분자량 6,000) 헤파린의 경구투여 후 시간에 따른 aPTT측정치이다.

도 4b 는 실시예 6 에서 제조된 저분자량(평균 분자량 6,000) 헤파린 유도체의 경구투여 후 시간에 따른 aPTT측정치이다.

도 4c 는 실시예 5 에서 제조된 고분자량(평균 분자량 12,000) 헤파린 유도체의 경구투여 후 시간에 따른 aPTT측정치이다.

도 5 는 고분자에 봉입된 실시예 1 에서 제조된 헤파린 유도체의 시간에 따른 방출곡선이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 생체에 적용가능한 소수성 개질물질을 헤파린과 공유결합시킨 양친성 헤파린 유도체를 제공한다. 이때, 담즙산으로 헤파린 유도체를 합성하여 장막에서의 담즙산 흡수를 이용하여 헤파린 유도체의 위장막 흡수를 가능케하거나, 스테롤 또는 알카노익산을 소수성 개질물질로 사용하여 헤파린 유도체의 위장막 흡수나 소수성도의 변화를 유도할 수 있다.

원료물질인 헤파린으로는 분자량이 100 내지 1,000,000 범위에 있는 헤파린을 사용할 수 있고, 특히 분자량 1,000 내지 6,000의 저분자량 헤파린이나 분자량 6,000 내지 100,000 의 고분자량 헤파린을 모두 사용할 수 있다.

헤파린에 결합하는 소수성 개질물질로는 바람직하게, 담즙산, 스테롤 또는알카노익산 등이 사용될 수 있는 바:

담즙산, 예를 들어, 콜릭산 (cholic acid), 디옥시콜릭산 (deoxycholic acid), 케노디옥시콜릭산 (chenodeoxycholic acid), 리토콜릭산 (lithocholic acid), 우르소콜릭산 (ursocholic acid), 우르소디옥시콜릭산 (ursodeoxycholic acid), 이소우르소디옥시콜릭산 (isoursodeoxycholic acid), 라고디옥시콜릭산 (lagodeoxycholic acid), 글리코콜릭산 (glycocholic acid), 타우로콜릭산 (taurocholic acid), 글리코디옥시콜릭산 (glycodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜릭산 (glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜릭산 (dehydrocholic acid), 하이오콜릭산 (hyocholic acid), 하이오디옥시콜릭산 (hyodeoxycholic acid) 또는 이들의 혼합물이 사용되거나;

스테롤, 예를 들어, 콜레스타놀 (cholestanol), 코프로스타놀 (coprostanol), 콜레스테롤 (cholesterol), 에피콜레스테롤 (epicholesterol), 에르고스테롤 (ergosterol), 에르고칼시페롤 (ergocalciferol) 또는 이들의 혼합물 사용되거나;

긴 알킬사슬을 가진 알카노익산, 바람직하게 탄소수 4 내지 25개의 알카노익산, 보다 바람직하게 부티릭산, 발레릭산, 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산, 라우릭산, 미리스틱산, 팔미틱산, 스테아릭산 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

헤파린과 소수성 개질물질은 화학적 공유결합으로 결합되어 헤파린 유도체로 합성된다. 이때, 바람직하게 헤파린과 소수성 개질물질은 약 1:1 내지 1:1000 의 몰비로 공유결합될 수 있다.

상기와 같은 헤파린 유도체의 바람직한 예를 하기의 화학식 (1) 내지 (11)로 나타낼 수 있다:

상기식에서,

헤파린'은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내고,

소수성 개질물질'은 담즙산 또는 알카노익산에서 -COOH 를 제외한 부분을 나타내거나, 스테롤에서 -OH 를 제외한 부분을 나타내며,

n 은 1 내지 1000 을 나타낸다.

보다 바람직한 헤파린 유도체의 예는 담즙산, 콜레스테롤 및 알카노익산으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종의 소수성 개질물질이 헤파린과 공유결합된 화학식(1a)의 헤파린 유도체이다:

상기식에서,

헤파린′은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내고,

소수성 개질물질''은 담즙산 또는 알카노익산에서 -COOH 를 제외한 부분을 나타내거나, 콜레스테롤에서 -OH 를 제외한 부분을 나타내며,

n 은 1 내지 1000 을 나타낸다.

상기와 같은 헤파린 유도체는 헤파린에 소수성 개질물질을 공유결합시킴으로써 제조한다. 헤파린은 아민기 이외에 카르복실기, 설폰기, 및 하이드록실기 등의 음이온을 함유하고 있기 때문에 헤파린 유도체의 제조시 헤파린의 구조를 변경하면 생화학적 활성도(항혈전성도)가 감소한다. 이중에서 설폰기나 카르복실기를 치환하면 전혀 항혈전성이 나타나지 않는 반면에 아민기를 치환하면 항혈전성도가 95% 이상 유지되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에서는 항혈전성에 전혀 영향을 주지 않는 헤파린의 아민기와 소수성 개질물질의 일정 작용기를 이용하여 두 물질을 공유결합시키고자 하였다.

예를 들어, 담즙산, -OH 가 -COOH 로 전환된 콜레스테롤 또는 알카노익산을 소수성 개질물질로서 헤파린에 공유결합시키는 경우, 헤파린의 아민그룹과 공유결합시키기 전에 상기 소수성 개질물질의 카르복실 그룹을 먼저 활성화시킨 후 헤파린과 공유결합시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한 헤파린내의 아민기는 기능성 그룹의 약 7 %를 차지하고 있으므로 상기 소수성 개질물질의 카르복실그룹 활성화를 위하여 디사이클로헥실카르보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide : DCC)와 N-하이드록시숙시미드 (N-hydroxysuccimide : HOSu)를 이용하거나, 이소부틸클로로포르메이트 (isobutylchloroformate : IBCF) 또는 디카르보이미드 (dicarboiimide : EDC) 등을 이용할 수 있다. 한편, 콜레스테롤은 하이드록실 그룹만을 가지고 있으므로 클로로아세틱산, 숙신산 무수물 (succinic anhydride), 또는 에틸브로모아세테이트 (ethyl bromoacetate) 및 포타슘 t-부톡사이드 (potassium tert-butoxide) 등을 사용하는 방법으로 하이드록실기를 카르복실기로 전환시킨 다음 헤파린과 공유결합시킬 수 있다.

예를 들어, 담즙산, -OH 가 -COOH 로 전환된 콜레스테롤, 및 알카노익산으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종의 소수성 개질물질을 디사이클로헥실카르보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide : DCC) 및 N-하이드록시숙시미드 (N-hydroxysuccimide : HOSu)로 활성화시킨 후 헤파린과 공유결합시키는 방법을 구체적으로 설명하면, 상기 소수성 개질물질을 용매에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 용매에 용해시켜 이 두 용액을 혼합한 후, N-하이드록시숙시미드 (HOSu)를 용매에 녹인 것을 상기 용액에 가한 후, 상온에서 4 - 50 시간 반응시켜 생성된 디사이클로헥실우레아(DCU) 침전을 여과해낸 용액을 냉각건조시킨 것(활성화된 소수성 개질물질의 용액)과 헤파린 용액을 상온에서 2 - 10 시간 반응시켜 양친성 헤파린 유도체를 제조할 수 있다.

