JP2604930B2 - ヒアルロン酸およびコンドロイチン誘導体 - Google Patents

ヒアルロン酸およびコンドロイチン誘導体

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JP2604930B2
JP2604930B2 JP3330905A JP33090591A JP2604930B2 JP 2604930 B2 JP2604930 B2 JP 2604930B2 JP 3330905 A JP3330905 A JP 3330905A JP 33090591 A JP33090591 A JP 33090591A JP 2604930 B2 JP2604930 B2 JP 2604930B2
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本 秀 幸 森
藤 照 臣 伊
上 和 泓 井
野 哲 奥
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株式会社ディ・ディ・エス研究所
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】〔発明の背景〕
【産業上の利用分野】本発明は新規なヒアルロン酸およ
びコンドロイチンの誘導体に関する。更に詳しくは、長
期体内残留がなく、癌組織への移行性のある多糖型高分
子担体およびこれに薬物が結合した複合体としてのヒア
ルロン酸およびコンドロイチンの誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】水溶性高分子を薬物担体として使用する
ことは、従来からとりわけ製剤の分野において試みら
れ、関連する多数の技術が提供されてきた。多くの場合
においてカルボキシメチルセルローズ、ヒドロキシプロ
ピルセルローズ、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ
等のセルローズ誘導体が使用され、これらの物質自体の
物理化学的性状を利用して薬物の分散化、徐放化等が意
図されてきた。しかしこれらの例においては薬物は担体
としてのセルローズ誘導体と製剤的な混合によって一体
化はしているものの、担体に化学結合しているものでは
ない。
【０００３】ところで、薬物を必要な組織に必要な時に
必要な量だけ送達する、いわゆる臓器指向の技術におい
て、水溶性高分子を薬物担体として利用する場合には、
単なる混合ではなく、薬物が担体に化学結合する必要が
ある。そのような試みとしては下記文献１），２），
３）があり、１）ではデキストランにマイトマイシンＣ
を結合する技術、２）ではマンナンにマイトマイシンＣ
を結合する技術、３）では同じくマンナンにブレオマイ
シンを結合する技術がそれぞれ開示されている。 １） 瀬崎 仁：薬学雑誌、１０９，６１１−６２１，
（１９８９） ２） 第４９回日本癌学会総会記事（１９９０）４２５
頁、演題番号２１５５ ３） 第４９回日本癌学会総会記事（１９９０）４２５
頁、演題番号２１５４
【０００４】しかし、多糖型水溶性高分子の中でもいわ
ゆるムコ多糖類と称される一群の酸性多糖高分子を担体
として利用し、これに薬物を化学結合して薬物送達を行
う技術についてはその試みは未だ十分な展開がなされて
いないのが実状である。
【０００５】そこで、本発明者の中の一部の者は先にキ
チン、キトサンを使用して上記の技術の試みを行ったと
ころ、意外にもＮ‐アセチルカルボキシメチルキトサン
誘導体が優れた薬物送達の可能性を示すことを見出だし
た（特願平２−２１５８０３号明細書）。そこで、適切
な修飾を加えることによってムコ多糖が上記の可能性を
持つこと、とりわけ酸性ムコ多糖の代表であるヒアルロ
ン酸あるいはコンドロイチンがキチン、キトサンにおけ
ると同様にこれに適切な修飾を加えることによって前記
のような可能性を示すことが期待されるに至った。
【０００６】しかしながらヒアルロン酸あるいはコンド
ロイチンにおける上記関連技術については、僅かに下記
文献４）および５）があり、白金錯体について述べられ
ているが、応用の一般的な展開は見られていない。 ４） 第４８回日本癌学会総会記事（１９８９）３７４
頁、演題番号２１０７ ５） 第４９回日本癌学会総会記事（１９９０）３９４
頁、演題番号１９７２また特開昭６２−６４８０２号公
報には、ヒアルロン酸エステルが開示されている。 しかしここにおいてもヒアルロン酸のカルボキシル基を
エステル化するにとどまっており、上記の技術における
担体としての利用に至る展開は見られてない。
【０００７】上記にかんがみ本発明者はヒアルロン酸お
よびコンドロイチンについて検討を行い、その結果、ヒ
アルロン酸およびコンドロイチンを構成する単位二糖の
遊離水酸基に、更にはヒアルロン酸およびコンドロイチ
ンを酸化開環し、開裂末端のアルデヒド基を還元して得
られたポリアルコール体の水酸基にペプチド鎖を介して
薬物を結合することによって目的が達成されることを知
り、本発明を完成するに至った。
【０００８】〔発明の概要〕
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、薬物
を化学結合を介して保持し、薬物送達が可能な多糖誘導
体およびその塩を提供することを目的としている。また
本発明は、長期体内残留がなく、癌組織への移行性ある
多糖誘導体であって、これに薬物が化学結合可能な薬物
担体を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明による
第一の態様の多糖誘導体は、下記の一般式（Ｉ）または
（II）で表される単位から構成される、ゲルろ過法によ
る分子量が３，０００〜８００，０００であるものおよ
びその塩である。
【００１０】
【化８】
【００１１】〔前記式（Ｉ）および（II）中、Ｙ１、Ｙ
２、Ｙ３およびＹ４は、同一または異なっていてもよ
く、それぞれ水素原子、基−ＣＯＮＨ２、または、下記
一般式（III ）で表わされる基：
【００１２】
【化９】
【００１３】（式中、Ｚ１は１〜５個の同一または異な
るアミノ酸を含んでなるペプチド鎖を表わし、Ｐは水素
原子、水酸基または保護基を表わし、Ｗは酸素原子また
は基ＮＨを表わす。ただし、Ｃ−Ｚ1 結合はＣ−Ｎ結合
である）、を表わすか、もしくは、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３お
よびＹ４のうち、いずれか２つが一緒になって結合して
下記一般式（IV）で表わされる基：
【００１４】
【化１０】
【００１５】（式中、Ｚは１〜５個の同一または異なる
アミノ酸を含んでなるペプチド鎖を表わし、Ｐは前記一
般式（III)で定義したものと同義である。ただし、Ｃ＝
Ｚ2 結合はＣ＝Ｎ結合である）を表わす。ただし、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４として前記一般式（III ）
で表わされる基または前記一般式（IV）で表わされる基
を有する単位が分子中に少なくとも１以上存在する。〕
【００１６】更に、本発明による第二の態様の多糖誘導
体は、下記の一般式（Ｖ）および（VI）または（VII ）
および（VIII）で表わされる単位から構成される、ゲル
ろ過法による分子量が１，０００〜８００，０００であ
るものおよびその塩である。
【００１７】
【化１１】
【００１８】更に、本発明による第三の態様の多糖誘導
体は、下記の一般式（IX）および（X)または（XI）およ
び（XII)で表わされる単位から構成される、ゲルろ過法
による分子量が１，０００〜８００，０００であるもの
およびその塩である。
【００１９】
【化１２】
【００２０】更にまた、本発明による第四の態様の多糖
誘導体は、下記の一般式(XIII)および（XIV)または（X
V）および（XVI)で表わされる単位から構成されるゲル
ろ過法による分子量が１，０００〜８００，０００であ
るものおよびその塩である。
【００２１】
【化１３】
【００２２】〔前記式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ
５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８は、同一または異なっていて
もよく、それぞれ水素原子、基−ＣＯＮＨ２、または、
前記で定義した一般式（III)で表わされる基を表わす
か、もしくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４または
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８のうちいずれか２つの基が
一緒になって結合して請求項１で定義した一般式（IV）
で表わされる基を表わす。ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、
Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８として前記一般式
（III ）で表わされる基または前記一般式（IV）で表わ
される基を有する単位が分子中に少なくとも１以上存在
する。〕
【００２３】［発明の具体的説明］ （多糖誘導体）前記一般式（Ｉ）で表される二糖単位に
おいて、Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｙ４＝Ｈのもの、すなわ
ち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラヌロシ
ル−Ｄ−グルコサミンを繰り返し単位とした高分子化合
物がいわゆるヒアルロン酸である。また、一般式（II）
で表される二糖単位において、Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｙ４
＝Ｈのもの、すなわち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−β−Ｄ
−グルコピラヌロシル−Ｄ−ガラクトサミンを繰り返し
単位とした高分子化合物がいわゆるコンドロイチンであ
る。従って、本発明による第一の態様の多糖誘導体は、
ヒアルロン酸またはコンドロイチンの水酸基にペプチド
鎖が導入されてなる誘導体、である。
【００２４】一般式（Ｉ）および（II）において、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は、それぞれ水素原子、基
−ＣＯＮＨ２もしくは前記一般式（III ）で表される基
を表すか、もしくは、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４のう
ち、いずれか２つが一緒になって結合する、前記一般式
（IV）で表される基を表す。ただし、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３
およびＹ４として前記一般式（III)で表される基もしく
は前記一般式（IV）で表される基を有する単位が分子中
に少なくとも１以上存在する必要がある。
【００２５】また、前記式（Ｖ）または式(VII）で表さ
れる二糖単位はヒアルロン酸またはコンドロイチンを構
成する単位であり、前記式（VI）または式(VIII)で表さ
れる二糖単位は式（Ｖ）または式(VII）で表される単位
のグルクロン酸の２位と３位の間の結合が開裂した構造
を有する。従って、本発明による第二の態様の多糖誘導
体は、ヒアルロン酸またはコンドロイチンの分子中の一
部の二糖単位においてそのグルクロン酸の２位と３位の
間の結合が開裂され、その開裂末端がアルデヒド基であ
るものということが出来る（なお、この第二の態様の多
