DE69730352T2 - Verfahren zur herstellung eines arzneimittelkomplexes - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines arzneimittelkomplexes Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat und eine Arzneimittel-Verbindung wie z. B. ein antineoplastisches Mittel aneinander gebunden werden.
  • Technischer Hintergrund
  • Antineoplastische Mittel, die zur Behandlung fester Tumoren wie etwa Lungenkrebs oder Karzinomen der Verdauungsorgane und Blutkrebsarten wie z. B. Leukämie verwendet werden, werden über Verabreichungswege wie z. B. intravenöse oder orale Verabreichung systemisch verabreicht und dann an die spezifischen Tumororte verbracht und zeigen ihre therapeutische Wirksamkeit, indem sie die Proliferation von Krebszellen hemmen oder unterdrücken. Systemisch verabreichte antineoplastische Mittel werden jedoch rasch von der Leber und den retikuloendothelialen Organen aus dem Blut aufgenommen oder in den Urin abgeschieden, und dementsprechend können ihre Konzentrationen im Blut bisweilen soweit abgesenkt werden, daß ihre Verteilung an den Tumororten unzureichend ist. Zudem weisen die üblichen antineoplastischen Mittel selbst schlechte Verteilungsselektivität an den Tumororten (Tumorselektivität) auf, und daher werden die antineoplastischen Mittel gleichmäßig über verschiedene Gewebe und Zellen im ganzen Körper verteilt und wirken auch gegen normale Zellen und Gewebe als Zytotoxine, was insofern zu Problemen führt, als abträgliche Wirkungen, z. B. Erbrechen, Fieber oder Alopezie mit sehr hohen Raten auftreten. Erwünscht ist daher die Entwicklung eines Hilfsmittels zur wirksamen und selektiven Verteilung antineoplastischer Mittel an Stellen mit Tumoren.
  • EP 0 757 049 A1 , ein Dokument gemäß Art. 54(3) EPÜ, beschreibt ein Camptothecin-Derivat sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. Camptothecin- Derivate haben verstärkte Antitumorwirkung. Sie werden hergestellt durch Zusammengeben des Hydrochlorids der Arzneimittel-Verbindung mit dem Natriumsalz eines Polysaccharids in gleichen Systemen.
  • EP 0 059 221 A1 beschreibt medizinische Zusammensetzungen für den Gastrointestinaltrakt. Die Zusammensetzung umfaßt ein wasserlösliches Salz von Alginsäure als wirksamen Bestandteil derselben. Als wasserlösliches Salz wird ein Ammonium-Salz und ein Amin-Salz verwendet.
  • Auch die JP 57 046920 A beschreibt ein Arzneimittel für die Verdauungsorgane, das als wirksamen Bestandteil ein wasserlösliches Salz von Alginsäure enthält. Bevorzugte Salze sind Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Amin-Salze. Das Arzneimittel hat schützende Wirkung für die Schleimhäute der Verdauungsorgane und hämostatische Wirkung für die Verdauungsorgane.
  • Als ein derartiges Hilfsmittel wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen als Arzneimittel freisetzender Träger verwendet und ein antineoplastisches Mittel an das Polysaccharid-Derivat gebunden wird, um das Verschwinden des antineoplastischen Mittels aus dem Blut zu verzögern und die Selektivität gegenüber Tumorgewebe zu steigern. Zum Beispiel offenbart die internationale Veröffentlichung WO 94/19376 einen Arzneimittel-Komplex, bei dem eine Peptid-Kette (Anzahl der Aminosäurereste: 1 bis 8) an eine Carboxyl-Gruppe eines Polysaccharids mit Carboxyl-Gruppen gebunden wird, und des weiteren Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycin C, Bleomycin oder dergleichen mit Hilfe der Peptid-Kette gebunden wird. Zudem offenbart die japanische Patentveröffentlichung (KOKOKU) Nr. (Hei) 7-84481/1995 einen Arzneimittel-Komplex, bei dem das vorstehend erwähnte antineoplastische Mittel mit Hilfe einer Schiffschen Base oder einer Säureamid-Bindung in ein carboxymethyliertes Mannoglucan-Derivat eingeführt wird. Diese Arzneimittel-Komplexe sind dadurch gekennzeichnet, daß sie erheblich bessere Antitumorwirkung im Vergleich zu den Antitumormitteln selbst, die nicht an einen Arznei mittel freisetzenden Träger gebunden sind, sowie geringere Toxizität und weniger abträgliche Wirkungen aufweisen.
  • Zu den Techniken, die Arzneimittel-Komplexe unter Verwendung von polyalkoholisierten Polysaccharid-Derivaten als Arzneimittel freisetzende Träger betreffen, sind einige Berichte verfügbar, zum Beispiel "Researches on polysaccharide-peptide-doxorubicin complexes – Correlations between stabilities of polysaccharide carriers in blood and their anti-neoplastic activities" (Abstracts des 10. Meetings der Japan Society of Drug Delivery System, 279, 1994); "Researches on polysaccharide-peptide-doxorubicin complexes – Pharmacokinetics and antineoplastic activity" (Abstracts des 9. jährlichen Meetings der Japanese Society for the Study of Xenobiotics, 292, 1994); Abstracts des 19. Seminars zu Trends in Research and Development (abgehalten durch The Qrganization for Drug A D R Relief R&D Promotion and Product Review) D-9, 1995; und "Researches on drug delivery to a tumor tissue by polysaccharide carriers" (Abstracts des 12. Colloid and Interface Technology Symposium, The Chemical Society of Japan, 51, 1995).
  • Diese Arzneimittel-Komplexe werden üblicherweise hergestellt durch Herstellung des Natriumsalzes eines Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen, z. B. Carboxymethylpullulan oder Carboxymethylmannoglucan, und anschließendes Binden einer Carboxyl-Gruppe des Polysaccharid-Derivats an eine Amino-Gruppe eines Antitumormittels (oder eine N-terminale Amino-Gruppe einer an das Antitumormittel bindenden Peptidkette) durch eine Säureamid-Bindung. Die Natriumsalze der Polysaccharid-Derivate sind zumindest in organischen Lösungsmitteln völlig unlöslich, und dementsprechend wird bei der Durchführung der obigen Reaktion ein Verfahren herangezogen, umfassend die Herstellung des Natriumsalzes eines Polysaccharid-Derivats als Lösung in Wasser oder in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, das Wasser enthält, und anschließendes Lösen eines Kondensationsmittels und eines Antitumormittels (oder ei nes Antitumormittels mit Peptid-Kette) in Form des Hydrochlorids oder dergleichen in der Lösung.
  • Bei der Reaktion wird die dehydratisierende Kondensation jedoch in einem wasserhaltigen Lösungsmittel durchgeführt, und daher war es unmöglich, das gewünschte Produkt in hohen Ausbeuten zu erhalten. Die Antitumormittel, die als Stoffe für die Reaktion eingesetzt werden, sind im allgemeinen teuer, und erwünscht ist die Entwicklung eines Verfahrens zur effizienten Herstellung des vorstehend erwähnten Arzneimittel-Komplexes unter Berücksichtigung der Herstellungskosten. Zudem weisen die in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 beschriebenen Verbindungen, die als Antitumormittel brauchbar sind, einen Lacton-Ring in ihrem Molekül auf, und es bestehen Probleme insofern, als bei der Durchführung der vorstehend erwähnten Reaktion mit diesen Verbindungen, die jeweils an eine Peptid-Kette gebunden sind, der Lacton-Ring in Gegenwart einer Base und Wasser geöffnet wird, und die resultierende Carboxyl-Gruppe mit der N-terminalen Amino-Gruppe der an das Antitumormittel gebundenen Peptid-Kette reagieren kann, so daß sich die Ausbeute an gewünschtem Produkt verringert und der gewünschte einheitliche Arzneimittel-Komplex nicht erhalten wird. Gewünscht ist daher die Entwicklung eines Reaktionsverfahrens, mit dem sich die Bildung von Verbindungen vermeiden läßt, deren Lacton-Ring geöffnet ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur effizienten Herstellung von Arzneimittel-Komplexen, die einen Wirkstoff wie z. B. ein Antitumormittel oder ein entzündungshemmendes Mittel an einem Tumorort oder dergleichen ortsselektiv freisetzen können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem sich die Arzneimittel-Komplexe in großem Maßstab kostengünstig herstellen lassen, indem ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen mit einer Arzneimittel-Verbin dung wie z. B. einem Antitumormittel oder mit einem Spacer, umfassend ein Oligopeptid oder dergleichen, das an die Arzneimittel-Verbindung gebunden ist, effizient umgesetzt wird.
  • Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe führten die bei dieser Erfindung tätigen Erfinder eingehende Untersuchungen durch und fanden im Ergebnis, daß bei der Umsetzung eines Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen mit einer Arzneimittel-Verbindung oder einem an einen Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer unter Verwendung eines organischen Aminsalzes des Polysaccharid-Derivats an Stelle des üblicherweise verwendeten Natrium-Salzes das Salz des Polysaccharid-Derivats in hoher Konzentration in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden kann, das im wesentlichen frei von Wasser ist, so daß die Reaktion des Polysaccharid-Derivats mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer mit außerordentlich hohen Ausbeuten durchgeführt werden kann und Nebenprodukte oder dergleichen verringert werden können. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde verwirklicht.
  • Die vorliegende Erfindung macht somit ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes verfügbar, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung mit Hilfe eines eine Aminosäure umfassenden Spacers oder eines 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassenden Spacers aneinander gebunden werden, oder eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung ohne den Spacer aneinander gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein organisches Aminsalz des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen in einem nichtwäßrigen System mit der Arzneimittel-Verbindung umgesetzt oder der Spacer in einem nichtwäßrigen System an die Arzneimittel-Verbindung gebunden wird; sowie ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend erwähnten Arzneimittel-Komplexes, umfassend die Schritte: (1) Überführen eines Alkalimetallsalzes des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl- Gruppen in ein organisches Aminsalz desselben, und (2) Umsetzen des organischen Aminsalzes mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer in einem nichtwäßrigen System.
  • Gemäß bevorzugten Ausführungsformen wird das obige Verfahren bereitgestellt, wobei das Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen ein Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ist; das obige Verfahren, wobei der Dextran-Polyalkohol, aus dem der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol besteht, ein Dextran-Polyalkohol ist, der erhalten wird durch Behandeln eines Dextrans unter Bedingungen, die im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen; das obige Verfahren, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol ist; das obige Verfahren, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 500000, vorzugsweise im Bereich von 50000 bis 450000 und besonders bevorzugt im Bereich von 200000 bis 400000 ist, und der Carboxymethylierungsgrad pro Saccharid-Grundrest im Bereich von 0,01 bis 2,0, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,0 und besonders bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 0,5 liegt; sowie das obige Verfahren, wobei die Arzneimittel-Verbindung ein antineoplastisches Mittel oder ein entzündungshemmendes Mittel ist.
  • Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das obige Verfahren bereitgestellt, wobei die Arzneimittel-Verbindung eine Arzneimittel-Verbindung ist, die einen Lacton-Ring bilden kann; das obige Verfahren, wobei eine Arzneimittel-Verbindung mit gebildetem Lacton-Ring oder ein Spacer, der an eine Arzneimittel-Verbindung mit gebildetem Lacton-Ring gebunden ist, für die Reaktion des organischen Aminsalzes mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer eingesetzt wird; sowie das obige Verfahren, wobei die zur Bildung eines Lacton-Rings befähigte Arzneimittel-Verbindung (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-di hydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo-[de]py-rano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion ist.
  • Kurze Erklärung der Zeichnungen
  • 1 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 8, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 2 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 8, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 3 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 9, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 4 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 9, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 5 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 10, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 6 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 15, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 7 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 15, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 8 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 28, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 9 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 28, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 10 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 29, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 11 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 29, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 12 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 34, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 13 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 34, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 14 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 39, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 15 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 39, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 16 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 41, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 17 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 41, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 18 zeigt das GPC-Diagramm des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 44, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 19 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 44, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
  • 20 zeigt die Pharmakokinetik des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 15, hergestellt mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Jeder Punkt in der Figur gibt einen Durchschnittswert aus drei Experimenten an.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Der mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellte Arzneimittel-Komplex ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung mit Hilfe eines eine Aminosäure umfassenden Spacers oder eines 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassenden Spacers aneinander gebunden werden oder ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung ohne den Spacer aneinander gebunden werden.
