DE69533370T2

DE69533370T2 - Heparinähnliche sulfatierte Polysaccharide

Info

Publication number: DE69533370T2
Application number: DE69533370T
Authority: DE
Inventors: Rolando Barbucci; Agnese Magnani; Gloria Cialdi
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-23
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2015-03-24
Also published as: EP0702699A1; US6051701A; ATE273324T1; DE69516960T2; ITPD940054A1; ES2148504T3; US6339074B1; EP0702699B1; CA2163337A1; CA2163337C; EP0940410B1; WO1995025751A1; ES2224541T3; ITPD940054A0; US6027741A; DE69533370D1; ATE193023T1; JPH09510493A; JP2007262426A; EP0940410A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die homogene Sulfatierung von Polysacchariden und halbsynthetischen Derivaten davon, insbesondere Glycosaminoglycanen, wie Hyaluronsäure und ihren Estern und Tetraalkylammoniumsalzen, für die Herstellung von neuen Biomaterialien, welche nützlich in biomedizinischen, Gesundheitspflege- und pharmazeutischen Anwendungen sind, und derartige Biomaterialien an sich. Solche sulfatierten Derivate zeigen eine antithrombotische Aktivität, wie durch die Verlängerung sowohl der Thrombinzeit als auch der Vollblutgerinnungszeit verdeutlicht wird. Darüber hinaus zeigen die Abwesenheit von Hämolyse und das Wachstum und die Gestalt von Endothelzellen, welche mit solchen sulfatierten Derivaten in Kontakt gebracht wurden, dass diese Materialien vielversprechende heparinähnliche Verbindungen sind.
Beschreibung des betroffenen Fachgebiets
Viele Moleküle biologischen Ursprungs sind Polyelektrolyte, und ihre Wechselwirkungen sind in einer großen Vielzahl biochemischer Reaktionen sehr bedeutsam. Folglich sind synthetische und/oder halbsynthetische Polyelektrolyte nunmehr für einige Zeit in Verwendung gewesen. Diese Polyelektrolyte ahmen die biologischen Merkmale natürlicher Polyelektrolyte nach und können geringfügig unterschiedliche Merkmale im Vergleich zum Ausgangsmaterial aufweisen.
Polyelektrolyte biologischen Ursprungs schließen sulfatierte Polysaccharide und insbesondere Heparin und seine Derivate (D. A. Lane und U. Lindahl, Hrsg., Heparin – Chemical and Biological Properties, Clinical Applications, Edward Arnold, London) ein, welche eine wichtige Rolle in Zell-Substrat-Wechselwirkungen, insbesondere im Prozess der Inhibition viraler Aktivität, im Prozess der Blutgerinnung, bei der Lipidentfernung etc. spielen.
Heparin ist das biologisch reaktivste Mitglied der Familie der sulfatierten Glycosaminoglycane. Es ist wegen seiner antithrombotischen und gerinnungshemmenden Eigen schaften gut bekannt. Tatsächlich wird es bei der Behandlung von kardiovaskulären Krankheiten umfassend eingesetzt und trägt enorm zum Erfolg der offenen Herzchirurgie bei. Nichtsdestoweniger ist die Struktur von Heparin nicht einfach und ist wegen der Zahl an Variationen nicht vollständig bekannt. Kommerzielle Heparine bestehen aus einem Spektrum von 21 Heparinen (Nader et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun. 57: 488), welche von Molekulargewichten von 3000 bis 37500 bei variierenden gerinnungshemmenden Aktivitäten reichen.
Die Blut-Antigerinnungs-Aktivität von Heparin wird strukturellen Merkmalen zugeschrieben, z. B. dem Ausmaß der Sulfatierung, dem Ausmaß der Dissoziation, besonderen Sequenzen von COO^–- und SO^– ₃-Gruppen, sowie der molekularen Gestalt und Größe. Diese Faktoren scheinen dank ihrer Bedeutung für das Ionenbindungsvermögen von Heparin mit der biologischen Aktivität zusammenzuhängen (Stivala et al. (1967) Arch. Biochem. Biophys. 122: 40). Wegen seiner hoch negativ geladenen Natur besitzt Heparin eine starke Affinität für Kationen, und seine Aktivität ist pH-abhängig.
Die meisten der leicht verfügbaren natürlichen Polysaccharide sind sulfatiert worden, im Bestreben, Heparin-Analoge zu erhalten (Hoffman et al. (1982) Carbohydrate Res. 2: 115; Kindness et al. (1980) Brit. J. Pharmac. 69: 675; Horton et al. (1973) Carbohydrate Res. 30: 349; Okada et al. (1979) Makromol. Chem. 180: 813; Kikuchi et al. (1979) Nippon Kagaku Kaishi 1: 127; Manzac et al. (1981) Proc. Third M. I. S. A. O. 5: 504), und in jüngster Zeit wurden Sulfat-, Karboxyl- und Sulfonatgruppen an synthetische Polymere, wie Polystyrol (Kanmaugue et al. (1985) Biomaterials 6: 297) und Polyurethan (Ito et al. (1992) Biomaterials 13: 131) gebunden. Die gerinnungshemmenden Aktivitäten dieser Materialien waren viel niedriger als bei Heparin und waren vom Typ und der Bindung der Substituenten, dem Grad der Substitution und den Sequenzen abhängig.
Es sind einige chemische Reaktionen bekannt, welche es möglich machen, Polysaccharide zu sulfatieren (WO 88/00211; EP 0 340 628 ; Nagasawa et al. (1986) Carbohydrate Research 158: 183–190), aber es ist noch nicht möglich gewesen, sulfatierte Polysaccharide zu erhalten, welche neben den chemischen und chemisch-physikalischen Merkmalen, welche für derartige Polysaccharide besonders sind, ebenfalls neue Merkmale, wie gerinnungshemmende Aktivität, besitzen.
Die FR-A-2584728 offenbart ein Verfahren zum Sulfatieren eines Glycosaminoglycans in der Form eines Salzes, welches in einem organischen Medium löslich ist. Die FR-A-2584728 offenbart, dass das Glycosaminoglycan vorzugsweise aus Dermatansulfat, den Chondroitinen, Chondroitinsulfat oder Hyaluronsäure gewählt wird. Ein Sulfatierungsgrad im Bereich von 2 bis 4 wird im Allgemeinen für die sulfatierten Glycosaminoglycane offenbart.
Die US-A-2 599 172 offenbart Schwefelsäureester von Hyaluronsäure und Verfahren zur Herstellung derartiger Ester durch Veresterung mit Chlorsulfonsäure und rauchender Schwefelsäure, insbesondere bei geringer Temperatur.