糖誘導体を「開環アルデヒド体」という場合がある）。
【００２６】またさらに、前記式(IX)または式(XI)で表
される二糖単位はヒアルロン酸またはコンドロイチンを
構成する単位であり、前記式(X) または(XII）で表され
る二糖単位は式（IX）または式（XI）で表される単位の
グルクロン酸の２位と３位の間の結合が開裂した構造を
有する。従って、本発明による第三の態様の多糖誘導体
は、ヒアルロン酸またはコンドロイチンの分子中の一部
の二糖単位においてそのグルクロン酸の２位と３位の間
の結合が開裂され、その開裂末端がヒドロキシメチル基
であるものであるということが出来る（なお、この第三
の態様の多糖誘導体を「開環ポリアルコール体」という
場合がある）。
【００２７】これらの多糖誘導体のグルクロン酸の開裂
の程度は特に限定されないが、その誘導体である後記す
る式（XIII）および（XIV)または（XV）および（XVI)で
表される単位から構成される多糖誘導体とされたときの
水溶性を考慮して決定されるのが好ましい。
【００２８】前記式（XIII）、（XIV)、（XV）および
（XVI)で表される二糖単位において、Ｘ１〜Ｘ８がすべ
て水素原子であるものは、それぞれ前記式（IX）、
（Ｘ）、（XI）および（XII)で表される二糖単位であ
る。従って、本発明による第四の態様の多糖誘導体は、
本発明による第三の態様の多糖誘導体の水酸基にペプチ
ド鎖が導入されてなる誘導体である。この第四の態様の
多糖誘導体は、第一の態様の多糖誘導体よりも水溶性が
高く、より疎水性の薬物を導入しても好ましい水溶性を
保持するので有利である。
【００２９】式（XIII）、（XIV)、（XV）および（XVI)
において、Ｘ１〜Ｘ８は同一または異なっていてもよ
く、それぞれ水素原子、基−ＣＯＮＨ２または前記一般
式(III）で表される基を表すか、もしくは、Ｘ１〜Ｘ４
のうちのいずれか２つまたはＸ５〜Ｘ８のうちいずれか
２つが一緒になって結合する前記一般式（IV）で表され
る基を表す。ただし、Ｘ１〜Ｘ８として前記一般式（II
I)または前記一般式（IV）で表される基を有する単位が
分子中に少なくとも一つ以上存在することが必要であ
る。
【００３０】一般式（III)および（IV）において、Ｚ１
もしくはＺ２は１〜５個の同一または異なるアミノ酸を
含んでなるペプチド鎖を表す。ここで、このアミノ酸の
数は薬物放出特性や抗原性を考慮すると、１〜４個が好
ましい。さらに、このペプチド鎖はアミノ酸のみから構
成されている場合に加えて、鎖中の一部にアミノ酸以外
の化合物を含む場合も包含する意味に用いる。例えは、
コハク酸のような二塩基性カルボン酸がペプチド鎖の中
にまたは末端に存在していてもよい。また、このペプチ
ド鎖を構成するアミノ酸は、α−アミノ酸のほかに、ε
−アミノカプロン酸、γ−アミノ酪酸などのアミノ酸類
似の化合物であってもよい。また、ペプチド鎖の結合方
向は、ヒアルロン酸またはコンドロイチンにＮ末端側か
ら結合しているのが通常であるが、例えばペプチド鎖中
にＬｙｓが存在する場合には、ε−アミノ基を結合させ
ることによってペプチド鎖の結合方向を逆転させてもよ
い。
【００３１】また、ペプチド鎖にＰが結合する位置は、
ペプチド鎖の末端および鎖中のいずれでもよい。従っ
て、このペプチド鎖の末端または鎖中に結合するＰが水
素原子または水酸基のときは、それぞれそのペプチド鎖
の末端または鎖中アミノ酸のアミノ基の水素原子または
末端または鎖中アミノ酸のカルボキシル基の水酸基を表
すものである。
【００３２】本発明による多糖誘導体においてＺ１およ
びＺ２で表されるペプチド鎖の好ましい具体例を示せば
下記の通りである。
【００３３】
【化１４】
【００３４】また、本発明による多糖誘導体のペプチド
鎖はその末端または鎖中にあるアミノ基あるいはカルボ
キシル基が保護されていてもよい。保護基は一般的にア
ミノ酸の保護に用いられているものであれば制限されな
いが、例えば、アミノ保護基としてはt-ブトキシカルボ
ニル基、p-メトキシベンジルオキシカルボニル基、ま
た、カルボキシル基の保護基としては低級アルコキシ
基、例えばt-ブチルオキシ基、ベンジルオキシ基、低級
アルキルイミノ基、例えばメチルイミノ基などを挙げる
ことができる。
【００３５】本発明による前記一般式（Ｉ）または（I
I）を単位とする多糖誘導体は、ゲルろ過法による、ピ
ーク位置の分子量が３，０００〜８００，０００範囲に
ある。また本発明による前記式（Ｖ）および（VI）また
は（VII ）および（VIII）で表わされる単位から構成さ
れる多糖誘導体ならびに前記式（IX）および式（Ｘ）ま
たは式（XI）および（XII ）で表わされる単位から構成
される多糖誘導体は、ゲルろ過法によるピーク位置の分
子量が１，０００〜８００，０００の範囲にある。
【００３６】また、本発明による多糖誘導体におけるペ
プチド鎖の存在量は、その用途にしたがって適宜決定さ
れてよい。分子中の単糖単位の総モル数をａとして、分
子中に導入されたＺ１および／またはＺ２で表されるペ
プチド鎖の総モルをｂとした場合、この両者の間にｂ／
ａ（置換度）＝１／２〜１／１００の関係が成立するも
のが好ましい。この置換度は例えば以下に説明するＮＭ
Ｒ法または吸光光度法によって算出することができる。
【００３７】ＮＭＲ法 標品についてプロトン−ＮＭＲを測定する。構成成分で
あるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基あるいはＮ−
アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基のアセチル基の三個
のプロトンに由来する吸収ピークは２．０ppm 付近に観
察される。一方、このピークと、Ｚ1 −Ｐおよび／また
はＺ2 −Ｐのプロトンに由来する吸収ピークが分離して
観察される場合には、両者の吸収強度を利用して置換度
を次式より求めることが可能である。
【００３８】
【数１】 Ｉｓ：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基あるいはＮ
−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基のアセチル基のプ
ロトン由来の吸収ピークの積分値 Ｉｙ：Ｚ1 −Ｐおよび／またはＺ2 −Ｐのプロトンに由
来の吸収ピークの積分値 ｎ：Ｉｙに対応するプロトンの個数
【００３９】吸光光度法 Ｚ1 −Ｐおよび／またはＺ2 −Ｐに特性吸収がある場合
に、吸光光度法によりこの置換基の含量（重量％）を求
め、次式に従って置換度を求めることが可能である。
【００４０】
【数２】 Ｃｙ：Ｚ1 −Ｐおよび／またはＺ2 −Ｐの含量（重量
％） Ｍｙ：Ｚ1 −Ｐおよび／またはＺ2 −Ｐの分子量 Ｍｓ：式（Ｉ）または式（II）で表わされる単位から構
成される多糖誘導体の置換度を求める場合、Ｍｓはヒア
ルロン酸またはコンドロイチンを構成する二糖単位の分
子量である。なお、ナトリウム塩の場合の分子量はヒア
ルロン酸、コンドロイチンいずれの場合も４０１であ
る。 また、式（XIII）および式（XIV)または式（XV）および
式（XVI)で表される単位から構成される多糖誘導体の置
換度を求める場合、Ｍｓは式（IX）または式（XI）で表
される単位の分子量(401) と、式（Ｘ）または（XII)で
表される単位の分子量(403) との、式（IX）と式（Ｘ）
の存在比または式（XI）と式（XII)との存在比の重み付
け平均値である。
【００４１】本発明による多糖誘導体は、その塩として
存在することができるが、その用途を考慮すれば薬学上
許容可能な塩であることが好ましい。そのような塩とし
ては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩またはカルシ
ウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の
塩および、アルギニン塩、リジン塩のようなアミノ酸塩
を挙げることができる。特にナトリウム塩、カリウム塩
が好ましい。
【００４２】本発明による多糖誘導体は、前記したＺ１
およびＺ２で表されるペプチド鎖の末端または鎖中に、
生理活性を有した化合物を化学結合によって保持させる
ことが可能である。従って、本発明による多糖誘導体は
薬物輸送の担体として利用することができる。また、本
発明による多糖誘導体は、薬物送達に必要な時間内にお
いて十分な血中安定性を示す一方、生体内で徐々に分解
を受け、長時間の体内残留が起こらないことが期待され
る。さらにまた、本発明による多糖誘導体は、癌組織移
行性に優れている点も有利である。
【００４３】本発明による多糖誘導体におけるペプチド
鎖への薬物の結合は、例えばペプチド鎖の末端または鎖
中アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のＰで表さ
れる水素原子あるいは水酸基と置換してペプチド鎖と結
合することによってなされる。例えば、一般式Ｒ１ＯＨ
で表されるアルコール性水酸基を有したアルコール系医
薬化合物は末端または鎖中アミノ酸のカルボキシル基と
結合することが可能である。また、一般式Ｒ２ＣＯＯＨ
で表されるカルボキシル基を有したカルボン酸系医薬化
合物は末端または鎖中アミノ酸のアミノ基と結合するこ
とが、また、一般式Ｒ３Ｒ４ＮＨで表されるアミノ基を
有したアミノ系医薬化合物もまた末端または鎖中アミノ
酸のカルボキシル基と結合することが可能である。この
ような医薬化合物の具体例として、カルボン酸系医薬化
合物としては、メソトレキサート、ブメタニド、フロセ
ミド、ジノプロストなどが挙げられ、アルコール系医薬
化合物としては、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、アドレナリンなどが挙げられ、また、ア
ミノ系医薬化合物としては、ダウノルビシン、ドキソル
ビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンなどが挙げ
られる。
【００４４】（多糖誘導体の製造）本発明による多糖誘
導体の基本をなすヒアルロン酸は、臍帯、皮膚、腱、関
節液、さらにサメの皮、クジラの軟骨、ヒト血清、鶏冠
などの広く動物組織中に存在しており、これらの組織か
ら抽出して利用することが可能であり、また、市販品を
利用することも可能である。
【００４５】ヒアルロン酸の平均分子量は１０６〜１０
７程度であることから、本発明による多糖誘導体に用い
るためには、適当な分子量に低分子量化することが必要
となる。低分子量化は、ヒアルロニダーゼなどの酵素に
よる加水分解によって容易に行うことができる。
【００４６】例えば、ヒト臍帯由来ヒアルロン酸に、そ
の約１／２００量のウシ睾丸ヒアルロニダーゼをｐＨ
５．０、３７℃で２時間反応させることにより、分子量
１０５に低分子化されたヒアルロン酸を得ることができ
る。酵素量や反応時間を調節することにより、得られる
ヒアルロン酸の分子量は、増減させることができる。ま
た、この酵素反応で低分子化されるヒアルロン酸の由来
は、ヒト臍帯に限らない。低分子化したヒアルロン酸
は、そのまま薬物担体の素材として化学修飾することも
可能であるが、混在する蛋白や他のムコ多糖を除去した
後に用いることが望ましい。その精製は、ムコ多糖の精
製法として知られるプロテアーゼを用いる除蛋白法やセ
チルピリジニウムクロリドなどの第四級アンモニウム塩
による分画、エタノール分画などの方法を組み合わせて
行うことができる。
【００４７】コンドロイチンについては、角膜やスルメ
イカ、マダコなどの頭足類から抽出することができる。
また、コンドロイチン硫酸を脱硫酸することによっても
得ることができ、市販もされている。コンドロイチン硫
酸Ａを脱硫酸したコンドロイチンの場合、分子量はおよ