  • Der Rest der in dem Arzneimittel-Komplex enthaltenen Arzneimittel-Verbindung ist von einer Arzneimittel-Verbindung abgeleitet, die für die therapeutische und/oder präventive Behandlung von Erkrankungen an Säugern, darunter Menschen, als Medikament verwendet wird, zum Beispiel als antineoplastisches Mittel, entzündungshemmendes Mittel, antibakterielles Mittel oder dergleichen, und der Rest besteht aus einer Teilstruktur der Arzneimittel-Verbindung. Allerdings ist die Arzneimittel-Verbindung, von der der Rest abgeleitet ist, nicht auf die vorstehend erwähnten beschränkt. Als Arzneimittel-Verbindung kann des weiteren jede Verbindung verwendet werden, solange sie eine oder mehrere reaktive funktionelle Gruppen aufweist, die sich an der Bildung einer Bindung zu einem Polysaccharid-Derivat oder einem Spacer beteiligen können (zum Beispiel Amino-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe, Thiol-Gruppe, Ester-Gruppe oder dergleichen). Der Begriff "Arzneimittel-Verbindung" in der vorliegenden Beschreibung umfaßt auch Prodrug-Verbindungen, die als Teil derselben die Hauptstruktur der Arzneimittel-Verbindung mit per se pharmakologischer Wirkung enthalten und die Verbindung in vivo reproduzieren können.
  • Der Begriff "Rest der Arzneimittel-Verbindung" in der vorliegenden Beschreibung bedeutet insbesondere eine von der Arzneimittel-Verbindung abgeleitete Teilstruktur, die nach Bindungsbildung in der Verbindung vorliegt, wenn man davon ausgeht, daß eine Bindung zwischen dem Polysaccharid-Derivat oder dem Spacer und dem Rest einer Arzneimittel-Verbindung durch Reaktion einer reaktiven funktionellen Gruppe der Arzneimittel-Verbindung und einer reaktiven funktionellen Gruppe des Polysaccharid-Derivats oder des Spacers gebildet wird (z. B. Kondensation unter Dehydratisierung etc.). Wird die Arzneimittel-Verbindung zum Beispiel durch D-NH2, D-COOH, D-COOR, D-OH, D-SH, D-CONH2 oder D-NH-COOR dargestellt (wobei R eine Niederalkyl-Gruppe oder dergleichen ist), so wird der Rest der Arzneimittel-Verbindung dargestellt durch D-NH-(D-NH-CO-Q etc.), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q, etc.), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q, etc.), D-O-(D-O-CO-Q, D-O-Q, etc.), D-S-(D-S-CO-Q, D-S-Q, etc.), D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q etc.) bzw. D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q, D-NH-CO-NH-Q, etc.) (das in Klammern Stehende bedeutet eine Bindung zwischen dem Spacer oder dem Polysaccharid-Derivat und dem Rest der Arzneimittel-Verbindung, wobei Q die verbleibende Teilstruktur des Spacers und des Polysaccharid-Derivats bedeutet, mit der Ausnahme einer reaktiven funktionellen Gruppe bzw. einer Carboxyl-Gruppe). Die Art der Bindung zwischen dem Spacer oder dem Polysaccharid-Derivat und dem Rest der Arzneimittel-Verbindung ist jedoch nicht auf die vorstehend erwähnten beschränkt. Der Rest der Arzneimittel-Verbindung kann an eine Carboxyl-Gruppe des Polysaccharid-Derivats, die N-terminale Amino-Gruppe oder die C-terminale Carboxyl-Gruppe des Spacers oder an eine reaktive funktionelle Gruppe gebunden sein, die in einer den Spacer aufbauenden Aminosäure vorliegt.
  • Als Rest der Arzneimittel-Verbindung können vorzugsweise die Reste antineoplastischer Mittel wie z. B. Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycin C, Bleomycin, Cyclocytidin, Vincristin, Vinblastin, Methotrexat, antineoplastischer Mittel mit Platin (Cisplatin oder Derivate desselben) Taxol oder dessen Derivate, Camptothecin oder dessen Derivate (antineoplastische Mittel, die beschrieben sind in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994, vorzugsweise (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo-[de]py-rano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion wie in Anspruch 2 offenbart oder dergleichen) verwendet werden. Bevorzugt sind zudem auch Reste von Steroid-Entzündungshemmern wie z. B. Hydrocortisonsuccinat und Prednisolonsuccinat und Nichtsteroid-Entzündungshemmern wie z. B. Mefenamsäure, Flufenamsäure, Diclofenac, Ibuprofen und Tinoridin.
  • Der Rest der Arzneimittel-Verbindung kann direkt oder mit Hilfe eines Spacers an das Polysaccharid binden. Als Spacer können solche verwendet werden, die eine Aminosäure oder 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassen. Sind insbesondere der Rest der Arzneimittel-Verbindung und das Polysaccharid-Derivat mit Hilfe eines Spacers aneinander gebunden, so hat der Spacer die Form eines Rests einer Aminosäure, das heißt, eines Rests, der erhalten wird durch Entfernen eines Wasserstoff-Atoms und einer Hydroxyl-Gruppe von einer Amino-Gruppe bzw. einer Carboxyl-Gruppe der Aminosäure, oder eines Rests eines Oligopeptids, das 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfaßt, das heißt, eines Rests, der erhalten wird durch Entfernen eines Wasserstoff-Atoms und einer Hydroxyl-Gruppe von der N-terminalen Amino-Gruppe bzw. von der C-terminalen Carboxyl-Gruppe des Oligopeptids.
  • Bevorzugte Spacer sind Reste von Oligopeptiden, die 2 bis 6 Aminosäuren umfassen. Die Art der den Spacer bildenden Aminosäuren unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und es können zum Beispiel L- oder D-Aminosäuren, vorzugsweise L-Aminosäuren eingesetzt werden, und es können β-Alanin, ε-Aminocapronsäure, γ-Aminobuttersäure oder dergleichen, wie auch α-Aminosäuren verwendet werden. Diese Aminosäuren – außer den α-Aminosäuren – befinden sich vorzugsweise in der Nähe des Polysaccharid-Derivats im Spacer.
  • Wird zum Beispiel ein Oligopeptid-Spacer verwendet, so unterliegt die Bindungsrichtung keinen speziellen Einschränkungen, und im allgemeinen kann der N-Terminus des Spacers über eine Säureamid-Bindung an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols gebunden sein, und der C-Terminus des Spacers kann an eine Amino-Gruppe der Arzneimittel-Verbindung gebunden sein. Wird alternativ ein Lysin-Rest als Aufbaueinheit des Peptid-Spacers eingebracht, so kann man die α-Amino-Gruppe und die ε-Amino-Gruppe des Lysin-Rests jeweils Säureamid-Bindungen mit Carboxyl-Gruppen anderer Aminosäuren ausbilden lassen, um N-Termini an beiden Enden des Peptid-Spacers zu bilden, so daß Bindungsbildung mit den Carboxyl-Gruppen der Arzneimittel-Verbindung möglich wird. Durch Einbringen eines oder mehrerer Reste von Diamin-Verbindungen oder Dicarbonsäure-Verbindungen (Reste von Diamin-Verbindungen wie etwa Ethylendiamin oder Dicarbonsäure-Verbindungen wie etwa Bernsteinsäure) als Aufbaueinheiten in einen Spacer kann ein Spacer genutzt werden, der entweder N-Termini oder C-Termini an beiden Enden aufweist.
  • Wird ein Spacer verwendet, der ein Oligopeptid umfaßt, so unterliegt die Aminosäuresequenz keinen speziellen Einschränkungen. Zu den bevorzugt verwendeten Spacern zählen zum Beispiel ein Spacer, der ein Rest eines durch -X-Z- dargestellten Dipeptids ist, worin X einen Rest einer hydrophoben Aminosäure bedeutet, und Z einen Rest einer hydrophilen Aminosäure bedeutet; und X-Z- für einen Rest steht, der aus einem Dipeptid besteht, das gebildet wird durch Peptid-Bindung zwischen einer hydrophoben Aminosäure (X) und einer hydrophilen Aminosäure (Z) am N-terminalen Ende bzw. am C-terminalen Ende, wobei ein Wasserstoff-Atom und eine Hydroxyl-Gruppe von der Amino-Gruppe am N-Terminus bzw. von der Carboxyl-Gruppe am C-Terminus entfernt werden, sowie ein Spacer, der einen Rest des Dipeptids als Teilpeptidsequenz enthält. Als hydrophobe Aminosäure kann beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin, Leucin oder dergleichen verwendet werden, und als hydrophile Aminosäure kann beispielsweise Glycin, Alanin oder dergleichen verwendet werden. Der Spacer kann eine Wie derholungssequenz des Dipeptid-Rests aufweisen (zum Beispiel X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z-, etc.).
  • Durch Verwendung eines Spacers, der eine solche Dipeptid-Struktur enthält, kann der Spacer an tumorösen oder entzündeten Stellen hydrolysiert werden, die vermutlich reichlich Peptidase enthalten, so daß die Arzneimittel-Verbindung in hoher Konzentration an diesen Stellen freigesetzt wird, und dementsprechend ist die Struktur, die aus dem das obige Dipeptid enthaltenden Spacer und der Arzneimittel-Verbindung durch Aneinanderbinden gebildet wird, eine bevorzugte Teilstruktur des Arzneimittel-Komplexes gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Wird ein Rest eines antineoplastischen Mittels, das konzentrationsabhängige antineoplastische Wirkung aufweist (antineoplastische Mittel, die stärkere antineoplastische Wirkung bei höherer Konzentration aufweisen: konzentrationsabhängige antineoplastische Mittel, z. B. Doxorubicin etc.), als Rest der Arzneimittel-Verbindung verwendet, so kann besonders bevorzugt ein Spacer verwendet werden, der aus dem durch -X-Z- dargestellten obigen Dipeptid-Rest zusammengesetzt ist, oder ein Spacer, der den obigen Dipeptid-Rest als Teilpeptidsequenz enthält.
  • Wird zudem ein zeitabhängiger Typ eines antineoplastischen Mittels, der eine einzuhaltende Einwirkzeit oberhalb einer bestimmten Konzentration erfordert, als Rest der Arzneimittel-Verbindung verwendet, so kann durch Einsatz des obigen Spacers bisweilen gesteigerte antineoplastische Wirkung erhalten werden. Zu den Beispielen hierfür gehören die in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarten antineoplastischen Mittel und vorzugsweise das in Anspruch 2 offenbarte antineoplastische Mittel. Im allgemeinen sollte der Spacer nicht auf die vorstehend erwähnten eingeschränkt werden, und es ist notwendig, einen geeigneten Spacer nach den Gesichtspunkten der Wirkungsweise des antineoplastischen Mittels, den pharmakokinetischen Merkmalen oder dem Auftreten von Toxizität, der Freisetzbarkeit des antineoplastischen Mittels in vivo und dergleichen auszuwählen. Bei Karzinomen, die schnelle Proliferation zeigen, ist es im allgemeinen bevorzugt, den obigen Spacer auszuwählen, der die Arzneimittel-Verbindung innerhalb kurzer Zeit in hoher Konzentration freisetzen kann.