Die WO-A-89/07932 offenbart die Verwendung eines sulfatierten Saccharides oder eines Salzes oder eines Komplexes davon als Bestandteil in topischen Präparationen für die Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten oder Befunden beim Zahn oder dem Zahn-Stützgewebe. Vorzugsweise ist das sulfatierte Saccharid ein polysulfatiertes oder persulfatiertes Saccharid, z. B. Sucralfat(Saccharose-oktakis)-Hydrogensulfat (Aluminiumkomplex) oder ein Natrium- und/oder Kaliumsalz von Saccharose-oktakis(hydrogensulfat). Die Präparation kann in der Form einer Lösung, Suspension, Salbe, Paste, Pulver, Gel, Creme, Dental-Fixativ, Zahnfleisch-Implantat, Kaugummi, kaubare Tablette, Brausetablette oder einer Pastille vorliegen.
Zusammenfassung der Erfindung
Das vorliegende Vorgehen zum Untersuchen der strukturellen Eigenschaften, welche mit den gerinnungshemmenden Eigenschaften von Polysacchariden assoziiert sind, bestand darin, zunächst Polymere, welche wohl definierte chemische Gruppen besitzen, bestehend aus regelmäßig wiederkehrenden Einheiten, auszuwählen, und als Zweites ihre chemische Struktur zu modifizieren.
Solche Moleküle müssen deshalb:

(1) regelmäßige Sequenzen von monomeren Einheiten enthalten, und
(2) ohne Zerstörung ihrer Struktur chemisch modifizierbar sein.

Hyaluronsäure, die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix bei Säugern, besteht aus abwechselnden Einheiten von N-Acetylglucosamin- und Glucuronsäure-Resten, und scheint deswegen ein geeignetes Makromolekül zu sein.
Die Sulfatierung von alkoholischen Hydroxylen, welche in der Polymerkette eines Polysaccharides oder eines seiner semisynthetischen Derivate vorhanden sind, durch Verwenden eines geeigneten Sulfatierungsmittels kann zur Bildung neuer Derivate mit chemisch-physikalischen Merkmalen, aber vor allem biologischen Merkmalen, welche von denjenigen des Ausgangsmaterials verschieden sind, führen.
Die Polyelektrolyt-Polysaccharide, welche als Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Glycosaminoglycane ein. Zuerst und vor allem handelt es sich unter diesen um Hyaluronsäure und semisynthetische Derivate hiervon. Einige besonders wichtige semisynthetische Derivate von Hyaluronsäure sind ihre Ester mit Alkoholen der aliphatischen, araliphatischen, heterozyklischen und cycloaliphatischen Reihen, bezeichnet als "HYAFF", welche beschrieben sind in den U.S.-Patenten 4 851 521, 4 965 353 und 5 202 431 und dem EP 0 216 453 . Die Sulfatierung derartiger vorverarbeiteter Biomaterialien ist ein neues Merkmal der vorliegenden Erfindung. In diesem Falle findet die Sulfatierungsreaktion nicht länger in der homogenen Phase statt sondern vielmehr auf der Oberfläche des Biomaterials in der heterogenen Phase, wobei die gegenüber dem Reaktionslösungsmittel exponierten Hydroxylgruppen aktiviert werden.
Der Sulfatierungsgrad, welcher direkt auf dem Biomaterial erhalten werden kann, ist ein bedeutsames Merkmal und erfordert eine sorgfältige kinetische Regulierung. Um die Solubilisierung des Biomaterials zu verhindern, welche durch die erhöhte hydrophile Natur des Polymeren, welches die Matrix bildet, induziert wird, darf die Anzahl von -SO₃-Gruppen je dimerer Einheit einen bestimmten Spiegel nicht überschreiten, im Allgemeinen geringer als 1,5–2, was von dem Ausmaß der Hydrophilität des Ausgangs-Biomaterials abhängt. Im Falle von HYAFF-11-Folien, worin alle Carboxyle an der Esterbindung mit Benzylgruppen beteiligt sind, sollte der Maximum-Sulfatierungsgrad beispielsweise 1,5 nicht übersteigen.
Die Reagenzien, welche üblicherweise für Sulfatierung verwendet werden, schließen den Komplex zwischen Schwefeltrioxid und Pyridin (SO₃-Pyridin) ein.
Die Reaktion wird durch Zusetzen des Sulfatierungs-Reagenz zu einem Tetrabutylammoniumsalz eines Polysaccharids in Lösung, oder zu einer Lösung eines Polysaccharidesters, welcher, im Falle von Partialestern, die verbleibenden Carboxyfunktionen in der Form von Tetrabutylammoniumsalzen enthält, in aprotischen Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid, N,N'-Dimethylformamid und N-Methylpyrrolidon, in einem Temperaturbereich von 0°C bis 60°C durchgeführt.
Unterschiedliche Sulfatierungsgrade, gemessen durch die Zahl an Sulfatgruppen pro Disaccharid-Einheit, werden durch Variieren der Menge von SO₃-Pyridin erhalten. Das Verhältnis zwischen der Molzahl an Hydroxylen und der Molzahl an Sulfatierungsreagenz kann zwischen 1 : 1 und 1 : 12 schwanken.
Überraschenderweise gelang es den Anmeldern der vorliegenden Erfindung. die Polysaccharidkette von Hyaluronsäure und ihren semisynthetischen Derivaten auf eine spezifische und homogene Weise zu sulfatieren, ohne den Verlust der Merkmale des Polymeren, insbesondere dessen Molekulargewicht, zu verursachen, wodurch neue Polymere mit biologischen und physiko-chemischen Merkmalen erhalten werden, welche Hyaluronsäure und ihre semisynthetischen Derivate früher nicht besaßen.
Durch dieses Verfahren ist es möglich, neue Polymere mit unterschiedlichen Sulfatierungsspiegeln, aber mit dem gleichen Molekulargewicht zu erhalten. Polymere mit neuen biologischen Merkmalen können durch Verwenden von Biopolymeren, worin die Carboxygruppen mit Tetrabutylammonium-Salz versalzt sind, als Ausgangsmaterialien erhalten werden. Derartige Biopolymere sind nicht hämolytisch.
Ein bemerkenswertes Kennzeichen dieser sulfatierten Polysaccharide ist ihr Vermögen, die Blutgerinnungszeit zu erhöhen. Der Thrombinzeit-Test wird durchgeführt durch Messen, wie lang es dauert, damit Fibrinogen zu Fibrin umgewandelt wird, sobald Thrombin zu einer Probe von menschlichem Blut in Gegenwart des Testmaterials zugesetzt worden ist. Der Thrombinzeit-Test in derselben Blutprobe, jedoch in Gegenwart des als Ausgangsmaterial verwendeten Polymeren, wird als ein Referenzwert herangezogen. Der Test verliert nach über 240 Sekunden die Signifikanz. Die Gerinnungszeit wird einfach durch Messen der Zeit bestimmt, welche benötigt wird, damit eine Probe von menschlichem Blut in Gegenwart des Testmaterials gerinnt. Zeiten, welche zwei Stunden überschreiten. werden nicht berücksichtigt.