そ１０4 であり、これをそのまま本発明による薬物担体
の素材として用いることができる。
【００４８】本発明による第二の態様の多糖誘導体は、
ヒアルロン酸またはコンドロイチンから、グルクロン酸
の２位と３位の結合を酸化開裂して得ることができる。
まず、上記のようにして得た低分子量化されたヒアルロ
ン酸またはコンドロイチンに酸化剤（例えば過ヨウ素酸
またはその塩）を作用させることによって、開環アルデ
ヒド体を得ることができる。この反応は反応に関与しな
い溶媒（例えば水）中の温和な条件、例えば０〜１０℃
の温度で、１〜３週間で完了させることができる。反応
後多糖誘導体は、反応液を透析し、沈殿助剤（例えば酢
酸ナトリウム）を加え、エタノールで析出させることに
よって得ることができる。
【００４９】更にこうして得た多糖誘導体のアルデヒド
基を還元することにより、開環ポリアルコール体とする
ことができる。還元剤としては、例えば水素化ホウ素ナ
トリウムなどを用いることができる。この反応は反応に
関与しない溶媒（例えば水）中の温和な条件、０〜３０
℃の温度で、１〜３日間で完了させることができる。反
応後多糖誘導体は、反応液をｐＨ５程度に調整し、エタ
ノールで析出させることによって得ることができる。
【００５０】次にこの低分子量化されたヒアルロン酸お
よびコンドロイチン、または、開裂され、開裂末端を基
−ＣＨ２ＯＨとされた多糖誘導体を、R.Alenらの方法
（R.Alen, etal. Eur. J. Biochem. 18, 351-360(1971
））に類似の方法によって化学修飾し、分子中に存在
する水酸基にペプチド鎖を導入する。具体的には下記の
ようにして導入を行う。
【００５１】まず、ヒアルロン酸もしくはコンドロイチ
ンまたは式（IX）および式（Ｘ）または式（XI）および
式（XII ）で表わされる単位から構成される多糖誘導体
を水に溶かし、溶液のｐＨを塩基性、好ましくは１０．
５〜１１．５、に保ちながら、シアノゲンハライド、例
えばブロムシアン、を反応させて糖残基中の水酸基を活
性化する。ヒアルロン酸またはコンドロイチンの糖残基
数とブロムシアンのモル比は、１：２０〜１０：１程度
が好ましい。続いて、この反応溶液にペプチドを加えた
後、ｐＨを、酸、例えば０．１Ｎ塩酸等を用いて９．０
程度に下げ、室温で一晩撹拌を行うと、活性化された水
酸基とペプチド鎖のアミノ基との間で結合し、本発明に
よる多糖誘導体を得ることができる。ここで、糖残基と
ペプチドの結合様式にはイソウレア型（式（III ）にお
いて、Ｗが基ＮＨとなる場合）、ウレタン型（式（III
）において、Ｗが酸素原子である場合）、イミドカル
ボネート型（式（IV）の場合）が存在する。本発明にお
いてはこれらの結合様式が単独で生じた場合あるいは複
合して生じた場合、いずれの場合も包含される。また上
記の反応の過程で、二糖単位の一部水酸基が活性化され
ることなく、不活性のカルバメートを生ずる場合（分子
中の水酸基のいずれかが基−ＣＯＮＨ２に置換された場
合）もあるが、この反応はペプチド鎖の結合を生じさせ
ないので、出来るだけ防止するのが好ましい。
【００５２】加えるペプチドの量は、活性化された水酸
基に対して過剰量用いることが好ましい。また、添加す
るブロムシアンの量を調整することによって、ペプチド
の導入量を増減させることが可能となる。
【００５３】以上のようにして得た本発明による多糖誘
導体に医薬化合物を化学結合させることによって、本発
明による多糖誘導体を薬物担体として用いることが可能
となる。医薬化合物の導入は、ペプチド鎖のアミノ基も
しくはカルボキシル基を、医薬化合物の官能基もしくは
活性化された置換基と反応させることによって行なえ
る。好ましい具体例を示せば下記の通りである。
【００５４】例えば、本発明による多糖誘導体のペプチ
ド鎖に、Ｌｙｓ残基を含むペプチドを用いた場合、この
Ｌｙｓ残基のε−アミノ基にカルボキシル基を有する薬
物をアミド結合で導入し、〔ヒアルロン酸−ペプチド−
薬物〕複合体もしくは〔コンドロイチン−ペプチド−薬
物〕複合体を得ることができる。この場合、上述のブロ
ムシアン法によるペプチド導入反応時には、このε−ア
ミノ基は適当な保護基で保護し、反応終了後に脱保護す
る必要がある。例えば、代表的なアミノ基の保護である
Ｂｏｃ基でε−アミノ基を保護したＬｙｓ残基（Ｎε−
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）を含むペプチドを導入した〔ヒアルロ
ン酸−保護ペプチド〕複合体を弱酸処理、例えば、０．
５Ｎ塩酸中、室温で一晩処理することにより、遊離のア
ミノ基を持つ〔ヒアルロン酸−ペプチド〕複合体を得る
ことができる。次に、この複合体を、例えば、１％Ｎａ
ＨＣＯ３水溶液に溶解後、カルボキシル基を有する薬物
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（活性エステ
ル）を加えて反応させることにより、〔ヒアルロン酸−
ペプチド−薬物〕複合体を得ることができる。ここで薬
物として、例えばメソトレキサート（ＭＴＸ）を選択す
れば、〔ヒアルロン酸−ペプチド−ＭＴＸ〕複合体が得
られる。また、これらの複合体のペプチド末端のカルボ
キシル基にアミノ基を有する薬物をアミド結合で結合さ
せても、〔ヒアルロン酸−ペプチド−薬物〕複合体もし
くは、〔コンドロイチン−ペプチド−薬物〕複合体を得
ることができる。
【００５５】
【実施例】
（実施例１）ヒト臍帯由来ヒアルロン酸（ＳＩＧＭＡ
社、Ｈ−１８７６、２．０５ｇ）を、ｐＨ５．０に調整
した０．１Ｍ酢酸緩衝液（２０５ml）に溶解後、ウシ睾
丸ヒアルロニダーゼ（１０mg）を加え、３７℃で２時間
反応させた。反応液をエタノール（１Ｌ）中に加えて、
析出した沈殿物を集め、真空乾燥して１．７４ｇの低分
子化ヒアルロン酸を得た。この物質を次のように精製し
た。この物質（１．７２ｇ）を、ｐＨ８．０に調整した
１０mMリン酸緩衝液（１７２ml）に溶かし、プロナーゼ
Ｅ（ＳＩＧＭＡ社、３．４mg）を加えた後、４０℃で２
０時間反応させ、ヒアルロン酸に結合している蛋白を消
化した。反応液を５０mlに濃縮し５．８ｇの塩化ナトリ
ウムを加えた後、２Ｍの塩化ナトリウムを含むセチルピ
リジニウムクロライド（ＣＰＣ）の１０％水溶液（１５
３ml）を加え、さらにＣＰＣの０．０５％水溶液（６１
２ml）を加えた。この溶液をポアサイズ０．４５μｍの
メンブランフィルター（日本ミリポア工業株式会社、Ｈ
ＡＷＰ膜）を用いて吸引ろ過し、得られたろ液（８１０
ml）に上述のＣＰＣの０．０５％水溶液３，２４０mlを
加えた。析出した沈殿物を集め、１０％のエタノールを
含む２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（５５ml）に溶解後、エ
タノール（２４０ml）を加えた。析出した沈殿物を集
め、真空乾燥して、精製された低分子化ヒアルロン酸
０．９６ｇを得た。この物質の分子量は、デキストラン
を標準物質としてＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷXLカラ
ム（東ソー株式会社）を用いたゲルろ過法で、１×１０
5 であった。
【００５６】この物質（８０mg）を水（６ml）に溶解
し、ブロムシアン（３６mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨで
ｐＨを１０．５〜１１．５に調整しながら、３０分攪拌
した。続いて、この反応液に、Ｌｙｓ残基のε‐アミノ
基をＢｏｃ基で保護したＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ（Ｂｏｃ）（８１mg）を水（３ml）に溶かして加え、
０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で
１７時間反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００
mg）を加えた後、エタノール（４０ml）を加えて析出し
た沈殿物を集め、真空乾燥して、８０mgのヒアルロン酸
‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体を
得た。本複合体の置換度は、ＮＭＲ法により１／１５と
算出された。この物質（８０mg）を０．５Ｎ ＨＣｌ
（８ml）に溶解後、室温で１８時間処理した。反応液を
中和した後、エタノール（４８ml）を加えて析出した沈
殿物を集め、真空乾燥して、Ｌｙｓ残基のε‐アミノ基
が脱保護されたヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ
‐Ｌｙｓ複合体（７０mg）を得た。４５mgのメソトレキ
サート（ＭＴＸ）をジメチルホルムアミド（１ml）に溶
解後、Ｎ，Ｎ′‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（２
０．６mg）を加え、４℃で１７時間反応させた。反応液
にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（１１．５mg）とピリ
ジン１６μｌを加え、室温で１．５時間反応させた。一
方、上記ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ複合体（４０mg）を、１％ＮａＨＣＯ３水溶液（４m
l）に溶解後、上記反応液の０．５mlを加えて、室温で
４時間反応させた。反応液にエタノール（１８ml）を加
えて析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、４０mgのヒ
アルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ
複合体を黄色粉末として得た。本複合体の紫外・可視部
吸収スペクトルとゲルろ過溶出パターンをそれぞれ図１
および図２に示す。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３
０６ｎｍ）の吸光度分析によると６．４％（重量％）で
あった。
【００５７】（実施例２）実施例１で得られた低分子化
ヒアルロン酸 （８０mg）を水（６ml）に溶解し、ブロムシアン（４１
mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１１．
５に調整しながら４０分間攪拌した。続いて、この反応
液に、Ｌｙｓ残基のε‐アミノ基をＢｏｃ基で保護した
Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１０４m
g）を水（３ml）に溶かして加え、０．１ＮＨＣｌでｐ
Ｈを９．０に調整した後、室温で１８時間反応させた。
反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を加えた後、エタ
ノール（４０ml）を加えて析出した沈殿物を集め、真空
乾燥して、９３mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇ
ｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体を得た。本複合体の置換
度は吸光光度法により、１／１２と算出された。この複
合体（９１mg）を実施例１と同様に酸処理して、８６mg
のヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合
体を得た。この物質の紫外・可視部吸収スペクトルを図
３に示す。本複合体（３０mg）を１％ ＮａＨＣＯ３水
溶液（３ml）に溶解後、実施例１の方法に準じて調製し
たＭＴＸの活性エステル溶液０．５mlを加え、室温で３
