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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Heparinderivate gemäß den Patentansprüchen, die
im Vergleich zu unmodifiziertem Heparin eine erhöhte Hydrophobie aufweisen.
Die Erfindung betrifft somit amphiphile Heparinderivate, wobei die
biologische Wirksamkeit des Polysaccharids beibehalten wird. Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung solcher amphiphlen Heparinderivate
und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß den Patentansprüchen.
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Heparin
ist ein aus sulfatierten D-Glukosamin- und D-Glukuronsäureresten
bestehendes Polysaccharid. Auf Grund seiner zahlreichen ionisierberen
Sulfatgruppen besitzt Heparin eine starke elektronegative Ladung.
Zudem ist es eine relativ starke Säure, die leicht wasserläsliche Salze,
z.B. Heparinnatrium, bildet. Es kommt in den Mastzellen vor und kann
aus vielen Körperorganen,
insbesondere aus den Körperorganen
mit reichlich Mastzellen extrahiert werden. Leber und Lunge sind
besonders reich an Heparin. Das zirkulierende Blut enthält keine
Heparin, außer
nach einem totalen Zerreißen
der Mastzellen. Heparin spielt viele physiologische Rollen, wie Blutgerinnung,
Hemmung der glatten Muskelzellen-Proliferation und so weiter. Insbesondere
ist Heparin ein potentes Antikoagulanz, das stark mit Antithrombin
III unter Verhinderung der Bildung von Fibrin-Gerinnseln wechselwirkt.
In vivo sind die Anwendungen von Heparin allerdings sehr begrenzt.
Aufgrund seiner Hydrophilie und hohen negativen Ladung wird Heparin
vom GI-Takt, der Nasen- oder Mudschleimhaut und dergleichen nicht
effizient absorbiert. Darum bestehen die einzigen, klinisch angewandten
Wege der Verabreichung in der intravenösen und subkutanen Injektion.
Da Heparin in relativ wenigen Lösungsmitteln
löslich
ist, ist es zudem schwer zum Überziehen
von Oberflächen
medizinischer Vorrichtung oder in Abgabensystemen zu verwenden.
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Zur
Verbesserung der Eigenschaften von Heparin kuppelten R.J. Lindhardt
et al., 83 J. Pharm. Sci. 1034–1039
(1994), Lauryl(C12)- und Stearyl(C12)-Gruppen an einzelne Heparinketten und
erhielten ein derivatisiertes Heparin mit erhöhter Hydrophobie, jedoch mit
geringer antikoagulativer Wirkung. Dieses Ergebnis zeigte, dass
die Kupplung einer kleinen linearen aliphatischen Kette an Heparin zur
Verstärkung
der Hydrophobie von Heparin unter Bewahrung der Wirksamkeit unwirksam
war. Somit waren die bekannten Heparinderivate bisher zur Bewahrung
der antikoagulativen Wirksamkeit unwirksam.
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Rivera
et al., Oral Delivery of Heparin in Cobination with Sodium N-[8-(2-Hydroxybenzolyl)amonio]caprylate:
Pharmalogical Considerations, 14 Pharm. Res. 1830–1834 (1997),
offenbarten die Möglichkeit
der oralen Gabe von Heparin unter Verwendung eines Gemisches von
Heparin mit Natrium-N-[8-(2-hydroxybenzolyl)amino]caprylat.
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Dryjski
et al., Investigations on Plasma Activity of Low Molecular Weight
Heparin after Intravenous and Oral Administrations, 28 Br.J.Clin.Pharma.188–192 (1989),
beschrieben die Möglichkeit
der oralen Absorption von niedermolekularem Heparin, unter Verwendung
von Aktivierungsmitteln.
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Zur
Formulierung eines Heparin-Abgassystems wurden zwei grundlegende
Verfahren entwickelt. Ein Verfahren umfasst das Binden von Heparin über ionische
Bindungen an eine kationische Polymermatrix. Die Freisetzung von
Heparin wird über
einen Ionenaustauschmechanismus gesteuert. Ein weiteres Verfahren
umfasst disperses Heparin, wobei Heparin zuerst physikalisch mit
einem Polymeren ge mischt und sodann die Freisetzung von Heparin durch
Diffusion gesteuert wird. Das einfachste und wirksamste Verfahren
zur Herstellung einer sochen Heparinvorrichtung ist das Lösungsmittelgießen. Ein Lösungsmittelgießverfahren
kann allerdings nicht zur Herstellung der Heparinvorrichtung verwendet
werden, da Heparin nicht in dem zum Auflösen des Polymeren verwendeten
organischen Lösungsmittel
gelöst
wird. Wenn Heparinderivate mit erhöhter Hydrophobie unter Beibehaltung
der biologischen Wirksamkeit hergestellt werden könnten, dann
könnten die
Heparinderivate einfach durch ein Lösungsmittelgießverfahren
in einer Polymermatrix immobilisiert werden.
