DE60125154T2

DE60125154T2 - Teildesulfatierte glykosaminoglykanderivate mit antiangiogenischer aktivität und ohne antikoagulierender wirkung

Info

Publication number: DE60125154T2
Application number: DE60125154T
Authority: DE
Inventors: Benito Casu; Giangiacomo Torri; Anna Maria Naggi; Giuseppe Giannini; Claudio Pisano; Sergio Penco
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: HK1051867A1; EP1268558B1; ITRM20000041A0; US8222231B2; CA2397964C; ITRM20000041A1; HUP0204196A2; MXPA02007195A; KR100812406B1; DE60125154D1; US20030013682A1; US20050107331A1; KR20020080381A; CN1396930A; PT1268558E; SK287566B6; JP2003523460A; CA2397964A1; CY1108001T1; SK10672002A3

Description

Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft teilentsulfatierte Glycosaminoglycanderivate, insbesondere Heparine, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung als Wirkbestandteile zur Herstellung von Medikamenten mit einer antiangiogenen Aktivität, insbesondere zur Behandlung von Tumoren wie z.B. metastatischer Formen, sowie die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Wirkbestandteile enthalten.
Stand der Technik
Das erste Molekül, das antiangiogene Aktivität besitzt, wurde von Henry Brem und Judah Folkman 1975 in Knorpeln entdeckt. Seitdem sind mehr als 300 neue Moleküle mit der Befähigung zur Inhibierung von Angiogenese entdeckt worden.
In den frühen 80er Jahren wurde mit dem Auffinden von Interferon(α/β) als Inhibitor einer Tumor-Angiogenese die klinische Versuchsphase auf der Grundlage dieses therapeutischen Lösungsansatzes eingeleitet.
Die Medien verursachten eine ziemliche Aufregung, als am 3. März 1998 die New York Times die Neuigkeit verbreitete, dass 2 Moleküle, Angiostatin und Endostatin, aufgefunden in J. Folkman's Laboratorien an der Harvard Medical School und am Children's Hospital in Boston, sehr ermutigende Ergebnisse im Kampf gegen Krebs lieferten. Der hohe Wirkungsgrad dieser beiden Moleküle zur Inhibierung der Angiogenese ließ die Suche nach neuen Verbindungen stark ansteigen. Derzeit gibt es ca. 30 Moleküle, die mit einer Antikrebs-Aktivität ausgestattet sind, über einen antiangiogenen Mechanismus wirken und bereits in die klinischen Versuchsstadien [Phasen I bis III] eingetreten sind, wobei nahezu die gleiche Zahl von Firmen und Institutionen beteiligt sind.
Allein in den Vereinigten Staaten wird geschätzt, dass es ca. 9 Millionen Patienten gibt, denen eine antiangiogene Therapie helfen könnte. Derzeit nehmen mindestens 4.000 Patienten an klinischen Versuchen mit dieser Therapie teil, ohne dass besondere unerwünschte Wirkungen registriert worden wären.
Innerhalb des Rahmens des allgemeinen Angiogenese-Konzepts sollte zwischen Vaskulogenese, d.h. der Bildung von Blutgefäßen während der embryonalen Entwicklung, und Angiogenese im strikten Begriffssinn unterschieden werden, welche die Bildung neuer Blutgefäße (Kapillaren) während des postnatalen Lebens, ausgehend von vor-existierenden Gefäßen, bedeutet. Die Bedeutung der Angiogenese für das Wachstum solider Tumoren ist umfänglich dokumentiert. Während der letzten drei Jahrzehnte ist berichtet worden, dass das Tumorwachstum sowie die Bildung von Metastasen strikt von der Entwicklung neuer Gefäße und der Befähigung zur Vaskularisierung (Gefäßbildung) der Tumormasse abhängen.
Die Inhibierung der Angiogenese unterliegt der Bildung nekrotischer Masse innerhalb des Tumors oder der Induktion von Apoptose in Tumorzellen.
Es bestehen ganz klare und eindeutige Unterschiede zwischen Neovaskularisation (Gefäßneubildungen) in normalem Gewebe und denjenigen in Tumorgewebe. Bei ersterer stellt das vaskuläre Endothelium ein ruhendes Gewebe mit einem sehr niedrigen mitotischen Index seiner Bestandteilszellen dar (mit einer in Hunderten von Tagen gemessenen Erneuerungszeit), und das vaskuläre Netzwerk ist regelmäßig, relativ einheitlich und geeignet zur angemessenen Versorgung aller Gewebe mit Sauerstoff, ohne jeden arteriovenösen Zusammenhang. Im Tumorgewebe gibt dagegen die Stimulation der Fortpflanzung der Endothelialzellen Anlass zu einem hohen mitotischen Index in den letzteren (mit einer mittleren Erneuerungszeit von 5 Tagen), die Neovaskularisation ist deutlich unregelmäßig mit Flächen von Einschlüssen, manchmal mit geschlossenen Endungen, mit arteriovenösen Kontakten an einigen Punkten, und schließlich weist die Basalmembran Lücken auf, was an einigen Punkten zu Gewebehypoxie führt. Diese Unterschiede bieten die Möglichkeit zur Identifizierung von Arzneimitteln, die eine Tumorgefäßneubildung selektiv blockieren.
In einem Tumor fällt die Neovaskularisation nicht immer mit einem präzisen Stadium der Tumorentwicklung zusammen; es gibt in der Tat Fälle, in denen die Angiogenese sogar vor der Entwicklung des Tumors beginnt (z.B. Karzinome des Gebärmutterhalses), wiederum andere, bei denen die 2 Phasen zusammenfallen (z.B. Karzinome der Blase und Brust) sowie weitere Fälle, bei denen die Angiogenese nach dem Neoplasma beginnt (z.B. Melanome und Eierstockkarzinome; siehe z.B. "Manual of Medical Oncology", IV. Ausgabe (1991), G.Bonadonna et al.).
Antiangiogene Therapie stellt zahlreiche Vorteile im Vergleich mit traditioneller Standard-Chemotherapie dar (Cancer Research 1998, 58, 1408-16):

a) Spezifität: ihr Ziel ist ein Prozess, d.h. die Tumorneovaskularisation;
b) Bioverfügbarkeit: ihr Ziel sind die Endothelialzellen, die ohne die Probleme traditioneller Chemotherapie erreicht werden können, wobei direkt auf die Tumorzellen eingewirkt wird;
c) Chemoresistenz: dies ist wahrscheinlich der wichtigste Vorteil dieser Therapie; tatsächlich ist es, da Endothelialzellen, nicht wie Tumorzellen, genetisch stabil sind, unwahrscheinlich, dass Arzneiresistenzphänomene auftreten;
d) metastatische Ausbreitung: Blockade der Neovaskularisation schränkt die Fortpflanzung der Tumorzellen zu weiteren Teilen des Körpers über den Blutstrom ein;
e) Apoptose: Blockade des Gefäßnetzwerkes im Tumor verringert die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Tumorzellen; Apoptose ist unter diesen Bedingungen begünstigt;
f) verringerte systemische Toxizität: toxische Effekte, wie Myelosuppression, gastrointestinale Effekte und temporärer Haarausfall, welche nahezu unabdingbar bei traditioneller Chemotherapie auftreten, werden bei antiangiogener Therapie nicht festgestellt.

