JPS59220197A - 新規な含窒素多糖体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビブリオ属に属する微生物を利用して生産さ
れる抗腫瘍活性を示す新規な含窒素多糖体およびその製
造法に関する。

近年、種々の微生物が生産する多糖類の制癌作用につい
ているいろと報告されて訃夛、それらのうちには工業的
に製品化されているものもある。

本発明者は、種々の微生物が生産する多糖類についてそ
の制癌作用を研究した結果、海洋細菌であるビブリオ属
に属する菌を培養することによシ得られる培養液中に低
毒性であって、！座逼細胞の増殖を強く抑制する作用を
呈する新規な含窒素多糖体を見出し、本発明をなすに至
った。

したがって、本発明は、抗棟錫活性を示す新規な含窒素
多糖体および該多糖体を製造するための方法を提供する
ことを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明に係る含窒素多糖体（以下本物質と称する）は下
記に示す諸性質によって特定される。

１）形状 白色の粉末体であって、無味、無臭である。

２）均一性 超遠心分析で単一ピークを呈するとともに、セルロース
アセテート膜を用いた電気泳動分析でもアルシアンブル
ーに染まる単一バンドを示すことから高い均一性を有す
ると言える。

３）分子量 セファロース４Ｂカラムクロマトグラフイ分析による測
定で１００，０００乃至１，０００，０００の平均分子
量を有する。

４）融点 明確な融点を示さないが、２７０℃付近で分解して褐変
する。

５）溶解性 水にｍ解し、メタノール、エタノール、アセトン、グロ
パノール、ｎ−ブタノール、酢酸エチル。

ヘキサン、ベンゼン、エーテル韮ｏ：ニクロロホルムに
不溶。

６）呈色反応 アンスロン反応　　　　　　　　陽性 モーリッシュ反応　　　　　　　陽性 システィン硫酸反応　　　　　　陽性 フェノール硫酸反応　　　　　　繭性 銅７オーリン反応　　　　　　　陽性 カルバゾール反応　　　　　　　陽性 ニンヒドリン反応　　　　　　　Ｉ易性（４Ｎ−ＨＣｌ
により１００℃で４時間加水分解後）エルソンモルガン
反応陽性 （４Ｎ−ＨＣｌによりｉｏｏ℃で４時間加水分解後）以
上の呈色反応から本物質が糖質部分と蛋白質部分とから
構成されていることがり解し得る。

７ン　比旋光度 本物質は０．５４９６水溶液で〔α）ＨＡｇ　＝＋２７
０比旋光度を示す。

８ン　赤外線吸収スペクトル ３６００〜３２００ｃｍ−”（Ｄブロードな吸収は水酸
４＜ＯＨ）に由来すると考えられ、１６５０１　。

１４００ｃｍ−”および１１００ｃｍ　　付近に多糖体
の官能基の吸収がみらｎる。

９ノ　紫外線吸収スペクトル 本物質の０．０３３％水溶液についての紫外線吸収スペ
クトルは第２図に示すとおりである。

１０）本物質を構成する４質部分の糖組成本物質の４０
ダに４　Ｎ　−ＨＣｌを添加し１００℃で４時間加水分
解を行った後、常法によシ（ただし、アミノ糖の吸着に
よる損失を防止するためイオン交換樹脂を使用しない）
アルディドールアセテート化を行ったものについてガス
クロマトグラフィ分析した精米、ガラクトース、グルコ
ース。

グルコサミンおよびガラクトチミンが検出された。

なお、本物質の５０１ｎｙにエチレンオキサイドとナト
リウムボロヒドリドを作用させてウロン酸のカルボキシ
ル基を還元した後、上述と同様な手順で加水分解して分
析した結果、ガラクトースの存在比が増力口したことが
らガラクトロン酸の存在が認められる。