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In
Bezug auf das Vorgenannte ist einzusehen, dass die Entwicklung eines
hydrophoben Heparinderivates oder eines amphiphilen Heparinderivates
mit hoher biologischer Wirksamkeit ein deutlicher technischer Fortschritt
wäre. Ein
solches hydrophobes Heparinderivat könnte in einem kontrolliert
freisetzenden System zur oralen Verabreichung, oder zur Oberflächen-Modifikation
medizinischer Vorrichtungen zur Verbesserung der Biokompatibilität verwendet
werden. Ein soches Heparinderivat würde die medizinischen Anwendungen
von Heparin stark erweitern.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, amphiphile Heparinderivate
mit hoher biologischer Heparin-Wirksamkeit zu synthetisieren.
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht auch darin, ein hydrophobes Heparinderivat
bereitzustellen, das in einem Lösungsmittel
wie Aceton/Wasser sowie in Wasser löslich ist.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Heparinderivate bereitzustellen,
die für
ein kontrolliert freisetzendes System zur Verhinderung der Koagulation
an einer Oberfläche
eingesetzt werden können.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Heparinderivate
bereitzustellen, die aus dem GI-Trakt absorbiert werden können, was
die orale Abgabe zur Verhinderung der Blutgerinnung leichter macht.
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Noch
eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Heparingerivate,
enthaltend Heparin in Verbindung mit einer Gallensäure wie
Desoxycholsäure
oder Glykocholsäure
oder einem hydrophoben Mittel wie Cholesterin, bereitzustellen.
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Diese
und weitere Aufgaben können
unter Bereitstellung einer chemische Zusammensetzung, enthaltend
ein kovalent an Gallensäuren
oder Sterine gebundenes Heparin, erfüllt werden. Vorzugsweise besitzt
ein solches Heparin ein Molekulargewicht von etwa 200 bis 100000.
Bevorzugte Gallensäuren
umfassen Cholsäure,
Desoxycholsäure,
Chenodesoxycholsäure,
Lithocholsäure,
Ursocholsäure,
Ursodecoxycholsäure,
Isoursodesoxycholsäure,
Lagodesoxycholsäure,
Glykocholsäure,
Taurocholsäure,
Glykodesoxycholsäure,
Glykochenodesoxycholsäure, Dehydrocholsäure, Dehydrocholsäure, Hyocholsäure, Hyodesoxycholsäure und
Gemische davon. Bevorzugte Sterine umfassen Cholestanol, Coprostanol,
Cholesterin, Epicholesterin, Ergosterin, Ergosterin, Ergocalciferol
und Gemische davon.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung,
enthaltend eine pharmazeutisch wirksame Menge von (a) einer chemischen
Zusammensetzung, enthaltend ein kovalent an Gallensäuren oder
Sterinen gebundenes Heparin und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Der
pharmazeutisch verträgliche
Träger
kann ein oraler Arzneimittelträger,
ein verzögert
freisetzender Träger,
ein Träger
zur parenteralen Verabreichung und dergleichen sein. Bevorzugte
verzögert freisetzende
Träger
enthalten Polymermatrizes wie sie aus der Technik hinreichend bekannt
sind, einschließlich
von Gliedern, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Poly(ethylenoxid)-Poly(caprolacton)-Copolymeren,
Polyurethan-Polymeren, Silikon- Polymeren, Ethylen-Vinylacetat-Polymeren,
Hydrogelen, Collagen, Gelatine, und Gemische hiervon und dergleichen.
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Noch
ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Hemmung
der Blutgerinnung an medizinischen Vorrichtungen, die mit Blut in
Kontakt kommen, umfassend das Überziehen
der medizinischen Vorrichtung mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
enthaltend eine Polymermatrix, die innig mit einer chemischen Zusammensetzung vermischt
ist, die kovalent an Gallensäuren
oder Sterinen gebundenes Heparin enthält. Typischerweise wird die
medizinische Vorrichtung unter Anwendung einer Filmgießtechnik,
wie sie aus der Technik hinreichend bekannt ist, überzogen.