Eine Anzahl molekularer Elemente ist dafür bekannt, an einer Tumorangiogenese beteiligt zu sein (Oncology 1997, 54, 177-84). Pro- und anti-angiogene endogene Faktoren sind dafür bekannt, am biologischen Regelmechanismus zur Bildung neuer Gefäße beteiligt zu sein.
Unter den angiogenen Stimulatoren sind zu nennen: Fibrolbast-Wachstumsfaktoren (FGF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Angiogenin, Transformierungswachstumsfaktor-α, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Plättchen-stämmiger Endothelialzellwachstumsfaktor, Transformierungswachstumsfaktor-β, ein in-vitro-Inhibitor, aber ein in-vivo-Stimulator, Plazentalwachstumsfaktor, Interleukin-8, Hepatozytwachstumsfaktor, Plättchen-stämmiger Wachstumsfaktor, Granulozytkolonie-Stimulierfaktoren, Proliferin, die Prostaglandine (PGE₁, PGE₂), GM1-GT1b, Substanz P, die Bradykinine und Stickoxid.
Dagegen schließen die Angiogenese-Inhibitoren ein: den löslichen Rezeptor von bFGF, die Interferone (α, β, γ), Angiostatin, Thrombospondin 1, Prolactin (16kDa-terminales Aminofragment), Plättchenfaktor 4 (PF4), die Gewebe-Metalloproteinase (TIMP)-Inhibitoren, plazentales Proliferin-bezogenes Peptid, Glioma-stämmigen Angiogenese-Inhibierungsfaktor, die angiostatischen Steroide, Knorpel-stämmigen Inhibitor (cartilage-derived inhibitor = CDI), die Heparinasen, Interleukin-12, Plasminogenaktivator-Inhibitor, die Retinoide, Endostatin, Angiopoietin-2, Genistein, Stickoxid und GM3.
Die Integrine stellen eine große Familie von Transmembranproteinen dar, die Wechselwirkungen von Zelle-zu-Zelle und von Zelle-zu-extrazellulärer Matrix vermitteln. Alle Integrine sind befähigt, die gemeine Peptidsequenz Arg-Gly-Asp ("universelle Zellerkennungsstelle") zu erkennen, obwohl jedes Integrin vorrangig eine unterschiedliche Konformation dieses Tripeptids erkennt. Die Inhibierung spezifischer Subtypen von Integrinen kann pharmakologisch im Hinblick auf die Entwicklung von Angiogenese-Inhibitoren ebenfalls sehr interessant sein.
Auch die Steuerung von Protein-Kinase-C (PK-C) kann eine Regulierung der Angiogenese ermöglichen. Es gibt in der Tat klassische PK-C-Inhibitoren mit der Befähigung, Angiogenese vollständig oder teilweise zu blockieren.
Trotz enormer Investitionen und der Einschaltung zahlreicher institutioneller und privater Forschungszentren ist das Krebsproblem immer noch weit davon entfernt, abschließend und endgültig gelöst zu sein. Obwohl sich die Prognose für Krebsopfer verbessert hat, bei Überlebensraten, die in den letzten 30 Jahren im Durchschnitt von 30 auf 50 % angestiegen sind, und obwohl die genetischen, zellulären und biochemischen Mechanismen, die an der Entwicklung eines Tumors beteiligt sind, nun gut bekannt sind, stellen die Chancen, diesen Typ eines Leidens zu besiegen oder zumindest einzuschränken, immer noch ein schmerzlich wahrgenommenes Problem dar, und viele Aspekte sind nach wie vor ungelöst, wie die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens, einer vollständigen Ausrottung und einer metastatischen Ausbreitung des Primärtumors.
Seit den späten 70er Jahren, als die Beobachtungen von Folkman durch die internationale wissenschaftliche Gemeinschaft nach und nach bestätigt wurden, sind Hunderte von mit antiangiogener Aktivität ausgestatteten Molekülen aus natürlichen Quellen (Pflanzen, Fungi, biologischen Flüssigkeiten) isoliert und im Labor synthetisiert worden.
Eine Anzahl von Arzneien befindet sich bereits in Phase III, wie Marimastat (British Biotech.), 1'AG3340 (Prinomast-Agouron) und Neovastat (Aeterna), die alle hauptsächlich auf der Ebene der Lunge (SNCL) mit einem Mechanismus unter Interferenz mit den Metalloproteinasen wirken. Ebenfalls in Phase III befinden sich RhuMad-VEGF (dies ist ein anti-VEGF-Antikörper von Genetech) und Interferon-α (kommerziell), die gegen solide Tumoren dank deren Interferenz mit pro-angiogenen Wachstumsfaktoren wirksam sind, oder TNP-470 (TAP Pharm.), das direkt auf die Endothelialzellen einwirkt.
Schließlich sind Arzneimittel wie CAI (NCI) und IM862 (Cytran) als antiangiogene Mittel wirksam, allerdings mit einem nicht-spezifischen und kaum verstandenen Mechanismus.
Diese oben genannten Arzneimittel können in einigen Jahren Teil des therapeutischen Rüstzeugs des Onkologen werden, es gibt aber auch weitere Moleküle, die erst kürzlich in klinische Versuchsreihen der Phase I/II eingeführt worden sind wie Combretastatin (OxiGene), Methoxyöstradiol und Endostatin (EntreMed), die auf der Basis vorklinischer Studien vielversprechend sind. Firmen wie Bristol Myers-Squibb (mit BMS-275291), Novartis (mit CGS27023A) oder Parke-Davis (mit Suramin) sind an dieser therapeutischen Strategie beteiligt.
Heparin
Heparin ist eine heterogene Mischung aus natürlich vorkommenden Polysacchariden verschiedener Längen und verschiedener Sulfatiergrade, welche antikoagulierende Aktivität besitzt und von den Stütz- bzw. Verbindungsgewebemastzellen ausgeschieden wird, die in der Leber (aus der die Mischung zuerst isoliert wurde), in den Muskel, Lungen, der Schilddrüse und der Milz vorkommen.
Zusätzlich zur regulären Sequenz ist eine Sequenz, die der Wirkstelle für die Antithrombin-Aktivität entspricht, in Heparin identifiziert worden.
Die Antitumor- und antimetastasische Aktivität von Heparin und seinen Derivaten beruht auf deren Fähigkeit, Heparanase zu inhibieren, Wachstumsfaktoren zu blockieren und Angiogenese zu regeln.
Heparansulfate (HS)
Heparansulfate (HS) sind überall vorkommende Protein-Liganden. Die Proteine binden an die HS-Ketten für eine Vielfalt von Wirkungen von einer einfachen Immobilisierung oder einem Schutz vor proteolytischem Abbau bis hin zu spezifischen Modulationen biologischer Aktivitäten, wie der Angiogenese.
Das Kohlenhydratgerüst besteht sowohl in Heparin als auch in den Heparansulfaten (HS) aus einer Abwechslung von D-Glucosamin (GlcN) und Hexuronsäuren (Glc.A oder IdO.A).
In Heparin sind die GlcN-Reste hauptsächlich N-sulfatiert, wogegen sie in HS sowohl N-sulfatiert als auch N-acetyliert sind, mit einer kleinen Menge an unsubstituiertem N-.
HS ist im Durchschnitt auch weniger O-sulfatiert als Heparin.
Die Verwendung von Heparin zur Behandlung von Angiogenesestörungen, wie von Tumoren, insbesondere von Metastasen, wird im Wesentlichen durch die Antikoagulansaktivität des Heparins eingeschränkt.
Chemische Modifikationen sind an Heparin vorgenommen worden, um so sein Antikoagulansvermögen zu verringern und gleichzeitig seine Antitumoreigenschaften zu bewahren.
Die Öffnung einer Glucuronsäure-Einheit in der Antithrombin-Stelle setzt die Affinität von Heparin für Antithrombin herab: auf diese Weise können Heparine mit verringerten antikoagulierenden Effekten verwendet werden, wobei aber immer noch die antiangiogenen Eigenschaften beibehalten bleiben.
Heparanasen
"Heparanasen" sind Enzyme, die zu einer Familie von Endoglycosidasen gehören, die die inneren Glycosid-Bindungen der Ketten von Heparansulfaten (HS) und von Heparin hydrolysieren.
Diese Endoglycosidasen sind an der Fortpflanzung von Tumorzellen, an Metastasen und an der Neovaskularisation von Tumoren beteiligt. Dies legt es nahe, dass sie auch an einer Tumor-Angiogenese als Ergebnis einer aus der extrazellulären Matrix erfolgenden Freisetzung von an Heparin gebundenen Wachstumsfaktoren, wie von aFGF (auch bezeichnet als FGF-1), bFGF (auch bezeichnet als FGF-2) und von VEGF, beteiligt sein können.
Diese Enzyme stellen biologische Zielpunkte für eine antiangiogene Aktivität dar. In der wissenschaftlichen Literatur findet man eine große Anzahl von Struktur/Affinität-Korrelationsstudien (siehe z.B. F. Lapierre et al., Glycobiology, Band 6, (3), 355-366, 1996). Obwohl viele Aspekte noch der Klärung bedürfen, ist über Studien berichtet worden, die die Inhibierung von Heparanasen durch Heparin und seine Derivate betreffen, und zwar unter Anwendung spezifischer Tests, die Überlegungen im Hinblick auf einen strukturellen Typ aufkommen ließen, welche als Leitlinien zum Erhalt neuer selektiverer Derivate dienen können.
In der genannten Arbeit von Lapierre et al. sind Heparinderivate beschrieben, die durch 2-O-Entsulfatierung oder durch "Glycol-Spaltung" (Oxidation mit Perjodat und anschließender Reduktion mit Natriumborhydrid) erhalten wurden. Diese Derivate, die hier als "2-O-entsulfatiertes Heparin" bzw. "RO-Heparin" definiert sind, haben zum Teil die antiangiogene Heparin-Aktivität beibehalten, wie dies mittels des CAM-Tests in der Gegenwart von Corticosteroiden analysiert wurde, wie berichtet in Tabelle III (ebenda auf Seite 360).
Heparine und FGF
Die FGFs regulieren mehrfache physiologische Prozesse wie Zellwachstum und -differenzierung, aber auch Funktionen, die an pathologischen Prozessen wie der Tumor-Angiogenese beteiligt sind.
Die FGFs sind Wachstumsfaktoren (eine Familie von mehr als 10 Polypeptiden, von denen die sauren (FGF-1) und die basischen FGFs (FGF-2) diejenigen darstellen, die am meisten untersucht worden sind, welche einen Polysaccharid-Cofaktor, Heparin oder HS benötigen, um an den FGF-Rezeptor (FGFR) gebunden zu werden und diesen zu aktivieren).
Obwohl der präzise Mechanismus, wodurch Heparin und HS die FGFs aktivieren, unbekannt ist, ist es allerdings bekannt, dass Heparin/FGF/FGFR einen "trimolekularen" oder "ternären" Komplex bilden.
Ein postulierter Mechanismus beruht darauf, dass Heparin und HS eine sogenannte Sandwich-Dimerisierung von FGF induzieren und durch letztere, auf die so dimerisierte Weise, ein stabiler Komplex mit FGFR gebildet wird.
Antimetastatische Aktivität von Heparinderivaten
Die Fähigkeit eines Primärtumors zur Erzeugung metastatischer Zellen stellt vielleicht das Hauptproblem dar, dem sich eine Antikrebs-Therapie zu stellen hat.
Heparinderivate mit einer wesentlichen Fähigkeit zur Blockierung von Heparanase scheinen in gleichem Maße zur Inhibierung der Angiogenese sowohl in Primärtumoren als auch in Metastasen befähigt zu sein.
Außerdem verringert die Inhibierung von Heparanase die Migrationsfähigkeit der Tumorzellen aus dem Primärtumor zu weiteren Organen.
Die folgende Tabelle liefert ein Beispiel einer Struktur/antimetastatische Aktivität-Korrelation im Fall von Heparin:

MG = Molekulargewicht

Die Daten in dieser Tabelle legen es nahe, dass sehr kurze Fragmente von Heparin noch immer mit guter antimetastatischer Aktivität ausgestattet sind, während diese Aktivität verringert ist, wenn die Aminogruppe des Glucosamins an Bernsteinsäure gebunden ist.
Die strukturellen Erfordernisse Heparin-artiger Moleküle, die eine Angiogenese-inhibierende Wirkung begünstigen, können in 2 Kategorien auf der Basis des zur Blockierung beabsichtigten Zieles eingeteilt werden:

a) Blockade von Heparanase, einem Enzym, das die Glycosid-Bindungen der Heparansulfate unter Freisetzung von Wachstumsfaktoren hydrolysiert. Diesbezüglich umfassen die Heparin-artigen Verbindungen vorzugsweise Sequenzen aus mindestens 8 Monosaccharid-Einheiten, enthaltend N-Acetylglucosaminglucuronsäure (oder N-sulfatiertes Glucosamin (siehe z.B. D. Sandback-Pikas et al., J. Biol. Chem. 273, 18777-18780 (1998) und darin zitierte Referenzen).
b) Blockade von angiogenen Wachstumsfaktoren (Fibroblast-Typ: FGF-1 und FGF-2; vaskulärer Endothelium-Typ: VEGF; vaskulärer Permeabilitätstyp: VPF).

Diesbezüglich weisen die Heparin-artigen Verbindungen vorzugsweise Sequenzen auf, die mindestens 5 Monosaccharid-Einheiten lang sind und 2-sulfatierte Iduronsäure und N,6-sulfatiertes Glucosamin enthalten (siehe z.B. M. Maccarana et al., J. Biol. Chem. 268, 23989-23905 (1993)).
In der Literatur sind auch kleine Peptide (mit 5 bis 13 Aminosäuren) mit antiangiogener Aktivität ( US 5,399,667 der University of Washington), die durch Bindung an einen Thrombospondin-Rezeptor wirken, oder längere Peptide (mit ca. 50 Aminosäuren) beschrieben.
Auch sind modifizierte Plättchenfaktoren bekannt – ( EP 0 589 719 , Lilly), die zur Inhibierung einer endothelialen Fortpflanzung, mit IC₅₀ = 7 nM, befähigt sind.
Oligosaccharid-Fragmente mit antiangiogener Aktivität sind ebenfalls in breitem Umfang beschrieben worden: Tatsächlich ist herausgefunden worden, dass durch Variieren der Kohlenhydrat-Sequenz die Wechselwirkungsselektivität gesteigert werden kann.
Außerdem kann Heparin als Vehikel für Substanzen eingesetzt werden, die ihrerseits antiangiogen sind, wie einige Steroide, bei denen die Affinität von Heparin für vaskuläre Endothelialzellen genutzt wird; siehe z.B. WO 93/12 793 der University of Texas und von Imperial Cancer Research Technology, worin Heparine mit Säure-labilen Verbindungsgliedern, wie an Cortison gebundenes Adipinsäurehydrazin, beansprucht sind. Der antiangiogene Effekt der konjugierten Moleküle ist größer als derjenige der unkonjugierten Moleküle, sogar bei gleichzeitiger Verabreichung.
In Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96, sind an Steroide (z.B. an Cortison) gebundene Heparine mit einer Hydrazongruppe in C-20 beschrieben, die eine größere antiangiogene Aktivität als die 2 unkonjugierten Moleküle aufweisen.
In EP 0 246 654 von Daiichi Sc. sind sulfatierte Polysaccharide mit antiangiogener Aktivität in Phase II-Studien beschrieben.
In EP 0 394 971 von Pharmacia & Upjohn – Harvard Coll. sind Hexasaccharide – Heparinfragmente – mit niedriger Sulfatierung mit der Befähigung zur Inhibierung des Wachstums von Endothelialzellen und von durch (FGF-1) stimulierter Angiogenese beschrieben.
In EP 0 618 234 von Alfa Wasserman ist ein Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Glycosaminoglycane mit einer Heparin- oder Heparanstruktur beschrieben, die eine nucleophile Gruppe tragen.
In WO 95/05 182 von Glycomed sind verschiedene sulfatierte Oligosaccharide mit antikoagulierender, antiangiogener und entzündungshemmender Aktivität beschrieben.
In US 5,808,021 von Glycomed ist ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen nicht-entpolymerisierten 2-O, 3-O-entsulfatiertem Heparin mit einem Entsulfatierprozentsatz in Position 2 der Iduronsäure (I, 2-O) und in Position 3 der Glucosamin-Einheit (A, 3-O) von ca. 99 bis 75 % des ursprünglichen Prozentsatzes beschrieben. Dieses Verfahren betrifft eine Entsulfatierung, die in der Gegenwart eines Kations eines zweiwertigen Metalls, z.B. von Calcium oder Kupfer, und anschließender Gefriertrocknung des erhaltenen Produkts durchgeführt wird. Die entsulfatierten Heparine weisen antiangiogene Aktivität auf.
In WO 99/27 976 ist ein Verfahren zur Herstellung von Polymermaterialien mit hoher Kompatibilität mit organischen Flüssigkeiten und Geweben offenbart, wobei die Materialien ein basisches Polymer umfassen, an das Moleküle eines Polysaccharids aus Disaccharid-Wiederholungseinheiten aus einer Uronsäure und einem Hexosamin kovalent gebunden sind. Das Polysaccharid wird entsulfatiert, um Epoxi-Funktionalitäten auf Uronsäure-Resten zu erhalten.
Aufgabe der hierin beschriebenen Erfindung ist es, optimale Glycosamoglycan-Strukturen zur Erzeugung antiangiogener Aktivität auf der Grundlage einer Heparanase-Inhibierung und/oder von FGF-Wachstumsfaktor-Inhibierungsmechanismen herauszufinden. Eine weitere Aufgabe der hierin beschriebenen Erfindung ist es, ein Medikament mit antiangiogener Aktivität bereitzustellen, das im Wesentlichen frei von den typischen Nebenwirkungen der Heparinderivate, wie z.B. der antikoagulierenden Aktivität, ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist nun herausgefunden worden, dass durch Unterziehen eines Glycosaminoglycans, wie eines Heparin-artigen Glycosaminoglycans, von Heparin oder modifiziertem Heparin, enthaltend Glucosamin-Reste, mit unterschiedlichen Graden einer N-Entsulfatierung und gegebenenfalls einer anschließenden vollständigen oder teilweisen N-Acetylierung, der gesteuerten 2-O-Entsulfatierungsbehandlung der Iduron-Einheiten bis zu einem Entsulfatierungsgrad von nicht mehr als 60 % der gesamten Uron-Einheiten und der anschließenden Öffnung von deren Glycosidring durch Glycolspaltung die angiogenen Wachstumsfaktor-Bindungseigenschaften erhalten bleiben. In überraschender Weise sind diese auf nicht mehr als 60 % ihrer gesamten Uron-Einheiten 2-O-entsulfatierten Heparine deutlich antiangiogen.
Die unter den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Bedingungen durchgeführte Entsulfatierung erzeugt auch die Bildung von Iduron-Einheiten mit einem Oxiraning in Position 2,3. Durch Öffnung des Oxiranrings unter den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Bedingungen entstehen L-Iduron- oder L-Galacturon-Einheiten.
Gegenstand der hierin beschriebenen Erfindung ist ein 2-O-entsulfatiertes Glycosaminoglycanderivat, insbesondere ein 2-O-entsulfatiertes Heparin, welche selektiv mit einem Entsulfatierungsgrad von nicht mehr als 60 % der gesamten Uron-Einheiten teilweise entsulfatiert sind, deren Glycosidring einer Glycol-Spaltung unterzogen worden ist, wobei durch diese Entsulfatierungslücken die Länge der durch die Abfolge von Disaccharidtrisulfat-Einheiten aufgebauten regulären Sequenzen verringert wird.
Eine besondere Ausführungsform der hierin beschriebenen Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel (I):
worin gilt:
der U-Ring hat die folgende Bedeutung:
worin X und X', gleich oder verschieden, eine Aldehyd- oder die -CH₂-D-Gruppe sind, worin D Hydroxyl oder eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Rest eines Kohlenhydrats oder Oligosaccharids ist;
R und R₁ sind, gleich oder verschieden, ein SO₃- oder Acetyl-Rest;
n und m variieren, gleich oder verschieden, von 1 bis 40; die Summe von n + m beträgt 6 bis 40; und das m:n-Verhältnis beträgt 10:2 bis 1:1. Vorzugsweise ist m größer als oder gleich n. Vorzugsweise beträgt n 40 bis 60 % der Summe von m + n. Das Symbol
zeigt an, dass die mit n und m markierten Einheiten entlang der Polysaccharidkette statistisch verteilt sind und nicht unbedingt in Sequenz vorliegen.
Die Verbindungen, die Gegenstand der hierin beschriebenen Erfindung sind, weisen interessante antiangiogene Eigenschaften auf und eignen sich daher als Wirkbestandteile zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Pathologien, die auf einer abnormen Angiogenese beruhen, und insbesondere zur Behandlung von Metastasen.
In vorteilhafter Weise zeichnen sich die Verbindungen gemäß der Erfindung durch verringerte, wenn nicht sogar überhaupt keine antikoagulierenden Eigenschaften aus, wodurch die für Heparine typischen Nebenwirkungen vermieden, aber zumindest herabgesetzt werden. Ein weiterer Vorteil resultiert aus der Tatsache, dass die Verbindungen gemäß der Erfindung mit instrumentellen analytischen Verfahren, wie mit NMR-Spektroskopie, charakterisiert werden können, wodurch eine Prozesssteuerung ermöglicht ist, die aus Gründen der industriellen Anwendbarkeit absolut erwünscht ist.
Auch im Fall modifizierter Heparine übt das Molekulargewicht (MG) eine sehr wichtige Funktion aus, wenn Angiogenese-Inhibitoren daraus hergestellt werden. In der Tat ist es gut bekannt, dass die Herabsetzung des Molekulargewichts (MG) auf Werte, die Pentasaccharid-Einheiten entsprechen, zu keinem Verlust der antiangiogenen Aktivität führt. Andererseits ist dargelegt worden, dass, jenseits einer bestimmten Länge, die Heparin-Ketten die Dimerisierung und somit die Aktivierung von FGF eher begünstigen als diese inhibieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Unter Entsulfatierungsgrad ist der Prozentsatz nicht-sulfatierter Iduronsäuren, bezogen auf die gesamten Uronsäuren, die ursprünglich im Ausgangsheparin vorhanden waren, gemeint. Ein anfänglich bevorzugter Bereich für den Entsulfatierungsprozentsatz beträgt ca. 40 bis 60 %. Unter den Verbindungen der Formel (I) ist die bevorzugte Verbindung:
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 11.200, einem Polydispersionsindex D von 1,3, einem Entsulfatierungsgrad von 1,99 (ausgedrückt als das SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von ca. 50 % (nachfolgend auch bezeichnet mit ST1514). Die genannte Verbindung ist durch die Formel (I) umfasst, worin, unter den weiteren entsprechenden Definitionen, m:n = 1:1 und die mit m und n markierten Einheiten entlang der Polysaccharid-Kette in regulärer, abwechselnder Weise verteilt sind.
Die Verbindungen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung werden mit einem Verfahren hergestellt, das umfasst:

a) basische Behandlung bei einer Temperatur von Umgebungstemperatur bis ca. 100, vorzugsweise von 50 bis 70 und noch bevorzugter bei ca. 65°C, was zur Eliminierung eines gesteuerten Prozentsatzes der Sulfatgruppen in Position 2 der Iduronsäure unter Bildung von Epoxidgruppen führt; und, gegebenenfalls,
b) Öffnung des genannten Epoxidrings bei einem pH-Wert von ca. 7 bei einer Temperatur von ca. 50 bis ca. 100 und vorzugsweise bei ca. 70°C, um Galacturonsäure-Reste zu ergeben; oder, alternativ,
c) Öffnung des genannten Epoxidrings bei einer Temperatur von ca. 0 bis 30 und vorzugsweise bei ca. 25°C, um Iduronsäure-Reste zu ergeben; und
d) Oxidation der Diole mit Natriumperjodat, um die Öffnung des Glycosidrings und die Bildung von 2 Aldehydgruppen pro modifiziertem Rest zu ergeben;
e) Reduktion der genannten Aldehydgruppen zum primären Alkohol und, gegebenenfalls, Überführung der D-Gruppe in eine Gruppe, die sich von Hydroxyl unterscheidet, gemäß den von Formel (I) umfassten unterschiedlichen Bedeutungen;
f) gegebenenfalls saure Hydrolyse, um Oligosaccharide, entsprechend den regulären Sequenzen, zu erhalten; oder, alternativ,
g) teilweise enzymatische Hydrolyse mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe aus Lyase, Heparinase, Heparitinase oder aus einem Äquivalent der in Stufe e) erhaltenen Produkte, um Oligosaccharide, vorzugsweise Tetra- oder Octasaccharide, mit dem nicht-reduzierenden endständigen Rest, bestehend aus ungesättigter Iduronsäure, zu ergeben, wobei der reduzierende Rest aus einem N-Sulfoglucosamin besteht und mindestens 1 offenen Iduronsäure-Rest enthält; oder, alternativ,
h) in Stufe a) erhaltene Verbindung oder das in Stufe b) erhaltene Produkt werden mit einer teilweisen Enzym-Hydrolyse behandelt; und, gegebenenfalls,
i) die in einer der Stufen a), b) und e) erhaltenen Produkte werden teilweise 6-O-entsulfatiert; oder, alternativ,
j) das teilweise oder gänzlich 6-entsulfatierte Ausgangsheparin wird den Stufen a), b) und e) unterzogen.