  • Spezielle Beispiele für die Spacer sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Allerdings ist der für das Verfahren zur Herstellung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung verwendete Spacer nicht auf die nachstehend erwähnten eingeschränkt, und es ist ohne weiteres klar, daß ein Durchschnittsfachmann einen Spacer in geeigneter Weise auswählen kann, um so optimale Freisetzungsgeschwindigkeit einer Arzneimittel-Verbindung zu erzielen. In der Tabelle sind die linken Enden der Peptidsequenzen N-Termini, und die Reste der Arzneimittel-Verbindungen sind an C-Termini gebunden. D-Phe steht für einen D-Phenylalanin-Rest, und die übrigen Aminosäuren stellen L-Aminosäuren dar. Die Höhe der Freisetzungsgeschwindigkeit wurde beurteilt anhand des Grades eingetretener Wirksamkeit des mit Doxorubicin gebundenen Arzneimittel-Komplexes an tumortragenden Walker 256-Ratten oder anhand der freien Doxorubicin-Konzentration an den Tumororten bei tumortragenden Walker 256-Ratten. Von diesen Spacern wird ein Spacer, der die Arzneimittel-Verbindung in kurzer Zeit in hoher Konzentration freisetzen kann, z. B. (N-Terminus)-Gly-Gly-Phe-Gly-, vorzugsweise für Doxorubicin verwendet.
  • Tabelle 1
    Figure 00150001
  • Als Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen, das die Polysaccharid-Derivat-Einheit des Arzneimittel-Komplexes bildet, können zum Beispiel alle Polysaccharide und chemisch oder biologisch modifizierten Derivate derselben verwendet werden, solange sie Carboxyl-Gruppen in ihren Molekülen aufweisen. Zum Beispiel können Polysaccharide wie etwa Hyaluronsäure, Pektinsäure, Alginsäure, Chondroitin und Heparin; und Polysaccharide wie etwa Pullulan, Dextran, Mannan, Chitin, Inulin, Levan, Xylan, Araban, Mannoglucan und Chitosan eingesetzt werden, wobei alle oder ein Teil der Hydroxyl-Gruppen mit funktionellen Gruppen eingeführt werden, die eine Carboxyl-Gruppe aufweisen. Zum Beispiel können bevorzugt solche verwendet werden, die carboxy(C1-4)alkylierte Hydroxyl-Gruppen aufweisen, oder solche mit Hydroxyl-Gruppen, die mit einer Carboxyl-Gruppe einer mehrbasigen Säure verestert sind. Des weiteren können auch solche verwendet werden, die durch Polyalkoholisierung der obigen Polysaccharide und anschließende Einführung funktioneller Gruppen mit einer Carboxyl-Gruppe erhalten werden.
  • Unter diesen Polysaccharid-Derivaten ist ein Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol bevorzugt. Zwar unterliegt der Polyalkoholisierungsgrad des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols keinen speziellen Einschränkungen, doch ist der den Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol bildende Dextran-Polyalkohol vorzugsweise ein Dextran-Polyalkohol, der erhalten wird durch Behandeln eines Dextrans unter Bedingungen, die im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen.
  • Die Art des zur Herstellung des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols verwendeten Dextrans unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und das Dextran kann α-D-1,6-Bindungen in beliebigen Anteilen enthalten. Zum Beispiel können Dextrane verwendet werden, die α-D-1,6-Bindungen mit einem Anteil von 85% oder mehr, 90% oder mehr und 95% oder mehr enthalten. Das Molekulargewicht des Dextrans unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und beispielsweise können Dextrane mit einem Molekulargewicht von etwa 10000 bis etwa 2000000, vorzugsweise etwa 50000 bis etwa 800000 verwendet werden. Als C1-C4-Alkyl-Gruppe, die die Carboxy(C1-4)alkyl-Gruppe des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols bildet, kann eine lineare oder verzweigte C1-C4-Alkyl-Gruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, n-Propyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, n-Butyl-Gruppe, sec-Butyl-Gruppe oder dergleichen verwendet werden, und vorzugsweise kann eine Methyl-Gruppe verwendet werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des vorstehend erwähnten Arzneimittel-Komplexes ein organisches Aminsalz des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen mit der Arzneimittel-Verbindung als solcher umgesetzt wird, oder ein organisches Aminsalz des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen mit einem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer in einem organischen Lösungsmittel umgesetzt wird, das im wesentlichen frei von Wasser ist, d. h., in einem nichtwäßrigen System. Als bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung soll ein Verfahren unter Verwendung eines Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols als Polysaccharid-Derivat nachstehend speziell erläutert werden. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf dieses Ausführungsbeispiel beschränkt.
  • Wird ein Dextran als Ausgangsmaterial eingesetzt, so kann das Dextran nacheinander mit einer großen Überschußmenge an Natriumperiodat und Natriumborhydrid behandelt werden, um einen Dextran-Polyalkohol zu ergeben, der im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung durchlaufen hat. Allerdings ist das Verfahren zur Polyalkoholisierung von Dextranen nicht auf das vorstehend erwähnte Verfahren beschränkt, und es kann jede dem Fachmann bekannte Methode herangezogen werden. Die Carboxy(C1-4)alkylierung kann so durchgeführt werden, daß zum Beispiel eine halogenierte (C1-4)Alkylcarbonsäure wie etwa Chloressigsäure, Bromessigsäure, α-Chlorpropionsäure, α-Methyl-α-chlorpropionsäure, β-Chlorpropionsäure, α-Methyl-β-chlorpropionsäure, α-Chlorbuttersäure, β-Chlorbuttersäure oder γ-Chlorbuttersäure, vorzugsweise Chloressigsäu re, mit den Hydroxyl-Gruppen des Dextran-Polyalkohols umgesetzt wird, um teilweise oder vollständige Carboxy(C1-4)alkylierung der Hydroxyl-Gruppen zu erreichen.
  • Der Dextran-Polyalkohol wird zum Beispiel in einem inerten Lösungsmittel gelöst, das nicht an den Reaktionen teilnimmt (z. B. Wasser, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid), und die Lösung wird mit einer halogenierten (C1-4)Alkylcarbonsäure oder einem Salz derselben in Gegenwart einer Base (z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) versetzt, und dann wird die Mischung mehrere Minuten bis mehrere Tage bei einer Temperatur von Eiskühlung bis etwa 100°C reagierenlassen. Der Grad der Einführung der Carboxy(C1-4)alkyl-Gruppe läßt sich in einfacher Weise steuern, indem die Reaktionstemperatur der Carboxy(C1-4)alkylierung oder die Menge der halogenierten (C1-4)Alkylcarbonsäure oder die als Reagenzien verwendeten Basen in geeigneter Weise ausgewählt werden, und diese Maßnahmen sind dem Fachmann wohlbekannt. Der Grad der Carboxy(C1-4)alkylierung der Hydroxyl-Gruppen des Dextran-Polyalkohols unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und dieser Grad kann beispielsweise im Bereich von 0,01 bis 2,0, vorzugsweise von 0,1 bis 1,0, und besonders bevorzugt von 0,3 bis 0,5 pro Rest des aufbauenden Saccharids liegen. Das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols ist etwa 5000 bis 500000, vorzugsweise etwa 50000 bis 450000, und besonders bevorzugt etwa 200000 bis 400000 bei Bestimmung mit Hilfe der Gelfiltrationsmethode.
  • Der wie vorstehend hergestellte Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol wird als wäßrige Lösung eines Alkalimetallsalzes bereitgestellt, etwa als Natrium-Salz oder Kalium-Salz. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Bildung der Bindung zwischen der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer ein organisches Aminsalz des Polysaccharid-Derivats an Stelle des obigen Polysaccharid-Derivats in Form des Alkalimetallsalzes eingesetzt wird. Das organische Amin salz des Polysaccharid-Derivats läßt sich in hoher Konzentration in einem organischen Lösungsmittel lösen, das im wesentlichen frei von Wasser ist, so daß die Reaktion in einem nichtwäßrigen System durchgeführt werden kann, und dementsprechend kann der Wirkungsgrad der Reaktion in bemerkenswerter Weise gesteigert werden.
  • Als organisches Aminsalz können zum Beispiel Salze aliphatischer Amine wie z. B. Triethylamin, Trimethylamin, oder Triethanolamin; Salze alicyclischer und aromatischer Amine wie etwa N-Methylpyrrolidin, N-Methylpiperidin, N-Methylmorpholin oder Dimethylaminopyridin; oder quartäre Ammoniumsalze wie z. B. Tetramethylammoniumchlorid oder Tetraethylammoniumchlorid verwendet werden. Die Umwandlung des Natriumsalzes des Polysaccharid-Derivats in das organische Aminsalz kann unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes oder dergleichen durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Natriumsalz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols in Wasser gelöst, auf eine mit dem Harz Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Typ) beschickte Säule aufgegeben und mit Wasser eluiert werden, und anschließend kann der resultierende Ablauf mit einem organischen Amin wie z. B. Triethylamin versetzt und lyophilisiert werden. Alternativ ist es auch möglich, die Umwandlung in einem Schritt durchzuführen, d. h., durch Lösen des Natriumsalzes des Carboxymethyldextran-Polyalkohols in Wasser und Durchleiten der Lösung durch ein Harz vom Triethylammonium-Typ.
  • Die Bindung zwischen der Arzneimittel-Verbindung selbst und der Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols oder die Bindung zwischen dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer und der Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols kann im allgemeinen so gebildet werden, daß eine reaktive Amino-Gruppe der Arzneimittel-Verbindung oder die N-terminale Amino-Gruppe des Spacers an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols über eine Säureamid-Bindung gebunden wird. Allerdings ist die Bindung zwischen der Arzneimittel-Verbindung oder dem Spacer und der Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols nicht auf die vorstehend beschriebene Bindung beschränkt, und es können auch andere chemische Bindungen sowie Bindungen unter Nutzung eines oder mehrerer Spacer verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Säureanhydrid zwischen der C-terminalen Carboxyl-Gruppe des Spacers oder einer Carboxyl-Gruppe der Arzneimittel-Verbindung und einer Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols gebildet werden, oder die jeweiligen Carboxyl-Gruppen können bei Verwendung einer Diamin-Verbindung wie z. B. Ethylendiamin, das als Spacer verwendet wird, über eine Säureamid-Bindung an die jeweiligen Amino-Gruppen der Diamin-Verbindung gebunden sein.
  • Ist die an der Arzneimittel-Verbindung substituierte reaktive Amino-Gruppe oder die N-terminale Amino-Gruppe des Spacers über eine Säureamid-Bindung an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols gebunden, so können Dehydratisierungskondensationsmittel, die normalerweise zur Synthese von Peptid-Ketten verwendet werden, zum Beispiel, N,N'-Dicycloalkylcarbodiimide wie z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbodiimid-Derivate wie etwa 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAPC), Benzotriazol-Derivate wie etwa 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (EEDQ) und dergleichen eingesetzt werden. Des weiteren kann die Reaktion auch mit Hilfe der Methode der aktivierten Ester oder der Säurehalogenid-Methode durchgeführt werden.
  • Die Reaktion kann in irgendeinem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, solange es wasserfrei ist und die Reaktionspartner (das organisches Aminsalz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols und die Arzneimittel-Verbindung oder den an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer) zu lösen vermag. Bevorzugt können beispielsweise N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetamid, N-Methylpyrrolidon, Sulfolan und dergleichen verwendet werden. Zwar unterliegt die Menge des Rests der Arzneimittel-Verbindung, der durch Reaktion mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer in den Carboxymethyldextran-Polyalkohol ein geführt wird, keinen speziellen Einschränkungen, doch sollte die Menge nach den Gesichtspunkten der physikochemischen Eigenschaften des Rests der Arzneimittel-Verbindung, der Pharmakokinetik, Wirksamkeit und Toxizität des Arzneimittel-Komplexes ausgewählt werden. Im allgemeinen kann ein Bereich von etwa 0,1 bis 30 Gew.-% und vorzugsweise etwa 1 bis 15 Gew.-% ausgewählt werden. Der Anteil des in den Carboxymethyldextran-Polyalkohol eingeführten Rests der Arzneimittel-Verbindung läßt sich in einfacher Weise, beispielsweise mit Hilfe von absorptionsspektrometrischen Analysen bestimmen.