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Kurze Beschreibung
der verschiedenen Ansichten der Zeichnungen
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1 zeigt
die biologische Wirksamkeit von hydrophobem Heparin, wie bestimmt
durch APTT-(ausgefüllte
Symbole) und Chromogen (offene Symbole)-Test: ν und Desoxycholsäure (DOCA); • und O Cholesterin τ und ∇ Palmitinsäure; σ und | Laurinsäure.
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2 zeigt
die Gerinnungszeit als Funktion der Zeit bei oraler Verabreichung
von niedermolekularem Heparin-DOCA.
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3 zeigt
die Gerinnungszeit als Funktion der Zeit bei oraler Verabreichung
von hochmolekularem Heparin-DOCA.
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4 zeigt
die kumulative Heparin-DOCA-Konjugat-Freisetzung aus einer Poly(ethylenoxid)-Poly(ε-caprolacton)(PEO-PCL)-Polymermatrix als
Funktion der Zeit, Gew.-% Heparin-DOCA in der Polymermatrix: (∇) 5 % DOCA;
(O) 10 % DOCA; (|) 20 % DOCA; () 30 % DOCA.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Bevor
die vorliegende Zusammensetzung und die Verfahren zur Herstellung
und Verwendung hiervon offenbart und beschrieben werden, muss eingesehen
werden, dass diese Erfindung nicht auf die hier offenbarten bestimmten
Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien beschränkt ist,
da solche Konfigurationen, Verfahrensschritten und Materialien etwas
variieren können.
Es muss zudem eingesehen werden, dass die hier angewendete Terminalogie
nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen angewandt wird
und dass sie nicht einschränkend gedacht
ist, da der Umfang der Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche und
die Äquivalente
hiervon eingeschränkt
ist.
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Es
muss angemerkt werden, dass, wie in dieser Beschreibung und in den
beigefügten
Ansprüchen
angewandt, die Singular-Formen „ein" und „eine" und „das" den pluralen Bezug einschließt, wenn es
der Kontext nicht eindeutig anderweitig vorgibt. Somit umfasst beispielsweise „eine Gallensäure" ein Gemisch von
zwei oder mehreren solchen Gallensäuren, und „ein Sterin" umfasst ein Gemisch
von zwei oder mehreren Sterinen.
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In
der Beschreibung und den Ansprüchen der
Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den nachstehend aufgeführten Definitionen
angewandt.
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Wie
hier verwendet, bedeutet „Gallensäuren" natürliche und
synthetische Derivate des Steroid Cholansäure, einschließlich, ohne
Einschränkung, Cholsäure, Desoxcholsäure, Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursocholsäure, Ursodesoxycholsäure, Isoursodesoxycholsäure, Lagodesoxycholsäure, Glykocholsäure, Taurocholsäure, Glykodesoxycholsäure, Glykochenodesoxycholsäure, Dehydrocholsäure, Hyocholsäure, Hyodesoxycholsäure, und Gemische
hiervon und dergleichen.
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Wie
hier verwendet, bedeutet „Sterine" mit den Steroiden
strukturverwandte Alkohole, einschließlich, ohne Einschränkung, Cholestanol,
Coprostanol, Cholesterin, Epicholesterin, Ergosterin, Ergocalciferol,
und Gemische hiervon und dergleichen.
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Wie
hier verwendet, werden „hydrophobes Heparinderivat" und „amphiphiles
Heparinderivat" austauschbar
verwendet. Heparin ist eine sehr hydrophile Substanz. Die Erhöhung der
Hydrophobie von Heparin durch Binden an ein hydrophobes Mittel führt zu etwas,
was hier als amhiphiles Heparinderivat oder hydrophobes Heparinderivat
bezeichnet wird. Beide Begriffe werden als richtig angesehen, da das
Heparinderivat im Vergleich zu nativem Heparin eine erhöhte Hydrophobie
besitzt und das Heparinderivat einen hydrophilen Teil und einen
hydrophoben Teil aufweist und somit amphiphil ist.
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Es
hinreichend bekannt, dass Heparin als antithrombogenes Mittel zur
Verhinderung der Blutgerinnung eingesetzt wird. Heparin ist auf
Grund einer hohen Dichte von negativen Ladungen, wie sie von Sulfon-
und Carbonsäuregruppen
bereitgestellt werden, äußerst hydrophil.