時間反応させた。反応液にエタノール（１４ml）を加え
て析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、３０mgのヒア
ルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複
合体を黄色粉末として得た。本複合体の紫外・可視部吸
収スペクトルを図４に示す。本複合体のＭＴＸ含量は、
紫外部（３０８ｎｍ）の吸光度分析によると、１２％
（重量％）であった。
【００５８】（実施例３）実施例１で得た低分子化ヒア
ルロン酸（８０mg）を水（６ml）に溶解後、ブロムシア
ン（１９mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５
〜１１．５に調整しながら、４０分攪拌した。続いてこ
の反応液に、ε‐アミノ基をＢｏｃ基で保護したＮε‐
Ｂｏｃ‐Ｌｙｓ（９８mg）を水（４ml）に溶かして加
え、０．１ＮＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温
で一晩反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００m
g）を加えた後、エタノール（４０ml）を加えて析出し
た沈殿物を集め、真空乾燥して、７９mgのヒアルロン酸
‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体を得た。本複合体の置換度は
ＮＭＲ法によって、１／１９と算出された。この複合体
（７６mg）を実施例１の方法と同様に酸処理してＢｏｃ
基を除去し、６６mgのヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体を得
た。本複合体（３０mg）を１％ ＮａＨＣＯ３水溶液
（６ml）に溶解後、実施例１の方法に準じて調製したＭ
ＴＸの活性エステル溶液０．５mlを加え、室温で３時間
反応させた。反応液にエタノール（３５ml）を加えて析
出した沈殿物を集め、真空乾燥して、２９mgのヒアルロ
ン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本
複合体のＭＴＸ含量は、紫外部（３０６ｎｍ）の吸光度
分析から８．３％（重量％）と決定された。
【００５９】（実施例４）実施例１で得た低分子ヒアル
ロン酸（８０mg）を水（６ml）に溶解後、ブロムシアン
（４３mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜
１１．５に調整しながら、４０分攪拌した。続いてこの
反応液にε‐アミノ基をＢｏｃ基で保護した。Ｎε‐Ｂ
ｏｃ‐Ｌｙｓ（９９mg）を水（４ml）に溶かして加え、
０．１ＮＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で一
晩反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を
加えた後、エタノール（５５ml）を加えて析出した沈殿
物を集め、真空乾燥して、９０mgのヒアルロン酸‐Ｌｙ
ｓ（Ｂｏｃ）複合体を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ
法によって１／６．６と算出された。この複合体（８４
mg）を実施例１の方法と同様に酸処理してＢｏｃ基を除
去し、７５mgのヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体を得た。本
複合体（３０mg）を１％ ＮａＨＣＯ３水溶液（３ml）
に溶解後、実施例１の方法に準じて調製したＭＴＸの活
性エステル溶液（０．５ml）を加え、室温で３時間反応
させた。反応液にエタノール（２０ml）を加えて析出し
た沈殿物を集め、真空乾燥して、３４mgのヒアルロン酸
‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合
体のＭＴＸ含量は、紫外部（３０６ｎｍ）の吸光度分析
により１８％（重量％）と決定された。
【００６０】（実施例５）コンドロイチン（生化学工業
社、８０mg）を水（６ml）に溶解後、ブロムシアン（４
０mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１
１．５に調整しながら、３０分攪拌した。続いて、この
反応液にε‐アミノ基をＢｏｃ基で保護した。Ｎε‐Ｂ
ｏｃ‐Ｌｙｓ（９８mg）を水６mlに溶かして加え、０．
１Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で１６
時間反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）
を加えた後、エタノール（６０ml）を加えて析出した沈
殿物を集め、真空乾燥して、７７mgのコンドロイチン‐
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体を得た。本複合体の置換度はＮ
ＭＲ法により、１／２４と算出された。この複合体（７
７mg）を実施例１の方法と同様に酸処理してＢｏｃ基を
除去し、５７mgのコンドロイチン‐Ｌｙｓ複合体を得
た。本複合体（３１mg）を１％ ＮａＨＣＯ３水溶液
（３ml）に溶解後、実施例１の方法に準じて調製したＭ
ＴＸの活性エステル溶液０．５mlを加え、室温で３時間
反応させた。反応液にエタノール（２０ml）を加えて析
出した沈殿物を集め、真空乾燥して、２９mgのコンドロ
イチン‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。
本複合体の紫外・可視部吸収スペクトルとゲルろ過溶出
パターンをそれぞれ図５および図６に示す。本複合体の
ＭＴＸ含量は紫外部（３０８ｎｍ）の吸光度分析から、
７．１％（重量％）と決定された。
【００６１】（実施例６）実施例１に準じてヒト臍帯由
来ヒアルロン酸１．９７ｇにウシ睾丸ヒアルロニダーゼ
を作用させ、分子量が２×１０5 の低分子化ヒアルロン
酸（１．０２ｇ）を得た。この物質（６０mg）を水（６
ml）に溶解後、ブロムシアン（８０mg）を加え、１Ｎ
ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１１．５に調整しながら、
５０分攪拌した。続いてこの反応液にＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐
Ａｌａ（６６mg）を水（３ml）に溶かして加え、０．１
Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で２０時
間反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を
加えた後、エタノール（４０ml）を加えて析出した沈殿
物を集め、真空乾燥して８１mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ
‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ複合体を得た。この物質の紫外・可視
部吸収スペクトルを図７に示す。本複合体の置換度は、
吸光光度法により１／４．２と算出された。
【００６２】（実施例７）実施例６で得た低分子ヒアル
ロン酸（６１mg）を水（６ml）に溶解後、ブロムシアン
（９０mg）を加え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜
１１．５に調整しながら、５０分攪拌した。続いてこの
反応液にＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ（８３mg）を水（３m
l）に溶かして加え、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０
に調整した後、室温で２０時間反応させた。反応液に酢
酸ナトリウム（１００mg）を加えた後、エタノール（４
０ml）を加えて析出した沈殿物を集め、真空乾燥して、
８３mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ複合体
を得た。本複合体の置換度は吸光光度法より１／４．４
と算出された。
【００６３】（実施例８）ヒト臍帯由来ヒアルロン酸
（ＳＩＧＭＡ社、Ｈ‐１８７６、２．０１ｇ）を、ｐＨ
５．０に調製した０．１Ｍ酢酸緩衝液（２０１ml）に溶
解後、ウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（１０mg）を加え、３
７℃で１．５時間反応させた。反応液をエタノール（８
００ml）に加えて、析出した沈澱物を集め、真空乾燥し
て１．７２ｇの低分子粗精製ヒアルロン酸を得た。この
物質（８６５mg）を実施例１に準じて精製し、６８２mg
の精製低分子化ヒアルロン酸を得た。この物質の分子量
を実施例１に準じて測定すると、５×１０5 であった。
この低分子ヒアルロン酸（８０mg）を水（６ml）に溶解
した後、ブロムシアン（３６mg）を加え、１Ｎ ＮａＯ
ＨでｐＨを１０．５〜１１．５に調整しながら室温で３
５分攪拌した。この反応液にＮε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓ（９
８ｍｇ）を水４mlに溶かして加え、０．１Ｎ ＨＣｌで
ｐＨを９．０に調整した後、室温で一晩反応させた。反
応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を加えた後、エタノ
ール（３７ml）を加えて析出した沈澱を集め、真空乾燥
して、９０mgのヒアルロン酸‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体
を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法により、１／５．
６と算出された。この複合体（８６mg）を０．５Ｎ Ｈ
Ｃｌ（８．６ml）に溶解して、室温で一晩攪拌した。反
応液を中和した後、エタノール（４０ml）を加え、析出
した沈澱物を集め、真空乾燥して、Ｂｏｃ基の除去され
たヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体（７５mg）を得た。１１
４mgのＭＴＸをジメチルホルムアミド（２．５ml）に溶
解した後、Ｎ，Ｎ′‐ジシクロヘキシルカルボジイミド
（５１．５mg）を加え、４℃で一晩反応させた。反応液
にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（２９mg）とピリジン
４０μｌを加え、室温で４時間反応させた。一方、上記
ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体（５１mg）を１％ＮａＨＣ
Ｏ３水溶液（５ml）に溶解後、上記反応液の０．８３ml
を加えて、室温で３時間反応させた。反応液にエタノー
ル（２５ml）を加えて析出した沈澱物を集め、真空乾燥
して、５６mgのヒアルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を
黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部
（３０６nm）の吸光度分析によると１６％（重量％）で
あった。
【００６４】（実施例９）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の代わりに
Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（８６mg）
を用い、加えるブロムシアンの量を３８mgとした以外は
実施例８と同様に反応を行い、ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐
Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（９４mg）を
得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法により、１／１１と
算出された。この複合体（８５mg）を実施例８に準じて
酸処理することにより、脱保護されたヒアルロン酸‐Ｇ
ｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（７６mg）を得
た。この複合体（５１mg）に、ＭＴＸの活性エステルを
実施例８と同様に作用させることにより、５０mgのヒア
ルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複
合体を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫
外部（３０７nm）の吸光度分析によると８．９％（重量
％）であった。
【００６５】（実施例１０）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の代わり
にＧｌｙ‐ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１０９
mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４５mgとした以
外は実施例８と同様に反応を行い、ヒアルロン酸‐Ｇｌ
ｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（９５m
g）を得た。本複合体の置換度は吸光度法により、１／
８．６と算出された。この複合体（９１mg）を実施例８
に準じて酸処理することにより、脱保護されたヒアルロ
ン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（８１m
g）を得た。この複合体（５０mg）に、ＭＴＸの活性エ
ステルを実施例８と同様に作用させることにより、５４
mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐
ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ
含量は紫外部（３０７nm）の吸光度分析によると１７％
（重量％）であった。
【００６６】（実施例１１）実施例８で得た粗精製のヒ
アルロン酸０．９３ｇを、ｐＨ５．０に調製した０．１
Ｍ酢酸緩衝液（９３ml）に溶解した後、牛睾丸ヒアルロ
ニダーゼ９．３mgを加え、３７℃で６．５時間反応させ
た。反応液にエタノール（４６５ml）を加え、析出した
沈澱物を集め、真空乾燥して０．７８ｇの低分子ヒアル
ロン酸を得た。このヒアルロン酸を実施例１に準じて精
製し、２７４mgの精製低分子ヒアルロン酸を得た。この
物質の分子量を実施例１に準じて測定すると、３×１０
４であった。この低分子ヒアルロン酸（８０mg）を水
（６ml）に溶解した後、ブロムシアン（３６mg）を加
え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１１．５に調整
しながら室温で３０分攪拌した。この反応液にＬｙｓ
（Ｂｏｃ）（９９mg）を水３mlに溶かして加え、０．１
Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で一晩反
応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を加え
た後、エタノール（５０ml）を加え、析出した沈澱を集
め、真空乾燥して、９４mgのヒアルロン酸‐Ｌｙｓ（Ｂ
ｏｃ）複合体を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法によ
り、１／７．６と算出された。この複合体（９０mg）を
０．５Ｎ ＨＣｌ（９．０ml）に溶解して、室温で一晩
攪拌した。反応液を中和した後、エタノール（７０ml）
を加えて析出した沈澱物を集め、真空乾燥して、Ｂｏｃ
基の除去されたヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体（８１mg）
を得た。この複合体（５１mg）を１％ＮａＨＣＯ３水溶
液（５ml）に溶解後、実施例８に準じて調製したＭＴＸ
の活性エステル溶液０．８３mlを加えて、室温で３．５
時間反応させた。反応液にエタノール（２５ml）を加え
て析出した沈澱物を集め、真空乾燥して、５２mgのヒア
ルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得
た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０７nm）の吸光
度分析によると１５％（重量％）であった。
【００６７】（実施例１２）Ｌｙｓ‐（Ｂｏｃ）の代わ
りにＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（８７
mg）を用い、加えるブロムシアンの量を３４mgとした以
外は実施例１１と同様に反応を行い、ヒアルロン酸‐Ｇ
ｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（９４
mg）を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法により、１／
１５と算出された。この複合体（９１mg）を実施例１１
に準じて酸処理することにより、脱保護されたヒアルロ
ン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合
体（８１mg）を得た。この複合体（５１mg）に、ＭＴＸ
の活性エステルを実施例１１と同様に作用させることに
より、４８mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ
‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合
体のＭＴＸ含量は紫外部（３０６nm）の吸光度分析によ
ると８．２％（重量％）であった。
【００６８】（実施例１３）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の代わり
にＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１０８
mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４３mgとした以
外は実施例１１と同様に反応を行い、ヒアルロン酸‐Ｇ
ｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（１１
４mg）を得た。本複合体の置換度は吸光度法により、１
／８．１と算出された。この複合体（１１０mg）を実施
例１１に準じて酸処理することにより、脱保護されたヒ
アルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体
（９７mg）を得た。この複合体（５１mg）に、ＭＴＸの
活性エステルを実施例１１と同様に作用させることによ
り、５３mgのヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐
Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合体
のＭＴＸ含量は紫外部（３０６nm）の吸光度分析による
と１９％（重量％）であった。
【００６９】（実施例１４）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（８
７mg）用い、加えるブロムシアンの量を４１mgとした以
外は実施例５と同様に反応を行ない、コンドロイチン‐
Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（８
１mg）を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法により、１
／５５と算出された。この複合体（７８mg）を実施例５
に準じて酸処理することにより、脱保護されたコンドロ
イチン‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（７１
mg）を得た。この複合体（６０mg）に、ＭＴＸ（４５m
g）の活性エステルを実施例８と同様にして反応させる
ことにより、５６mgのコンドロイチン‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ
‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得
た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０７nm）の吸光
度分析によると３．１％（重量％）であった。
【００７０】（実施例１５）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１
１４mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４１mgとし
た以外は実施例５と同様に反応を行い、コンドロイチン
‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体
（８２mg）を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法によ
り、１／２６と算出された。この複合体（８０mg）を実
施例５に準じて酸処理することにより、脱保護されたコ
ンドロイチン‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体
（７６mg）を得た。この複合体（６０mg）に、ＭＴＸ
（４５mg）の活性エステルを実施例８と同様にして反応
させることにより、５５mgのコンドロイチン‐Ｇｌｙ‐
Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末とし
て得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０６nm）の
吸光度分析によると６．５％（重量％）であった。
【００７１】（実施例１６）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＢｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）（７５mg）を用い、加
えるブロムシアンの量を３７mgとした以外は実施例５と
同様に反応を行い、Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ‐コンドロ
イチン）複合体（８６mg）を得た。この複合体（８４m
g）を実施例５に準じて酸処理することにより、脱保護
されたＧｌｕ（Ｌｙｓ‐コンドロイチン）複合体（７８
mg）を得た。この複合体（６０mg）に、ＭＴＸ（４５m
g）の活性エステルを実施例８と同様にして反応させる
ことにより、５６mgのＭＴＸ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ‐コンド