  • Als eine bevorzugten Ausführungsform des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung zeigt das folgende Schema das Verfahren zur Einführung des an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Oligopeptids, d. h., das in Anspruch 2 der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarte antineoplastische Mittel, in einen Carboxymethyldextran-Polyalkohol. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf die in dem Schema gezeigten beschränkt. In dem nachstehenden Schema beträgt die eingeführte Menge des Rests der Arzneimittel-Verbindung beispielsweise 1 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 4 bis 8 Gew.-%. Von den Aufbaueinheiten des Polyalkohols ist zudem nur eine Aufbaueinheit, die mit einer oder zwei Carboxymethyl-Gruppen eingeführt wird, in dem nachstehenden Schema beispielhaft dargestellt. Es sei jedoch klar, daß die Polysaccharid-Derivat-Einheit des Arzneimittel-Komplexes nicht durch Wiederholung der obenerwähnten Aufbaueinheit gebildet wird.
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Es ist bekannt, daß das Gleichgewicht der Arzneimittel-Verbindung in obigem Schema in einem sauren wäßrigen Medium (zum Beispiel etwa pH-Wert 3) auf der Seite der Verbindung liegt, deren Lacton-Ring geschlossen ist (die Ring-Verbindung), während das Gleichgewicht in einem basischen wäßrigen Medium (zum Beispiel etwa pH-Wert 10) auf der Seite der Verbindung liegt, deren Lacton-Ring geöffnet ist (die ringgeöffnete Verbindung), und daß die Arzneimittel-Komplexe, die mit den Resten eingeführt werden, die der Verbindung mit geschlossenem oder geöffnetem Ring entsprechen, ähnliche antineoplastische Wirkung aufweisen. Liegt jedoch ein Reaktionspartner, dessen Lacton-Ring geöffnet ist, im Reaktionssystem für die Reaktion zwischen dem Carboxymethyldextran-Polyalkohol und dem an die vorstehend erwähnte Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer vor (z. B. ein Oligopeptid-Spacer), so findet eine Kondensationsreaktion zwischen einer aus dem Lacton-Ring stammenden Carboxyl-Gruppe und einer aus dem Spacer stammenden Amino-Gruppe statt, was zu einer erheblichen Abnahme der Reaktionsausbeute führt und der gewünschte Arzneimittel-Komplex bisweilen nicht einheitlich erhalten werden kann. Eine solche Nebenreaktion läßt sich vermeiden, wenn man die Verbindung mit geschlossenem Ring als Reaktionspartner in einem nichtwäßrigen System verwendet, bei dem dieses Gleichgewicht nicht möglich ist. Das Verfahren der vor liegenden Erfindung ist daher besonders geeignet zur Herstellung des Arzneimittel-Komplexes, der die vorstehend erwähnte Arzneimittel-Verbindung enthält.
  • Der obenerwähnte, nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Arzneimittel-Komplex ist dadurch gekennzeichnet, daß er je nach Art des Rests der Arzneimittel-Verbindung (z. B. der Rest einer Arzneimittel-Verbindung wie z. B. eines antineoplastischen Mittels oder eines entzündungshemmenden Mittels) spezifisch eine gewünschte pharmakologische Wirkung an einer lokalen Stelle wie z. B. einer tumorösen oder entzündeten Stelle aufweisen und die der Arzneimittel-Verbindung an sich eigenen Toxizität verringern kann. Zum Beispiel weist der Carboxymethyldextran-Polyalkohol als Polysaccharid-Derivat-Einheit ausgezeichnete Retention in Blut auf, erreicht als Arzneimittel freisetzender Träger hohe Akkumulierung an tumorösen oder entzündeten Stellen und verleiht dem Arzneimittel-Komplex hohe Ortsselektivität bei Neoplasien und Entzündungen. Zudem kann man davon ausgehen, daß an den tumorösen oder entzündeten Stellen Protease (Peptidase) exprimiert wird, und dementsprechend wird der Arzneimittel-Komplex mit dem Spacer, der ein Oligopeptid umfaßt, an der Spacer-Einheit leicht hydrolysiert, so daß die freigesetzte Arzneimittel-Verbindung ihre Wirksamkeit entfalten kann.
  • Ein Medikament, das den nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Arzneimittel-Komplex enthält, kann im allgemeinen in Form eines lyophilisierten Produkts oder anderweitig in Phiolen oder dergleichen abgefüllt und als Zubereitung für die parenterale Verabreichung wie z. B. Injektion oder Tropfeninfusion, die bei Gebrauch gelöst werden, für die klinische Anwendung bereitgestellt werden. Allerdings ist die Form der pharmazeutischen Zubereitungen des Medikaments nicht auf die obenerwähnten Formen beschränkt. Zur Herstellung der obigen pharmazeutischen Zubereitungen können pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet werden, die hergestellt werden unter Verwendung pharmazeutischer Additive, die in diesem Fachgebiet verfügbar sind, zum Beispiel, Lösungsvermittler, pH-verändernde Mittel, Stabilisatoren und dergleichen.
  • Zwar unterliegt die Dosis des obigen Medikaments keinen speziellen Einschränkungen, doch sollte sie normalerweise bestimmt werden anhand der Dosis der Arzneimittel-Verbindung, die den Rest der Arzneimittel-Verbindung bildet, der Menge des in den Arzneimittel-Komplex eingeführten Rests der Arzneimittel-Verbindung, des Zustands des Patienten, der Art der Krankheit und dergleichen. Wird zum Beispiel ein Arzneimittel-Komplex parenteral verabreicht, in den etwa 6 Gew.-% des Rests des in Anspruch 2 der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarten antineoplastischen Mittels eingeführt wurden, so können im allgemeinen etwa 1 bis 500 mg, vorzugsweise etwa 10 bis 100 mg pro m2 Körperoberfläche pro Tag einmal am Tag verabreicht werden, und die Verabreichung kann vorzugsweise alle 3 bis 4 Wochen wiederholt werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung soll nun anhand von Beispielen ausführlicher erläutert werden.
  • In den Beispielen steht "A-NH-" für einen Rest einer Arzneimittel-Verbindung, wobei die Arzneimittel-Verbindung einen Lacton-Ring aufweist, etwa die in Anspruch 2 der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarte Arzneimittel-Verbindung (in den Beispielen bisweilen als "DX-8951" bezeichnet), und die Arzneimittel-Verbindung mit geschlossenem Lacton-Ring wird durch A-NH2 dargestellt. Ein Beispiel dafür ist die in obigem Schema durch A-NH- dargestellte Gruppe, in dem ein Lacton-Ring gebildet wurde. Zudem bedeutet A'-NH-, daß der Lacton-Ring des Rests der durch A-NH- dargestellten Arzneimittel-Verbindung entweder in der Form mit geschlossenem oder geöffnetem Ring oder alternativ als Mischung derselben vorliegt.
  • Solange nichts anderes ausdrücklich vermerkt ist, wurde der Carboxymethylierungsgrad des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (der Grad der Substitution mit Carboxymethyl-Gruppen pro aufbauendem Saccharid-Rest) bestimmt durch Überführen des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextran-Polyalkohols in die Form der freien Säure, Lösen der resultierenden Säure in wäßriger 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung und anschließendes Titrieren mit 0,1 N Salzsäure. Eine wäßrige Lösung des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextran-Polyalkohols wurde auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (H+-Form) aufgebracht, der Ablauf wurde lyophilisiert und dann als Probe verwendet. Die Probe wurde in einer vorgeschriebenen überschüssigen Menge einer wäßrigen 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und mit 0,1 N Salzsäure gegen Phenolphthalein als Indikator titriert. Der Carboxymethylierungsgrad wurde mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet: Carboxymethylierungsgrad = 13,4(a – b)/[s – 5,8(a – b)], worin "s" das Gewicht der aufgebrachten Probe (mg) ist, "a" die vorgeschriebene überschüssige Menge wäßriger 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung (ml) ist, und "b" das Volumen der für die Titration verbrauchten 0,1 N Salzsäure (ml) ist. Die Menge des eingeführten Arzneimittels (Gew.-%) wurde durch absorptionsspektrometrische Analyse unter Verwendung der charakteristischen Absorptionen der Arzneimittel-Verbindung (etwa 362 nm) bestimmt. Die Gelfiltration wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Säule: TSK-Gel G4000 PWXL; Elutionsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min; Säulentemperatur: 40°C.
  • Beispiel 1 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
    Figure 00260001
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (600 mg) und N-Hydroxysuccinimid (160 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (280 mg) versetzt. Diese Lösung wurde mit einer Lösung des Methansulfonats der in Anspruch 2 der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 beschriebenen Arzneimittel-Verbindung (600 mg, die in Beispiel 50 der vorstehend erwähnten Patentveröffentlichung beschriebene Verbindung) und in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöstem Triethylamin (0,16 ml) versetzt, und die Mischung wurde unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 10 : 1-Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure), um die Titelverbindung (1,0 g) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,40 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,10–8,17 (m, 2H), 7,91–8,01 (m, 1H), 7,78 (d, 1H, J = 10,75 Hz), 7,32 (s, 1H), 6,94–6,96 (m, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,57 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 5,43 (s, 2H), 5,23 (s, 2H), 3,77 (dd, 2H, J = 5,85 Hz, J = 8,80 Hz), 3,70 (d, 2H, J = 4,40 Hz), 3,65 (d, 2H, J = 5,35 Hz), 3,56 (d, 2H, J = 5,85 Hz), 3,15–3,25 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,86 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35).
    Masse (FAB): m/e 854 (M + 1).
  • Beispiel 2
  • Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Phe (600 mg) und N-Hydroxysuccinimid (160 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (280 mg) versetzt. Diese Lösung wurde mit einer Lösung des Methansulfonats von DX-8951 (600 mg) und in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöstem Triethylamin (0,16 ml) versetzt, und die Mischung wurde unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trocke ne eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 10 : 1-Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure), um die Titelverbindung (700 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,57 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,19 (d, 1H), 8,05–8,07 (m, 2H), 7,79 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 7,32 (s, 1H), 7,10 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 6,93–7,03 (m, 4H), 6,51 (s, 1H), 5,52–5,55 (m, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,18 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 4,84 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 4,57–4,59 (m, 1H), 3,57–3,71 (m, 6H), 3,15–3,25 (m, 2H), 3,00–3,02 (m, 1H), 2,80–2,90 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,86 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35 Hz).
    Masse (FAB): m/e 854 (M + 1)
  • Beispiel 3
  • Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Gly (120 mg) und N-Hydroxysuccinimid (39 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (70 mg) versetzt. Diese Lösung wurde mit einer Lösung des Methansulfonats von DX-8951 (150 mg) und in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöstem Triethylamin (0,039 ml) versetzt, und die Mischung wurde unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 10 : 1-Lösung), um die Titelverbindung (100 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,40 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,10–8,17 (m, 2H), 7,91–8,01 (d, 1H), 7,78 (d, 1H, J = 10,75 Hz), 7,32 (s, 1H), 6,94–6,96 (m, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,57 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 5,43 (s, 2H), 5,23 (s, 2H), 3,77 (dd, 2H, J = 5,85 Hz, J = 8,80 Hz), 3,70 (d, 2H, J = 4,40 Hz), 3,65 (d, 2H, J = 5,35 Hz), 3,56 (d, 2H, J = 5,85 Hz), 3,15–3,25 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,86 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35 Hz).
    Masse (FAB): m/e 764 (M + 1)
  • Beispiel 4 Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A-trifluoracetat (A-NH2 = DX-8951)
    Figure 00290001
  • 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) azeotrop destilliert, und anschließend wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,59–8,61 (m, 1H), 8,50 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,21–8,27 (m, 2H), 7,91–8,01 (br, 3H), 7,81 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 7,32 (s, 1H), 6,50–6,52 (br, 1H), 5,57–5,59 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,23 (s, 2H), 3,80–3,82 (m, 3H), 3,70–3,75 (m, 3H), 3,15–3,25 (m, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,86–1,88 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35 Hz).
  • Beispiel 5
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Dextran T2000 (10 g, Pharmacia, mittleres Molekulargewicht: 2000000) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer gelöst (pH-Wert 5,5, 1000 ml) und mit einer wäßrigen Lösung (1000 ml) von Natriumperiodat (33,0 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (7,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (14 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde mit einer Biomax-30-Membran (Millipore) ultrafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion abzutrennen. Die polymere Fraktion wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben. Nach einstündiger Behandlung dieses Dextran-Polyalkohols bei pH 3,0 wurde die niedermolekulare Fraktion mit einer Biomax-50-Membran abgetrennt, und anschließend wurde die polymere Fraktion mit einer Biomax-100-Membran abgetrennt, und das Ergebnis wurde lyophilisiert, um den gereinigten Dextran-Polyalkohol zu ergeben (2,0 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz war 220K (Gelfiltration, Dextran-Standard).