Auf Grund dieser Hydrophilie wird Heparin in der Regel durch intravenöse oder
subkutane Injektion verabreicht. Hier werden Heparinderivate mit
leicht hydrophoben oder amphiphilen Eigenschaften und mit hoher
biologischer Wirksamkeit beschrieben. Gallensäuren, z.B. Desoxycholsäure (DOCA)
und Sterine, z.B. Cholesterin wurden mit Heparin gekuppelt. Sowohl
Desoxycholsäure als
auch Cholesterin sind nichttoxisch, da sie natürlich vorkommende, im Körper auftretende
Verbindungen sind. Die Amingruppen von Heparin wurden mit den Carbonsäuregruppen
der Hydrphoben Mittel gekuppelt. Die endständigen Carbonsäuregruppen
in DOCA, Laurinsäure
und Palmitinsäure
wurden direkt zur Kupplungsreaktion eingesetzt, während die
Hydroxygruppe von Cholesterin vor dem Kuppeln durch Reaktion mit
Chloressigsäure
aktiviert wurde. Es wurde festgestellt, dass die Konjuktion solcher
hydrophober Gruppierungen mit Aminogruppen von Heparin wenig oder
keine Auswirkung auf die biologische Wirksamkeit von Heparin besitzt.
Die Kupplung zwischen Heparin und Hydrophoben Mitteln wurde durch
Nachweis der Amidobindung durch FT-IR- und 13C-NMR-Analyse
bestätigt.
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Die
Ausbeute der Kupplungsreaktion betrug etwa 70 bis 80 % und wurde
durch Änderung
der hydrophoben Mittel oder der Ausgangs-Molverhältnisse nicht merklich verändert. Im
Falle des Heparin-DOCA-Konjugates war bei Erhöhung des Ausgangsverhältnisses
auch die Menge an DOCA in dem Konjugat erhöht. Die DOCA in Heparin:DOCA
betrug 24 Gew.-%, wenn das Ausgangs-Molverhältnis von Heparin:DOCA 1:200
betrug. Dieses Molverhältnis
war im Vergleich zu dem Verhältnis
von Amingruppen im Heparin zu DOCA sehr hoch. Darum wird dieses Ausgangsverhältnis als
DOCA-Überschußmenge angesehen.
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Die
erfindungsgemäßen hydrophoben
Heparinderivate besitzen viele medizinische Anwendungen. Beispielsweise
kann das hydrophobe Heparin oral verabreicht werden. Die orale Verabreichung
von Heparin kann die Anwendung von Heparin als orales Antikoagulanz
stark ausweiten. Das Heparinderivat wird mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger wie
er aus der Technik hinreichend bekannt ist formuliert. Zudem können beispielsweise
hydrophobe Heparinderivate als Überzugsmaterial
für medizinische Vorrichtungen
wie Katheter, Herz-Lungen-Maschienen, Herz-Lungen-Oxygenatoren,
Nieren-Dialysatoren, Stent- oder Ballon- Überzug zur Verhinderung einer
Rezidivstenose und dergleichen eingesetzt werden. Das hydrophobe
Heparinderivat wird typischerweise mit einem Träger vermischt und anschließend durch
eine Filmgießtechnik,
wie sie aus der Technik hinreichend bekannt ist, auf die Oberfläche der
medizinischen Vorrichtung aufgebracht.
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Es
wurde auch festgestellt, dass die Konjugate aus Heparin mit Gallensäuren oder
Sterinen nach der Modifikation bei der fast protein liquid chromatography
(FPLC®)
die Neigung zu hydrophoben Wechselwirkungen mit hydrophoben Medien
besitzen, wie durch Chromatographie über Phenyl Sepharose® (Elution
mit Ammoniumsulfatpuffer statt mit Phosphatpuffer) gezeigt. Diese
Heparinderivate zeigten im Vergleich zu unmodifiziertem Heparin
eine erhöhte
Bindungsaffinität.
Die erhöhte
Wechselwirkung der modifizierten Heparinderivaten mit Phenyl Sepharose® wird
seiner erhöhten
Hydrophobie zugeschrieben, das Ergebnis der vorhandenen hydro phoben
funktionellen Gruppen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass hydrophobes
Heparin durch Konjugation einer Gallensäure oder eines Sterins mit
Heparin erhalten werden kann. In den Löslichkeitstests waren polare
oder organische Lösungsmittel
zum Lösen
der Konjugate von Heparin-hydrophobem Mittel geeignet. Beispielsweise
zeigte das Heparin-Desoxycholsäure-Konjugat
in 65 %iger Acetonlösung
(35 % Wasser) eine gute Löslichkeit.