Unter Verwendung der neuen Biopolymere der vorliegenden Erfindung ist es möglich, neue Biomaterialien zur Verwendung auf den biomedizinischen, Gesundheitspflege- und pharmazeutischen Gebieten zu entwickeln. Die erhaltenen Produkte besitzen biokompatible und biologische Merkmale, wie antithrombotische, gerinnungshemmende und antivirale Aktivitäten. Beispielsweise ist von sulfatierten Polyanionen gezeigt worden, antivirale Aktivität, einschließlich HIV-Inhibierung, zu zeigen. Die neuen Biopolymere der vorliegenden Erfindung können auch vorteilhaft bei Zellwachstums-Verfahren, in Systemen mit regulierter Arzneimittelfreisetzung und, allgemeiner, bei der inneren Chirurgie, in der extrakorporalen Sauerstoff-Zirkulation, bei der Adhäsions-Verhinderung, bei permanenten und bioabbaubaren Implantaten und in der Dialyse eingesetzt werden.
Wie im Fall anderer sulfatierter Polymere, wie Dextranen, inhibiert beispielsweise sulfatierte Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 10000 und 50000 Daltons die Herstellung von Tumornekrosefaktor (TNF), welcher das Hauptziel bei der Proliferation von Entzündungs-Zellen ist. Sulfatierte Hyaluronsäure kann deshalb als ein lokales entzündungshemmendes Mittel in der Form von auf Hyaluronsäure basierenden Biomaterialien oder Zusammensetzungen verwendet werden.
Die neuen Polymere können deshalb in der Form von Gels, Cremes oder Salben hergestellt werden und können verwendet werden, um Biomaterialien in der Form von Fäden, Schwämmen, Gaze, Membranen, Führungskanälen, Nicht-Woven-Geweben und Mikrokügelchen und Mikrokügelchen gemäß der therapeutischen Anwendungen, für welche sie beabsichtigt sind, herzustellen. Zuletzt ist es, abhängig vom Sulfatierungsgrad und dem Molekulargewicht des Polymeren möglich, Polymere herzustellen, welche antivirale Aktivität aufzeigen und/oder welche verwendet werden können, um in die verschiedenen Stadien von Zellwechselwirkungen einzugreifen. Diese Biopolymere können auch in Beschichtungsverfahren verwendet werden, welche neue biologische Eigenschaften an die Oberfläche von Trägermaterial, wie biomedizinischen Objekten und Vorrichtungen, verleihen.
Solche sulfatierten Biomaterialien können in Anwendungen eingesetzt werden, bei welchen das Produkt mit dem Blut oder stark vaskularisierten Geweben in Kontakt kommt, z. B. dem Einsatz von biopolymeren Dialyseschläuchen oder Membranen für innere oder äußere Chirurgie, welche in der Lage zur Verminderung der Zell-Adhäsion sind, etc. Insbesondere können die neuen, löslichen sulfatierten Hyaluronsäure-Derivate der vorliegenden Erfindung in der großen Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, welche im Fachgebiet bereits für Biomaterialien auf Hyaluronsäure-Basis gut bekannt sind.
Während Hyaluronsäure-Derivate mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 2,5 eine gute gerinnungshemmende Aktivität aufzeigen, kann beispielsweise auch das Molekulargewicht des Ausgangspolymeren bedeutend bei der Beeinflussung der Eigenschaften der neuen sulfatierten Biopolymere der vorliegenden Erfindung sein.
Insbesondere sind mindestens vier sulfatierte Hyaluronsäurederivate wegen ihres Molekulargewichts und Sulfatierungsgrads bemerkenswert. Bei diesen handelt es sich um:

1. Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 10000 und 50000 Daltons und mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5, 3,0 oder 3,5;
2. Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 50000 und 250000 Daltons und mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5, 3,0 oder 3,5;
3. Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 250000 und 750000 Daltons und mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5, 3,0 oder 3,5; und
4. Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 750000 und 1250000 Daltons und mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5, 3,0 oder 3,5.

Die Hyaluronsäurefraktionen mit den oben stehend beschriebenen Molekulargewichten können durch die Verwendung von Membranen mit besonderen Molekulargewichts-Ausschlusspunkten erhalten werden, wie im Fachgebiet bekannt ist.
Unter den semisynthetischen Esterderivaten von Hyaluronsäure sind polymere Matrizes von HYAFF 11 (100% Benzylester von Hyaluronsäure), sulfatiert zu Graden von 1,0 und 1,5, und HYAFF 11p75 (75% Benzylester von Hyaluronsäure), sulfatiert zu Graden von 0,5 und 1,0, besonders interessant.
Der weitere Umfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der ausführlichen Beschreibung und den Zeichnungen, welche nachstehend angegeben sind, offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obengenannten und weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden ausführlichen Beschreibungen im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen besser verständlich werden, welche sämtlich nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben werden, und welche nicht einschränkend für die vorliegende Erfindung sind, worin:
Die 1 den Effekt von Hyaluronsäure, sulfatiert mit 2,0, 2,5, 3,0 und 3,5SO₃-Gruppen pro wiederkehrender Einheit, auf die Vollblut-Gerinnungszeit (WBCT) und die Thrombinzeit (TT) zeigt.
Die 2 zeigt das Wachstum von menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen in Kontrollmedium (♦) sulfatierte Hyaluronsäure enthaltendem Medium (
) und Hyaluronsäure enthaltendem Medium (
), wie in Beispiel 14 beschrieben wird.
Die 3 ist eine schematische Wiedergabe einer Schale, welche für den Gelatine-Agarose-Test, beschrieben in Beispiel 15, angefertigt wurde. Oben: Querschnitt, welcher eine Zentral-Vertiefung und zwei benachbarte, 2 mm entfernt gelegene Vertiefungen zeigt. Das BACE wird in die Zentralvertiefung gebracht, und das Testmaterial und die Kontrolle werden in die benachbarten Vertiefungen eingebracht. Unten: Für den Test bereite Schale. Eine vierte Vertiefung, welche BACE enthält, ist etwa 2 cm entfernt von den drei ausge richteten Vertiefungen angeordnet (die Proportionen der Abstände sind in der Figur nicht beibehalten). Die vierte Vertiefung ist von dem Einfluss des Testmaterials weit entfernt und wird als eine Kontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass die Wanderung von BACE ausserhalb der Vertiefung als ein gleichmäßiger Halo bzw. Hof stattfindet, wenn keine Behandlung angewandt wird.
Die 4A, 4B, 5A, 5B, 6A und 6B verdeutlichen die Ergebnisse der Überprüfung der Induktion von Gefäßbildung in vitro, beschrieben im Beispiel 15. Die 4A und 4B zeigen die präferenzielle Wanderung von Endothelzellen eher in Richtung auf Cu(II)-sulfatierte Hyaluronsäure als in Richtung auf sulfatierte Hyaluronsäure allein. Die 5A und 5B zeigen die präferenzielle Wanderung von Endothelzellen eher in Richtung Cu(II)-Heparin als in Richtung auf Heparin allein. Die 6A und 6B zeigen, dass es keine präferenzielle Wanderung von Endothelzellen eher in Richtung auf den Cu(II)-Tris-Komplex als in Richtung auf das Medium allein gibt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung wird angegeben, um dem Fachmann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zu helfen.