  • Dieser gereinigte Dextran-Polyalkohol (1,8 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (10,5 g) in Wasser (45 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (15 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und anschließend wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Nachdem diese Reaktionsmischung mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt worden war, wurde die niedermolekulare Fraktion durch Ultrafiltration mit einer Biomax-10-Membran abgetrennt. Die polymere Fraktion wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (1,8 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz war 330K (Gelfiltration, Dextran-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad belief sich auf 0,8.
  • Das obige Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (300 mg) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (1,5 × 8,6 cm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Dieser Ablauf wurde mit Triethylamin (0,5 ml) versetzt und lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (380 mg). Teile des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (jeweils 300 mg) wurden wie vorstehend beschrieben mit der Säule behandelt, um das Triethylam monium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (380 mg, 400 mg).
  • Beispiel 6
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natriumsalz
  • Das in obigem Beispiel 5 erhaltene Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (0,15 g) wurde zu einer wäßrigen Lösung gegeben, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (1,05 g) in Wasser (4,5 ml), und anschließend bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (1,5 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt, in 90 ml Methanol eingetropft, mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (0,15 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden mit Methanol gewaschen, in Wasser (5 ml) gelöst und mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (0,15 ml) versetzt. Diese wäßrige Lösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,45 μm) filtriert, das Filtrat wurde in 35 ml Ethanol eingetropft, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, in Wasser gelöst und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (0,18 g). Der Carboxymethylierungsgrad dieser Substanz pro Saccharid-Rest belief sich auf 1,2 (Alkalimetrie).
  • Beispiel 7
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natriumsalz
  • Das in Beispiel 5 erhaltene gereinigte Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (0,2 g) wurde zu einer wäßrigen Lösung gegeben, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (0,84 g) in Wasser (6 ml), und anschließend bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (1,2 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt, in 120 ml Methanol eingetropft, mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (0,2 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden mit Methanol gewaschen, dann in Wasser (5 ml) gelöst und mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (0,2 ml) versetzt. Diese wäßrige Lösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,45 μm) filtriert, das Filtrat wurde in 35 ml Ethanol eingetropft, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, in Wasser gelöst und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (0,2 g). Der Carboxymethylierungsgrad dieser Substanz pro Saccharid-Rest belief sich auf 0,4 (Alkalimetrie).
  • Beispiel 8
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 5 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (380 mg, Carboxymethylierungsgrad: 0,8) wurde in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (49 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,017 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (380 mg) versetzt, und dann wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 1 M Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt, und es wurden jeweils 5 ml-Anteile der Mischung in 25 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen.
  • Die Niederschläge wurden in Wasser gelöst und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert, und die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert. Das resultierende Rohprodukt wurde in Wasser (30 ml) gelöst, mit 0,1 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und eine Stunde bei 37°C behandelt. Diese behandelte Lösung wurde wie vorstehend beschrieben dialysiert, und anschließend wurde die innere Dialysatlösung durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (289 mg). Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,25 mg/ml) sind in 1 bzw. 2 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,3% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 9
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Die Titelverbindung (300 mg) wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 8 synthetisiert durch Einführen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A, erhalten durch Abspalten der Boc-Gruppe von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (50 mg) in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4, in das in Beispiel 5 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (380 mg). Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,19 mg/ml) sind in 3 bzw. 4 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,3% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 10
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Die Titelverbindung (190 mg) wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 8 synthetisiert durch Einführen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A, erhalten durch Abspalten der Boc-Gruppe von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (41 mg) in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4, in das in Beispiel 5 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (380 mg). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,34 mg/ml) ist in 5 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,3% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 11
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse (7 Mäuse pro Gruppe) wurden vorbereitet durch subkutane Transplantation von 1 × 106 Maus-Fibrosarkom-Meth A-Zellen in die rechte Leistenregion von (7 Wochen alten) männlichen BALB/c-Mäusen. Am 7. Tag wurde der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 9, gelöst in destilliertem Wasser zur Injektion, alle 4 Tage 4mal in die Schwanzvene der Meth A-Tumor-tragenden Mäuse injiziert. Am 21. Tag nach der Transplantation wurden die Tumor-Massen ausgeschnitten und gewogen, um die Hemmungsrate des Tumor-Wachstums gemäß folgender Gleichung zu berechnen: Hemmungsrate des Tumor-Wachstums (%) = [1 – (mittleres Tumor-Gewicht der Gruppe mit verabreichter Testprobe/mittleres Tumor-Gewicht der Kontrollgruppe)] × 100. Im Ergebnis wurde gefunden, daß der in Beispiel 9 erhaltene Arzneimittel-Komplex der vorliegenden Erfindung erheblich gesteigerte Antitumor-Wirkung im Vergleich zur Arzneimittel-Verbindung selbst, ohne Spacer und Polysaccharid-Derivat, aufweist und keine Toxizität zeigt (Gewichtsverlust). Das Polysaccharid-Derivat selbst (Beispiel 5) und die alleine mit dem Spacer (Trifluoressigsäure-Salz von H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 = DX-8951) – der erhalten wurde durch Abspalten der Boc-Gruppe aus der Verbindung von Beispiel 1 nach dem Verfahren von Beispiel 4) – eingeführte Arzneimittel-Verbindung erwiesen sich als nicht wirksam.
  • Tabelle 2
    Figure 00360001
  • Beispiel 12
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden in ähnlicher Weise vorbereitet wie in Beispiel 11, und die Antitumor-Wirkung wurde mit der verglichen, die durch Einzelverabreichung der Arzneimittel-Komplexe der Beispiele 8 und 9 einmal an Tag 7 erhalten wurde. Im Ergebnis war der Grad der Antitumor-Wirkung wie folgt: (Polysaccharid-Derivat)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' > (Polysaccharid-Derivat)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' > Arzneimittel-Verbindung selbst. Die Verbindung, die den Rest der Arzneimittel-Verbindung in direkter Bindung zu einer Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextran-Polyalkohols von Beispiel 5 ohne jeglichen Spacer umfaßt (Menge des eingeführten Rests der Arzneimittel-Verbindung: 6,2 Gew.-%), erwies sich als nicht wirksam.
  • Tabelle 3
    Figure 00370001
  • Beispiel 13
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Dextran T500 (10 g, Pharmacia, Molekulargewicht: 500K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer gelöst (pH 5,5, 1000 ml) und mit einer wäßrigen Lösung (1000 ml) von Natriumperiodat (33 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (7,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (14 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde dann über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt, um Lösung 1 zu ergeben. Daneben wurde eine Reihe der vorstehend beschriebenen Verfahren mit Dextran T500 (10 g, Pharmacia, Molekulargewicht 500K) durchgeführt, um Lösung 2 zu ergeben. Des weiteren wurde eine Reihe der vorstehend beschriebenen Verfahren mit Dextran T250 (jeweils 10 g, Pharmacia, Molekulargewicht 250K) durchgeführt, um Lösung 3 und Lösung 4 zu er geben. Die Lösungen 1–4 wurden vereinigt und mit einer Biomax-50-Membran ultrafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion abzutrennen. Die polymere Fraktion wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben (25 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 163K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (11 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (46,2 g) in Wasser (330 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (66 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 9 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (13 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 228K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,4.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (600 mg) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (0,93 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (690 mg).
  • Beispiel 14
  • Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 1 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zwei mal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) azeotrop destilliert und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,53 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,40–8,48 (m, 2H), 8,28 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,95–8,07 (br, 3H), 7,81 (d, 1H, J = 10,2 Hz), 7,30–7,37 (m, 2H), 7,15–7,30 (m, 5H), 6,50–6,55 (br, 1H), 5,50–5,57 (m, 1H), 5,41 (d, 2H, J = 7,82 Hz), 5,25 (s, 2H), 4,55–4,62 (m, 1H), 3,55–3,92 (m, 6H), 3,15–3,25 (br, 2H), 2,98–3,03 (m, 1H), 2,73–2,82 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,84–1,92 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35 Hz).
  • Beispiel 15
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 13 erhaltene Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (400 mg) wurde in das Triethylammonium-Salz überführt (470 mg) und in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 14 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (62 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,02 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (470 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren und Lichtabschirmung reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst, mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt und dann mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (600 mg) zu ergeben. Das mittels GPC-Analyse erhalte ne Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,1 mg/ml) sind in 6 bzw. 7 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,8% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 16
  • Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 2 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) azeotrop destilliert, und anschließend wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,62–8,66 (m, 2H), 8,23 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,18–8,20 (m, 1H), 7,98–8,10 (br, 2H), 7,79 (d, 1H, J = 10,7 Hz), 7,32 (s, 1H), 7,09 (d, 2H, J = 7,3 Hz), 6,93–7,03 (m, 4H), 6,50–6,60 (br, 1H), 5,52–5,55 (m, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,18 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 4,80 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 4,57–4,59 (m, 1H), 3,57–3,71 (m, 6H), 3,15–3,25 (m, 2H), 3,00–3,02 (m, 1H), 2,80–2,90 (m, 1H), 2,50 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,86–2,00 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J = 7,35 Hz).
  • Beispiel 17
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 13 erhaltene Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,0 g) wurde in das Triethylammonium-Salz überführt (1,2 g) und in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 16 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (158 mg) in N,N-Dimethylformamid (15 ml), Triethylamin (0,05 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren und Lichtabschirmung reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst, mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,4 g) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 5,2% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 18
  • Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-OH
  • H-Gly-Phe-Leu-OH (3,0 g) wurde in 50% wäßriges Dioxan (48 ml) gegeben und mit Eis gekühlt. Diese Lösung wurde mit wäßrigem 1 N Natriumhydroxid (9,45 ml) und einer (Boc)2O (2,27 g) enthaltenden Dioxan-Lösung (24 ml) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N Salzsäure (9,45 ml) versetzt, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der resultierende Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 5 : 1-Lösung), um die Titelverbindung zu ergeben (2,5 g).
  • Beispiel 19
  • Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl
  • Das in Beispiel 18 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-OH (2,4 g) und N-Hydroxysuccinimid (656 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt, dann mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,17 g) versetzt und 2 Stunden gerührt. Diese Lösung wurde mit einer N,N-Dimethylformamid-Lösung (40 ml) versetzt, in der das Tosylat von N-Gly-OBzl (1,9 g) und Triethylamin (0,79 ml) gelöst worden waren, und die Mischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde zur unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 50 : 1-Lösung), um die Titelverbindung zu ergeben (2,0 g).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,20–8,30 (m, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,83 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,32–7,37 (m, 5H), 6,89–6,95 (m, 1H), 5,12 (s, 1H), 4,52–4,59 (br, 1H), 4,34 (dd, 1H, J = 7,3 Hz, J = 15,1 Hz), 3,93 (dd, 1H, J = 5,5 Hz, J = 17,2 Hz), 3,84 (dd, 1H, J = 5,5 Hz, J = 17,2 Hz), 3,54 (dd, 1H, J = 5,9 Hz, J = 16,7 Hz), 3,42 (dd, J = 5,9 Hz, J = 16,7 Hz), 3,00 (dd, 1H, J = 4,4 Hz, 13,7 Hz), 2,78 (dd, 1H, J = 8,8 Hz, J = 13,2 Hz), 1,50–1,65 (m, 1H), 1,45 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 1,36 (s, 9H), 0,86 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,82 (d, 3H, J = 6,4 Hz).
  • Beispiel 20
  • Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH
  • Das in Beispiel 19 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl (1,7 g) wurde in einer Mischlösung aus Ethylacetat (30 ml) und Methanol (30 ml) gelöst und mit 5% Pd/C (1,5 g) versetzt, um eine katalytische Reduktion durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, um die Titelverbindung zu ergeben (1,15 g).