Schließlich
wurde festgestellt, dass die biologische Wirksamkeit von modifizierten
Heparinderivaten durch Konjugation mit hydrophoben Mitteln nicht
nennenswert beeinflusst wurde. Die Rolle eines hydrophoben, mit
Heparin konjugierten Mittels wurde bezüglich zweier biologischer Wirksamkeiten
von Heparin, wie bestimmt durch Antiloagulations- und Faktor Xa-Tests
studiert. Obwohl die Hydrophobie mit einer etwas verminderten antikoagulativen
und Antifaktor Xa-Wirksamkeit einhergeht, wurde die Abnahme in der
biologischen Wirksamkeit nicht als gravierend angesehen. Diese Ergebnisse
zeigen, dass die Blockierung der Amingruppen von Heparin wenig Auswirkung
auf seine biologische Wirksamkeit besitzt. Die biologische Wirksamkeit
von Heparin in den Konjugaten Heparin-hydrophobes Mittel zeigte
allerdings eine progressive Verminderung, wenn die Menge an hydrophobem Mittel
in dem Konjugat 20 Gew. % überschritt.
Bei weniger als 20 Gew. % an hydrophobem Mittel in den Konjugaten
lag die biologische Wirksamkeit der Konjugate bei über 80 %
der biologischen Wirksamkeit von unmodifiziertem Heparin. Die Vermutung
liegt nahe, dass 80 % der biologischen Wirksamkeit in hydrophobem
Heparin zur Aufrechterhaltung der biologischen Wirksamkeit bei medizinischen
Anwendungen ausreicht.
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Beispiel 1
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Synthese
von Heparin-DOCA-Konugaten. 5 ml N-hydroxysuccinimid (HOSu, 92 mg/ml)
in Dimethylformamid (DMF) wurden mit 5 ml Diciclohexylxarbodiimid
(DCC) (165 mg/5 ml) in DMF vermischt, und anschließend wurden
5 ml DOCA (196 mg/5 ml) in DMF zugesetzt. Da Molverhältnis von
DOCA, HOSu und DCC betrug 1:1,6:1,6. Die Konzentration von HOSu
und DCC waren etwas höher
als die Konzentration von DOCA, um die DOCA vollständig zu
aktivieren. Die resultie rende Lösung
wurde 5 h bei Raumtemperatur unter Vakuum umgesetzt. Anschließend wurde
das Nebenprodukt, Dicyclohexylharnstoff (DCU), das während der
Umsetzung ausfiel, entfernt. Das nicht umgesetzte DCC wurde durch
Zugabe von 1 Tropfen destilliertem Wasser und Filtration entfernt.
Das verbleibende HO-Su wurde durch Zugabe von 15 ml destilliertem
Wasser ebenfalls entfernt. Das aktivierte DOCA wurde ausgefällt und
anschließend
lyophilisiert. Anschließend
wurde das aktivierte DOCA in DMF gelöst und 4 h bei Raumtemperatur
mit Heparin umgesetzt. Die bei solchen Umsetzungen verwendeten Mengen
an Heparin betrugen 40 bis 400 mg. Nach der Umsetzung waren die beiden
Typen von Produkten folgende: ein wasserlösliches und ein wasserunlösliches
Produkt. Diese Produkte wurden durch Filtration über ein 0,45-μm-Membranfilter
getrennt, und das wasserunlösliche
Produkt wurde in einem Vakuumofen getrocknet. Das wasserlösliche Produkt
wurde 1 Tag unter Verwendung einer Membran (MWCO 3 500) gegen Wasser
dialysiert. Anschließend
wurde das Heparin-DOCA gefriergetrocknet.
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Die
nach dieser Verfahrensweise hergestellten Heparinderivate wurden
durch FT-IR und
NMR nach den aus der Technik hinreichend bekannte Verfahren zum
Beweis der erfolgreichen Kupplung zwischen Heparin und Hydrophobem
Mittel charakterisiert. Der Beweis für die Heparinderivate ist die
durch Kupplung einer Amingruppe des Heparins mit einer Carbonsäuregruppe
des hydrophoben Mittels erzeugte Amidbindung. Im FT-IR-Spektrum
wurde eine deutliche Änderung
des Spektrums im Bereich 1740 bis 1500 cm–1 festgestellt.