ロイチン）複合体を黄色粉末として得た。本複合体のＭ
ＴＸ含量は紫外部（３０６nm）の吸光度分析によると
５．７％（重量％）であった。
【００７２】（実施例１７）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＬｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（１
１７mg）を用い、加えるブロムシアンの量を３５mgとし
た以外は実施例５と同様に反応を行い、コンドロイチン
‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体
（６５mg）を得た。本複合体の置換度はＮＭＲ法によ
り、１／５０と算出された。この複合体（６３mg）を実
施例５に準じて酸処理することにより、脱保護されたコ
ンドロイチン‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ複合体
（５４mg）を得た。この複合体（５０mg）に、ＭＴＸ
（４５mg）の活性エステルを実施例８と同様にして反応
させることにより、４５mgのコンドロイチン‐Ｌｅｕ‐
Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末とし
て得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０７nm）の
吸光度分析によると６．０％（重量％）であった。
【００７３】（実施例１８）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＰｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（９８mg）を
用い、加えるブロムシアンの量を３７mgとした以外は実
施例５と同様に反応を行い、コンドロイチン‐Ｐｈｅ‐
Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（８１mg）を得た。こ
の複合体（７８mg）を実施例５に準じて酸処理すること
により、脱保護されたコンドロイチン‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ
‐Ｌｙｓ複合体（７２mg）を得た。この複合体（６０m
g）に、ＭＴＸ（４５mg）の活性エステルを実施例８と
同様にして反応させることにより、５６mgのコンドロイ
チン‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉
末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０７
nm）の吸光度分析から４．７％（重量％）であった。
【００７４】（実施例１９）実施例１に準じて調製した
分子量１×１０５の低分子ヒアルロン酸（８０mg）を水
（６ml）に溶解した後、ブロムシアン（３２mg）を加
え、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１１．５に調整
しながら室温で３０分攪拌した。この反応液にＢｏｃ‐
Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）（７５mg）を水２mlに溶かして加え、
０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で
一晩反応させた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）
を加えた後、エタノール（４０ml）を加えて析出した沈
澱を集め、真空乾燥して、９２mgのＢｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌ
ｙｓ‐ヒアルロン酸）複合体を得た。本複合体の置換度
はＮＭＲ法により、１／８．０と算出された。この複合
体（９０mg）を０．５Ｎ ＨＣｌ（９．０ml）に溶解し
て、室温で一晩攪拌した。反応液を中和した後、エタノ
ール４２mlを加え、析出した沈澱物を集め、真空乾燥し
て、Ｂｏｃ基の除去されたＧｌｕ（Ｌｙｓ‐ヒアルロン
酸）複合体（８６mg）を得た。この複合体（６０mg）を
１％ＮａＨＣＯ３水溶液（５ml）に溶解した後、実施例
８に準じて調製したＭＴＸ（４５mg）の活性エステルを
加えて、室温で３時間反応させた。反応液にエタノール
（３５ml）を加え、析出した沈澱物を集め、真空乾燥し
て、６２mgのＭＴＸ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸）
複合体を黄色粉末として得た。本複合体ＭＴＸ含量は、
紫外部（３０６nm）の吸光度分析から１３％（重量％）
と算出された。
【００７５】（実施例２０）Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）
の代わりにＬｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
（１１７mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４２mg
とした以外は実施例１９と同様に反応を行い、ヒアルロ
ン酸‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合
体（８９mg）を得た。本複合体の置換度は、ＮＭＲ法に
より１／６．８と算出された。この複合体（８６mg）を
実施例１９に準じて酸処理することにより、脱保護され
たヒアルロン酸‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ（Ｂ
ｏｃ）複合体（７５mg）を得た。この複合体（６０mg）
に、ＭＴＸ（４５mg）の活性エステルを実施例８と同様
にして反応させることにより、６４mgのヒアルロン酸‐
Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色
粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０
６nm）の吸光度分析によると１４％（重量％）であっ
た。
【００７６】（実施例２１）Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）
の代わりにＰｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（９８m
g）を用い、加えるブロムシアンの量を３７mgとした以
外は実施例１９と同様に反応を行い、ヒアルロン酸‐Ｐ
ｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（９６mg）を得
た。本複合体の置換度は、ＮＭＲ法により１／６．６と
算出された。この複合体（９３mg）を実施例１９に準じ
て酸処理することにより、脱保護されたヒアルロン酸‐
Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ複合体（８２mg）を得た。この
複合体（６０mg）に、ＭＴＸ（４５mg）の活性エステル
を実施例８と同様にして反応させることにより、６２mg
のヒアルロン酸‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合
体を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外
部（３０６nm）の吸光度分析によると１７％（重量％）
であった。
【００７７】（実施例２２） (1) 実施例１に準じて調製した分子量１×１０５の低
分子化ヒアルロン酸（２００mg）に、過ヨウ素酸ナトリ
ウム（３６mg）を１０mlの水に溶かして加え、４℃で７
日間反応させた。この反応液を水に対して透析した後、
酢酸ナトリウム（３７０mg）を加えた。この液をエタノ
ール（１５０ml）中に加え、析出した沈澱を集め、真空
乾燥して、ヒアルロン酸の開環アルデヒド体（１６６m
g）を得た 。 (2) このヒアルロン酸の開環アルデヒド体（１６
６mg）に、水素化ホウ素ナトリウム（１６６mg）を０．
１％炭酸水素ナトリウム水溶液（１６．６ml）に溶かし
て加え、室温で一晩攪拌した。この反応液を酢酸でｐＨ
５．０に調整した後に、エタノール（８０ml）を加え、
析出した沈澱を集め、真空乾燥して、ヒアルロン酸の開
環ポリアルコール体（１５０mg）を得た。この物質のゲ
ルろ過溶出パターン（検出：示差屈折率）を図１１とし
て示す。 (3) この開環ポリアルコール体（７０mg）を水（６m
l）に溶解した後、ブロムシアン（３３mg）を加え、１
Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１０．５〜１１．５に調整しなが
ら室温で３０分攪拌した。この反応液にＮε‐Ｂｏｃ‐
Ｌｙｓ（８６mg）を水３mlに溶かして加え、０．１Ｎ
ＨＣｌでｐＨを９．０に調整した後、室温で一晩反応さ
せた。反応液に酢酸ナトリウム（１００mg）を加えた
後、エタノール（４５ml）を加え、析出した沈澱を集
め、真空乾燥して、６９mgの開環ポリアルコール化ヒア
ルロン酸‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体を得た。本複合体の
置換度はＮＭＲ法により、１／１３と算出された。この
複合体（６７mg）を０．５Ｎ ＨＣｌ（６．７ml）に溶
解して、室温で一晩攪拌した。反応液を中和した後、エ
タノール４０mlを加え、析出した沈澱物を集め、真空乾
燥して、Ｂｏｃ基の除去された、開環ポリアルコール化
ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ複合体（５７mg）を得た。この複
合体（４５mg）を１％ＮａＨＣＯ３水溶液（４．５ml）
に溶解した後、実施例８に準じて調製したＭＴＸ（３５
mg）の活性エステルを加えて、室温で３時間反応させ
た。反応液にエタノール（４０ml）を加え、析出した沈
澱物を集め、真空乾燥して、４７mgの開環ポリアルコー
ル化ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末と
して得た。本複合体のＭＴＸ含量は、紫外部（３０６n
m）の吸光度分析によると１２％（重量％）と算出され
た。
【００７８】（実施例２３）Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓの代
わりにＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（９
５mg）を用い、加えるブロムシアンの量を３７mgとした
以外は実施例２２と同様に反応を行い、開環ポリアルコ
ール化ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ
（Ｂｏｃ）複合体（７９mg）を得た。本複合体の置換度
は、ＮＭＲ法により１／１１と算出された。この複合体
（７７mg）を実施例２２に準じて酸処理することによ
り、Ｂｏｃ基の除去された開環ポリアルコール化ヒアル
ロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（６０
mg）を得た。この複合体（５０mg）に、ＭＴＸ（３８m
g）の活性エステルを実施例８と同様に反応させること
により、５４mgの開環ポリアルコール化ヒアルロン酸‐
Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色
粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０