  • Beispiel 21
  • Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 20 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH (200 mg) und N-Hydroxysuccinimid (58 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (5 ml) gelöst. Nach Abkühlen auf 4°C wurde N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (104 mg) zur Lösung gegeben und gelöst. Diese Lösung wurde mit einer N,N-Dimethylformamid-Lösung versetzt, in der das Methansulfonat von DX-8951 (224 mg) und Triethylamin (0,059 ml) gelöst worden waren, und die Mischung wurde unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 10 : 1-Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure), um die Titelverbindung zu ergeben (200 mg).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,35 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,08–8,18 (m, 2H), 7,75–7,85 (m, 2H), 7,32 (s, 1H), 7,10 (d, 2H, J = 6,8 Hz), 7,08–7,13 (m, 3H), 6,85–6,95 (br, 1H), 6,40–6,65 (br, 1H), 5,52–5,55 (m, 1H), 5,46 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 5,37 (d, 1H, J = 18,5 Hz), 5,24 (s, 2H), 4,44–4,52 (m, 1H), 4,15–4,25 (m, 1H), 3,68–3,72 (m, 2H), 3,40–3,52 (m, 2H), 3,15–3,25 (br, 2H), 2,85–2,95 (m, 1H), 2,65–2,75 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,25 (m, 1H), 1,80–1,91 (m, 2H), 1,50–1,65 (m, 1H), 1,45 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 7,4), 0,86 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,82 (d, 3H, J = 6,4 Hz).
  • Beispiel 22
  • Synthese von 3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 21 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (97 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) azeotrop destilliert und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (95 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,57 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,47 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,32 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 8,17 (t, 1H, J = 5,5 Hz), 7,81–7,91 (br, 3H), 7,79 (d, 1H, J = 10,7 Hz), 7,32 (s, 1H), 7,21–7,23 (m, 5H), 7,12–7,17 (m, 1H), 6,45–6,55 (br, 1H), 5,57 (q, 1H, J = 4,4 Hz), 5,43 (d, 1H, J = 16,1 Hz), 5,34 (d, 1H, J = 16,1 Hz), 5,23 (s, 2H), 4,67 (dt, 1H, J = 4,0 Hz, J = 9,0 Hz), 4,31 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, J = 15,0 Hz), 4,0–4,4 (br, 1H), 3,74–3,76 (m, 2H), 3,56 (dd, 1H, J = 6,0 Hz, J = 16,0 Hz), 3,41 (dd, 1H, J = 6,0 Hz, J = 16,0 Hz), 3,17–3,19 (br, 2H), 3,02 (dd, 1H, J = 4,0 Hz, J = 14,0 Hz), 2,70 (dd, 1H, J = 10,0 Hz, J = 14,0 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,05–2,15 (m, 1H), 1,85 (dt, 2H, J = 7,0 Hz, J = 14,0 Hz), 1,50–1,55 (m, 1H), 1,45 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 7,4 Hz), 0,85 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,80 (d, 3H, J = 6,4 Hz).
  • Beispiel 23
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 13 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (690 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 22 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (95 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (0,03 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (690 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren und Lichtabschirmung reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Die Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst, mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend wurde das Filtrat lyophilisiert, um die Titelverbindung (600 mg) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 4,8% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 24
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Dextran T500 (50 g, Pharmacia, Molekulargewicht: 500K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer gelöst (pH 5,5, 5000 ml) und mit einer wäßrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165,0 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde dann über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde mit einer Biomax-50-Membran ultrafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion abzutrennen. Die polymere Fraktion wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben (27,1 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 140K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (5 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (21 g) in Wasser (150 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (30 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (5,6 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 263K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,4.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (2,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (2,2 g).
  • Beispiel 25
  • Synthese des Trimethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextran-Polyalkohols
  • Das in Beispiel 24 erhaltene Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, Me3NH+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (950 mg).
  • Beispiel 26
  • Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-hydrochlorid (A-NH2 = DX-8951)
  • In ähnlicher Weise wie in Beispiel 14 wurde das aus 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (400 mg) erhaltene 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz in Wasser/MeOH (1 : 4) gelöst, auf eine Säule (1,5 × 8,6 cm) mit Bio-Rad AG 1-X8 (200–400 mesh, Cl–-Form) aufgebracht und mit dem obigen Lösungsmittel eluiert. Der Ablauf wurde eingeengt und dann lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (310 mg).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,53 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 8,46–8,48 (m, 1H), 8,37–8,39 (m, 1H), 7,95 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,80 (s, 3H), 7,78 (d, 1H, J = 11,1 Hz), 7,34 (s, 1H), 7,14–7,24 (m, 5H), 6,50 (s, 1H), 5,56–5,60 (m, 1H), 5,35–5,40 (m, 2H), 5,24 (s, 2H), 4,51–4,56 (m, 1H), 3,86 (dd, J = 4,8, 13,5 Hz, 1H), 3,68–3,79 (m, 3H), 3,54 (s, 2H), 3,15–3,22 (m, 2H), 3,01 (dd, J = 5,6, 13,5 Hz, 1H), 2,78 (dd, J = 9,6, 3,5 Hz, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,12–2,23 (m, 2H), 1,81–1,89 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J = 7,2 Hz).
    Masse (FAB): m/e 753 (M + 1).
  • Beispiel 27
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 25 erhaltene Trimethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (0,1 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (6 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 26 erhaltenen Hydrochlorids von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (24 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (5 μl) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (0,1 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Die Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (90 mg) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 11% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 28
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 25 erhaltene Trimethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (0,1 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (6 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 26 erhaltenen Hydrochlorids von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (36 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (8 μl) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (0,1 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Die Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 12 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben. Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 36 μg/ml) sind in 8 bzw. 9 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 15% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 29
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Dextran T250 (20 g, EXTRASYNTHESE, mittleres Molekulargewicht 250K) wurde in 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,5, 2000 ml) gelöst und mit einer wäßrigen Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend unter Eiskühlung mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die niedermolekulare Fraktion wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran von der resultierenden wäßrigen Lösung abgetrennt, um die zurückgehaltene Lösung 1 zu ergeben, die nicht durch die Membran lief. Daneben wurde Dextran T250 (50 g, EXTRASYNTHESE, mittleres Molekulargewicht 250K) in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 5000 ml) gelöst und mit einer wäßrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend unter Eiskühlung mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die niedermolekulare Fraktion wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran von der resultierenden wäßrigen Lösung abgetrennt, um die zurückgehaltene Lösung 2 zu ergeben, die nicht durch die Membran lief. Die zurückgehaltenen Lösungen 1 und 2 wurden vereinigt und mit einer Biomax-30- Membran ultrafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion von der Fraktion abzutrennen, die durch die Biomax-50-Membran gelaufen war, und lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben (25,7 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 47K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (5 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (35 g) in Wasser (150 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (50 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (7,2 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 127K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,8. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (2,2 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (2,69 g).
  • Dieses Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (2,67 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (200 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung versetzt, die erhalten wurde durch Lösen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A, das erhalten worden war durch Abspalten der Boc-Gruppe aus 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (350 mg) – hergestellt in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 – mit Hilfe eines ähnlichen Verfahrens wie dem von Beispiel 16, und Triethylamin (0,116 ml) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), und einer Lösung, erhalten durch Lösen von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (2,67 g) in N,N-Dimethylform amid (10 ml), und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (100 ml) versetzt, und jeweils 8 ml-Anteile der Mischung wurden in jeweils 30 ml Ethanol eingetropft. Jede Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen (3500 U/min, 8 Minuten). Die Niederschläge wurden mit Aceton gewaschen und dann in Wasser gelöst, mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (10 ml) versetzt und anschließend mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und 1 Stunde bei 37°C weiter behandelt. Die behandelte Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-10-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und dann lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (2,30 g). Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,20 mg/ml) sind in 10 bzw. 11 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,8% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 30
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Zu einer Lösung (2000 ml) von Dextran T10 (20 g, Pharmacia, mittleres Molekulargewicht 10K) in 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,5) wurde eine wäßrige Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) gegeben. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend unter Eiskühlung mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde mit einer Biomax-5-Membran (Millipore) ultrafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion abzutrennen, und die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch eine Biomax-30-Membran laufenlassen. Das resultierende Filtrat wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol (8,0 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 13K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (3,7 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (25,9 g) in Wasser (111 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (37 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (6,2 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 37K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,9.
  • Dieses Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natriumsalz (6,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und dann mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (9,3 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (7,2 g).
  • Beispiel 31
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Der in Beispiel 30 erhaltene Dextran-Polyalkohol (3,9 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (16,3 g) in Wasser (117 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (23,4 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (5,0 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 28K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,5. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (4,8 g) wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 30 in das Triethylammonium-Salz überführt, um die Titelverbindung zu ergeben (5,6 g).
  • Beispiel 32
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Eine wäßrige Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) wurde einer Lösung (2000 ml) von Dextran 4 (20 g, Funakoshi, mittleres Molekulargewicht: 4K–6K) in 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,5) zugesetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend unter Eiskühlung mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde mit einer Biomax-3-Membran (Millipore) ult rafiltriert, um die niedermolekulare Fraktion abzutrennen. Das erhaltene Filtrat wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol (6,0 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 9K (Gelfiltration, Pullulan-Standard). Dieser Dextran-Polyalkohol (2,7 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (18,9 g) in Wasser (81 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (27 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (4,2 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 20K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,9.
  • Dieses Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natrium-Salz (4,0 g) wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 30 in das Triethylammonium-Salz überführt, um die Titelverbindung zu ergeben (4,8 g).
  • Beispiel 33
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Der in Beispiel 32 erhaltene Dextran-Polyalkohol (2,7 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (11,3 g) in Wasser (81 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (16,2 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (2,7 g). Das Molekularge wicht dieser Substanz belief sich auf 16K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,5. Dieses Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natrium-Salz (2,7 g) wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 30 in das Triethylammonium-Salz überführt, um die Titelverbindung zu ergeben (3,1 g).
  • Beispiel 34
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 30 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,5 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von Triethylamin (0,07 ml) und 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (210 mg) in N,N-Dimethylformamid (40 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,5 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde jeweils mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-3-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,3 g) zu ergeben. Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 65 μg/ml) sind in 12 bzw. 13 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 6,4% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 35
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 31 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,2 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von Triethylamin (0,056 ml) und 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (168 mg) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde jeweils mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-3-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,0 g) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 4,8% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 36
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 32 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,2 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von Triethylamin (0,056 ml) und 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (168 mg) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde jeweils mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-3-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,0 g) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,9% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 37
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 33 erhaltene Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (1,5 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von Triethylamin (0,07 ml) und 3'-N- (Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (210 mg) in N,N-Dimethylformamid (40 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,5 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde jeweils mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-3-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,3 g) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 4,6% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 38
  • Synthese von Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 = DW-8286)
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (42 mg) and N-Hydroxysuccinimid (12 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (2 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (22 mg) versetzt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des Hydrochlorids der durch folgende Formel dargestellten Verbindung
    Figure 00580001
    [(1S,9S)-1-Amino-5-chlor-9-ethyl-2,3-dihydro-9-hydroxy-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion: DW-8286] (50 mg) und Triethylamin (0,01 ml) in N,N-Dimethylformamid (6 ml) gegeben, und die Mischung wurde unter Rühren und Lichtabschirmung 16 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 10 : 1-Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure), um die Titelverbindung (27 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (CDCl3), δ: 8,10–8,20 (br, 1H), 7,95–8,05 (br, 1H), 7,70–7,80 (br, 2H), 7,50–7,60 (br, 1H), 7,40–7,50 (br, 1H), 7,10–7,25 (m, 5H), 7,05–7,15 (br, 1H), 5,85–5,95 (br, 1H), 5,50–5,60 (br, 1H), 5,40–5,50 (m, 1H), 5,25–5,35 (m, 1H), 5,05–5,15 (m, 1H), 4,90–5,00 (m, 1H), 4,70–4,80 (br, 1H), 4,10–4,25 (br, 2H), 3,60–3,90 (m, 4H), 3,10–3,40 (m, 3H), 2,95–3,05 (br, 1H), 2,15–2,30 (br, 1H), 1,75–1,90 (br, 2H), 1,39 (s, 9H), 0,80–1,00 (m, 3H).