상기에서, DCU 침전을 여과해낸 여액을 경우에 따라, 일정 용매로 재침전시켜 활성화된 소수성 개질물질 침전물을 얻어, 이를 헤파린 용액과 반응시킬 수도 있다.

이러한 양친성 헤파린 유도체 제조방법의 예를 하기 반응식 1, 2 및 3 에 나타내었다.

반응식 1: 담즙산의 일종인 디옥시콜릭산 (deoxycholic acid : DOCA)을 헤파린에 공유결합시킨 DOCA-헤파린 유도체의 제조방법

반응식 2 :스테롤의 일종인 콜레스테롤을 헤파린에 공유결합시킨 콜레스테롤-헤파린 유도체의 제조방법

반응식 3: 알카노익산-헤파린 유도체의 제조방법

상기 반응식에서,

DOCA′는 디옥시콜릭산(deoxycholic acid: DOCA)에서 -COOH를 제외한 부분을 나타내고,

헤파린′은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내며,

콜레스테롤′은 콜레스테롤에서 -OH를 제외한 부분을 나타내고,

알카노익산′은 알카노익산에서 -COOH를 제외한 부분을 나타내며,

DCC는 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)를 나타내고,

HOSu는 N-하이드록시숙시미드(N-hydroxysuccimide)를 나타내며,

DCU는 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 나타낸다.

상기 반응식 1 에서는 대표적인 담즙산인 DOCA를 사용하여, 개질된 헤파린 유도체를 제조하는 방법을 나타내었는데, 이의 바람직한 실시태양을 나타내면 다음과 같다. 우선 담즙산 0.1 - 1몰을 용매 [예: 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO) 등] 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC) 0.1 - 2몰을 용매에 용해시킨 후, 상기 용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu) 0.1 - 2몰을 용매에 녹인 후, 상기 용액에 가한다. 상온에서 4 - 50 시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU)가 형성되어 침전되며, 이를 걸러낸 용액을 냉각건조시킨 후, 헤파린 용액과 상온에서 2 - 10 시간 반응시키면 개질된 양친성 헤파린 유도체가 얻어진다. 이때, 최종생성물에는 불순물, 즉 미반응된 DOCA, DCC, HOSu등이 잔류할 수 있는데, 이러한 불순물은 물에 침전시켜 투석을 이용하여 목적 생성물과 분리시킬 수 있다.

상기 반응식 2 에서는 콜레스테롤을 사용하여 개질된 헤파린 유도체를 제조하는 방법을 나타내었는데, 콜레스테롤의 하이드록실기를 카르복실기로 전환시킨 후 반응시킨다는 것을 제외하고는 담즙산을 사용한 방법과 유사한 방법으로 콜레스테롤-헤파린 유도체를 제조할 수 있는 바, 이의 바람직한 실시태양을 나타내면 다음과 같다. 전술한 바와 같이 콜레스테롤의 구조중에 하이드록실기를 헤파린과 결합할 수 있는 관능기로 전환시키기 위하여 클로로아세틱산, 숙신산무수물 (succinic anhydride), 또는 에틸브로모아세테이트 및 포타슘 t-부톡사이드 (BrCH₂COOC₂H₅/t-BuOK) 등과 같은 물질을 이용하여 콜레스테롤의 하이드록실기를 카르복실기로 전환시키게 되는데, 이때, 예를 들어, 100 mg 의 콜레스테롤을 10 - 50 mg 의 클로로아세틱산과 상온에서 5 - 20 시간 반응시켜서 전환된 콜레스테롤을 얻는다. 전환된 콜레스테롤 0.1 - 1 몰을 용매 [예: 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO) 등] 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 0.1 - 2 몰을 용매에 용해시킨 후, 상기용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu) 0.1 - 2 몰을 용매에 녹인 후 상기용액에 가한다. 상온에서 4 - 50 시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아(DCU)가 형성되어 침전되며, 이를 걸러낸 용액을 냉각건조시킨 후, 헤파린 용액과 상온에서 2 - 10 시간 반응시키면 개질된 양친성 헤파린 유도체가 얻어진다. 후처리 과정은 담즙산을 사용한 경우와 유사하게 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

상기 반응식 3 에서는 알카노익산을 사용하여, 개질된 헤파린 유도체를 제조하는 방법을 나타내었는데, 담즙산을 사용한 방법과 유사한 방법으로 알카노익산-헤파린 유도체를 제조할 수 있는 바, 이의 바람직한 실시태양을 나타내면 다음과 같다. 알카노익산 0.1 - 1 몰을 용매 [예 : 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO) 등] 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 0.1 - 2 몰을 용매에 용해시킨 후, 상기용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드(HOSu) 0.1 - 2 몰을 용매에 녹인 후, 상기 용액에 가한다. 상온에서 4 - 50 시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아(DCU)가 형성되어 침전되며, 이를 걸러낸 용액을 냉각건조시킨 후, 헤파린 용액과 상온에서 2 - 10 시간 반응시키면 개질된 양친성 헤파린 유도체가 얻어진다. 후처리 과정은 담즙산을 사용한 경우와 유사하게 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

이와 같이 개질된 헤파린 유도체는 약제학적 유효량의 헤파린 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물용으로 사용할 수 있는 바, 특히 경구용 항혈전제로 사용할 수 있고, 경구용 약물전달매체로 사용할 수도 있으며, 또한 유기용매에 녹으므로 용매증발법을 이용하여 의료기기 및 인공장기의 표면을 개질하여 항혈전성을 높이기 위한 표면개질제로서의 서방형 항혈전제로 사용할 수 있다.

양친성화된 헤파린 유도체를 경구용 항혈전제로 사용할 때에는, 통상적인 약제학적 담체와 함께 제조된 정제, 용액제, 현탁액제, 분제 또는 산제 등의 제제형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 헤파린 유도체를 용액제로 경구투여할 때에는 카르보네이트 완충액에 1mg/3㎖ 내지 100mg/3㎖의 농도로 용해시킨 용액을 체중1kg당 0.1㎖ 내지 10㎖ 씩 경구투여할 수 있다.

양친성화된 헤파린 유도체를 경구용 약물전달매체로 사용할 때에는, 활성 성 분으로 사용되는 약물 1 mg 당 헤파린 유도체 0.01 내지 10 mg 을 다른 통상적인 약제학적 담체와 함께 사용하게 된다. 투여량은 활성 성분으로서 사용되는 약물의 종류 및 양에 따라 달라지게 된다.