Eine intensive Bande wurde bei 1585 cm–1 beobachtet
und den Amidvibrationen zugeschrieben, die mit dem Vorliegen der
Amidbindung zwieschen Heparin und hydrophobem Mittel in Verbindung
stehen. Der Peak der N-H-Gruppe im Heparinteil des Heparinderivates
erschien bei etwa 3500 bzw. 1620 cm–1.
Das 13C-NMR-Spektrum des Heparin-DOCA-Konjugats zeigte
charakteristisch Absorptionspeaks bei δ 7,58 (Kohlenstoff in Aminbindung), δ 5,5 (H-1
von Glukosamin-2,6-disulfat), δ 5,35
(H-1 von Glukosamin-2-sulfat), δ 5,2
(H-1 von Iduronsäure-2-sulfat)-
Das 13C-NMR-Spektrum zeigte im Vergleich von Heparin-DOCA mit Heparin
unterschiedliche Peaks bei 178 ppm (Kohlenstoff in Aminbindung).
Diese Ergebnisse bestätigen
das Vorliegen einer Amidbindung im Heparin-DOCA-Konjugat, was die
Kupplung einer Amingruppe von Heparin an eine Carbonsäuregruppe
von DOCA zeigt.
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Beispiel 2
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Herstellung
von Heparin-Cholesterin-Konjugaten. Die Hydroxylgruppe von Cholesterin
wurde durch Umsetzung mit Chloressigsäure unter Erhalt einer freien
Carbonsäuregruppe
aktiviert. Das modifizierte Cholesterin wurde mit HOSu und DCC in
10 ml DMF umgesetzt. Das Molverhältnis
von Cholesterin, HOSu und DCC betrug 1:1,6:1,6, und die Umsetzung
erfolgte für
5 h lang bei Raumtemperatur. Zur Entfernung von nicht umgesetztem
DCC und HOSu wurde Wasser zugesetzt, und die Lösung wurde über eine 0,45-μ-Membran
filtriert. Als nächstes
wurde das aktivierte Cholesterin 5 h mit gelöstem Heparin umgesetzt. Zwei
Produkte, ein wasserlösliches
und ein wasserunlösliches
Produkt, wurden durch die Umsetzung erhalten. Diese Produkte wurden
nach den vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweisen
aufgearbeitet.
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Beispiel 3
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Löslichkeitstest
mit Heparin-DOCA-Konjugat. Heparin kann in relativ wenigen Lösungsmitteln wie
Wasser und Formamid gelöst
werden. Die erfindungsgemäßen Heparinderivate
besitzen leicht hydrophobe Eigenschaft, somit wurde vermutet, dass solche
Derivate in zusätzlichen
Lösungsmitteln
löslich
wären.
Dies wurde in dem vorliegenden Beispiel durch Überprüfung der Löslichkeit in Gemischen von Aceton
und Wasser als Lösungsmittel
getestet. Im Falle der Heparin-DOCA-Konjugate nahm die Löslichkeit des Konjugats in
dem Lösungsmittel
bei Zunahme von DOCA in Gew.-% zu. Bei 14 Gew.-% DOCA löste sich
das Heparin-DOCA-Konjugat
in 50:50 Aceton-Wasser, allerdings löste sich das Konjugat nicht
in 70:30 Aceton-Wasser. Bei 24 Gew.-% DOCA erhöhte sich die Löslichkeit
des Heparin-DOCA-Konjugats
in dem Lösungsmittel
bei Erhöhung des
Acetongehaltes des Lö sungsmittels.
Die Löslichkeit
von Heparin-DOCA (24 %) in dem Lösungsmittel war
bei einem Volumenverhältnis
von 50:50 Aceton-Wasser maximal.