Aus Zwecken der Veranschaulichung werden nachstehend einige Beispiele der Herstellung von neuen sulfatierten Polymeren gemäß der vorliegenden Erfindung vorgestellt. Obgleich diese Beispiele sich auf Hyaluronsäure und ihre semisynthetischen Derivate, wie Tetrabutylammonium-Salze und Ester, richten, können die gleichen Verfahren auf andere Polysaccharide angewandt werden, wie andere Glycosaminoglycane, Alginsäure, Gellan, Carboxymethylcellulose, Carboxymethylamid und Carboxymethylchitin und semisynthetische Derivate hiervon, wie ihre Tetrabutylammoniumsalze und Partialester mit aliphatischen, araliphatischen, heterocyclischen und cycloaliphatischen Alkoholen, wie beschrieben in den U.S.-Patenten 4 851 521, 5 122 598, 5 300 493, 5 332 809 und 5 336 668; der europäischen Patentanmeldung Nr. 93 917 681.4; EP 0 216 453 , EP 0 251 905 , EP 0 342 557 , EP 0 518 710 , EP 0 603 264 und EP 0 605 478 ; und WO 93/06136 und WO 94/03499.
Beispiel 1
Sulfatierung von Natriumhyaluronat, Sulfatierungsgrad 3
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes von Hyaluronsäure werden in 10 ml Dimethylformamide (DMF) solubilisiert. 1,305 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml DMF, werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, gereinigtes Wasser werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 0°C und 4°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch Kernmagnetresonanz (NMR) bestimmt.
Die Thrombinzeit und Gerinnungszeit in diesem und dem folgenden Beispielen wurden bestimmt, wie beschrieben in WO 92/11294. Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 42,2 im Vergleich zu den 11,3 Sekunden des Ausgangspolymers und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten, welche in dem Kontrollblut gemessen wurden.
Beispiel 2
Sulfatierung von Natriumhyaluronat, Sulfatierungsgrad 3,5
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes von Hyaluronsäure werden in 10 ml Dimethylformamide (DMF) solubilisiert. 2,088 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml DMF, werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch Kernmagnetresonanz (NMR) bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine unbegrenzte Thrombinzeit im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer.
Beispiel 3
Sulfatierung des Partialethylesters von Hyaluronsäure: 75% der Carboxygruppen sind in der Form des Ethylesters, Sulfatierungsgrad 3
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes des 75%-Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-7p75) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 1,305 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 45 Sekunden, im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer, und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 4
Sulfatierung des Partialethylesters von Hyaluronsäure: 50% der Carboxygruppen sind in der Form eines Ethylesters, Sulfatierungsgrad 2,5
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes des 50%-Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-7p50, 50% der Carboxygruppen sind mit Ethanol verestert) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 1,044 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 47 Sekunden im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 5
Sulfatierung des Partialethylesters von Hyaluronsäure: 25% der Carboxygruppen sind in der Form eines Ethylesters, Sulfatierungsgrad 2
0,250 Gramm des TBA-Salzes eines Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-7p25, 25% der Carboxygruppen sind mit Ethanol verestert) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 0,783 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8.5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 49 Sekunden im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 6
Sulfatierung des Partialbenzylesters von Hyaluronsäure: 75% der Carboxygruppen sind in der Form eines Benzylesters, Sulfatierungsgrad 3,5
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes eines Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-11p75, 75% der Carboxygruppen sind mit Benzylalkohol verestert) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 2,088 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 44 Sekunden im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 7
Sulfatierung des Partialbenzylesters von Hyaluronsäure: 50% der Carboxygruppen sind in der Form eines Benzylesters, Sulfatierungsgrad 3
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes eines Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-11p50, 50% der Carboxygruppen sind mit Benzylalkohol verestert) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 1,305 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 46 Sekunden im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 6
Sulfatierung des Partialbenzylesters von Hyaluronsäure: 25% der Carboxygruppen sind in der Form eines Benzylesters, Sulfatierungsgrad 2
0,250 Gramm des Tetrabutylammoniumsalzes eines Partialethylesters von Hyaluronsäure (HYAFF-11p25, 25% der Carboxygruppen sind mit Benzylalkohol verestert) werden in 10 ml Dimethylformamid (DMF) solubilisiert. 0,522 Gramm SO₃-Pyridin, solubilisiert in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), werden dieser Lösung unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Die Lösung wird mindestens eine Stunde lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C geschüttelt. Etwa 200 ml, auf 0°C gekühltes, H₂O werden anschließend zugegeben. Der pH-Wert der Mischung wird durch Zugeben von 1 M Natriumhydroxid auf einen Wert zwischen 8,5 und 9,5 gebracht. Das Derivat wird dann mit 120 ml Ethylalkohol präzipitiert. Wasserfreies Natriumacetat wird bis zur Sättigung zugegeben, und das Präzipitat wird zwischen 1 und 24 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen 4°C und 0°C absetzen gelassen. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation, beispielsweise 15 Minuten lang bei 1500 U/min, abgetrennt, in gereinigtem H₂O solubilisiert und dann dialysiert, bis sämtliche(s) restliche(s) Reagenz und Reaktionsprodukte vollständig eliminiert worden sind. Der Grad der Sulfatierung wird durch NMR bestimmt.
Das so erhaltene Produkt besitzt eine Thrombinzeit von 48 Sekunden im Vergleich zu 11,3 Sekunden für das Ausgangspolymer und eine Gerinnungszeit von über 2 Stunden im Vergleich zu 28 Minuten für das Kontrollblut.
Beispiel 9
Herstellung von Folien von HYAFF 11, Sulfatierungsgrad 1,5
0,250 Gramm einer Folie aus HYAFF 11 werden in einem Bad von 250 ml einer Mischung von Chloroform : Dimethylformamid in einem Verhältnis von 1 : 1 eingetaucht. 50 ml einer Lösung, erhalten durch Solubilisieren von 3,4 Gramm eines Komplexes von Pyridin-SO₃ in Dimethylformamid werden dann zugesetzt.
Die Reaktion wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur voranschreiten gelassen, wonach die Folie entfernt und in einem Bad von destilliertem Wasser (100 ml) und zuletzt in einer Lösung von Wasser : Ethanol, 50 : 50, eingetaucht wird. Die Folie wird dann 48 Stunden lang bei 55°C in einem Ofen getrocknet.
Beispiel 10
Herstellung von Folien von HYAFF 11p75, Sulfatierungsgrad 1
0,250 Gramm einer Folie aus HYAFF 11p75 werden in einem Bad von 250 ml einer Mischung von Chloroform : Dimethylformamid in einem Verhältnis von 1 : 1 eingetaucht. 50 ml einer Lösung, erhalten durch Solubilisieren von 2,3 Gramm eines Komplexes von Pyridin-SO₃ in Dimethylformamid werden dann zugesetzt.