한편, 인체삽입용 의료기기 및 인공장기의 혈전형성 억제를 위하여 양친성화된 헤파린 유도체가 함유된 고분자 피막을 제조하여 의료기기 및 인공장기의 표면개질제로서의 서방형 항혈전제로 사용할 수 있는 바, 예를 들어, 헤파린 유도체를 신장 투석기, 심장 폐 산소공급장치, 심혈관 연결관등의 의료장비에 대한 코팅물질로 사용할 수 있다. 헤파린 유도체는 고분자 피막에서 장시간 동안 서서히 방출되어 나옴으로써 혈전형성을 억제하는 기능을 나타낼 수 있는 것이다. 고분자 피막 제조시, 헤파린의 양친성 유도체와, 예를 들어, 폴리에틸렌(PEG)-폴리카프로락탐(PCL)의 블록 공중합체를 아세톤과 물의 50 : 50 혼합용액에 녹인 후 상온 건조하여 피막을 제조할 수 있다. 여기에서, 고분자 물질로는 아세톤과 물의 혼합용액(부피비로 30:70 내지 70:30) 또는 알콜과 물의 혼합용액(부피비로 30:70 내지 70:30)에 용해되는 모든 고분자 물질을 사용할 수 있다. 양친성 헤파린 유도체의 고분자 물질에 대한 혼합비율은 바람직하게 중량비로 1% 내지 30 % 이다. 상기와 같은 표면개질제를 의료기기 및 인공장기의 표면에 피복시킬 때, 피복 두께는 일반적으로 0.001 mm 내지 1 mm 로 하지만, 두께의 제한은 없다.

이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명의범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에서는 헤파린 유도체 합성의 예를 기술하고 있는데, 이와 같이 제조된 헤파린 유도체의 합성여부를 확인하기 위하여, 적외선 분광분석 스펙트럼 (FT-IR), 핵자기공명분석(NMR)등을 이용한다.

시험예에서는 헤파린 유도체내의 소수성물질의 함량을 조사하기 위해 빛산란장치로 분자량을 측정하고, 양친성화된 헤파린의 물리적 특성을 파악하기 위해서 역상 크로마토그래피에 의한 분석을 행하며, 유기용매에서의 용해도를 측정한다. 또한 양친성 헤파린의 생화학적 활성도(항혈전성도)를 확인하기 위하여 aPTT(activated partial thromboplastin time)와 크로모제닉(chromogenic) 분석(Factor Xa 분석)을 행한다. 그리고, 제조된 양친성 헤파린 유도체에 대해서 쥐를 이용한 동물실험에서 경구로 일정량을 투여한 후, 위장막 흡수를 분석하여 경구투여시 항혈전효과를 분석한다. 한편 임상증상과 함께 부검을 통하여 조직에 대한 이상반응을 확인한다. 또한 고분자 매체와 혼합하여 용매증발법으로 표면개질을 시도하고 표면에서의 헤파린 유도체의 방출특성을 분석하여 표면개질에 의한 항혈전성을 분석한다.

실시예 :

실시예 1 내지 5

디옥시콜릭산 (DOCA: deoxycholic acid) 0.5 몰을 디메틸포름아미드 (DMF:dimethylformamide) 5 ㎖에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC:dicyclohexylcarbodiimide) 0.8 몰을 DMF 5 ㎖에 용해시킨 후, 상기 용액을혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu:N-hydroxysuccimide) 0.8 몰을 DMF 5 ㎖에 녹인 후 서서히 상기 용액에 가했다. 상온에서 10시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU:dicyclohexylurea)가 형성되어 침전되며, 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터에 걸러낸 후, 여액을 냉동건조시켜 얻어진 활성화된 디옥시콜릭산 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 후, 상온에서 평균 분자량이 12,000인 고분자량의 헤파린 용액과 4 시간 동안 반응시켰다. 상기에서 활성화된 디옥시콜릭산과 헤파린을 반응시킬 때, 5 ㎖ 의 증류수에 헤파린 일정량을 용해시켜 활성화된 디옥시콜릭산과 반응시켰다. 반응몰비는 헤파린:DOCA 가 1:6, 1:16, 1:60, 1:85 및 1:200이 되도록하였는 바, DMF 5㎖에 활성화된 디옥시콜릭산 100mg 을 용해시킨 용액과 증류수 5㎖에 헤파린을 각각 400mg, 150mg, 40mg, 30mg 및 13mg씩 용해시킨 용액을 반응시켰다. 이를 하기 표 1 에 정리하였다.

실시예 번호	헤파린:DOCA 몰비	헤파린 용액의 사용량(헤파린mg/증류수㎖)	활성화된 DOCA 용액의사용량(활성화된DOCAmg/DMF㎖)
실시예 1	1:6	400mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 2	1:16	150mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 3	1:60	40mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 4	1:85	30mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 5	1:200	13mg/5㎖	100mg/5㎖

각각의 생성물은 셀룰로우즈 투석막(mwco 3,500)으로 투석한 후, 냉동건조하여 각각 335mg, 132.6mg, 32mg, 25.3mg 및 8.4mg의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 얻었다.

실시예 5 에서 제조된 DOCA-헤파린 유도체를 적외선 분광분석 스펙트럼(FT-IR)과 핵자기공명장치(NMR)에 의해 분석하였다. 도 1 에 나타낸 바와 같이 적외선 분광분석 스펙트럼(FT-IR)에 의해 헤파린 내의 아미드결합 생성을 확인할 수 있었으며, 이는 헤파린과 소수성 물질이 결합된 헤파린 유도체가 생성되었음을 나타낸다. 이러한 적외선 분광분석 스펙트럼에 있어서, 헤파린과 소수성 물질사이의 아미드결합 생성이 도 1(a) 1,585 ㎝^-1에서의 흡수파장으로 나타났으며, 아미드결합에서 소수성물질의 C = O 이중결합이 도 1(b) 1,720 ㎝^-1에서의 흡수파장으로 나타났다.¹H-핵자기공명(NMR) 분석 결과를 살펴보면, DOCA-헤파린 유도체의 흡수파장은 δ7.58(아미드 결합의 수소원자), δ5.5 (글루코스아민 2,6-디설페이트), δ5.35 (글루코스아민 2-설페이트의 수소-1), δ5.2(아이듀오릭산 2-설페이트의 수소-1)이었으며,¹³C-핵자기공명분석에서는 178 ppm 근처에서 새로운 아미드 결합의 피크가 나타났다.

실시예 6

평균 분자량이 6,000인 저분자량 헤파린을 사용한 것, 및 헤파린:DOCA의 반응몰비가 1:200이 되도록 하기 위해 헤파린 7mg을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 활성화된 DOCA 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 용액을 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 1 의 방법과 유사한 방법으로, 7.5mg의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 수득했다.