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Beispiel 4
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Trennungsanalyse
von Heparin auf Phenol Sepharose CL-4B-Gel bei 4°C. Phenyl Sepharose® CL-4B
wurde zur Entfernung von nicht umgesetztem Heparin aus Heparin-DOCA,
Heparin-Cholesterin und Heparin-Alkansäure verwendet. Zusätzlich war es
zum Abschätzen
des Hydrophobiegrades in den Heparin-Kupplungsderivaten nützlich. Eine handelsübliche Heparinnatrium-Präparation
aus Rinderlunge (antikoagulative Wirksamkeit 140USP Einheiten(mg) wurde
von der Firma Pharmacia Hepar Co. (Franklin, Ohio) erhalten. Eine
Phenyl Sepharose CL-4B Gel-Säure wurde
von der Firma Pharmacia Biotech (Schweden) erhalten. Die Säule (HR
16/30 I.D.) wurde mit 10 Volumina Wasser gewaschen und anschließend vor
der Verwendung durch Waschen mit wenigstens 40 ml 50 mM Phosphatpuffer
pH 7,0 für
20 min und anschließend
mit 40 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0, erhaltend 1,7 M Ammoniumsulfat,
und anschließend
mit 40 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 equilibriert. Die Lösung von
Heparin (5 ml) und hydrophobem Heparin (5 mg) in demselben Phosphatpuffer
(5 ml) wurde auf die Säule
aufgegeben und mit dem Lösungsmittelgradienten
eluiert. Die Fließgeschwindigkeit
betrug 1 ml/min, und es wurden jeweils 2-ml-Fraktionen mit einem
Fraktionssammler gesammelt. Nach der Elution von der Säule wurde
die Säule zur
Entfernung von sämtlichem
Heparin oder sämtlichen
Heparin-DOCA-Konjugaten, die zurückgehalten
wurden, mit 100 ml Wasser und 1,7 M Ammoniumsulfat gewaschen, und
die gesammelten Fraktionen wurden mit Azure A (0.01 mg/ml) 1 min
lang gemischt. Jede Fraktion, die Heparin oder hydrophobes Heparin
enthielt, wurde durch spektrophotometrische Messung der Extinktion
bei 500 nm in einem Varian CARY 1E UV/VIS Spektralphotometer quantitativ
bestimmt.
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Die Änderung
in den Eluktionskurven von Heparin-DCA-Konjugaten bei FPLC für die verschiedenen
Kupplungsverhältnisse
zwischen Heparin und DOCA wurde er mittelt. Heparin wurde mit PBS
als Elutionsmittel, jedoch ohne Ammoniumsulfat, da Heparin sehr
hydrophil ist, eluiert. Heparin-DOCA-Konjugat wurde nicht mit PBS,
sondern mit Ammoniumsulfatlösung
eluiert. Wenn die Konzentration an Ammoniumsulfat in dem Elutionsmittel
zunahm, nahm auch die Hydrophobie der eluierten Heparin-Konjugate
zu. Das Heparin-DOCA-Konjugat wurde in 1,3 M Ammoniumsulfatlösung vollständig eluiert,
auch bei Zunahme des DOCA-Gehaltes.
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Beispiel 5
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Biologische
Wirksamkeit von Heparinderivaten. Die antikoagulative Wirksamkeit
modifizierter Heparinderivate wurde durch die aktivierte partielle Thromboplastinzeit
(APTT) bzw. den Faktor Xa-Chromogentest bestimmt. Die antithrombogene
Wirksamkeit der Heparinderivate wurde durch FXa-Chromogentest bzw.
APTT gemessen (1). Die biologische Wirksamkeit
von Heparin, das in diesen Experimenten verwendet wurde, besaß eine Potenz
von 140 Einheiten/mg. Die biologische Wirksamkeit sämtlicher,
in dieser Studie hergestellten Heparinderivate lag im Vergleich
zu der biologische Wirksamkeit von unmodifiziertem Heparin über 70 %.
Es bestand kein Unterschied in der biologischen Wirksamkeit der
Konjugate bezügliche
der zur Herstellung der Konjugate verwendeten hydrophoben Mittel.
Die biologische Wirksamkeit von Heparinderivaten nahm allerdings
mit zunehmenden Mengen an hydrophobem Mittel in den Konjugaten leicht
ab. Wenn ein Konjugat, das 7 Gew.-% DOCA enthielt, getestet wurde, betrug
die relative biologische Wirksamkeit des Heparin-DOCA-Konjugates
93 % gemäß APTT-Test, und
80 % gemäß FXa-Test.
Im Gegensatz dazu nahm beim Test eines Konjugats, das 24 Gew. % DOCA
enthielt, die relative biologische Wirksamkeit eines solchen Heparin-DOCA-Konjugates auf
71,5 % (APTT) bzw. 70,1 % (FXa-Test) ab.