６nm）の吸光度分析によると１４％（重量％）であっ
た。
【００７９】（実施例２４）低分子化ヒアルロン酸の代
わりにコンドロイチン（生化学工業社、２００mg）を用
いた以外は実施例２２と同様に反応を行い、コンドロイ
チンの開環ポリアルコール体（１３４mg）を得た。実施
例２２に準じて、この物質（７０mg）にブロムシアン
（３３mg）を作用させた後、Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓ（８
６mg）を反応させて、開環ポリアルコール化コンドロイ
チン‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）複合体（６４mg）を得た。本複
合体の置換度はＮＭＲ法により１／３０と算出された。
この複合体（６２mg）を、実施例２２に準じて酸処理す
ることにより、Ｂｏｃ基の除去された開環ポリアルコー
ル化コンドロイチン‐Ｌｙｓ複合体（５６mg）を得た。
この複合体（４５mg）に、ＭＴＸ（３５mg）の活性エス
テルを実施例８と同様にして反応させることにより、４
３mgの開環ポリアルコール化コンドロイチン‐Ｌｙｓ‐
ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ
含量は紫外部（３０６nm）の吸光度分析によると６．４
％（重量％）であった。
【００８０】（実施例２５）実施例２４において得られ
たコンドロイチンの開環ポリアルコール体（６５mg）
に、実施例２２に準じてブロムシアン（３９mg）を作用
させた後、Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
（８７mg）を反応させることによって、開環ポリアルコ
ール化コンドロイチン‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ（Ｂｏｃ）複合体（６２mg）を得た。本複合体の置換
度はＮＭＲ法により１／３７と算出された。この複合体
（６０mg）を実施例２２と同様に酸処理することによっ
て、Ｂｏｃ基の除去された開環ポリアルコール化コンド
ロイチン‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（５
１mg）を得た。この複合体（４０mg）に、ＭＴＸ（３１
mg）の活性エステルを実施例８と同様に反応させること
により、３７mgの開環ポリアルコール化コンドロイチン
‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄
色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３
０６nm）の吸光度分析によると５．８％（重量％）であ
った。
【００８１】（実施例２６）低分子化ヒアルロン酸（２
００mg）に対して反応させる過ヨウ素酸ナトリウムの量
を１／２に減じて１８mgとした以外は実施例２２と同様
にして、開環の割合の低いヒアルロン酸開環ポリアルコ
ール体（１５３mg）を得た。実施例２２に準じて、この
物質（６５mg）にブロムシアン（３６mg）を作用させた
後、Ｎε‐Ｂｏｃ‐Ｌｙｓ（８０mg）を反応させること
により、開環ポリアルコール化ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ
（Ｂｏｃ）複合体（７３mg）を得た。本複合体の置換度
はＮＭＲ法により１／９．０と算出された。この複合体
（７１mg）を、実施例２２に準じて酸処理することによ
って、Ｂｏｃ基の除去された開環ポリアルコール化ヒア
ルロン酸‐Ｌｙｓ複合体（６５mg）を得た。この複合体
（５０mg）に、ＭＴＸ（３８mg）の活性エステルを実施
例８と同様にして反応させることにより、５３mgの開環
ポリアルコール化ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体
を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部
（３０６nm）の吸光度分析によると１６％（重量％）で
あった。
【００８２】（実施例２７）実施例２６において得られ
たヒアルロン酸の開環ポリアルコール体（６５mg）に、
実施例２２に準じてブロムシアン（２７mg）を作用させ
た後、Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（８
５mg）を反応させることにより、開環ポリアルコール化
ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）複合体（７６mg）を得た。本複合体の置換度はＮＭ
Ｒ法により１／１４と算出された。この複合体（７４m
g）を実施例２２と同様に酸処理することによって、Ｂ
ｏｃ基の除去された開環ポリアルコール化ヒアルロン酸
‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ複合体（７０mg）を
得た。この複合体（５０mg）に、ＭＴＸ（３８mg）の活
性エステルを実施例８と同様に反応させることにより、
４９mgの開環ポリアルコール化コンドロイチン‐Ｇｌｙ
‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体を黄色粉末と
して得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０６nm）
の吸光度分析によると１３％（重量％）であった。
【００８３】（実施例２８）Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）
の代わりにＧｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐α‐Ｂｏｃ‐ε‐
Ｌｙｓ（１０２mg）を用い、加えるブロムシアンの量を
４１mgとした以外は実施例１９と同様に反応を行い、ヒ
アルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐α‐Ｂｏｃ‐ε
‐Ｌｙｓ複合体（１００mg）を得た。本複合体の置換度
は、ＮＭＲ法により１／７．１と算出された。この複合
体（９７mg）を実施例１９に準じて酸処理することによ
って、脱保護されたヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇ
ｌｙ‐ε‐Ｌｙｓ複合体（９１mg）を得た。この複合体
（６０mg）に、ＭＴＸ（４５mg）の活性エステルを実施
例８と同様にして反応させることにより、６３mgのヒア
ルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐ε‐Ｌｙｓ‐α‐
ＭＴＸ複合体を黄色粉末として得た。本複合体のＭＴＸ
含量は紫外部（３０９nm）の吸光度分析によると１４％
（重量％）であった。
【００８４】（実施例２９）Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）
の代わりにＢｏｃ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ
（１０２mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４１mg
とした以外は実施例１９と同様に反応を行い、Ｂｏｃ‐
Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合体
（９８mg）を得た。本複合体の置換度は、ＮＭＲ法によ
り１／１０と算出された。この複合体（９６mg）を実施
例１９に準じて酸処理することによって、脱保護された
Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合体
（９１mg）を得た。この複合体（７０mg）に、ＭＴＸ
（５４mg）の活性エステルを実施例８と同様にして反応
させることにより、７１mgのＭＴＸ‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐
Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合体を黄色粉末として
得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０８nm）の吸
光度分析によると１６％（重量％）であった。
【００８５】（実施例３０）Ｂｏｃ‐Ｇｌｕ（Ｌｙｓ）
の代わりにＢｏｃ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ
（８４mg）を用い、加えるブロムシアンの量を４１mgと
した以外は実施例１９と同様に反応を行い、Ｂｏｃ‐Ｇ
ｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合体
（９９mg）を得た。本複合体の置換度は、ＮＭＲ法によ
り１／６．６と算出された。この複合体（９７mg）を実
施例１９に準じて酸処理することによって、脱保護され
たＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合
体（８９mg）を得た。この複合体（７０mg）に、ＭＴＸ
（５４mg）の活性エステルを実施例８と同様にして反応
させることにより、７６mgのＭＴＸ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐
Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ヒアルロン酸複合体を黄色粉末として
得た。本複合体のＭＴＸ含量は紫外部（３０８nm）の吸
光度分析によると１６％（重量％）であった。
【００８６】（実施例３１）実施例１に準じて調整した
分子量１×１０5の低分子化ヒアルロン酸（１６１mg）
に、過ヨウ素酸ナトリウム（２９mg）を１０mlの水に溶
かして加え、４℃で１０日間反応させた。この反応液を
水に対して透析した後、酢酸ナトリウム（２６８mg）を
加えた。この液をエタノール（１３４ml）中に加え、析
出した沈澱を集め、真空乾燥して、ヒアルロン酸の開環
アルデヒド体（１３８mg）を得た。この物質のゲルろ過
溶出パターン（検出：示差屈折率）を図１２として示
す。
【００８７】（実験例１）試料と方法 実施例３（ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ−ＭＴＸ）の複合体
（１mg）を、ウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（１００μｇ）
の存在下および非存在下０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０，２００μｌ）中３７℃で反応させ、０、１．４およ
び２４時間の反応液を実施例１記載と同じゲルろ過法に
より分析した。結 果 結果を図８に示す。図８は反応時間とその反応時間での
反応液においてピークの溶出が現われる溶出時間との関
係を示すグラフである。図中○印線および●印線は、ヒ
アルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸについてヒアルロニダーゼ
が存在しない場合およびヒアルロニダーゼが存在する場
合におけるそれぞれの結果を示す。図８より、この複合
体にはヒアルロニダーゼの作用による低分子化が認めら
れ、従って生体内において徐々に分解を受け、長時間の
体内残留は起こらないことが期待される。
【００８８】（実験例２）実施例１に示した複合体（ヒ
アルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙｓ‐ＭＴ