  • Beispiel 39
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DW-8286)
  • Das in Beispiel 24 erhaltene Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (175 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DW-8286) (29 mg), das erhalten worden war aus dem in Beispiel 38 hergestellten 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (27 mg) durch Abspalten der Boc-Gruppe in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4, und Triethylamin (9 μl) in N,N-Dimethylformamid (5 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (175 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Die Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-30-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (135 mg) zu ergeben. Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 99 μg/ml) sind in 14 bzw. 15 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 6,1% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 40
  • Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DW-8089)
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (163 mg) and N-Hydroxysuccinimid (45 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (79 mg) versetzt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des Tosylats der durch folgende Formel dargestellten Verbindung
    Figure 00600001
    [(1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-2,3-dihydro-9-hydroxy-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion: DW-8089] (170 mg) und Triethylamin (0,054 ml) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gegeben, und die Mischung wurde unter Rühren und Lichtabschirmung über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 94 : 6-Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure), um die Titelverbindung (100 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,51 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 8,41 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 8,29 (s, 1H), 8,17 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,03 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,90 (dd, 1H, J = 4,8, 5,6 Hz), 7,79 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 7,53 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,36 (s, 1H), 7,13–7,25 (m, 5H), 6,94–6,95 (m, 1H), 5,60–5,63 (m, 1H), 5,36–5,47 (m, 2H), 5,21–5,30 (m, 2H), 4,42–4,47 (m, 1H), 3,63–3,96 (m, 3H), 3,51–3,59 (m, 3H), 3,31–3,40 (m, 1H), 3,09–3,21 (m, 1H), 3,02 (dd, 1H, J = 4,8, 13,5 Hz), 2,76–2,81 (m, 1H), 2,13–2,17 (m, 2H), 1,85–1,90 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 0,89 (t, 3H, J = 8,0 Hz),
    Masse (FAB): m/e 822 (M + 1).
  • Beispiel 41
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DW-8089)
  • Das in Beispiel 24 erhaltene Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (1,6 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (60 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung, die erhalten wurde durch Lösen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DW-8089), das erhalten worden war aus dem in Beispiel 40 hergestellten 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (200 mg) durch Abspalten der Boc-Gruppe in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4, Triethylamin (0,07 ml) in N,N-Dimethylformamid (20 ml), und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,6 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen.
  • Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in jeweils 10 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (2500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, dann in Wasser gelöst, mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (20 ml) versetzt und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt. Diese Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-10-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,20 g) zu ergeben. Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,26 mg/ml) sind in 16 bzw. 17 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,0% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 42
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz
  • Dextran T150 (20 g, Pharmacia, mittleres Molekulargewicht: 150K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 2000 ml) gelöst und mit einer wäßrigen Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und eine Stunde bei 4°C gerührt. Der pH der Mischung wurde mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran (Millipore) auf 500 ml eingeengt, um Lösung 1 zu ergeben. Daneben wurde eine Reihe der vorstehend beschriebenen Verfahren mit Dextran T110 (20 g) durchgeführt, um die Lösung 2 zu erhalten. Lösung 1 und Lösung 2 wurden vereinigt, und die vereinigte Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, 4 Stunden bei 40°C inkubiert, und dann auf pH 7 eingestellt, um eine Lösung zu ergeben, die den Dextran-Polyalkohol mit niedrigerem Molekulargewicht enthielt. Die Lösung wurde durch eine Biomax-30-Membran laufenlassen, durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt und dann lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben (4,6 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 17K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (2,5 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (17,5 g) in Wasser (75 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (25 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 9 eingestellt und dann durch Ultrafiltration mit einer Biomax-5-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (4,0 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 45K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,9.
  • Dieses Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Natrium-Salz (3,7 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (5,8 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (4,4 g).
  • Beispiel 43
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 42 erhaltene Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (4,4 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (300 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von Triethylamin (0,19 ml) und 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951) (580 mg) in N,N-Dimethylformamid (45 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (4,4 g) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren und Lichtabschirmung reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 1 M Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt, und dann wurden jeweils 5 ml-Anteile dieser Mischung in jeweils 25 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in Wasser gelöst und mit einer Dialysemembran (Spectrapore 1, Grenzmolekulargewicht 6000–8000) gegen gereinigtes Wasser dialysiert. Die innere Dialysatlösung wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (3,4 g) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 4,6% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 44
  • Synthese von α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NΗ-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Der in Beispiel 42 erhaltene Dextran-Polyalkohol (2 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (14 g) in Wasser (60 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde α-Brompro pionsäure (19 ml) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und dann wurde die Mischung 18 Stunden bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (2,95 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 45K (Gelfiltration, Pullulan-Standard). Der α-Methylcarboxymethylierungsgrad pro Saccharid-Rest wurde je nach Carboxymethyldextran-Polyalkohol wie folgt erhalten: Eine wäßrige Lösung des α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohol-Natrium-Salzes wurde auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (H+-Form) aufgebracht, und der Ablauf wurde lyophilisiert und als Probe verwendet. Diese Probe wurde in einer vorgeschriebenen überschüssigen Menge einer wäßrigen 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und mit 0,1 N Salzsäure gegen Phenolphthalein als Indikator titriert. Der α-Methylcarboxymethylierungsgrad wurde gemäß folgender Gleichung erhalten: α-Methylcarboxymethylierungsgrad = 13,4(a – b)/[s – 7,2(a – b)], worin "s" das Gewicht der eingesetzten Probe (mg) ist, "a" die vorgeschriebene überschüssige Menge wäßriger 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung (ml) ist, und "b" die Menge der für die Titration verbrauchten 0,1 N Salzsäure (ml) ist. Im Ergebnis wurde der α-Methylcarboxymethylierungsgrad zu 0,8 gefunden.
  • Dieses Natrium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohols (2,2 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und dann mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (2,69 g).
  • Dieses Triethylammonium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextran-Polyalkohols (2,68 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (60 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung, die erhalten wurde durch Lösen des Trifluores sigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951), das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 16 erhalten worden war durch Abspalten der Boc-Gruppe aus 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (350 mg), das in ähnlicher Weise synthetisiert wurde wie in Beispiel 2, und Triethylamin (0,116 ml) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), und mit einer Lösung, erhalten durch Lösen von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (2,68 g) in N,N-Dimethylformamid (10 ml) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (40 ml) versetzt, und jeweils 6 ml-Anteile der Mischung wurden in jeweils 30 ml Ethanol eingetropft. Dies wurde jeweils mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gewonnen (3500 U/min, 8 Minuten). Die Niederschläge wurden mit Aceton gewaschen und dann in Wasser gelöst, mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (10 ml) versetzt, mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und 1 Stunde bei 37°C behandelt. Die behandelte Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-10-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und dann lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (2,15 g). Das mittels GPC-Analyse erhaltene Ergebnis nach Lösen dieser Verbindung in wäßrigem 0,1 M Natriumchlorid (Säule: TSK-Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Pufferlösung, pH 9,0, 0,21 mg/ml) sind in 18 bzw. 19 gezeigt. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in der Verbindung belief sich auf 5,9% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 45
  • Synthese von 3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Eine Mischung aus dem p-Toluolsulfonsäure-Salz von Phe-Gly-OBzl (3,06 g), Boc-Gly-OH (1,10 g), N-Hydroxysuccinimid (941 mg), N-Methylmorpholin (0,725 ml) und N,N-Dimethylformamid (40 ml) wurde auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,56 g) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 98 : 2-Lösung), um Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl zu ergeben (1,93 g).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,52 (dd, 1H, J = 5,6, 6,4 Hz), 7,97 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,30–7,39 (m 5H), 7,15–7,26 (m, 5H), 6,83 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 5,14 (s, 1H), 4,52–4,57 (m, 1H), 3,87–3,96 (m, 2H), 3,57 (dd, 1H, J = 5,6, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H, J = 5,6, 16,7 Hz), 3,01 (dd, 1H, J = 4,8, 14,3 Hz), 2,77 (dd, 1H, J = 5,6, 14,3 Hz), 1,37 (s, 9H).
  • Das resultierende Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl (1,78 g) wurde in Ethylacetat (60 ml) gelöst und in Gegenwart von 5% Pd/C (1,8 g) 24 Stunden lang katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, um Boc-Gly-Phe-Gly-OH zu ergeben (1,41 g).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,35 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 7,94 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,15–7,26 (m, 5H), 6,85 (dd, 1H, J = 5,6, 6A Hz), 4,52–4,58 (m, 1H), 3,76 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 3,56 (dd, 1H, J = 6,4, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H, J = 5,6, 16,7 Hz), 3,03 (dd, 1H, J = 5,0, 13,5 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 9,5, 13,5 Hz), 1,37 (s, 9H).
  • Das oben erhaltene Boc-Gly-Phe-Gly-OH (500 mg) und N-Hydroxysuccinimid (161 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine N,N-Dimethylformamid-Lösung (50 ml) gegeben, die das Methansulfonat von DX-8951 (530 mg) und Triethylamin (0,146 ml) gelöst enthielt. Die Mi schung wurde auf 4°C gekühlt, mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (268 mg) versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur unter lichtgeschützten Bedingungen reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 96 : 4-Lösung), um 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) zu ergeben (100 mg).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,39 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,34 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 7,98 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 10,3 Hz), 7,33 (s, 1H), 7,13–7,24 (m, 5H), 6,80 (dd, 1H, J = 5,6, 6,4 Hz), 5,55–5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H, J = 16,0 Hz), 5,41 (d, 1H, J = 16,0 Hz), 5,25 (s, 2H), 4,43–4,46 (m, 1H), 3,69–3,79 (m, 2H), 3,50 (dd, 1H, J = 5,6, 16,7 Hz), 3,41 (dd, 1H, J = 5,6, 16,7 Hz), 3,16–3,19 (m, 2H), 2,98 (dd, 1H, J = 4,8, 14,3 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 9,5, 14,3 Hz), 2,41 (s, 3H), 2,19–2,25 (m, 1H), 2,10–2,15 (m, 1H), 1,82–1,90 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 8,0 Hz).
    Masse (FAB): m/e 797 (M + 1).
  • Das resultierende 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (100 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) azeotrop destilliert und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,52–8,62 (m, 1H), 7,94 (s, 3H), 7,79 (t, 1H, J = 11,1 Hz), 7,34 (s, 1H), 7,15–7,27 (m, 5H), 6,52 (s, 1H), 5,57–5,61 (m, 1H), 5,36–5,46 (m, 2H), 5,24 (s, 2H), 4,66–4,70 (m, 1H), 3,69–3,81 (m, 2H), 3,61–3,68 (m, 1H), 3,40–3,47 (m, 1H), 3,15–3,23 (m, 1H), 3,01 (dd, 1H, J = 4,0, 13,5 Hz), 2,77 (dd, 1H, J = 9,5, 13,5 Hz), 2,12–2,23 (m, 2H), 1,81–1,91 (m, 2H), 0,89 (t, 3H, J = 7,2 Hz).
    Masse (FAB): m/e 697 (M + 1).
  • Beispiel 46
  • Synthese von 3'-N-(Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Boc-Phe-Gly (771 mg) und N-Hydroxysuccinimid (300 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit einer N,N-Dimethylformamid-Lösung (50 ml) versetzt, in der das Methansulfonat von DX-8951 (1058 mg) und Triethylamin (0,293 ml) gelöst worden waren. Die Mischung wurde auf 4°C gekühlt, mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (494 mg) versetzt und unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 98 : 2-Lösung) um 3'-N-(Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) zu ergeben (1,20 g).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,29 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 8,21 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 7,76 (d, 1H, J = 10,3 Hz), 7,32 (s, 1H), 7,13–7,25 (m, 5H), 6,92 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,49 (s, 1H), 5,56–5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 5,38 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 5,25 (s, 2H), 4,08–4,12 (m, 1H), 3,78 (d, 1H, J = 4,8 Hz), 3,16–3,25 (m, 2H), 2,99 (dd, 1H, J = 4,0, 13,5 Hz), 2,72 (dd, 1H, J = 10,3, 13,5 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,09–2,35 (m, 2H), 1,80–1,91 (m, 2H), 1,16 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J = 8,0 Hz).