Gemäß der hierin beschriebenen Erfindung ist die bevorzugte Verbindung:
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem oben beschriebenen Verfahren, worin Stufe a) 45 min lang bei 60°C und Stufe b) bei 70°C bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt werden, und dieses Heparin weist ein Molekulargewicht (MG) von 11.200, einen Polydispersionsindex D von 1,3, einen Entsulfatierungsgrad von 1,99 (ausgedrückt als das SO3^–:COO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von ca. 50 % auf (nachfolgend auch bezeichnet mit ST1514).
Die Molekulargewichte werden mit HPLC-GPC (Hochleistungsflüssigchromatografie-Gelpermeationschromatografie) bestimmt. Der Entsulfatierungsgrad wird durch Konduktometrie (Leitfähigkeitsmessung) und der Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren wird mit ¹³C-NMR bestimmt.
MG ist das Molekulargewicht, und D ist der Polydispersionsindex, ausgedrückt als MG/Mn.
Gemäß der hierin beschriebenen Erfindung sind die Ausgangsprodukte Glycosaminoglycane verschiedenen Ursprungs und vorzugsweise natürlich vorkommende Heparine. Es ist auch möglich, chemisch modifizierte Heparine mit einem Prozentgehalt von N,6-Disulfat von 0 bis 100 % zu verwenden. Ausgehend von Produkten mit unterschiedlichem 6-O-sulfatierten Glucosamingehalt ist es möglich, die Länge der regulären Sequenzen zwischen 1 offener Iduronsäure und einer weiteren zu modulieren. Die Glycosaminoglycane gemäß der Erfindung mit geöffnetem Gycosidring werden gewöhnlich von den Fachleuten als RO-Derivate bezeichnet, wodurch gemeint ist, dass der Glycosidring mittels einer Oxidationswirkung und anschließender Reduktion (Reduktion-Oxidation = RO) geöffnet worden ist. Diese Öffnung des Glycosidrings wird gewöhnlich auch als "Glycol-Spaltung" bezeichnet, und zwar wegen der Bildung der 2 primären Hydroxylreste am offenen Ring. Die entsprechenden Verbindungen werden auch als "RO"- oder "Glycol-Spaltung"-Derivate bezeichnet.
In einer weiteren Ausführungsform der hierin beschriebenen Erfindung eignen sich die Aldehyde und der primäre Hydroxyrest, die aus der oben beschriebenen ("Glycol-Spaltung")-Öffnungsreaktion stammen, auch zu einer anschließenden Funktionalisierung. Daher können die Verbindungen der Formel (I) auch gleiche oder unterschiedliche Gruppen, wie oben definiert für X und X', am aus der Glycol-Spaltung stammenden primären Hydroxyrest, z.B. Oligosaccharid- oder Peptid-Gruppen, aufweisen, die von einzelnen Sacchariden oder Aminosäuren bis zu mehr als 1 Längen-Einheit, vorzugsweise bis 2 oder 3 Einheiten, reichen.
Verbindungen der Formel (I), worin X und X' -CH₂OH sind, können auch als Vehikel für weitere Typen von Arzneimitteln verwendet werden, und zwar mittels einer geeigneten Bindung an den Heparin-Teil, wobei diese dazu befähigt ist, eine stabile Bindung unter den normalen Bedingungen der Herstellung und Lagerung einer formulierten Arznei zu ergeben, wobei aber die transportierte Arznei im Körper, vorzugsweise in der Nachbarschaft des Zielorgans, erneut freigesetzt wird. Entsprechende Beispiele von Arzneimitteln, die transportiert werden können, sind steroidale und nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneimittel, Corticosteroide und weitere Arzneimittel mit antimetastatischer Wirkung, in welchem Fall sich eine vorteilhafte Steigerung des antimetastatischen Effekts als Ergebnis der Summe der getrennten innewohnenden Aktivitäten der Verbindungen gemäß der Erfindung und des daran gebundenen antimetastatischen Mittels mit den entsprechenden Vorteilen einer größeren Zielselektivität und niedrigeren systemischen Toxizität einstellt. Beispiele dieser Arzneimittel sind die Metalloproteinase-Inhibitoren. Weitere Arzneimittel, die in geeigneter Weise transportiert werden können, sind diejenigen, die auf der endothelialen Ebene wirken. Verbindungen der Formel (I), in denen sich X und X' von Hydroxy oder einem Aldehyd unterscheiden, können ebenfalls als Vehikel für Arzneimittel verwendet werden, in welchem Fall die Gruppen X und X' als "Abstandshalter" zwischen dem transportierten Molekül, d.h. zwischen dem Glycosaminoglycan der vorliegenden Erfindung und dem als Vehikel fungierenden Molekül, wirken, und zwar in denjenigen Fällen, in denen dies aus Gründen der Pharmakokinetik oder Pharmakodynamik erwünscht sein mag.
Im Fall von Verbindungen gemäß der Erfindung, die aus Heparin stammen, werden diese aus Heparin selbst mit Entsulfatierverfahren hergestellt, die den Fachleuten bekannt sind. Beispielsweise wird die Entsulfatierung in der Gegenwart alkalischer Mittel, wie von Natriumhydroxid, bei Temperaturen von Umgebungstemperatur bis 100 und vorzugsweise von 50 bis 70°C, z.B. bei 60°C, über einen hinreichend langen Zeitraum durchgeführt, um die angestrebte Entsulfatierung zu erzielen. Die Entsulfatierung wird durch Einwirken auf die Verfahrensparameter, wie auf die Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer, die Temperatur und auf die Reaktionszeiten, gesteuert. Ein bevorzugtes Beispiel beruht auf der Einhaltung konstanter Konzentrationen des Substrats (des Glycosaminoglycans) bei 80 mg/mL und von NaOH bei 1 M, einer konstanten Temperatur von 60°C und auf der Steuerung der Entsulfatierung über eine Reaktionszeit von 1 bis 60 min. Die Bedingungen können vom Fachmann, z.B. durch Erhöhung der Reaktionstemperatur und Verkürzung der Reaktionszeit, auf der Grundlage üblicher statistischer Versuchspraxis sowie auf der Grundlage von dessen Fachwissen variiert werden.
Durch die Behandlung mit den alkalischen Mitteln entsteht eine Zwischenproduktverbindung, die durch das Vorliegen eines Epoxidrings auf der entsulfatierten Einheit gekennzeichnet ist. In ganz überraschender Weise haben sich diese Zwischenproduktverbindungen als Verbindungen mit antiangiogenen Eigenschaften, die denen der Verbindungen der Formel (I) ähneln, erwiesen. Somit stellen einen weiteren Gegenstand der hierin beschriebenen Erfindung auch ein Derivat von teilentsulfatiertem Heparin und daher Heparin mit einer verringerten Ladung, insbesondere mit nicht mehr als 60 % entsulfatiertes Heparin, das durch einen Epoxidring auf der Entsulfatierstelle gekennzeichnet ist, dar. Die genannten Verbindungen, die durch einen Epoxidring gekennzeichnet sind, gehören ebenfalls zu den Gegenständen gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. zu den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese enthalten, sowie zu deren Verwendung zur Herstellung von Medikamenten mit antiangiogener Aktivität.
Die folgenden Verbindungen sind bevorzugt:
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 12.900 D, einem Polydispersionsindex D von 1,5, einem Entsulfatierungsgrad von 2,05 (ausgedrückt als das SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren: 5 % Epoxidgruppen, 29 % oxidierte und reduzierte Uron-Reste (nachfolgend auch bezeichnet mit ST1513);
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 11.000 D, einem Polydispersionsindex D von 1,5, einem Entsulfatierungsgrad von 2,05 (ausgedrückt als das SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren. 5 % Epoxidgruppen, 29 % oxidierte und reduzierte Uron-Reste;
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 9.200 D, einem Polydispersionsindex D von 1,5 und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren: 11 % Epoxidgruppen, 27,5 % oxidierte und reduzierte Uron-Reste.
In einer der möglichen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung sind die folgenden Verbindungen bevorzugt:
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem oben beschriebenen Verfahren, wobei die Stufe a) 15 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 12.900 D, einen Polydisperionsindex D von 1,5, einen Entsulfatierungsgrad von 2,05 (ausgedrückt als das SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten aufweist (nachfolgend bezeichnet als ST1513);
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem oben beschriebenen Verfahren, wobei die Stufe a) 30 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 11.000 D, einen Polydispersionsindex D von 1,5, einen Entsulfatierungsgrad von 1,8 (ausgedrückt als das SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten aufweist (nachfolgend bezeichnet als ST1516);
teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem oben beschriebenen Verfahren, wobei die Stufe a) 60 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 9.200 D, einen Polydispersionsindex D von 1,5 und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 11 % Epoxidgruppen und 27,5 % oxidierten und reduzierten (gespaltenen) Uron-Resten aufweist (nachfolgend bezeichnet als ST1515).
Im Anschluss an die Bildung des Epoxidrings wird dieser geöffnet, wobei auf bekannte Verfahrenstechniken zurückgegriffen wird. Der Prozentsatz des gebildeten Epoxids wird aus dem Verhältnis zwischen den Flächen der ¹³C-NMR-Signale bei ca. 55 ppm, charakteristisch für die Kohlenstoffatome 2 und 3 des das Epoxid enthaltenden Uronsäurerings, und der Gesamtzahl anomerer Signale (C1 der Glucosamin- und Uronsäure-Reste). Wird die Öffnungsreaktion heiß durchgeführt, wird ein Galacturonsäure-Rest erhalten, wogegen, falls die Öffnungsreaktion des Epoxidrings kalt durchgeführt wird, ein Iduronsäure-Rest erhalten wird. Bevorzugte Beispiele der einen Epoxidring enthaltenden Verbindungen sind diejenigen, die mit dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich sind und einen epoxidierten Uronsäure-Gehalt von 14 % (nachfolgend ST1509), 24 % (nachfolgend ST1525) bzw. von 30 % (nachfolgend ST1526) aufweisen.
Das teilweise entsulfatierte Heparin wird dann einer "Glycol-Spaltung" (abgekürzt mit RO) gemäß dem oben definierten Verfahren und einem Smith-Abbau (Smith degration, abgekürzt mit SD) unterzogen.
Alternativ dazu, können Verbindungen der Formel (I) auch ohne den Umweg über das Epoxid-Zwischenprodukt, d.h. durch direkte Glycol-Spaltung und anschließenden Smith-Abbau, erhalten werden.
Das bisher beschriebene Verfahren führt zu Verbindungen der Formel (I), in denen die Gruppen X und X' beide -CH₂OH sind.
Bezüglich X und X', die sich von -CH₂OH unterscheiden, sind für den Fachmann Verfahren auf dem Gebiet der Überführung der Hydroxylgruppe in weitere durch die obigen Definitionen umfasste Gruppen verfügbar. Beispielsweise ist die Konjugation mit Aminosäuren oder Peptiden durch Behandlung der Aldehyd-Zwischenproduktverbindungen aus der Glycol-Spaltungsreaktion mit einer reduktiven Aminierungsreaktion durchführbar (J. Hoffmann et al., Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983)), welche in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt werden kann und mit der Bewahrung der Heparin-Struktur verträglich ist.
Gegebenenfalls können, was einen weiteren Gegenstand der hierin beschriebenen Erfindung darstellt, die Verbindungen der Formel (I) weiter mit sauren Mitteln unter geeigneten pH-Bedingungen, z.B. bei einem pH-Wert von 4, abgebaut werden, um eine Mischung aus Oligosacchariden zu ergeben, in denen die antiangiogenen Eigenschaften erhalten bleiben.
In gleicher Weise stellen somit die mit einer der Stufen g), h), i) und j) des obigen Verfahrens erhaltenen Verbindungen ebenfalls Gegenstände der vorliegenden Erfindung dar.
Gegenstände der hierin beschriebenen Erfindung stellen außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen dar, die als ihren Wirkbestandteil mindestens eine Verbindung der Formel (I), allein oder in Kombination mit einer weiteren oder mehreren Verbindungen der Formel (I), oder die genannte Verbindung der Formel (I) oder Verbindungen in Kombination mit den oben beschriebenen entsulfatierten Heparinen, z.B. mit den epoxidierten Zwischenproduktverbindungen, enthalten; die letzteren können auch allein als Wirkbestandteil in den pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Der Wirkbestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung liegt in einer Mischung mit geeigneten Vehikeln und/oder Exzipienten, die gewöhnlich in der pharmazeutischen Technologie verwendet werden, wie z.B. mit den in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", letzte Ausgabe, beschriebenen, vor. Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkbestandteils. Die Dosierungen werden von den jeweiligen Fachleuten, z.B. vom Kliniker oder vom Erstversorgungsarzt, gemäß dem Typ der zu behandelnden Krankheit und der Verfassung des Patienten oder auch einhergehend mit der Verabreichung weiterer Wirkbestandteile bestimmt und ermittelt. Als Beispiel können Dosismengen im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg genannt werden.