Die Reaktion wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur voranschreiten gelassen, wonach die Folie entfernt und in einem Bad von destilliertem Wasser (etwa 100 ml) und zuletzt in einer Lösung von Wasser : Ethanol, 50 : 50, eingetaucht wird. Die Folie wird dann 48 Stunden lang bei 55°C in einem Ofen getrocknet.
Beispiel 11
Biologische Charakterisierung von löslicher sulfatierter Hyaluronsäure und Hyaluronsäureestern
Vollblut-Gerinnungszeit in Gegenwart von sulfatierter Hyaluronsäure mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden
Dieser Test wurde an Hyaluronsäure und sulfatierter Hyarulonsäure unter Verwendung von Blut aus einem einzigen Spender durchgeführt. Die Kontrolle enthielt Blut allein.
Für jeden Test wurden drei Reagenzgläser, welche jeweils 5 ml Blut enthielten, vorbereitet. Das Erste stellt die Leerprobe dar, während im Zweiten und Dritten 25 mg Hyaluronsäure bzw. 25 mg sulfatierte Hyaluronsäure solubilisiert wurden.
Die Ergebnisse sind in der 1 gezeigt, worin es ersehen werden kann, dass Hyaluronsäure mit 3,0 und 3,5SO₃-Gruppen pro wiederkehrender Einheit zu Vollblutgerinnungszeiten (WBCT) gleich Unendlich führte. Die Gerinnungszeit für Vollblut-Kontrollen belief sich auf ungefähr 15 Minuten. Blut in Gegenwart von Hyaluronsäure war nach 45 Minuten geronnen.
Thrombinzeit in Gegenwart von sulfatierter Hyaluronsäure mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden
Die Throminzeit für Hyaluronsäure mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden wurde unter Verwendung eines Elvi 820 Digiclot (Logos S. p. A., Mailand, Italien) bestimmt. Diese Vorrichtung besitzt eine Inkubationsplatte, welche auf eine Temperatur von 37°C einge stellt ist, und nimmt 32 Reagenzgläser und vier Reagenziengefäße auf, von denen zwei bei 600 U/min magnetisch gerührt werden können. Sie enthält zwei thermostatische Mess-Vertiefungen, welche mit einem Magnetrührer bei 300 U/min ausgestattet sind, und einen lichtabschließenden Deckel. Eine magnetische Pipette mit anpassbarem Volumen (0,1–0,2 ml) zur Reagenzienverteilung aktiviert die Vorrichtung, welche selbst durch die geringsten Variationen der optischen Dichte hinsichtlich einer Gerinnselbildung gestoppt wird. Die Gerinnung wird photometrisch verfolgt. Ein Lichtstrahl aus einer Leuchte tritt zuerst durch einen 525-nm-Interferenzfilter und zuletzt durch eine Kapazitäts-Zelle. Eine Photodiode misst die Variationen der optischen Dichte des Plasmas bei Gerinnselbildung. Ein photometrischer Signalprozessor hält das digitale Chronometer beim nähestliegenden Zehntel einer Sekunde an. Der Thrombinzeit-Test wird unter Verwendung des Reagenz "Thrombina" (Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica) durchgeführt.
Der Test wird an allen Proben durchgeführt unter Verwendung von Plasma, erhalten durch Zentrifugation von Blut aus mehreren Spendern (Plasma-Pool), welche zuvor mit einem gerinnungshemmenden Mittel (1 ml einer Lösung von Natriumcitrat/9 ml Blut) behandelt worden waren. Die Lösungen wurden bei Konzentrationen von 1 mg/ml Hyaluronsäure und sulfatierter Hyaluronsäure in Phosphatpufferlösung hergestellt.
Wie in der 1 zusammengefasst wird. verlängert Hyaluronsäure mit 2,5, 3,0 und 3,5SO₃-Gruppen pro wiederkehrender Einheit die Thrombinzeit. Hyaluronsäure mit 2,0SO₃-Gruppen je wiederkehrender Einheit verlängerte die Thrombinzeit nicht, d. h. die Thrombinzeit war gleich zu derjenigen in der Kontrolle, was zeigt, dass dieses besondere sulfatierte Hyaluronsäure-Derivat keine heparin-artige gerinnungshemmende Aktivität aufweist. Die Thrombinzeit in Gegenwart von Hyaluronsäure ist ähnlich zu jener in der Kontrolle.
In der 1 wird ebenfalls die Menge von Heparin gezeigt, welche 1 mg des sulfatierten Hyaluronsäure-Produkts entspricht, was mittels einer Kalibrierungskurve bestimmt wurde.
Thrombinzeit in Gegenwart von sulfatierten Hyaluronsäureestern mit unterschiedlichen Sulaftierungsgraden
Die Throminzeit wurde auch an Plasma bestimmt, in welchem sulfatierte Derivate von Hyaluronsäure (Hyaluronsäure-Molekulargewicht = 200000 Daltons), d. h. HYAFF 11 (100% Benzylester von Hyaluronsäure; Sulfatierungsgrad 2,0), HYAFF 11p25 (25 Benzylester von Hyaluronsäure; Sulfatierungsgrad 3,0) und HYAFF 11p75 (75% Benzylester von Hyaluronsäure; Sulfatierungsgrad 3,5), solubilisiert worden waren.
Im Falle des sulfatierten HYAFF 11 wurde der Einfluss der Konzentration davon, und von Thrombin, auf die TT untersucht.
Die Ergebnisse für sulfatiertes HYAFF 11 sind in der Tabelle 1 gezeigt, worin Hyaluronsäure als eine Referenz verwendet wurde, da sie in Plasma löslich ist, und wobei die Thrombin-Konzentration in internationalen Einheiten (International Units, UI) angegeben ist.
Tabelle 1 Thrombinzeit in Gegenwart von sulfatiertem HYAFF 11
Diese Ergebnisse offenbaren eine längere Thrombinzeit für Plasma in Gegenwart von sulfatiertem HYAFF 11 als in Gegenwart von Hyaluronsäure. Der Einfluss der Konzentrationen an Hyaluronsäure, sulfatierter Hyaluronsäure und Thrombin sollte bemerkt werden. Sulfatiertes HYAFF 11 (6 mg/ml) verlängerte die Thrombinzeit signifikant, wenn Thrombin bei entweder 6 UI oder 0,6 UI eingesetzt wird, im Vergleich zu Hyaluronsäure. Geringe Mengen (2 mg/ml) von sulfatiertem HYAFF 11 führten zu keiner signifikanten Variation der Thrombin-Zeit.
Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse für sulfatiertes HYAFF 11p25 und sulfatiertes HYAFF 11p75 auf die Thrombin-Zeit.
Tabelle 2 Thrombinzeit in Gegenwart von sulfatiertem HYAFF 11p25 und sulfatiertem HYAFF 11p75
Die Daten in der Tabelle 2 zeigen, das sowohl sulfatiertes HYAFF 11p25 als auch sulfatiertes HYAFF 11p75 die Thrombinzeit verlängern. Die längere Thrombinzeit für sulfatiertes HYAFF 11p75 entspricht etwa 0,15 UI/ml Heparin-Alctivität. Die längere Thrombinzeit für sulfatiertes HYAFF 11p25 entspricht etwa 0,25 UI/ml Heparin-Aktivität.