Ｘ）を生理食塩水に溶かし、４０mg／mlのものを準備し
た。別に担癌ラット数匹より血液を採取し、遠心分離に
よりプラズマを得た。直ちにプラズマ１９０μｌに上記
の水溶液１０μｌを加え、３７℃にて一定時間インキュ
ベートした。各時間のサンプルについてメタノール、ク
ロロホルムによる除蛋白処理を行った後に、ＨＰＬＣ
（ＧＰＣ，カラム：ＴＳＫ‐ｇｅｌ Ｇ４０００Ｐ
ＷXL，カラム温度：４０℃，溶出液：０．１Ｍ‐ＮａＣ
ｌ水溶液，検出：３０７ｎｍにおける紫外部吸収）にて
分析した。０時間を１００％とした時の各時間後の複合
体の量の変化を図９に示す。図９より本発明物質が薬物
送達に必要な時間内において十分な血中安定性を示すこ
とがわかる。
【００８９】（実験例３）試料と方法 実施例４および実施例５に準じて調製したヒアルロン酸
‐Ｌｙｓ‐３Ｈ‐ＭＴＸおよびコンドロイチン‐Ｌｙｓ
‐３Ｈ‐ＭＴＸをそれぞれ試料Ａおよび試料Ｂとした。
ＩＣＲ系の雄性マウスを用いて、Ｓａｒｃｏｍａ １８
０を鼠頸部皮下に移植し、１０日後のマウスを実験に供
した。試料を生理食塩水に溶解し、１群３匹のマウスを
用い、尾静脈より試料ＡおよびＢを２０mg／kgを投与し
た。投与後６時間に大腿動脈および静脈を切断し、血液
を採取後、癌組織を摘出した。血液を遠心分離して得ら
れた血清と癌組織を燃焼装置を用いて燃焼し、放射活性
を液体シンチレーション法にて測定し、濃度を求めた。結 果 結果を表１に示す。表１より、試料の癌組織中濃度は血
清中濃度に比べて高く、特に試料Ａについて顕著であっ
た。
【００９０】
【表１】
【００９１】（実験例４）実施例２２で得た複合体（開
環ポリアルコール化ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ）の
ラットプラズマ中における安定性を実施例２に準じて評
価した。複合体の残存率の経時変化は図１０に示される
通りである。図１０により本発明による物質が薬物送達
に必要な時間内において十分な血中安定性を示すことが
わかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ‐ＭＴＸ複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃
度：５０μｇ／ml、溶媒：０．２％ ＮａＨＣＯ３）を
表わす。
【図２】ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ‐ＭＴＸ複合体のゲルろ過溶出パターン（検出：３０
３ｎｍにおける紫外部吸収）を表わす。
【図３】ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度：５mg／
ml、溶媒：水）を表わす。
【図４】ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ｇｌｙ‐Ｌｙ
ｓ‐ＭＴＸ複合体の紫外・可視部吸収スペクトル（濃
度：１００μｇ／ml、溶媒： ０．２％ ＮａＨＣ
Ｏ３）を表わす。
【図５】コンドロイチン‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体の紫外
・可視部吸収スペクトル（濃度：１００μｇ／ml、溶媒
０．２％ ＮａＨＣＯ３）を表わす。
【図６】コンドロイチン‐Ｌｙｓ‐ＭＴＸ複合体のゲル
ろ過溶出パターン（検出：３０３ｎｍにおける紫外部吸
収）を表わす。
【図７】ヒアルロン酸‐Ｇｌｙ‐Ｐｈｅ‐Ａｌａ複合体
の紫外・可視部吸収スペクトル（濃度：２．５mg／ml、
溶媒：水）を表わす。
【図８】反応時間とその反応時間での反応液においてピ
ークの溶出が現われる溶出時間との関係を示すグラフを
表わす。
【図９】複合体として存在しているＭＴＸの血漿中濃度
の経時変化（in vitro）を示すグラフを表わす。
【図１０】開環ポリアルコール化ヒアルロン酸‐Ｌｙｓ
‐ＭＴＸの血漿中濃度の経時変化（in vitro）を示すグ
ラフを表わす。
【図１１】開環ポリアルコール化ヒアルロン酸のゲルろ
過溶出パターン（検出：示差屈折率）を表す。
【図１２】開環アルデヒド化ヒアルロン酸のゲルろ過溶
出パターン（検出：示差屈折率）を表す。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わ
    される単位から構成される、ゲルろ過法による分子量が
    ３，０００〜８００，０００である、多糖誘導体および
    その塩（但し、ヒアルロン酸またはコンドロイチンの水
    酸基にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含んでなるペプチド鎖
    が導入されてなる多糖誘導体およびその塩を除く）。 【化１】 〔前記式中、 Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４は、同一または異なってい
    てもよく、それぞれ水素原子、基−ＣＯＮＨ２、また
    は、 下記一般式（ＩＩＩ）で表わされる基： 【化２】 （式中、 Ｚ１は１〜５個の同一または異なるアミノ酸を含んでな
    るペプチド鎖を表わし、 Ｐは水素原子、水酸基または保護基を表わし、 Ｗは酸素原子または基ＮＨを表わす。ただし、Ｃ−Ｚ１
    結合はＣ−Ｎ結合である）、 を表わすか、もしくは、 Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４のうち、いずれか２つが一
    緒になって結合して下記一般式（ＩＶ）で表わされる
    基： 【化３】 （式中、 Ｚ２は１〜５個の同一または異なるアミノ酸を含んでな
    るペプチド鎖を表わし、 Ｐは前記一般式（ＩＩＩ）で定義したものと同義であ
    る。ただし、Ｃ＝Ｚ２結合はＣ＝Ｎ結合である）を表わ
    す。 ただし、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４として前記一般式
    （ＩＩＩ）で表わされる基または前記一般式（ＩＶ）で
    表わされる基を有する単位が分子中に少なくとも１以上
    存在し、かつＹ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４が全て水素
    原子を表すことはない。〕
  2. 【請求項２】下記の式（Ｖ）および式（ＶＩ）または式
    （ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）で表される単位から構
    成される、ゲルろ過法による分子量が１，０００〜８０
    ０，０００である、多糖誘導体およびその塩。 【化４】
  3. 【請求項３】下記の式（ＩＸ）および式（Ｘ）または式
    （ＸＩ）および式（ＸＩＩ）で表される単位から構成さ
    れる、ゲルろ過法による分子量が１，０００〜８００，
    ０００である、多糖誘導体およびその塩。 【化５】
  4. 【請求項４】下記の式（ＸＩＩＩ）および式（ＸＩＶ）
    または式（ＸＶ）および式（ＸＶＩ）で表される単位か
    ら構成される、ゲルろ過法による分子量が１，０００〜
    ８００，０００である、多糖誘導体およびその塩。 【化６】 〔前記式中、 Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８
    は、同一または異なっていてもよく、それぞれ水素原
    子、基−ＣＯＮＨ２、または、 請求項１で定義した一般式（ＩＩＩ）で表わされる基を
    表わすか、もしくは、 Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４またはＸ５、Ｘ６、Ｘ７お
    よびＸ８のうちいずれか２つの基が一緒になって結合し
    て請求項１で定義した一般式（ＩＶ）で表わされる基を
    表わす。 ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７お
    よびＸ８として前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる基ま
    たは前記一般式（ＩＶ）で表わされる基を有する単位が
    分子中に少なくとも１以上存在し、かつＸ１、Ｘ２、Ｘ
    ３、およびＸ４、またはＸ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ８が
    それぞれ全て水素原子を表すことはない。〕
  5. 【請求項５】分子中の単糖単位の総モル数ａと、分子中
    に導入されたＺ１またはＺ２で表わされるペプチド鎖の
    モル数ｂとが、ｂ／ａ＝１／２〜１／１００の関係にあ
    る、請求項１または４記載の多糖誘導体およびその塩。
  6. 【請求項６】Ｚ１およびＺ２が１〜４個の同一または異
    なるアミノ酸を含んでなるペプチド鎖を表わし、そのＣ
    末端側アミノ酸にＰが結合してなる、請求項１または４
    記載の多糖誘導体およびその塩。
  7. 【請求項７】Ｚ１−ＰおよびＺ２−Ｐが、下記のいずれ
    かである、請求項１または４のいずれか一項記載の多糖
    誘導体およびその塩。 【化７】
  8. 【請求項８】請求項１、４〜７のいずれか一項記載の多
    糖誘導体のＰで表される水素原子または水酸基が、さら
    に基ＯＲ１、ＣＯＲ２もしくはＮＲ３Ｒ４ （ここで、 基ＯＲ１は、一般式Ｒ１ＯＨで表されるアルコール性水
    酸基を有する医薬化合物のアルコール性水酸基から水素
    原子を除いた残基を表し、 基ＣＯＲ２は、一般式Ｒ２ＣＯＯＨで表されるカルボキ
    シル基を有する医薬化合物のカルボキシル基から水酸基
    を除いた残基を表し、 基ＮＲ３Ｒ４は、一般式Ｒ３Ｒ４ＮＨで表されるアミノ
    基を有する医薬化合物のアミノ基から水素原子を一個除
    いた残基を表す） で置換されてなる、多糖誘導体およびその塩。
  9. 【請求項９】一般式Ｒ２ＣＯＯＨで表されるカルボキシ
    ル基を有する医薬化合物がメソトレキサートである、請
    求項８記載の多糖誘導体およびその塩。
  10. 【請求項１０】ヒアルロン酸またはコンドロイチンにシ
    アノゲンハライドを反応させた後、ペプチド鎖を反応さ
    せることからなる、請求項１記載の多糖誘導体およびそ
    の塩の製造法。
  11. 【請求項１１】ヒアルロン酸またはコンドロイチンに過
    ヨウ素酸またはその塩を反応させることからなる、請求
    項２記載の多糖誘導体およびその塩の製造法。
  12. 【請求項１２】ヒアルロン酸またはコンドロイチンに過
    ヨウ素酸またはその塩を反応させ、次に水素化ナトリウ
    ムを反応させることからなる、請求項３記載の多糖誘導
    体およびその塩の製造法。
  13. 【請求項１３】ヒアルロン酸またはコンドロイチンに過
    ヨウ素酸またはその塩を反応させ、次に水素化ナトリウ
    ムを反応させ、更にシアノゲンハライドを反応させた
    後、ペプチド鎖を反応させることからなる、請求項４記
    載の多糖誘導体およびその塩の製造法。
  14. 【請求項１４】請求項１又は４記載の多糖誘導体のＰ
    を、一般式Ｒ１ＯＨで表されるアルコール性水酸基を有
    する医薬化合物、一般式Ｒ２ＣＯＯＨで表されるカルボ
    キシル基を有する医薬化合物または一般式Ｒ３Ｒ４ＮＨ
    で表されるアミノ基を有する医薬化合物と置換すること
    からなる、請求項８記載の多糖誘導体の製造法。
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