    Masse (FAB): m/e 741 (M + 1).
  • Das oben erhaltene 3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A (170 mg) wurde in Trifluoressigsäure (4 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (10 ml) und zweimal mit Ethanol (10 ml) azeotrop destilliert und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (100 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,88 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 8,68 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 8,05–8,15 (m, 3H), 7,79 (d, 1H, J = 11,1 Hz), 7,26–7,36 (m, 5H), 6,52 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 5,57–5,62 (m, 1H), 5,43 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 5,38 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 5,19–5,28 (m, 1H), 4,10–4,18 (m, 1H), 3,93 (dd, 1H, J = 4,8, 16,7 Hz), 3,82 (dd, 1H, J = 4,8, 16,7 Hz), 3,17–3,24 (m, 2H), 3,14 (dd, 1H, J = 4,8, 13,5 Hz), 2,95 (dd, 1H, J = 8,0, 13,5 Hz), 2,42 (s, 3H), 2,14–2,25 (m, 2H), 1,83–1,91 (m, 2H), 0,89 (t, 3H, J = 8,0 Hz).
    Masse (FAB): m/e 640 (M + 1).
  • Beispiel 47
  • Synthese von 3'-N-Gly-NH-A-Trifluoressigsäure-Salz (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Methansulfonat von DX-8951 (530 mg) und Triethylamin (0,28 ml) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Boc-Gly versetzt (327 mg). Die Mischung wurde unter Rühren und lichtgeschützten Bedingungen über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol = 98 : 2-Lösung) um 3'-N-(Boc-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) zu ergeben (500 mg).
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,38 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,77 (d, 1H, J = 10,7 Hz), 7,31 (s, 1H), 6,89–6,91 (m, 1H), 6,49 (s, 1H), 5,55–5,59 (m, 1H), 5,45 (d, 1H, J = 16,1 Hz), 5,38 (d, 1H, J = 16,1 Hz), 5,27 (d, 1H, J = 19,0 Hz), 5,18 (d, 1H, J = 19,0 Hz), 3,50–3,62 (m, 2H), 3,15–3,19 (m, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,18–2,24 (m, 1H), 2,08–2,12 (m, 1H), 1,81–1,91 (m, 2H), 1,31 (s, 9H), 0,87 (t, 3H, J = 8,0 Hz).
    Masse (FAB): m/e 593 (M + 1).
  • Das oben erhaltene 3'-N-(Boc-Gly)-NH-A (100 mg) wurde in Trifluoressigsäure (2 ml) gelöst und eine Stunde stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zweimal mit Methanol (10 ml) und zweimal mit Ethanol (10 ml) azeotrop destilliert und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (70 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6), δ: 8,88 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 8,08 (s, 3H), 7,81 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 7,34 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,63–5,67 (m, 1H), 5,45 (d, 1H, J = 16,7 Hz), 5,40 (d, 1H, J = 16,7 Hz), 5,36 (d, 1H, J = 19,1 Hz), 5,25 (d, 1H, J = 19,1 Hz), 3,56 (s, 2H), 3,11–3,19 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,23–2,28 (m, 1H), 2,11–2,19 (m, 1H), 1,81–1,91 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J = 8,0 Hz).
    Masse (FAB): m/e 493 (M + 1).
  • Beispiel 48
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Trimethylammonium-Salz
  • Dextran T500 (50 g, Pharmacia, Molekulargewicht: 500K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer gelöst (pH 5,5, 5000 ml) und mit einer wäßrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165,0 g) versetzt. Nach 10tägigem Rühren bei 4°C unter Lichtabschirmung wurde die Mischung mit Ethylenglycol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, eine Stunde bei 4°C gerührt und anschließend mit wäßrigem 8 M Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um den Dextran-Polyalkohol zu ergeben (20,2 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 159K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextran-Polyalkohol (7,5 g) wurde einer wäßrigen Lösung zugegeben, erhalten durch Lösen von Natriumhydroxid (31,5 g) in Wasser (225 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (45 g) unter Eiskühlung gegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und dann durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols zu ergeben (8,5 g). Das Molekulargewicht dieser Substanz belief sich auf 274K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad war 0,4. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (2,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (2,2 g).
  • Beispiel 49
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 48 erhaltene Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (200 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (7 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 45 erhaltenen 3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salzes (A-NH2 = DX-8951) (41 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,014 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (100 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in 10 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (190 mg) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 4,5% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 50
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 24 erhaltene Natrium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (2,5 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Säule mit Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, Et3NH+-Form) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Der Ablauf wurde lyophilisiert, um das Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz zu ergeben (2,5 g).
  • Das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextran-Polyalkohols (200 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (12 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 46 erhaltenen 3'-N-(Phe-Gly)-NH-A-Trifluoressigsäure-Salzes (A-NH2 = DX-8951) (42 mg) und Triethylamin (0,016 ml) in N,N-Dimethylformamid (5 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (200 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren und Lichtabschirmung reagierenlassen. Diese Reaktionsmischung wurde mit Wasser (300 ml) versetzt und mit einer 10K-Ultrafiltrationsmembran (Filtron) ultrafiltriert. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde mit wäßrigem 0,1 N Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt und durch eine Filtrationsmembran laufenlassen (0,16 μm, Filtron). Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt, anschließend durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um die Titelverbindung zu ergeben (180 mg). Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 6,1% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 51
  • Synthese von Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 48 erhaltene Carboxymethyldextran-Polyalkohol-Triethylammonium-Salz (370 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Diese Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 47 erhaltenen 3'-N-Gly-NH-A-Trifluoressigsäure-Salzes (A-NH2 = DX-8951) (57 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,027 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (185 mg) versetzt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren reagierenlassen. Jeweils 5 ml-Anteile dieser Reaktionsmischung wurden in 10 ml Ethanol eingetropft. Diese Mischung wurde mit wäßrigem 3 M Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (3500 U/min, 8 Minuten) gewonnen. Die Niederschläge wurden in wäßrigem 0,5 M Natriumchlorid gelöst und mit wäßrigem 0,1 M Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde durch Ultrafiltration mit einer Biomax-50-Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht durch die Membran gelaufen war, wurde durch ein Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (290 mg) zu ergeben. Der Gehalt des Rests der Arzneimittel-Verbindung in dieser Verbindung belief sich auf 0,5% (Gew./Gew.) bei Bestimmung auf der Grundlage der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH 9,0).
  • Beispiel 52
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden in ähnlicher Weise vorbereitet wie in Beispiel 11, und die Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 15 wurde durch Einzelverabreichung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 untersucht. Im Ergebnis zeigte der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15 erheblich verstärkte Antitumor-Wirkung und einen breiteren wirksa men Dosisbereich im Vergleich zu der eigentlichen Arzneimittel-Verbindung von Beispiel 12.
  • Figure 00750001
  • Beispiel 53
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • SC-6-Tumor-tragende Nacktmäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden vorbereitet durch subkutane Transplantation eines Stückes eines menschlichen SC-6-Magentumorblocks in die rechte Leistenregion von Nacktmäusen (BALB/c-nu/nu, männlich). Am 27. Tag nach der Transplantation wurde der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15, gelöst in destilliertem Wasser zur Injektion, als intravenöse Einzelgabe verabreicht, und seine Antitumor-Wirkung wurde mit der der eigentlichen Arzneimittel-Verbindung verglichen. Im Ergebnis zeigte der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15 höhere Antitumor-Wirkung im Vergleich zur eigentlichen Arzneimittel-Verbindung, wobei kein Todesfall als Folge von Toxizität zu verzeichnen war.
  • Figure 00760001
  • Beispiel 54
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Menschlichen Lungenkrebs QG-90 tragende Nacktmäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 53 vorbereitet. Am 16. Tag nach der Transplantation wurde der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15, gelöst in destilliertem Wasser zur Injektion, als intravenöse Einzelgabe verabreicht, und seine Antitumor-Wirkung wurde mit der der eigentlichen Arzneimittel-Verbindung verglichen. Im Ergebnis zeigte der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15 erheblich verstärkte Antitumor-Wirkung und einen breiteren wirksamen Dosisbereich im Vergleich zur eigentlichen Arzneimittel-Verbindung.
  • Figure 00770001
  • Beispiel 55
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes von Beispiel 41 wurde für Einzelverabreichung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 untersucht, und seine Antitumor-Wirkung wurde mit der der eigentlichen Arzneimittel-Verbindung verglichen. Im Ergebnis zeigte der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 41 erheblich verstärkte Antitumor-Wirkung und einen breiteren wirksamen Dosisbereich im Vergleich zu der eigentlichen Arzneimittel-Verbindung.
  • Figure 00780001
  • Beispiel 56
  • Antitumor-Wirkung des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Wirkung wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 durch Einzelverabreichung der Arzneimittel-Komplexe der Beispiele 29, 43 bzw. 44 untersucht. Im Ergebnis zeigten all diese Arzneimittel-Komplexe hohe Antitumor-Wirkung und einen breiteren wirksamen Dosisbereich.
  • Figure 00790001
  • Beispiel 57
  • Pharmakokinetik des Arzneimittel-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A-Tumor-tragende Mäuse wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 11 vorbereitet, der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15 wurde als Einzelgabe in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 verabreicht (10 mg/kg, berechnet als Arzneimittel-Verbindung) und die Änderung der Konzentration des Arzneimittel-Komplexes in verschiedenen Geweben wurde bestimmt. Im Ergebnis wurde gefunden, daß der Arzneimittel-Komplex von Beispiel 15 äußerst lange Retention im Blutspiegel, hohe Verteilung in Tumor-Geweben und hohe Tumor-Selektivität bei Leber und Dünndarm aufweist. Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Reaktion zwischen dem Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und der mit dem Spacer oder dergleichen gebundenen Arzneimittel-Verbindung läßt sich mit hohen Ausbeuten durchführen, und läßt man eine Arzneimittel-Verbindung mit Lacton-Ring reagieren, so können Nebenreaktionen verringert werden, und daher ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchaus brauchbar als Verfahren zur Herstellung des Arzneimittel-Komplexes.

Claims (9)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung mit Hilfe eines eine Aminosäure umfassenden Spacers oder eines 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassenden Spacers aneinander gebunden werden, oder eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung ohne den Spacer aneinander gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein organisches Aminsalz des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen in einem nichtwäßrigen System mit der Arzneimittel-Verbindung umgesetzt oder der Spacer in einem nichtwäßrigen System an die Arzneimittel-Verbindung gebunden wird.
  2. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung mit Hilfe eines eine Aminosäure umfassenden Spacers oder eines 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassenden Spacers aneinander gebunden werden, oder eines Arzneimittel-Komplexes, wobei ein Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung ohne den Spacer aneinander gebunden werden, umfassend die Schritte: (1) Überführen eines Alkalimetallsalzes des Polysaccharid-Derivats mit Carboxyl-Gruppen in ein organisches Aminsalz desselben, und (2) Umsetzen des organischen Aminsalzes mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer in einem nichtwäßrigen System.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polysaccharid-Derivat mit Carboxyl-Gruppen ein Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Dextran-Polyalkohol, aus dem der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol besteht, ein Dextran-Polyalkohol ist, der erhalten wird durch Behandeln eines Dextrans unter Bedingungen, die im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Arzneimittel-Verbindung ein antineoplastisches Mittel oder ein entzündungshemmendes Mittel ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Arzneimittel-Verbindung eine Arzneimittel-Verbindung ist, die einen Lacton-Ring bilden kann.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine Arzneimittel-Verbindung mit gebildetem Lacton-Ring oder ein Spacer, der an eine Arzneimittel-Verbindung mit gebildetem Lacton-Ring gebunden ist, für die Reaktion des organischen Aminsalzes mit der Arzneimittel-Verbindung oder dem an die Arzneimittel-Verbindung gebundenen Spacer eingesetzt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die in Anspruch 7 beschriebene, zur Bildung eines Lacton-Rings befähigte Arzneimittel-Verbindung (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion ist.
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