Reptilase-Zeit
Reptilase ist ein Enzym, welches im Gift von Bothrox atrops gefunden wird, welches Fibrinogen durch Abspaltung von dessen Fibrinopeptid A gerinnen lässt.
Die Reptilasezeit wird durch Auflösen von sulfatierter Hyaluronsäure oder sulfatiertem Hyaluronsäurederivat in 1 ml 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wovon dann 0,3 ml zu 0,3 ml menschlichem Plasma zugesetzt werden, bestimmt. Die Reptilase-Zeit wird durch Inkubieren des menschlichen Plasmas, enthaltend die sulfatierte Hyaluronsäure oder das Derivat, während 2 Minuten bei 37°C, danach Zusetzen von Reptilase-Reaktivstoff (Fraktion von Thrombin-Extrakten aus Bothrox atrops-Gift. Hemodiagnostica Diagnostica Stago, Boehringer Mannheim) und Messen der Gerinnungszeit in automatischer Weise (Elvi Digiclot 2 Coagulometer, Logos S. p. A., Mailand. Italien) bestimmt.
Die Tabelle 3 zeigt die Effekte des sulfatierten HYAFF 11, des sulfatierten HYAFF 11p25 und des sulfatierten HYAFF 11p75 auf die Reptilase-Zeit.
Tabelle 3 Reptilase-Zeit in Gegenwart von sulfatiertem HYAFF 11, sulfatiertem HYAFF 11p25 und sulfatiertem HYAFF 11p75
Die Daten in der Tabelle 3 zeigen, dass keines der sulfatierten Hyaluronsäure-Derivate irgendeinen signifikanten Effekt auf die Reptilase-Zeit besaß.
Beispiel 12
Hämolyse-Test
Der Hämolyse-Assay misst die direkte Wechselwirkung von Substanzen mit der Plasma-Membran von Erythrozyten.
25 mg sulfatierte Hyaluronsäure wurden in 0,5 ml Natriumzitrat gelöst. Das Assay-Röhrchen wurde dann mit 5 ml frischem menschlichen Blut gefüllt. Die Kontrolle enthielt lediglich mit Citrat versetztes Vollblut. Der Hämolyse-Test wurde durchgeführt, wie beschrieben in Albanese et al. (1994) Biomaterials 15: 129.
Die mit sulfatierter Hyaluronsäure erhaltenen Ergebnisse zeigen. dass dieses Material keinerlei hämolytische Aktivität aufzeigt.
Beispiel 13
Biologische Charakterisierung von unslöslichen, sulfatierten Hyaluronsäure-Derivaten
Thrombin-Zeit in Gegenwart von unlöslichen Folien von sulfatierten Hyaluronsäureestern mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden
Der Thrombinzeit-Test wurde an runden Stücken von unlöslichen Folien aus sulfatierten Hyaluronsäureestern, verwendet zur Auskleidung von Küvetten, im Wesentlichen wie beschrieben in Beispiel 11 für sulfatierte Hyaluronsäure mit unterschiedlichen Sulfatierungsgraden, durchgeführt. 1,2 ml Plasma wurden in jede Küvette gegeben, welches dann zusammen mit den Folien-Rundstücken 10 Minuten lang inkubiert wurde. 0,2 ml Thrombin-Reagenz wurden dann zugegeben, und die Gerinnungszeit wurde überwacht. Das Molekulargewicht von Hyaluronsäure und der Sulfatierungsgrad der Ester waren wie in Beispiel 11.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Thrombin-Zeiten von menschlichem Plasma, welches mit Folien von unlöslichen sulfatierten Hyaluronsäureestern in Kontakt gebracht wird
Die Daten in der Tabelle 4 zeigen keine signifikanten Variationen in den Thrombinzeiten von Plasma, welches in Kontakt mit Folien aus sulfatierten Hyaluronsäureestern gebracht wird.
Beispiel 14
Wachstum von kultivierten menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen in Gegenwart von sulfatierter Hyaluronsäure
Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen wurden aus Nabelschnüren durch Kollagenase-Verdau unter Befolgung eines Standard-Protokolls isoliert. Die Zellen wurden in einer 5%-CO₂-Atmosphäre bei 37°C in Medium 199 (GIBCO Laboratories) mit 20% fötalem Kälberserum, L-Glutamin und Gentamicin gehalten.
Die Endothelzellen wurden als solche durch ihre polygonale Morphologie identifiziert. Für Proliferations-Experimente wurden die Zellen verwendet, als die Kulturen Konfluenz er reicht hatten. Hyaluronsäure wurde in Medium 199 gelöst, bis eine Konzentration von 5 mg/ml erhalten wurde. Der Assay wurde geplant, um Kontaladauern von 24, 48 und 72 Stunden zwischen dem Material und den Zellen zu erlauben. Alle 24 Stunden wurde das Medium aus den Vertiefungen entfernt, und sterile PBS-Lösung wurde über die Folie gespült, um die nicht-angehefteten Zellen zu entfernen. Die Zellen wurden mit einem umgekehrten Mikroskop (DIAPHOT TMD Nikon) analysiert, und Bilder wurden mit einer Nikon-Kamera aufgenommen. Die Zellen wurden dann mit Trypsin abgelöst und in einer Burker-Kammer gezählt. Trypan-Blau wurde verwendet, um zwischen toten und lebenden Zellen zu unterscheiden.
Die 2 zeigt die Wachstumskurven der humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC).
Die Anzahl von Endothelzellen in Medium, welches sulfatierte Hyaluronsäure enthielt, stieg mit der Zeit an. und es wird ein besseres Wachstum gezeigt als in Medium, welches Hyaluronsäure enthält, oder in einer Reinmedium-Kontrolle.
Die Morphologie von Endothelzellen wurde unter Verwendung umgekehrter Mikroskopie untersucht. Die Endothelzellen in dem Medium, welches sulfatierte Hyaluronsäure enthielt, waren gut ausgebreitet, ohne morphologische Veränderung und ohne Strukturveränderungen in der Zellorganisation.
Die gleiche Morphologie wurde für die Endothelzellen in Gegenwart von Hyaluronsäure und für die Kontrolle bemerkt. Der einzige bemerkenswerte Unterschied bestand in der Zellproliferation. Tatsächlich waren die Zellen in dem Medium, welches sulfatierte Hyaluronsäure enthielt, nach einem Tag eine nahezu konfluente Monoschicht, wohingegen die Zellen in Medium, enthaltend Hyarulonsäure, oder in reinem Medium erst nach 3 Tagen Konfluenz erreichten.