Beispiele der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind diejenigen, die oral oder parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, transdermal oder in Form nasaler oder oraler Sprühprodukte verabreicht werden können. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die sich zweckmäßigerweise eignen, sind Tabletten, Hart- oder Weichkapseln, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Sirup und feste Formen für unmittelbare flüssige Zubereitungen. Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung sind z.B. alle intramuskulären, intravenösen und subkutanen injizierbaren Formen sowie Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Liposom-Formulierungen sollten ebenfalls genannt werden. Die Tabletten schließen auch Formen zur gesteuerten Freisetzung des Wirkbestandteils, sei es als orale Verabreichungsformen, mit geeigneten Schichten überzogene Tabletten, mikroverkapselte Pulver, Komplexe mit Cyclodextrinen oder als Depot-Formen, z.B. als subkutane Formen, wie Depot-Injektionen oder -Implantate, ein.
Die Verbindungen gemäß der hierin beschriebenen Erfindung besitzen antiangiogene Aktivität. Dadurch eignen sie sich zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Lebewesen, ganz allgemein von Säugern und insbesondere von Menschen, die an veränderter Angiogenese leiden. Beispiele der Krankheiten, die mit dem Medikament behandelt werden, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, sind Primärtumoren, Metastasen, diabetische Retinopathien, Psoriasis, retrolentikuläre Fibroplasie, Restenose nach Angioplastik und Herz-Bypass.
In vorteilhafter Weise sind die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen frei von den für Heparin typischen Nebenwirkungen. Insbesondere sind die Verbindungen gemäß der Erfindung im Wesentlichen frei von einer antikoagulierenden Aktivität. Unter "im Wesentlichen frei von einer solchen Aktivität" versteht der Fachmann keine oder eine lediglich vernachlässigbare Aktivität aus Sicht der klinischen Anwendung.
Einer der ersten Wachstumsfaktoren, der aufgefunden wurde und eine angiogene Rolle aufwies, war bFGF (oder FGF-2), und kurz darauf folgte aFGF (oder FGF-1) (bezüglich einer Übersicht siehe Christofori, Oxford University, 1996). Beide Proteine sind Mitglieder einer Klasse von Wachstumsfaktoren, die durch einen hohen Affinitätsgrad für Heparin gekennzeichnet sind. Weitere potente angiogene Induktoren sind VEGF, VEGF-B und VEGF-C. Alle 3 VEGF-Faktoren werden, wie die FGFs, überall im Körper exprimiert. Beide dieser Typen von Faktoren, a/bFGF(FGF-1 und FGF-2) sowie VEGF, binden an spezifische Hoch-Affinitätsrezeptoren mit einer Transmembrandomäne, die Tyrosin-Kinase-Aktivität besitzt. Die 3 Rezeptoren für die VEGFs – VEGF-1 (flt-1), VEGF-2 (kdr/flk-1) und VEGF-3 (flt-4) – werden spezifisch auf Endothelialzellen exprimiert, wogegen die 4 FGF-Rezeptoren in zahlreichen Organen und Geweben exprimiert werden (bezüglich einer Übersicht siehe Risau und Flame, 1995, Annu. Rev. Cell Dev: Biol. 11: 73-91). bFGF-Bindung an Heparin oder an Fragmente von Heparansulfat verursacht deren Dimerisierung und die Möglichkeit zur Bindung an deren eigenen Rezeptor durch Aktivierung des Übertragungsweges des Signals, das die Endothelialzelle sowohl bei einer Mitogenese als auch bei einer Differenzierung aktiviert.
Die Inhibierung der FGF-Bindung an Heparin oder an Fragmente von Heparansulfat stellt somit ein wertvolles therapeutisches Ziel zur Bekämpfung der pathologischen Neoangiogenese dar, die durch ein gesteigertes lokales oder systemisches Niveau von Wachstumsfaktoren induziert wird.
Im Hinblick darauf wurde ein in vitro-Modell entworfen, das die Befähigung aufweist, die Interferenz der verschiedenen unterschiedlichen Heparinderivate mit der bFGF-Bindung an seinen eigenen Rezeptor zu bewerten.
Insbesondere wurden Eierstockzellen von Chinesischen Hamstern (CHO-K1) verwendet, die Heparansulfate auf ihrer Oberfläche besitzen, denen aber ein FGF-Rezeptor-1 fehlt. CHO-Zellen, bezeichnet mit CHO-745flg, wurden ebenfalls verwendet, die den FGF-Rezeptor-1 exprimieren, aber, nicht wie die erstere Gruppe, Membran-Heparan-Sulfate nicht besitzen. Diese letzteren Zellen wurden stabil mit cDNA für ein grün fluoreszierendes Protein transfiziert und konnten dadurch unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Kombination von Filtern zum Nachweis der grünen Emission betrachtet werden. Kurz gesagt, beruht diese Verfahrenstechnik auf der Möglichkeit, dass die 2 Typen von Zellen nur dann wechselwirken (stabile Bindungen bilden) können, wenn FGF den 2 Zelltypen zugefügt ist. Tatsächlich binden, in diesem Fall, die Heparansulfate der CHO-745flg-Zellen an FGF, das seinerseits an die CHO-K1-Zellen gebunden wird, wodurch eine Brücke erstellt wird. Die auftretende Bindung ist als Ergebnis der grünen Fluoreszenz nachweisbar, die durch die CHO-745flg-Zellen emittiert wird.
Außerdem wurden die Verbindungen bezüglich ihrer Zellfortpflanzungsinhibierungsaktivität analysiert. In der Tat besteht einer der Haupteffekte von FGF darin, Zellwachstum in der Abwesenheit von Serum in Zellen zu stimulieren, die FGF-Rezeptor-1 (FGFR-1) exprimieren.
Zu diesem Zweck wurden 2 Zelllinien verwendet, die beide FGFR-1 exprimieren (L6WT1 und Rinder-Aortazellen), deren Wachstum in der Gegenwart von FGF mit oder ohne die Zugabe von Heparinderivaten bewertet wurde, für welche eine Inhibitoraktivität erwartet wurde.
Inhibierung der FGF2-mediierten interzellulären Adhäsion
CHO-K1-Zellen wurden in einer Dichte von 90.000 Zellen/cm² in 24-Loch-Platten ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen in 3 % Glutaraldehyd in PBS 2 h lang bei 4°C fixiert und mit 0,1 M Glycin/PBS gewaschen. Auf die fixierten Monoschichten wurden CHO-745/flg-Zellen, transfiziert mit FGFR-1, mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm² in DMEM, enthalten 10 mM EDTA, 30 ng/ml FGF-2 und steigende Dosismengen der Testverbindungen, gegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurden die anhaftenden Zellen unter dem umgekehrten Mikroskop gezählt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Anzahl von anhaftenden Zellen im Vergleich mit denjenigen ausgedrückt, die in der Abwesenheit der Testverbindungen gemessen wurden. Die Verbindungen wurden in Triplikaten bei 6 Konzentrationen von 1 ng/mL bis 100 μg/mL untersucht und der ID₅₀-Wert für jede Verbindung berechnet (Tabelle 1). Tabelle 1 Inhibierung der interzellulären Adhäsion (ID₅₀) von CHO-K1 und CHO-745flg-Zellen
Inhibierung der DNA-Synthese in mit FGFR-1 transfizierten L6-Zellen
L6-WT1-Zellen (Ratten-Myoblasten, transfiziert mit FGFR-1) wurden mit einer Dichte von 25.000 Zellen/cm² in 48-Loch-Platten in DMEM + 10 % FCS ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit Serum-freiem Medium gewaschen und 48 h lang mit DMEM + 0,5 % FCS inkubiert. Die Zellen wurden dann 16 h lang mit FGF-2 bei Konzentrationen von 15 und 30 ng/mL in der An- oder Abwesenheit der Testverbindungen (alle mit 100 μg/mL) inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde ³H-Thymidin (0,25 μCi/Loch) ohne Änderung des Medium zugefügt. Nach 6 h wurde das ausfällbare TCA gemessen. Jeder Versuchspunkt ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben: Tabelle 2 Inhibierung der DNA-Synthese in mit FGFR-1 transfizierten L6-Zellen
Effekt auf die DNA-Synthese in Rinder-Aorta-Endothelial-Zellen (BAEC)
BAEC-Zellen wurden bei einer Dichte von 2.500 Zellen/cm² in 48-Loch-Platten in EGM-Bullet-Kit-Komplettmedium ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen in der Abwesenheit von Serum in EGM-Medium ohne Rinder-Hirnextrakt und hEGF gezüchtet. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen mit 30 ng/mL bFGF in der Anwesenheit steigender Konzentrationen der Testverbindung behandelt. Nach 16 h wurde 1 μCi/mL ³H-Thymidin zum Medium gegeben. Nach 6 h wurde die ausfällbare TCA-Aktivität gemessen. Jeder Versuchspunkt ist der Mittelwert von 8 Bestimmungen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 6 angegeben: Tabelle 3 Effekt auf die DNA-Synthese in Rinder-Aorta-Endothelialzellen (BAEC) – ST1514
Tabelle 4 Effekt auf die DNA-Synthese in Rinder-Aorta-Endothelialzellen (BAEC) – ST1528
Tabelle 5 Effekt auf die DNA-Synthese in Rinder-Aorta-Endothelialzellen (BAEC) – ST1525
Tabelle 6 Effekt auf die DNA-Synthese in Rinder-Aorta-Endothelialzellen (BAEC) – ST1507
Test der Zollfortpflanzung in BAEC
BAEC-Zellen im 7. Durchlauf wurden mit einer Dichte von 2.500 Zellen/cm² in 96-Loch-Platten in EBM-Medium ohne Rinder-Hirnextrakt und hEGF ausgesät. Zu diesem Medium wurden 30 ng/mL FGF-2 und jede der Testverbindungen mit 5 Konzentrationen von 10 ng/mL bis 100 μg/mL gegeben. Nach 3 Tagen wurden die Zellen fixiert und mit Kristall-Violett gefärbt und die optische Dichte mittels eines ELISA-Mikroplatte-Messgeräts bestimmt. Jeder Versuchspunkt wurde vierfach bestimmt, und der ID₅₀-Wert wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben: Tabelle 7 Test der Zellfortpflanzung in BAEC
Test der Zollfortpflanzung in fötalen BAEC-GM-7373
GM7373-Zellen wurden mit einer Dichte von 70.000 Zellen/cm² in 96-Loch-Platten in MEM + 10 % FCS-Medium ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit Serum-freiem Medium gewaschen und mit 10 ng/mL FGF-2 in Medium, enthaltend 0,4 % FCS, behandelt. Nach 8 h wurden die Testverbindungen zum Medium in 5 Konzentrationen von 10 ng/mL bis 100 μg/mL gegeben. Nach weiteren 16 h wurden die Zellen trypsinisiert und in einer Burker-Kammer gezählt. Der ID₅₀-Wert wurde für jede Verbindung gemessen, und die Ergebnisse sind Mittelwerte von 2 Versuchen in Triplikaten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben: Tabelle 8 Test der Zellfortpflanzung in fötalen BAEC-GM-7373
Inhibierung der Angiogenese
Zur Untersuchung der Angiogenese war das angewandte Modell das Kückenembryo-chorioallantoische Membran-(chick embryo chorioallantoic membrane = CAM)-Modell (Ribatti et al., Int. J. Dev. Biol. 40, 1189 (1996)).
300 embryonierte Hühnereier wurden bei 37°C unter konstanten Feuchtigkeitsbedingungen inkubiert. Am 3. Tag der Inkubation wurde, nach Ansaugen von 2 bis 3 mL Eiweiß aus dem akuten Pol des Eis, um so die CAM von der Schale abzulösen, ein Fenster mit der Schere in der Schale geschnitten. Die Gefäße unter der CAM waren somit freigelegt. Das Fenster wurde mit einem durchsichtigen Glaspaneel verschlossen, und die Eier wurden zurück in den Inkubator gelegt. Am 8. Tag der Inkubation unter sterilen Bedingungen wurden die CAMs gemäß dem unten beschriebenen Protokoll mit der kürzlich entwickelten Verfahrenstechnik behandelt (Ribatti et al., J. Vasc. Res. 34, 455 (1997)), welche die Verwendung steriler Gelatineschwämme mit einer Größe von 1 mm² beinhaltet. Jedes Molekül wurde in 3 μL PBS bei einer Konzentration von 50 oder 100 μg/Embryo resuspendiert. Als Positivvergleich wurde FGF-2 verwendet (1 μg/Schwamm), für den eine potente angiogene Aktivität auf der CAM belegt worden ist (Ribatti et al., Dev. Biol. 170, 39 (1995)). Die Schwämme wurden zuerst auf der Oberfläche der CAM ruhend aufgelegt, und dann wurden 3 μL Lösung der Testsubstanz auf die Oberfläche des Schwamms pipettiert. Die CAMs wurden täglich mit einem Zeiss SR-Stereomikroskop mit fotografischer Ausrüstung untersucht. Die Versuche wurde am 12. Inkubationstag unterbrochen, als eine Gesamtbewertung der angiogenen Aktivität der Moleküle vorgenommen wurde, ausgedrückt als Prozentsatzinhibierung, bezogen auf die Zahl begonnener und beendeter Versuche (Tabelle 9). Außerdem wurde die Verbindung ST1514 bei einer Konzentration von 100 μg/Embryo analysiert, eine makroskopische quantitative Bewertung der angiostatischen Aktivität wurde ebenfalls gemäß der von Brooks et al. (Science, 264, 569, (1994)) vorgeschlagenen Verfahrenstechnik durchgeführt, wobei die Zahl der Gefäße gezählt wurde, die den Schwamm umgaben. Die Zahl der Gefäße wurde mit derjenigen der mit PBS (dem Vehikel der Testverbindung) und mit FGF-2 (dem Positivvergleich) behandelten Vergleichsschwämme verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben: Tabelle 9 Angiostatische Aktivität am CAM-Modell
Es sollte angemerkt sein, dass natürlich vorkommendes Heparin keine Aktivität aufweist.
Tabelle 10 Angiostatische Aktivität: makroskopische quantitative Bewertung (Brooks)
Es sollte angemerkt, dass natürlich vorkommendes Heparin keine Aktivität aufweist.
Bewertung der Heparin-Toxizität in Balb/c-Mäusen
20 6 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse mit einem Gewicht von 20 g (Harlan), aufgeteilt in Gruppen durch statistische Verteilung, wurden mit Heparinnatrium als Vergleich und mit der als ST1514 bezeichneten Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt. Der Behandlungszeitplan war vom g2dx5-Typ, d.h. insgesamt 5 Verabreichungen in Intervallen von 2 Tagen, unter Verabreichung von 200 μL/Maus mit Lösungen von 50 mg/kg/10 mL und 25 mg/kg/10 mL subkutan.
Die Substanzen wurden wie folgt solubilisiert:

Heparinnatrium: die Lösung wird durch Solubilisieren von 160 mg Pulver in 4 mL Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freier PBS 1×, pH = 7,4, zubereitet; sie wird in Anteile von 243 μL aufgeteilt und bei –20°C aufbewahrt. Zum Zeitpunkt der Behandlung wird die Lösung in Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freier PBS (Dulbecco, modifizierte Formulierung) 1×, pH = 7,4, verdünnt, so dass die Substanz in Endkonzentrationen von 50 und 25 mg/kg/10 mL vorliegt.
ST1514: die Lösung wird durch Solubilisieren von 160 mg Pulver in 4 mL Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freier PBS 1×, pH = 7,4, zubereitet; sie wird in Anteile von 243 μL aufgeteilt und bei –20°C aufbewahrt. Zum Zeitpunkt der Behandlung wird die Lösung in Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freier PBS (Dulbecco, modifizierte Formulierung) 1×, pH = 7,4, verdünnt, so dass die Substanz in Endkonzentrationen von 50 und 25 mg/kg/10 mL vorliegt.

48 h nach der letzten Verabreichung der Testsubstanzen wird eine Blutprobe zur Vollblutzählung und hämatologischen Analyse gezogen.
Blutprobennahme: die Mäuse werden in eine hermetisch verschlossene Schachtel gegeben, in die CO₂ in einer Menge geblasen wird, die ausreicht, um die Tiere zu betäuben. Blut wird dann aus dem retro-orbitalen Plexus eines jeden Tieres entnommen (ca. 1 mL Blut/Maus), das in Mengen von 0,4 mL Blut/Maus in Eppendorf-Teströhrchen, enthaltend 20 μL Vister-Heparin (5000 E/mL), zur Durchführung der Vollblutzählung der hämatologischen Analyse aufgeteilt wird; und die gleiche Blutmenge wird in weitere Eppendorf-Teströhrchen, enthaltend 50 μL 3,8 %iges Natriumzitrat, gegeben, um Prothrombin-Zeitbestimmungen vorzunehmen. Nach Entnahme der Blutprobe wird jedes Tier durch cervikale Dislokation geopfert.
Anzahl der Proben: 2 Blutproben/Maus werden gezogen, mit denen 2 Vollblutzählungen durchgeführt und 2 Objektträgerproben und eine Plasmaprobe erzeugt werden, die bei –20°C aufbewahrt werden.
Vollblutzählung: die Durchführung (Cell Analyzer 580 A, DELCON) erfolgt gemäß der im Betriebshandbuch beschriebenen Standardvorgehensweise. Die Blutprobe (25 μL) wird vom Verdünnungsgerät gezogen und auf ein Volumen von 10 mL (Verdünnung = 1:400) mit isotonischer Lösung (PLTA-Kochsalzlösung, DELCON) gebracht. Aus dieser Lösung (bezeichnet mit Lösung A) nimmt das Verdünnungsgerät automatisch eine Probe von 100 μL und bringt sie auf ein Volumen von 10 mL (Verdünnung = 1:100), um so eine Lösung B zu erhalten. Zur Lösung A werden 3 Tropfen Emosol (DELCON) zur Lyse zur roten Blutzellen gegeben. Diese Lösung wird zur WBC-Messung verwendet. Die Lösung B wird andererseits für die RBC- und Plättchen (PLT)-Messungen verwendet. Jede Probe wird in Duplikaten gemessen. Die erhaltenen Daten werden mit ANOVA analysiert.
Die Gruppen der mit Heparinnatrium in Dosismengen von 50 und 25 mg/kg/10 mL behandelten Tiere zeigen ein ausgeprägtes Hämatom an der Inoculumstelle; dieses Phänomen tritt in den mit ST1514 behandelten Gruppen nicht auf. Zur Untersuchung der Tiere durchgeführte Autopsien enthüllen, dass die mit Heparinnatrium in Dosismengen von 50 und 25 mg/kg/10 mL behandelten Gruppen Lebern mit abnormen Charakteristika zeigen, wogegen kein derartiges Phänomen in den mit ST1514 behandelten Gruppen nachgewiesen wird.
Die Daten der hämotologischen Analyse zeigen eine Verringerung der roten Blutzellen in beiden mit Heparinnatrium mit Dosismengen von 50 und 25 mg/kg behandelten Gruppen im Vergleich zur Vergleichsgruppe, wogegen kein derartiger Unterschied in den mit ST1514 behandelten Gruppen nachweisbar ist.
Die mit Heparinnatrium mit einer Dosis von 25 mg/kg behandelte Gruppe zeigt eine signifikante Plättchendefizienz gegenüber der Vergleichsgruppe. Keine der untersuchten Behandlungsgruppen zeigt signifikante Unterschiede bei der Anzahl der weißen Blutzellen gegenüber der Vergleichsgruppe.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung noch weiter.
Beispiel 1
1 g Heparin wird in 12,5 mL 1 N NaOH gelöst. Die Lösung wird erwärmt und bei 60°C 45 min lang gerührt. Die Reaktion wird durch rasche Abkühlung und Neutralisation blockiert. Die Lösung wird dann bei 70°C bei pH = 7 erhitzt, bis der Epoxidring vollständig offen ist (der Reaktionstrend wird durch NMR verfolgt und gesteuert). Die entsulfatierte Probe (hier bezeichnet mit G2999H) wird in 20 mL Wasser gelöst und auf 4°C abgekühlt. Nach Zugabe von 20 mL 0,2 M NaJ0₄-Lösung wird das Ganze im Dunkeln 20 h lang gerührt, worauf die Reaktion durch Zugabe von Ethylenglykol angehalten und die Salze durch Tangentialultrafiltration beseitigt werden. 400 mg NaBH₄, aufgeteilt in mehrere Portionen, werden zur entsalzten Lösung (30 bis 40 mL) gegeben. Die Lösung wird 3 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann mit verdünnter HCl neutralisiert und durch Tangentialultrafiltration entsalzt. 710 mg Produkt, hier bezeichnet mit ST1514, werden erhalten.
Molekulargewicht (MG): 11.200 D, Polydispersionindex D: 1,3, Entsulfatierungsgrad: 1,9 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis); der Prozentsatz modifizierter Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren beträgt ca. 50 %. Die Verbindung wird mit NMR-Spektroskopie charakterisiert (1).
Beispiele 2 bis 4
Unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass die basische Lösung 15, 30 bzw. 60 min lang erwärmt wurde, wurden die folgenden Charakteristika erhalten:

– ST1513: Molekulargewicht (MG): 12.900 D, Polydispersionsindex D: 1,5, Entsulfatierungsgrad: 2,05 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis), Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren: 5 % Epoxigruppen, 29 % oxidierte und reduzierte (gespaltene) Uron-Reste;
– ST1516: Molekulargewicht (MG): 12.900 D, Polydispersionsindex D: 1,5, Entsulfatierungsgrad: 1,8 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis), Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren: 5 % Epoxigruppen, 29 % oxidierte und reduzierte (gespaltene) Uron-Reste;
– ST1515: Molekulargewicht (MG): 9.200 D, Polydispersionsindex D: 1,5, Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren: 11 % Epoxigruppen, 27,5 % oxidierte und reduzierte (gespaltene) Uron-Reste.

Claims

2-O-Entsulfatiertes Glycosaminoglycanderivat, insbesondere 2-O-entsulfatiertes Heparin, mit einem 2-O-Entsulfatierungsgrad von nicht mehr als 60 % der gesamten Uronsäuren, deren Glycosidring einer Glycol-Spaltung unterzogen worden ist.
Derivat gemäß Anspruch 1, das ein Heparin-artiges Glycosaminoglycan ist.
Derivatisiertes entsulfatiertes Heparin gemäß Anspruch 1, das ein modifiziertes Heparin ist, enthaltend Glycosamin-Reste mit unterschiedlichen Graden der N-Entsulfatierung und gegebenenfalls einer anschließenden vollständigen oder teilweisen N-Acetylierung.
Derivatisiertes entsulfatiertes Heparin gemäß Anspruch 1, das die folgende Formel (I) aufweist:
worin gilt: der U-Ring hat die folgende Bedeutung:
worin X und X', gleich oder verschieden, eine Aldehydgruppe oder eine -CH₂-D-Gruppe sind, worin D Hydroxy oder eine Aminosäure, ein Peptid oder ein Rest eines Kohlenhydrats oder Oligosaccharids ist; R und R₁ sind, gleich oder verschieden, ein SO₃- oder Acetyl-Rest; n und m können, gleich oder verschieden, von 1 bis 40 variieren; die Summe von n + m beträgt 6 bis 40; das m:n-Verhältnis beträgt 10:2 bis 1:1; das Symbol
besagt, dass die mit m und n markierten Einheiten statistisch entlang der Polysaccharid-Kette verteilt und nicht unbedingt in Sequenz vorliegen.
Derivat gemäß Anspruch 4, das ein teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 11.200 D, einem Polydispersionsindex von 1,3, einem Entsulfatierungsgrad von 1,99 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von ca. 50 % ist.
Derivat gemäß Anspruch 4, das ein teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 12.900 D, einem Polydispersionsindex von 1,5, einem Entsulfatierungsgrad von 2,05 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten ist.
Derivat gemäß Anspruch 4, das ein teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 11.000 D, einem Polydispersionsindex von 1,5, einem Entsulfatierungsgrad von 1,93 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten ist.
Derivat gemäß Anspruch 4, das ein teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin mit einem Molekulargewicht (MG) von 9.200 D, einem Polydispersionsindex von 1,5, einem Entsulfatierungsgrad von 1,93 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und mit einem Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 11 % Epoxidgruppen und 27,5 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten ist.
Verfahren zur Herstellung der Derivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, welches die Stufen umfasst: a) basische Behandlung bei einer Temperatur von Umgebungstemperatur bis 100°C, vorzugsweise von 50 bis 70°C und noch bevorzugter von 65°C, welche zur Eliminierung eines gesteuerten Prozentsatzes der Sulfatgruppen in Position 2 der Uronsäure und zur Bildung von Epoxidgruppen führt; und b) Öffnung des genannten Epoxidrings bei pH = 7 bei einer Temperatur von 50 bis 100°C und vorzugsweise von 70°C, um Galacturonsäure-Reste zu ergeben; oder, alternativ, c) Öffnung des genannten Epoxidrings bei einer Temperatur von 0 bis 30°C und vorzugsweise bei 25°C, um Iduronsäure-Reste zu ergeben; und d) Oxidation des Diols mit Natriumperjodat, um die Bildung des Glycosidrings und die Bildung von 2 Aldehydgruppen pro modifiziertem Rest zu ergeben; e) Reduktion der genannten Aldehydgruppen zum primären Alkohol, und gegebenenfalls, Überführung der Gruppe D zu einer Gruppe, die sich von Hydroxy unterscheidet, wie umfasst in den verschiedenen Bedeutung gemäß Anspruch 4; f) gegebenenfalls saure Hydrolyse, um Oligosaccharide, entsprechend den regulären Sequenzen, zu erhalten; oder, alternativ, g) partielle enzymatische Hydrolyse mit einem Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lyase, Heparinase, Heparitinase oder aus einem Äquivalent der in Stufe e) erhaltenen Produkte, um Oligosaccharide, vorzugsweise Tetra- oder Octasaccharide zu erhalten, wobei der nicht-reduzierende endständige Rest aus ungesättigter Iduronsäure und der reduzierende Rest aus einem N-Sulfoglucosamin bestehen und mindestens 1 Rest einer offenen Iduronsäure enthalten; oder, alternativ, h) die in Stufe a) erhaltene Verbindung oder das in Stufe b) erhaltene Produkt werden mit partieller Enzymhydrolyse behandelt; und, gegebenenfalls, i) die in einer der Stufen a), b) und e) erhaltenen Produkte werden teilweise 6-O-entsulfatiert, oder, alternativ, j) das teilweise oder vollständig 6-entsulfatierte Ausgangsheparin wird den Stufen a), b), d) und e) unterzogen.
Teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Stufe a) 45 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei pH = 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 11.200 D, einen Polydispersionindex von 1,3, einen Entsulfatierungsgrad von 1,99 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren von ca. 50 % gegenüber den gesamten Uronsäuren aufweist.
Teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Stufe a) 15 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei pH = 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 12.900 D, einen Polydispersionsindex von 1,5, einen Entsulfatierungsgrad von 2,05 (ausgedrückt als SO₃ ^–:COO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten aufweist.
Teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Stufe a) 30 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei pH = 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 11.000 D, einen Polydispersionsindex von 1,5, einen Entsulfatierungsgrad von 1,80 (ausgedrückt als SO₃ ^–:CO^–-Molverhältnis) und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 5 % Epoxidgruppen und 29 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten aufweist.
Teilweise 2-O-entsulfatiertes Heparin, erhältlich mit dem Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Stufe a) 60 min lang bei 60°C und die Stufe b) bei 70°C bei pH = 7 durchgeführt werden, und wobei dieses Heparin ein Molekulargewicht (MG) von 9.200 D, einen Polydispersionsindex von 1,5 und einen Prozentsatz der modifizierten Uronsäuren gegenüber den gesamten Uronsäuren von 11 % Epoxidgruppen und 27,5 % oxidierten und reduzierten Uron-Resten aufweist.
Mischungen aus Oligosacchariden mit antiangiogener Aktivität, erhältlich aus einem sauren Abbau der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8.
Mischungen aus Oligosacchariden mit antiangiogener Aktivität, erhältlich aus Stufe f) des Verfahrens gemäß Anspruch 9.
Mischungen aus Oligosacchariden mit antiangiogener Aktivität, erhältlich aus Stufe g) des Verfahrens gemäß Anspruch 9.
Mischungen aus Oligosacchariden mit antiangiogener Aktivität, erhältlich aus Stufe h) des Verfahrens gemäß Anspruch 9.
Mischungen aus Oligosacchariden mit antiangiogener Aktivität, erhältlich aus Stufe i) des Verfahrens gemäß Anspruch 9.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10 bis 18 als Wirkbestandteil in Abmischung mit pharmazeutisch zulässigen Vehikeln und Exzipienten.
Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10 bis 18 als Medikamente.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments mit antiangiogener Aktivität.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung pathologischer Zustände aufgrund abnormer Angiogenese.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, gegebenenfalls auch von Metastasen.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumor-Metastasen.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von diabetischer Retinopathie.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von retrolentikulärer Fibroplasie.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Psoriasis.
Verwendung gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Restenose nach einem Herz-Bypass.