실시예 7 내지 11

디옥시콜릭산(DOCA: deoxycholic acid) 0.5 몰을 디메틸포름아미드 (DMF:dimethylformamide) 5 ㎖ 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC:dicyclohexylcarbodiimide) 0.8몰을 DMF 5 ㎖에 용해시킨 후, 상기용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu:N-hydroxysuccimide) 0.8몰을 DMF 5 ㎖에 녹인 후 서서히 상기 용액에 가했다. 상온에서 10 시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU:dicyclohexylurea)가 형성되어 침전되는데, 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 걸러냈다. 여액을 헥산으로 추출하고 DMF 용액을 상온에서 증발시켰다. 생성물을 이소부탄올과 아세토니트릴 (acetonitrile)의 혼합용액으로 재침전시킨 후 침전물인 활성화된 디옥시콜릭산을 얻었다. 활성화된 디옥시콜릭산 100mg 을 DMF 5㎖에 녹인 후, 상온에서 평균 분자량이 12,000인 고분자량의 헤파린 용액과 4 시간 동안 반응시켰다. 상기에서 활성화된 디옥시콜릭산과 헤파린을 반응시킬 때, 5㎖의 증류수에 헤파린 일정량을 용해시켜 활성화된 디옥시콜릭산과 반응시켰다. 반응몰비는 헤파린:DOCA 가 1:6, 1:16, 1:60, 1:85 및 1:200이 되도록하였는 바, DMF 5㎖에 활성화된 디옥시콜릭산 100mg 을 용해시킨 용액과 증류수 5㎖에 헤파린을 각각 400mg, 150mg, 40mg, 30mg 및 13mg씩 용해시킨 용액을 반응시켰다. 이를 하기 표 2 에 정리하였다.

실시예 번호	헤파린:DOCA 몰비	헤파린 용액의 사용량(헤파린mg/증류수㎖)	활성화된 DOCA 용액의 사용량(활성화된DOCAmg/DMF㎖)
실시예 7	1:6	400mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 8	1:16	150mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 9	1:60	40mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 10	1:85	30mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 11	1:200	13mg/5㎖	100mg/5㎖

각각의 생성물을 물에 침전시켜 셀룰로우즈 투석막(mwco 3,500)으로 투석한 후, 냉동건조하여 각각 329mg, 128.4mg, 31.4mg, 24.3mg 및 7.2mg 의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 얻었다.

실시예 12

평균 분자량이 6,000인 저분자량 헤파린을 사용한 것, 및 헤파린:DOCA의 반응몰비가 1:200이 되도록하기 위해 헤파린 7mg 을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 활성화된 DOCA 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 용액을 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 7 의 방법과 유사한 방법으로, 7.1mg의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 수득했다.

실시예 13 내지 17

디옥시콜릭산(DOCA: deoxycholic acid) 0.5 몰을 디메틸포름아미드 (DMF:dimethylformamide) 5 ㎖ 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC:dicyclohexylcarbodiimide) 0.8 몰을 DMF 5 ㎖에 용해시킨 후, 상기용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu:N-hydroxysuccimide) 0.8 몰을 DMF 5 ㎖에 녹인 후 서서히 상기용액에 가했다. 상온에서 48시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU:dicyclohexylurea)가 형성되어 침전되는데, 이를 0.45 ㎛ 멤브레인 필터에 걸러냈다. 여액을 헥산으로 추출하고 DMF 용액을 상온에서 증발시켰다. 생성물을 아세토니트릴 (acetonitrile)로 재침전시켜, 침전물을 걸른 후, 건조하여활성화된 디옥시콜릭산을 얻었다. 활성화된 디옥시콜릭산 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 후, 상온에서 평균 분자량이 12,000인 고분자량의 헤파린 용액과 4 시간 동안 반응시켰다. 상기에서 활성화된 디옥시콜릭산과 헤파린을 반응시킬 때, 5㎖의 증류수에 헤파린 일정량을 용해시켜 활성화된 디옥시콜릭산과 반응시켰다. 반응몰비는 헤파린:DOCA 가 1:6, 1:16, 1:60, 1:85 및 1:200이 되도록하였는 바, DMF 5㎖에 활성화된 디옥시콜릭산 100mg을 용해시킨 용액과 증류수 5㎖에 헤파린을 각각 400mg, 150mg, 40mg, 30mg 및 13mg씩 용해시킨 용액을 반응시켰다. 이를 하기 표 3 에 정리하였다.

실시예 번호	헤파린:DOCA 몰비	헤파린 용액의 사용량(헤파린mg/증류수㎖)	활성화된 DOCA 용액의사용량(활성화된DOCAmg/DMF㎖)
실시예 13	1:6	400mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 14	1:16	150mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 15	1:60	40mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 16	1:85	30mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 17	1:200	13mg/5㎖	100mg/5㎖

각각의 생성물을 물에 침전시켜 셀룰로우즈 투석막(mwco 3,500)으로 투석한 후, 냉동건조하여 각각 332mg, 130.4mg, 30.4mg, 20mg 및 7.2mg의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 얻었다.

실시예 18

평균 분자량이 6,000인 저분자량 헤파린을 사용한 것, 및 헤파린:DOCA의 반응몰비가 1:200이 되도록하기 위해 헤파린 7mg을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 활성화된 DOCA 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 용액을 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 13 의 방법과 유사한 방법으로, 7.1mg의 양친성 DOCA-헤파린 유도체를 수득했다.

실시예 19 내지 23

콜레스테롤의 구조중에 하이드록실기를 헤파린과 결합할 수 있는 관능기로 전환시키기 위하여 클로로아세틱산의 카르복실기를 이용하여 하이드록실기를 카르복실기로 전환시켰다. 즉, 200 mg 의 콜레스테롤과 40 mg 의 클로로아세틱산을 상온에서 10시간 반응시켜 전환된 콜레스테롤을 얻었다. 전환된 콜레스테롤 0.5몰을 디메틸포름아미드 (DMF: dimethylformamide) 5 ㎖ 에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC: dicyclohexylcarbodiimide) 0.8몰을 DMF 5 ㎖ 에 용해시킨 후, 상기 용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu: N-hydroxysuccimide) 0.8몰을 DMF 5㎖에 녹인 후, 서서히 상기 용액에 가했다. 상온에서 10 시간동안 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU: dicyclohexylurea)가 형성되어 침전되며, 이를 0.45㎛ 멤브레인 필터에 걸러낸 후, 여액을 냉동건조시켜 얻어진 활성화된 콜레스테롤 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 후, 상온에서 평균 분자량이 12,000인 고분자량의 헤파린 용액과 4시간 동안 반응시켰다. 상기에서 활성화된 콜레스테롤과 헤파린을 반응시킬 때, 5㎖의 증류수에 헤파린 일정량을 용해시켜 활성화된 콜레스테롤과 반응시켰다. 반응 몰비는 헤파린:콜레스테롤이 1:6, 1:16, 1:60, 1:85 및 1:200 이 되도록 하였는 바, DMF 5㎖에 활성화된 콜레스테롤 100mg을 용해시킨 용액과 증류수 5㎖에 헤파린을 각각 400mg, 150mg, 40mg, 30mg 및 13mg씩 용해시킨용액을 반응시켰다. 이를 하기 표 4 에 정리하였다.