Beispiel 15
Überprüfung der Induktion von Gefäßbildung in vitro
Sulfatierte Hyaluronsäure bildet, wie Heparin, Komplexe mit dem Cu(II)-Ion, welche eine stöchiometrische Zusammensetzung Cu(OH)₂L aufweisen ("L" = "Ligand") (Barbucci et al. (1995) Gazetta Chimica Italiana, im Druck). Wie aus der Literatur bekannt ist, zeigt der Cu(II)-Heparin-Komplex einen gefäßbildenden Effekt (Alessandri et al. (1983) Cancer Research 43: 1790–1797).
Die Fähigkeit von sulfatierter Hyaluronsäure, Gefäßbildung in vitro herbeizuführen, wurde deshalb unter Verwendung eines Zellmigrations-Verfahrens (Alessandri et al. (1953) Cancer Research 43: 1790–1797) untersucht.
Die Migration von Endothelzellen in Agar wurde beobachtet, wobei das Verfahren schematisch in der 3 gezeigt ist. Das Vermögen einer Testprobe, Gefäßbildung in vitro zu induzieren, kann durch die Anzahl von Endothelzellen bestimmt werden, welche präferenziell eher in Richtung auf die Testprobe als in Richtung auf die Kontrollprobe wandern.
Der Zellmigrations-Test zur Untersuchung der von dem Komplex Cu(II)-Heparin induzierten Gefäßbildung, wie beschrieben in Alessandri et al., wurde in einer Pufferlösung von 0,1 M Tris, pH 7,5, durchgeführt. Allerdings ist in Gegenwart von Tris der gebildete Komplex tatsächlich Cu(II)-Tris, nicht Cu(II)-Heparin, sodass der beobachtete gefäßbildende Effekt den Cu(II)-Tris-Komplex in Gegenwart von Heparin betrifft.
Die vorliegenden Tests wurden unter Verwendung einer Pufferlösung von 0,1 M PBS, pH 7,4, durchgeführt. Bei diesem pH-Wert präzipitiert das Cu(II), welches nicht in dem Komplex vorliegt, in der Form eines Hydroxids. Lösungen von Cu(II)-Biologischem-Molekül wurden deshalb auf Zellulosefiltern mit einer Porengröße von 0,2 Mikrometer filtriert, um das Kupferhydroxid-Präzipitat vor der Verwendung von Lösungen zum Testen zu eliminieren.
Zwei Proben von sulfatierter Hyaluronsäure, eine mit 2,0SO₃-Gruppen und die andere mit 3,5SO₃-Gruppen pro wiederkehrender Einheit, wurden analysiert. Die Experimente wurde in Wiederholungsansätzen durchgeführt, und es wurden auch Proben, welche die Komplexe Cu(II)-Heparin und Cu(II)-Tris enthielten, analysiert. In jedem Experiment wurde der gefäßbildende Effekt des Komplexes Cu(II)-Biologisches-Molekül im Vergleich zu denjenigen des biologischen Moleküls allein untersucht. In spezifischer Weise wurde Cu(II)-sulfatierte-Hyaluronsäure mit sulfatierter Hyaluronsäure verglichen, und Cu(II)-Heparin wurde mit Heparin verglichen. Im Falle von Cu(II)-Tris enthielt die Kontrollprobe lediglich Medium.
Wie in den 4A, 4B, 5A, 5B, 6A und 6B gezeigt wird, erwies sich der Komplex Cu(II)-sulfatierte Hyaluronsäure (3,5SO₃-Gruppen je wiederkehrender Einheit) als fähig zur Induzierung von Gefäßbildung in vitro zu einem ähnlichen Ausmaß, zu demjenigen des Komplexes Cu(II)-Heparin.
Wie in den 4A und 4B gezeigt, gibt es eine präferenzielle Migration von Endothelzellen in Richtung auf die Cu(II)-sulfatierte Hyaluronsäure eher als in Richtung auf sulfatierte Hyaluronsäure allein.
Im Fall von Heparin wandern Endothelzellen präferenziell eher in Richtung auf den Komplex Cu(II)-Heparin als in Richtung auf Heparin allein (5A und 5B).
Der Effekt ist mit sulfatierter Hyaluronsäure stärker ausgeprägt als mit Heparin (vergleiche 4A, 5A und 4B, 5B).
Andererseits gibt es, im Falle des Komplexes Cu(II)-Tris (6A und 6B), keine präferenzielle Migration der Zellen eher in Richtung auf den Komplex als in Richtung auf das Medium allein.
Der Effekt der Probe, welche Cu(II)-sulfatierte Hyaluronsäure (2,0SO₃-Gruppen pro repetitive Einheit) enthielt, war eher mit demjenigen des Komplexes Cu(II)-Tris vergleichbar als mit demjenigen des Komplexes Cu(II)-Heparin. Dies demonstriert, dass die Anzahl von SO₃-Gruppen pro repetitiver Einheit signifikant das Erhalten von heparinartiger Aktivität bei der Induzierung von Gefäßbildung in vitro beeinflusst.
Beispiel 16
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Präparationen und Biomaterialien, umfassend die neuen, sulfatierten Derivate von Hyaluronsäure und andere sulfatierte Polysaccharide der vorliegenden Erfindung, können an Menschen verabreicht werden, allein oder in Assoziation mit anderen chemischen Polymeren, wie Polyurethan, Polymilchsäure, Carboxymethylzellulose, Carboxymethylchitin, Carboxymethylstärke und vernetzten Polymeren, oder Hyaluronsäureestern, -salzen, -derivaten, -komplexen, -fragmenten, -untereinheiten und/oder pharmakologisch annehmbaren Arzneimitteln, und zwar als Hilfsmittel auf den Gebieten der Biomedizin, Gesundheitspflege und Pharmazie.
Aufgrund ihrer antithrombotischen und gerinnungshemmenden Aktivitäten können die Biopolymere der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zur Herstellung von Biomaterialien verwendet werden, wie Führungskanälen, einem Bypass, künstlichen Venen oder Shunts, welche in der Hämodialyse, Kardiologie, extrakorporalen Zirkulation und, allgemeiner, im kardiovaskulären System eingesetzt werden sollen.
Die gefäßbildende Aktivität von Cu(II)-Sulfatierten-Hyaluronsäure-Komplexen kann bei der Stimulierung des Kapillarenwachstums eingesetzt werden.
Es ist kürzlich gezeigt worden, dass sulfatierte Hyaluronsäure ein wirkungsvoller Inhibitor von Tumornehrosefaktor-α (TNF-α) und TNF-β ist (Chang et al. (1994) Journal of Leukocyte Biology 55: 776–764). Daher können die sulfatierten Hyaluronsäure- und Hyaluronsäureester-Produkte der vorliegenden Erfindung ebenfalls therapeutische Anwendung als entzündungshemmende Mittel in der Behandlung von TNF-vermittelter Entzündung, systemischer Toxizität und verwandten Pathologien finden.
Darüber hinaus können sulfatierte Hyaluronsäure-Derivate als Beschichtungen für die Oberflächen von Materialien unter Anwendung von Techniken, wie Plasmabeschichtung, zur Herstellung von Vorrichtungen, welche in extrakorporalen Zirkulations-Anwendungen verwendet werden sollen, eingesetzt werden.