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Beispiel 6
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Orale
Heparingabe. Sechs Ratten aus dem Tierheim des Korea Animal Centers
wurde 12 h vor der Dosierung kein Futter mehr verabreicht. Gruppen von
Ratten, die 250 – 300
g wogen, wurde eine orale Einmaldosis von Heparin, hochmolekularem
Heparin-DOCA oder niedermolekularem Heparin-DOCA verabreicht. Blutproben
(0,5 ml) wurden seriell in Kapillaren, die mit Heparin in einem
Gemisch mit 3,8 % Natriumcitrat überzogen
waren, gesammelt. Die Proben wurden vor der Verabreichung des Heparins oder
Heparinderivate und 10 h danach stündlich gesammelt. Das Plasma
wurde durch Zentrifugieren geerntet und unterhalb von –20°C tiefgefroren.
Die Plasma-Wirksamkeit von Heparin in jeder Probe wurde durch APTT-Tests
bestimmt. Der APTT-Biotest wurde nach der Verfahrensweise von Beispiel
5 durchgeführt.
Die Plasma-APTT-Einheiten wurden aus der mit einem Fibrometer gemessenen
Gerinnungszeit bestimmt.
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Bei
niedermolekularem Heparin-DOCA (2) trat
die maximale Gerinnungszeit 4° h
nach der oralen Verabreichung ein. Die Gerinnungszeit ging nach
10 h wieder auf den Ausgangswert zurück. Für das hochmolekulare Heparin-DOCA
(3) trat die maximale Gerinnungszeit 8 h nach der
oralen Verabreichung ein. Die Gerinnungszeit wurde nach 10 h bei über 20 min
gehalten. Das hochmolekulare Heparin-DOCA besaß eine höhere antikoagulative Wirksamkeit
als das niedermolekulare Heparin-DOCA.
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Beispiel 7
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Abgabegeschwindigkeit
von Heparinderivaten in vitro. Es wurden In-vitro-Studien durchgeführt, indem
zunächst
derivatisiertes Heparin in ein PEO/PCL-Multiblock-Copolymeres über Polyethylenscheiben
(2,22 cm Durchmesser) eingegossen wurde. PEO/PCL ist ein Multiblock-Copolymeres,
bestehend aus alternierenden Blöcken
von Poly(ethylenoxid) (MW etwa 2000) und Poly(ε-caprolacton)(MW etwa 2000),
wobei das Gesamtmolekulargewicht des Copolymeren etwa 30000 beträgt.
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Das
Heparinderivat wurde mit dem Polymeren vermischt, in Aceton/Wasser
gelöst,
auf die Polyethylenscheiben gegossen und sodann das Lösungsmittel
verdampft. Dann wurde die Unterseite der Scheiben am Boden eines
50-ml-Teströhrchens angebracht.
Jede Scheibe wurde in 20 ml PBS-Puffer (pH 7,4 I = 0,15) eingetraucht
und in regelloser Anordnung in einem Wasserbad auf einem Schüttler (Han
Beak Scientific Co. Korea) bei 37°C
und 80 U/min positioniert. Zu ausgewählten Zeiten, die so bestimmt
waren, dass die Heparinderivate-Konzentration in dem Abgabemedium
nicht über
10 % ihrer Sättigungslöslichkeit
bei 37°C
anstieg, wurden die Proben entnommen und nach dem Mischen mit Azure
A durch UV-Spektroskopie (530 nm) auf den Arzneimittelgehalt geprüft. Zu jeder
Probenentnahmezeit wurde das gesamte Abgabemedium entfernt und durch
frischen, vorgewärmten
PBS-Puffer ersetzt. Nach der Abgabestudie wurde die ursprüngliche Menge
an Heparinderivat in dem PEO/PCL-Multiblock-Copolymerfilm durch
Zusammenzählen
der kumulativen, während
40 Tagen abgegebenen Menge und der nach 40 Tagen in der Scheibe
verbliebenen Menge berechnet. Dies wurde mit der aus dem Arzneimittel-Eintrag berechneten
Ausgangsmenge verglichen. Die kumulative, abgegebene Menge an Heparinderivate
wurde gegen die Zeit aufgetragen, und der abgegebene prozentuale
Gehalt wurde zu statistischen Vergleichen eingesetzt, die durch
Varianzanalysemessungen durchgeführt
wurden.
-
Die
Heparinderivate wurden mit fast kontrollierter Freisetzungsgeschwindigkeit
mit einem leichten Bursteffekt aus der Polymermatrix freigesetzte Menge
betrug etwa 10 % der eingebrachten Arzneimittelmenge (4)