실시예 번호	헤파린:콜레스테롤몰비	헤파린 용액의 사용량(헤파린mg/증류수㎖)	활성화된 콜레스테롤용액의 사용량(활성화된콜레스테롤mg/DMF㎖)
실시예 19	1:6	400mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 20	1:16	150mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 21	1:60	40mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 22	1:85	30mg/5㎖	100mg/5㎖
실시예 23	1:200	13mg/5㎖	100mg/5㎖

각각의 생성물을 셀룰로우즈 투석막(mwco 3,500)으로 투석한 후, 냉동건조하여 각각 313mg, 120mg, 26.7mg, 15mg 및 7.3mg의 양친성 콜레스테롤-헤파린 유도체를 얻었다.

실시예 23 에서 제조된 헤파린 유도체를 핵자기공명장치(NMR)에 의해 분석하였는 바,¹H-핵자기 공명분석에 있어서, 콜레스테롤-헤파린 유도체의 콜레스테롤 흡수파장은 δ0.69(3H 18-H₃), 0.7∼2.40(28H, 콜레스테롤 1-H₂, 4-H₂, 7-H₂, 8-H₁,9-H₁, 11-H₂, 14-H₁, 15-H₂, 16-H₂, 17-H₁, 20-H₁, 22-H₂, 23-H₂, 24-H₂및 25-H₁), δ1.02(3H, 19H-H₃), δ3.5(1H, 3-H₁), δ5.36(1H, 6-H₁)이었고, 헤파린의 흡수파장은 δ7.58(아미드 결합의 수소원자), δ5.5(글루코스아민 2,6-디설페이트), δ5.35(글루코스아민 2-설페이트의 수소-1), δ5.2(아이듀오릭산 2-설페이트의 수소-1) 이었다.

실시예 24

평균 분자량이 6,000인 저분자량 헤파린을 사용한 것, 및 헤파린:콜레스테롤의 반응몰비가 1:200이 되도록하기 위해 헤파린 7mg 을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 활성화된 콜레스테롤 100mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 용액을 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 19 의 방법과 유사한 방법으로, 7.3mg의 양친성 콜레스테롤-헤파린 유도체를 수득했다.

실시예 25

러릭산(lauric acid, 분자량: 200.32)을 사용하여 실시예 1 과 유사한 방법으로 헤파린 유도체를 제조하였다. 즉, 러릭산 0.5몰을 디메틸포름아미드 (DMF: dimethylformamide) 5㎖에 용해시키고, 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC: dicyclohexylcarbodiimide) 0.8몰을 DMF 5㎖에 용해시킨 후, 상기 용액을 혼합하고, N-하이드록시숙시미드 (HOSu: N-hydroxysuccimide) 0.8몰을 DMF 5㎖에 녹인 후, 서서히 상기 용액에 가했다. 상온에서 10시간 반응시키면 디사이클로헥실우레아 (DCU; dicyclohexylurea)가 형성되어 침전되며, 이를 0.45㎛ 멤브레인 필터에 걸러낸 후, 여액을 냉동건조시켜 얻어진 활성화된 러릭산 200mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 후, 상온에서 평균 분자량이 12,000인 고분자량의 헤파린 200mg을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 4시간 동안 반응(헤파린:러릭산 반응몰비=1:60)시켜, 136mg의 양친성 러릭산-헤파린 유도체를 수득하였다.

상기와 같이 제조된 헤파린 유도체를 핵자기공명장치(NMR)에 의해 분석하였는 바, 본 실시예에 의한 러릭산-헤파린 유도체의¹H-핵자기 공명분석 결과는 실시예 23 의 콜레스테롤-헤파린 유도체의 분석 결과와 동일하게 나타났다.

실시예 26

팔미틱산(palmitic acid, 분자량: 256.43)을 사용한 것, 및 헤파린:팔미틱산의 반응몰비가 1:60이 되도록하기 위해 헤파린 156mg 을 증류수 5㎖에 용해시킨 용액과 활성화된 팔미틱산 200mg을 DMF 5㎖에 용해시킨 용액을 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 25 의 방법과 유사한 방법으로, 140mg의 양친성 팔미틱산-헤파린 유도체를 수득했다.

시험예 :

시험예 1: 소수성물질의 함량

실시예 1 내지 5, 실시예 19 내지 23, 실시예 25 및 실시예 26에서 합성된 헤파린 유도체 중의 소수성물질의 함량은 빛 산란장치(light scattering)에 의해서 절대분자량을 측정함으로써 결정되었다. 이 장치는 488 nm의 아르곤이온 레이저를 이용한 장치이며, Malvern Intruments Ltd,(시리즈 4700)에서 구매하였다. 먼저 헤파린과 양친성 헤파린 유도체들을 각각 4가지 농도 (1.25, 2.5, 5 및 10 ㎎/㎖)로 물 또는 물과 메탄올 용매를 사용하여 만들었다. 이렇게 만든 농도들은 산란되는 세기를 측정하기 위해서 40 °에서 140 ° 까지 각도를 바꾸면서 10 번씩 빛의 세기를 측정함으로써 분자량을 자동으로 계산하였다. 이렇게 측정된 헤파린의 분자량과 양친성헤파린 유도체들의 분자량을 비교함으로써 소수성 물질의 함량을 얻었다. 하기 표 5a 내지 5c 에 헤파린 유도체의 수득률과 초기반응비율에 따른 소수성물질의 함량변화 분석 결과를 나타내었다.

실시예 번호	초기 반응 몰비(헤파린:DOCA)	헤파린 유도체의 분자량	헤파린 유도체중의 DOCA 함량(중량%)	생성물의 수득률(%)
실시예 1	1:6	13357	7.0	77
실시예 2	1:16	13706	9.6	74.8
실시예 3	1:60	14403	14.0	71.8
실시예 4	1:85	14759	16.0	72.9
실시예 5	1:200	16320	24.0	73

실시예 번호	초기 반응 몰비(헤파린:콜레스테롤)	헤파린 유도체의 분자량	헤파린 유도체중의콜레스테롤함량(중량%)	생성물의 수득률(%)
실시예 19	1:6	13151	5.8	77
실시예 20	1:16	13288	6.8	78
실시예 21	1:60	13791	10.0	74
실시에 22	1:85	14077	12.0	72.9
실시예 23	1:200	15500	20.0	73

실시예 번호	초기 반응 몰비(헤파린:알카노익산)	헤파린 유도체의 분자량	헤파린 유도체중의 알카노익산함량(중량%)	생성물의 수득률(%)
실시예 25	헤파린:러릭산(1:60)	13400	7.56	76
실시예 26	헤파린:팔미틱산(1:60)	13500	8.25	77

상기 표 5a 내지 5c 에서 분자량은 빛 산란 장치에 의해 측정된 값이며, 분자량의 측정으로 헤파린 유도체내에 소수성 물질이 얼마나 함유되어 있는지를 확인할 수 있었다. 헤파린은 분자량 측정결과 12,386 달톤이 나왔고, 예를 들어 헤파린과 DOCA를 1 : 200의 몰비로 반응시킬 경우, 생성된 헤파린 유도체의 분자량이 16,320 으로 나타나, 헤파린 유도체 중에 24 중량%의 DOCA를 함유함을 알 수 있었다. 또한, 상기 표에서 알 수 있는 바와 같이 헤파린과 콜레스테롤을 1 : 6 내지 1 : 200 의 몰비로 반응시킬 경우 수득율은 73 내지 78 % 로 나타났다. 그러나 헤파린 유도체중의 콜레스테롤 함량은 같은 조건에서 DOCA-헤파린 유도체 의 DOCA 양보다 적게 함유되어 있는 것으로 나타났다. 헤파린과 알카노익산의 반응에서는 서로 같은 반응비율에서 비슷한 수득율을 나타냄을 알 수 있었다.