Die sulfatierten Hyaluronsäurederivate der vorliegenden Erfindung können auch in der Form von Gaze, Fäden, Gelen, Hydrogelen, Schwämmen, Membranen, Non-Woven-Geweben und Mikrokügelchen, gemäß der therapeutischen Verwendung, für welche sie beabsichtigt sind, zur Förderung von Zellwachstumsprozessen, wie dem Keratinozyten-Wachstum, zur Beschleunigung der Heilung in Patienten, welche durch Dekubitus, Wunden, Verbrennungen und Hautgeschwüre betroffen sind, oder als Anti-Adhäsionsmittel in der Chirurgie verwendet werden.
In Abhängigkeit vom Sulfatierungsgrad und dem Molekulargewicht des Polymeren können die neuen sulfatierten Polysaccharide der vorliegenden Erfindung ebenfalls allein oder in Assoziation mit anderen chemischen Polymeren, wie denjenigen, welche obenstehend aufgelistet sind, oder mit vernetzten Polymeren oder Hyaluronsäureestern, -salzen, -derivaten, -komplexen, -fragmenten, -untereinheiten und/oder pharmakologisch annehmbaren Arzneimitteln, beispielsweise in der Dermatologie, Ophthalmologie, Otorhinolaryngologie, Odontologie, Gynäkologie, Urologie und als Arzneistoff-Zuführungssysteme bei der Behandlung von bakteriellen, mykotischen oder viralen Infektionen verwendet werden.
Beispiele von Kombinationsmedikamenten gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden ein:

– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einem Hyaluronsäureester, wie dem Benzyl- oder Ethylester;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einem vernetzten Hyaluronsäureester;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einem chemischen Polymer, wie den oben stehend aufgelisteten;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und Cu(II)-Ionen;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einem Metallion, wie Kalzium oder Silber;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einem Hyaluronsäureester mit einem Antiinfektionsmittel, wie einem basischen oder nicht-basischen Antibiotikum, Sulfamid, Antivirenmittel (wie Acyclovir), einem entzündungshemmendem Steroid-Mittel (wie Hydrokortison oder Prednisolon), einem entzündungshemmenden Nicht-Steroid-Mittel (wie Indomethacin), einem Wundheilungsmittel (wie epidermalem Wachstumsfaktor), einem antimikrobiellen Mittel. einem antibakteriellen Mittel oder einem Desinfektionsmittel;
– Assoziation von sulfatierter Hyaluronsäure und einer vernetzten Hyaluronsäure mit einem Antiinfektionsmittel, wie wie einem basischen oder nicht-basischen Antibiotikum, Sulfamid, Antivirenmittel (wie Acyclovir), einem entzündungshemmenden Steroidmittel (wie Hydrokortison oder Prednisolon), einem entzündungshemmenden Nicht-Steroid-Mittel (wie Indomethacin), einem Wundheilungsmittel (wie epidermalem Wachstumsfaktor), einem antimikrobiellen Mittel, einem antibakteriellen Mittel oder einem Desinfektionsmitel.

Claims

Sulfatierte Hyaluronsäure mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5, 3,0 oder 3,5 Sulfatgruppen pro Wiederholungseinheit an Hyaluronsäure, welche gewählt ist aus: (i) Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 10.000 und 50.000 Daltons; (ii) Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 50.000 und 250.000 Daltons; (iii) Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 250.000 und 750.000 Daltons; (iv) Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 750.000 und 1.250.000 Daltons.
Sulfatierter Hyaluronatester, wobei die Anzahl an Sulfatgruppen pro Wiederholungseinheit im Bereich von 0,5 bis 3,5 liegt.
Sulfatierter Hyaluronatester nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester ein Ester von Hyaluronsäure mit einem aliphatischen, araliphatischen, heterocyclischen oder cycloaliphatischen Alkohol ist.
Sulfatierter Hyaluronatester nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, welcher gewählt ist aus sulfatiertem Benzylhyaluronat und sulfatiertem Ethylhyaluronat, wobei in jedem Fall der Veresterungsgrad 25%, 50%, 75% oder 100% beträgt.
Sulfatierter Hyaluronatester nach Anspruch 4, wobei das Molekulargewicht der Hyaluronatestereinheit 200.000 Daltons beträgt.
Sulfatierter Hyaluronatester nach mindestens einem der Ansprüche 2–5, wobei der Sulfatierungsgrad pro dimerer Einheit weniger als 2 beträgt.
Komplexion, umfassend Cu(II) und sulfatierte Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1.
Komplexion, umfassend Cu(II) und sulfatierten Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6.
Biomedizinisches Objekt, umfassend sulfatierte Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1.
Biomedizinisches Objekt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt mit der sulfatierten Hyaluronsäure beschichtet ist.
Biomedizinisches Objekt, umfassend sulfatierten Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6.
Biomedizinisches Objekt nach Anspruch 11, das aus dem sulfatierten Hyaluronatester hergestellt ist.
Biomedizinisches Objekt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt mit dem sulfatierten Hyaluronatester beschichtet ist.
Biomedizinisches Objekt nach mindestens einem der Ansprüche 9–13, das gewählt ist aus einem Führungskanal, einem permanenten oder bioabbaubaren Implantat, einem Bypass, einer künstlichen Vene, einem Shunt, einer Gaze, einem Faden, einem Dialyserohr, einer Folie, einer Membran, einem Schwamm, einem Non-Woven-Gewebe oder Tissue und einem Mikrokügelchen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend sulfatierte Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend sulfatierten Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, welche ein Gel, Hydrogel, eine Creme oder eine Salbe ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 15–17 zur Verwendung als entzündungshemmendes Mittel.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines biomedizinischen Objekts oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines biomedizinischen Objekts oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittelsystems mit regulierter Freisetzung.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines Arzneimittelsystems mit regulierter Freisetzung.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Biomaterials mit antithrombotischen, gerinnungshemmenden oder antiviralen, insbesondere HIV-Inhibierungs-Eigenschaften.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines Biomaterials mit antithrombotischen, gerinnungshemmenden oder antiviralen, insbesondere HIV-Inhibierungs-Eigenschaften.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Biomaterials zur Förderung von Zellwachstumsprozessen, insbesondere der Gefäßbildung.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines Biomaterials zur Förderung von Zellwachstumsprozessen, insbesondere der Gefäßbildung.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beschleunigung der Heilung von Wunden, Verbrennungen, Dekubitus oder Hautgeschwüren.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beschleunigung der Heilung von Wunden, Verbrennungen, Dekubitus oder Hautgeschwüren.
Verwendung von sulfatierter Hyaluronsäure gemäß Anspruch 1 zum Beschichten eines biomedizinischen Objekts.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zum Beschichten eines biomedizinischen Objekts.
Verwendung von sulfatiertem Hyaluronatester gemäß mindestens einem der Ansprüche 2–6 zur Herstellung eines biomedizinischen Objekts.