시험예 2 : 헤파린 유도체의 소수성 정도

Pharmacia Hepar Co(Franklin OH)으로부터 구입한 페닐-세파로스 CL-4B는 실시예 1 내지 5 에서 제조된 DOCA-헤파린 유도체, 실시예 19 내지 23 에서 제조된 콜레스테롤-헤파린 유도체, 실시예 25 에서 제조된 러릭산-헤파린 유도체 및 실시예 26 에서 제조된 팔미틱산-헤파린 유도체의 소수성 정도를 확인하는데 사용되었다. 칼럼(HR 16/30 I.D.)은 10 배의 물로 세척한 후 50 mM 포스페이트완충액 (PBS: phosphate buffer solution) (pH 7.0) 및 1.7 M 암모늄설페이트 (ammonium sulfate) 를 함유한 PBS 완충액으로 각각 20분씩 평형화시켰다. 이와 같이 충전된 칼럼은 역상크로마토그래피의 원리를 이용한 것이며, 특히, 암모늄설페이트는 헤파린의 소수성 정도를 확인하는데 가장 적절한 용액이다.

소수성의 차이를 확인하기 위하여 동일한 PBS 완충액을 이용하여 각각의 상품화된 헤파린과 합성된 양친성 헤파린 (5㎎/5㎖)을 용해시켜 칼럼으로 투입시켰다. 이때의 유속은 1㎖/min 이며 농도구배는 처음 20 분 동안에는 친수성 성질을 가진 순수 PBS 완충액으로, 그 다음 60 분 동안은 암모늄설페이트를 농도구배로 걸어주면서 샘플의 소수성 정도를 분석하였다. 이렇게 유출된 용액을 분율수집장치 (fraction collector)에 의해 2 ㎖ 씩 시험관 튜브에 받았으며, 이 용액에 헤파린 존재유무와 농도를 확인할 수 있는 아주르(azure) A(농도: 0.01㎎/㎖)염색용액을 첨가하였다. 1 분 정도 반응시킨 후 UV스펙트로미터장치에 의해서 500 nm 흡수파장으로부터 양친성 헤파린의 양을 계산하였던 바, 개질되지 않은 헤파린의 피크는 단지 친수성 용매인 PBS 완충액에서만 나타났고, 양친성화된 헤파린은 소수성 용매인 암모늄설페이트농도구배에서만 피크가 나타났다. 소수성 개질물질로 양친성화시킨 물질들의 피크들을 살펴보면 소수성 개질물질의 양에 따라 또는 소수성 개질물질의 종류에 따라 피크의 양상이 다르게 나타났다. 즉 실시예 5 에서 제조된 소수성 물질인 DOCA 양이 24 % 인 헤파린 유도체의 경우에는 상대적으로 피크가 균등하게 나왔고, 낮은 농도의 암모늄설페이트 영역에서는 비교적 낮은 양의 DOCA-헤파린 유도체가 검출되었다. 실시예 25 에서 제조된 러릭산-헤파린 유도체나 실시예 26 에서 제조된 팔미틱산-헤파린 유도체가 가장 균일한 피크 양상을 보여주었다. 반면에 실시예 21 에서 제조된 콜레스테롤-헤파린 유도체와 실시예 2 에서 제조된 DOCA-헤파린 유도체의 경우에는 비교적 넓은 소수성 분포를 보였다.

상기 분석결과를 도 2a 내지 2h 에 나타내었는 바, 개질되지 않은 헤파린의 역상크로마토그래피 분석결과를 도 2a 에 나타냈으며, 실시예 1, 2, 3 및 5 에서 제조된 DOCA-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과를 각각 도 2b, 2c, 2d 및 2e 에 나타내었고, 실시예 21 에서 제조된 콜레스테롤-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과를 도 2f 에 나타내었으며, 실시예 25 및 26 에서 제조된 러릭산-헤파린 유도체 및 팔미틱산-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과를 각각 도 2g 및 2h에 나타내었다. 즉, 도 2b 는 DOCA (7%)-헤파린 유도체의 역상크로마토그래피 분석결과이고, 도 2c 는 DOCA (9.6%)-헤파린 유도체의 역상크로마토그래피 분석결과이며, 도 2d 는 DOCA(14%)-헤파린 유도체의 역상크로마토그래피 분석결과이고, 도 2e 는 DOCA(24%)-헤파린 유도체의 역상크로마토그래피 분석결과이며, 도 2f 는 콜레스테롤(10%)-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과이고, 도 2g 는 러릭산(7.56%)-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과이며, 도 2h 는 팔미틱산 (8.25%)-헤파린 유도체 의 역상크로마토그래피 분석결과이다.

시험예 3 : 헤파린 유도체의 용해도

실시예 1 내지 5 에서 제조된 양친성 헤파린 유도체는 물에 45 ㎎/㎖ 까지의 용해도를 나타내었으며, 물과 아세톤의 혼합용액에서도 40 ㎎/㎖ 의 높은 용해도를 나타내었다. 그러나 아세톤의 순수용액에는 용해되지 않았다. 한편 상기 양친성 헤파린 유도체는 에틸알콜과 물의 혼합용액에 대해서도 물과 아세톤의 혼합용액과 동일한 결과를 나타내었다.

실시예 19 내지 23, 25 및 26 에서 제조된 헤파린 유도체도 상기와 비슷한 용해도를 나타내었다.

하기 표 6 은 DOCA-헤파린 유도체와 헤파린을 사용하여 아세톤 또는 아세톤-물 용매에서의 용해도를 측정한 실험결과이다. 먼저 용해도를 측정하기 위해 농도는 1 중량/부피% 로 정하였다. 약 2 일간 진탕하여 염색용액으로 헤파린 및 헤파린 유도체의 용해정도를 측정한 결과, 헤파린은 순수한 물에만 녹는 반면, 실시예 1 및 3 에서 제조된 7 % 및 14 % 의 DOCA를 함유하고 있는 헤파린 유도체는 50 : 50 의 물-아세톤 용매에 까지 용해되었고, 실시예 5 에서 제조된 24 % 의 DOCA를 함유하고 있는 DOCA-헤파린 유도체의 경우에는 최대 30 : 70의 물-아세톤 용매에 까지도 잘 용해되었다.

DOCA-헤파린 유도체에서 DOCA의 함량에 따른 용해도의 차이

물: 아세톤(부피비 %)	헤파린	실시예1에서 제조된 DOCA(7 %)-헤파린 유도체	실시예3에서 제조된 DOCA(14 %)-헤파린 유도체	실시예5에서 제조된 DOCA(24 %)-헤파린 유도체
100 : 0	○	○	○	○
70 : 30	×	○	○	○
50 : 50	×	○	○	○
30 : 70	×	×	×	○
0 : 100	×	×	×	×

○ : 잘녹음, × : 녹지않음

시험예 4 : 생화학적 활성도 시험 (항혈전성도 시험)

실시예 1 내지 5, 실시예 19 내지 23, 실시예 25 및 26 에서 제조된 헤파린 유도체의 생화학적 활성도는 aPTT와 크로모제닉 분석(Factor Xa)방법에 의해 결정되었다. aPTT 분석방법은 혈액응고반응에서 혈전요소의 결핍을 조사하거나 헤파린의 반응을 조사하는데 적절한 방법으로 정확도가 상당히 우수하다. 혈소판이 최대로 제거된 혈장(PPP:platelet poor plasma) 을 한국적십자 혈액원에서 구매하여, 이를 37 ℃에서 숙성시킨 후 0.1 ㎖ 의 aPTT 용액을 신속하게 PPP 용액에 가하고 2 분간 반응시킨 후 0.1 ㎖의 칼슘클로라이드를 반응용액에 가했다. 이때 칼슘클로라이드를 가한후 피브린 덩어리가 생기는 시간을 피브린응고 측정장치(fibrometer)에 의해 기록했다. 크로모제닉 분석 (Factor Xa 분석)은 헤파린이 안티트롬빈 (antithrombin) Ⅲ 와 결합하여 팩터 Xa (Factor Xa)를 억제하는 효과를 이용하는 것으로 분석절차는 Sigma Co.에서 제공된 설명서에 따라 분석하였다. 그 결과, 실시예 1 내지 5, 실시예 19 내지 23, 실시예 25 및 26 에서 제조된 모든 헤파린 유도체들은 헤파린과 비교하여 70 % 이상의 생화학적 활성도를 나타냈고, 또한 소수성 개질 물질에 관계없이 대부분이 비슷한 활성도를 나타냈다. 실시예 1 에서 제조된 7 % 정도의 DOCA를 함유하고 있는 헤파린 유도체는 aPTT에서는 93 % , FXa분석에서는 80 % 의 높은 생화학적 활성도를 나타낸 반면에,실시예 5 에서 제조된 24 % DOCA를 함유한 소수성 헤파린은 70 % 정도의 생화학적 활성도를 보였다. 헤파린 유도체 중의 소수성 물질의 양에 따른 상대적 생화학적 활성도를 도 3 에 나타내었다.

시험예 5 : 헤파린 유도체의 위장막 흡수 시험

실시예 5 및 실시예 6 에서 제조된 디옥시콜릭산과 헤파린의 양친성 유도체의 위장막 흡수 시험은 300 그램의 쥐를 사용하여 실시했다. 쥐를 1 일 동안 금식시킨 후, 에테르로 마취시킨 후, 주사기로 헤파린 유도체를 경구투여했다. 헤파린 유도체 용액은 50 mg 의 헤파린 유도체를 3㎖ 의 카르보네이트 완충액에 녹여 준비했다. 상기의 헤파린 유도체 용액 3㎖ 를 경구투여한 후 매시간 마다 눈에서 0.5㎖ 씩 혈액을 체취한 후 10,000 rpm 에서 1 분간 원심분리하여 혈장 샘플을 취했다. 혈장 샘플은 aPTT 방법에 의하여 혈액의 응고 활성도를 분석했다. aPPT 방법에 의해 피브린응고장치(Fibrometer)에 혈장 샘플 0.1 ㎖ 를 넣고 액틴(actin) 0.1㎖, CaCl₂0.1 ㎖ 와 혼합하여 피브린 응고가 생기는 시간을 기계적으로 측정했다.

실시예 6 에서 평균분자량 6,000의 저분자량 헤파린과 DOCA를 1:200의 몰비로 반응시켜 제조한 양친성 헤파린 유도체를 300 그람의 쥐에 경구투여 한 후 체취한 혈액을 aPTT 분석방법을 이용하여 양친성 헤파린의 위장막 흡수량을 분석하였는 바, 실시예 6 에서 제조된 저분자량 헤파린 유도체는 투여 후 4 시간에서 최대치의 aPTT를 나타내었으며, 평균분자량 6,000의 저분자량 헤파린과 비교하여 7 배이상의 높은 값을 나타내었다. 또한 상기 헤파린 유도체는 8 시간 내지 10 시간의 혈중내 잔류 시간을 나타내었다.

실시예 5 에서 평균분자량 12,000의 고분자량 헤파린과 DOCA를 1:200의 몰비로 반응시켜 제조한 고분자량 헤파린 유도체에 대하여 상기와 동일한 시험을 하였으며, 최대치의 aPTT는 경구투여 후 8 시간에서 나타났고, 평균분자량 6,000의 저분자량 헤파린과 비교하여 10 배 이상의 높은 흡수치를 나타내었다. 또한, 상기 헤파린 유도체의 혈중잔류시간은 12시간까지 지속되었다.

평균분자량이 6,000인 저분자량 헤파린의 경구투여 후 시간에 따른 aPTT 측정치를 도 4a 에 나타내었으며, 실시예 6 에서 제조된 헤파린 유도체의 경구투여 후 시간에 따른 aPTT 측정치를 도 4b 에 나타내었고, 실시예 5 에서 제조된 헤파린 유도체의 경구투여 후 시간에 다른 aPTT 측정치를 도 4c 에 나타내었다.

시험예 6 : 헤파린 유도체의 독성시험

상기 시험예 5 의 시험과정에서 쥐 20마리에 대하여 임상증상을 관찰하였으나 입모, 활동성 감소 및 설사와 같은 이상증상이 전혀 나타나지 않았다. 또한 쥐를 해부하여 조직과 장기의 이상증상을 조사하였으나, 장기가 변색하였거나 수축하는 등의 이상증상이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 헤파린 유도체는 독성이 없는 것으로 판단되었다.

시험예 7 : 표면 개질제로서의 헤파린 유도체의 방출특성 분석

실시예 1 에서 제조된 디옥시콜릭산과 헤파린의 양친성 유도체를 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 폴리카프로락탐(PCL)의 블록 공중합체와 아세톤과 물의 50 : 50 혼합용액에 녹인 후 상온 건조하여 피막을 제조하였다. 헤파린 유도체의 공중합체에 대한 혼합비율을 중량비로 1 % 에서 30 % 까지 실시하였다.

상기 헤파린 유도체의 고분자 필름으로부터의 방출양상을 분석하였는 바, 헤파린 유도체는 45 일에 걸쳐 봉입량의 약 80 %가 1 차속도로 방출되어 나왔다. 고분자에 봉입된 헤파린 유도체의 시간에 따른 방출곡선을 도 5 에 나타내었다. 도 5 에는 헤파린 유도체의 공중합체에 대한 혼합비율이 5 중량%, 10 중량%, 20 중량% 및 30 중량% 인 경우의 방출곡선을 나타내었다.

시험예 8

실시예 19 에서 제조된 콜레스테롤-헤파린 유도체 및 실시예 26 에서 제조된 팔미틱산-헤파린 유도체 경우의 방출속도도 상기 시험예 7 의 결과와 동일하게 나타났다.

본 발명의 개질된 헤파린 유도체는 양친성 헤파린 유도체로 제조되는 데, 이렇게 제조된 헤파린 유도체는 상기한 시험예 3, 4 에서 확인할 수 있는 바와 같이 유기용매에 대한 용해도와 항혈전성이 우수하고, 시험예 7 에서 확인할 수 있는 바와 같이 고분자 필름으로부터 서서히 방출되어 나오므로 혈액과 접촉하는 모든 의료기기 및 인공장기의 표면개질에 사용하는 서방형 항혈전제로 이용될 수 있다. 또한, 상기한 시험예 5 에서 확인할 수 있는 바와 같이 위장막에서의 흡수도가 높아 경구용 항혈전제로 사용할 수 있으며, 타약물의 경구투여를 가능케하는 경구용 약물전달매체로 사용할 수 있다.

Claims

헤파린에 담즙산, 스테롤 및 알카노익산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종인 소수성 개질물질이 공유결합된 헤파린 유도체.
제 1 항에 있어서, 헤파린이 분자량 100 내지 1,000,000 범위의 헤파린임을 특징으로 하는 헤파린 유도체.
제 1 항에 있어서, 소수성 개질물질이 콜릭산 (cholic acid), 디옥시콜릭산 (deoxycholic acid), 케노디옥시콜릭산 (chenodeoxycholic acid), 리토콜릭산 (lithocholic acid), 우르소콜릭산 (ursocholic acid), 우르소디옥시콜릭산 (ursodeoxycholic acid), 이소우르소디옥시콜릭산 (isoursodeoxycholic acid), 라고디옥시콜릭산 (lagodeoxycholic acid), 글리코콜릭산 (glycocholic acid), 타우로콜릭산 (taurocholic acid), 글리코디옥시콜릭산 (glycodeoxycholic acid), 글리코케노디옥시콜릭산 (glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜릭산 (dehydrocholic acid), 하이오콜릭산 (hyocholic acid), 하이오디옥시콜릭산 (hyodeoxycholic acid) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 담즙산인 헤파린 유도체.
제 1 항에 있어서, 소수성 개질물질이 콜레스타놀 (cholestanol), 코프로스타놀 (coprostanol), 콜레스테롤 (cholesterol), 에피콜레스테롤 (epicholesterol), 에르고스테롤 (ergosterol), 에르고칼시페롤 (ergocalciferol) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 스테롤인 헤파린 유도체.
제 1 항에 있어서, 소수성 개질물질이 탄소수 4 내지 25개의 알카노익산인 헤파린 유도체.
제 6 항에 있어서, 알카노익산이 부티릭산, 발레릭산, 카프로익산, 카프릴릭산, 카프릭산, 라우릭산, 미리스틱산, 팔미틱산, 스테아릭산 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 1 종인 헤파린 유도체.
제 1 항에 있어서, 헤파린 및 소수성 개질물질이 1:1 내지 1:1000의 몰비로 공유결합된 헤파린 유도체.
제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 헤파린 유도체가 화학식(1) 내지 화학식(11)로 구성되는 군으로부터 선택된 1 종인 헤파린 유도체:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

상기식에서,

헤파린'은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내고,

소수성 개질물질'은 담즙산 또는 알카노익산에서 -COOH 를 제외한 부분을 나타내거나, 스테롤에서 -OH 를 제외한 부분을 나타내며,

n 은 1 내지 1000 을 나타낸다.
제 9 항에 있어서, 화학식(1a)의 헤파린 유도체:

[화학식 1a]

상기식에서,

헤파린′은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내고,

소수성 개질물질''은 담즙산 또는 알카노익산에서 -COOH 를 제외한 부분을 나타내거나, 콜레스테롤에서 -OH 를 제외한 부분을 나타내며,

n 은 1 내지 1000 을 나타낸다.
헤파린에 소수성 개질물질을 공유결합시켜 헤파린 유도체를 제조하는 방법.
제 11 항에 있어서, 담즙산, -OH가 -COOH로 전환된 콜레스테롤 및 알카노익산으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종의 소수성 개질물질을 헤파린과 공유결합시켜 화학식(1a)의 헤파린 유도체를 제조하는 방법:

[화학식 1a]

상기식에서,

헤파린′은 헤파린에서 -NH₂를 제외한 부분을 나타내고,

소수성 개질물질''은 담즙산 또는 알카노익산에서 -COOH 를 제외한 부분을 나타내거나, 콜레스테롤에서 -OH 를 제외한 부분을 나타내며,

n 은 1 내지 1000 을 나타낸다.
제 12 항에 있어서, 담즙산, -OH가 -COOH로 전환된 콜레스테롤 및 알카노익산으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종의 소수성 개질물질을 디사이클로헥실카르보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide : DCC) 및 N-하이드록시숙시미드 (N-hydroxysuccimide : HOSu), 이소부틸클로로포르메이트 (isobutylchloroformate : IBCF) 또는 디카르보이미드 (dicarboiimide : EDC)로 활성화시킨 후, 활성화된 소수성 개질물질을 헤파린에 공유결합시킴을 특징으로하여 화학식(1a)의 헤파린 유도체를 제조하는 방법.
제 12 항 또는 제 13항에 있어서, 콜레스테롤을 클로로아세틱산, 숙신산 무수물 (succinic anhydride), 또는 에틸브로모아세테이트 (ethyl bromoacetate) 및 포타슘 t-부톡사이드 (potassium tert-butoxide)와 반응시켜 콜레스테롤의 -OH를-COOH로 전환시킨 콜레스테롤을 헤파린에 공유결합시킴을 특징으로하여 화학식(1a)의 헤파린 유도체를 제조하는 방법.
제 1 항에서 청구된 헤파린 유도체를 유효성분으로 포함하는 경구용 항혈전용 약학적 조성물.
제 1 항에서 청구된 헤파린 유도체를 포함한 경구용 약물전달용 조성물.
제 1 항에서 청구된 헤파린 유도체를 고분자물질에 용해시킨 서방형 항혈전제를 의료기기 또는 인공장기의 표면 개질제로 사용하는 방법.