１１）蛋白質部分のアミノ酸組成 本物質を常法により加水分解したものについてアミノ酸
分析装置を用いて分析した結果のアミノ酸組成を例示す
ると次のとおりである。

アミノ酸　　　含量（）ｎｙ／１００９）リ　　　　ジ
　　　　ン　　　　　　　　　５７０ヒ　　ス　　ジ　
　ン　　　　　　　　　２６４アルギニン　　　７３２ アスパルギン酸　　　　２６８０ スレオニン　　　１９３０ セ　　　　リ　　　　ン　　　　　　　　６９３グルタ
ミン戚　　　　２３４０ グ　　リ　　シ　　ン　　　　　　　　　７４３ア　　
ラ　　ニ　　ン　　　　　　　　　９８９バ　　　　リ
　　　　ン　　　　　　　　　６３３インロイシン　　
　　６６９ ０　　　イ　　　シ　　ン　　　　　　　　　１１８０
なお、本物質に５％トリクロル酢酸並びに５％質含有量
の割合に変化がみられないこと、又、超遠心分析で単一
ピークのみが認められること、更にはセルロースアセテ
ート膜を用いての電気泳動分析で単一バンドを示すこと
から、本物質における糖質部分と蛋白質部分は結合して
いるものと推定される。

１２）４質部分と蛋白質部分の構成比 本物質における糖質部分と蛋白質部分の構成比は、化学
分析の結果、Ｆ記のように例示される。

蛋白質部分　　　　　　　　　　　２０ｉ量％（銅−７
オーソン法によりＶβアルブミン侯算） 次に本！］）Ｊの製造法について説明する。

本物質の製造 本物質は、本発明者により新たに分離されたビブリオ属
（Ｖｉｂｒｉｏ　）に属する菌株、ビブリオｓｐＭ−２
３１８を培養することにより生産される。ζこで用いる
ビブリオＭ−２３１８は岡山県玉野市海域にて採取され
たナマコ（戯団泗匹加凹戯肪、和名マナマコ）の消化管
内よ部分離さｎたものであって、微工研菌寄第７０８６
号（ＦｇＲＭ−Ｐ−７０８６）の受託番号で工業技術院
微生物工業研究所に寄託叶請されている。

以下にビブリオａｐＭ　−２３１８の主要な菌学的性質
を示す。

（１）形態学的性質 グラム染色陰性、短桿状で平均ｏ、ｇｘｉ、ｏ〜１．３
〜唸１ミクロンの大きさを有し、運動性あシ。

極鞭毛を有し、胞子形成能ない。

（２）各種培地における生育状態 １）シミ糖−栄養寒天培地における嫌気培養で生育良好
。

１リ　寒天平板培地で生育良好、丘状を形成し、湿潤、
均質かつ粘嘴性な不透明を呈し、色素の生成はみもれな
い。

１１Ｄ　　下記に示す液体培地で生育良好、濁りを生じ
、菌膜を形成し、沈澱はみられず、培地の着色なし。

培地組成：ペプトン５ｇ、酵母エキス１ｇおよび海水１
ｔかもなる栄養培 地にショ糖３０ｇを添加。

ＩＶ）　　−Ｆッコンキイ−（ＭａｅＣｏｎｋｅｙ　）
培地での生育良好。

■）キングＡ培地では生育良好、水溶性色素の生成なし
。

ｖｉ）　　キングＢ培地では生育良好、水溶性色素の生
成なし。

なお、上記１）〜ｖＤの培地はいずれも水の代シに海水
を用いて調製したものである。

（３）　　生理学的性質 １）生育温度範囲は５〜３０℃であって、最適生育温度
は２５〜３０℃。

１１）生育ＮａＣ１，一度範曲は１〜８％であって、最
適ＮａＣＬ濃度は３〜４％。

１１１）ゼラチンの液化　　　　　　陽性ＩＶ）　　ゼ
ラチンの分解　　　　　　陽性Ｖ）デンプンの加水分解
　　　　陽性 ■０　　キチンの加水分解　　　　　陰性ｖｌ［）　　
パープルミルク培地でペプトン化する。

ｖｉｉＤ　　ブドウ糖の酸化−発酵　　　発酵する０１
沙　楯の分解性： 糖　　　　酸生成　　ガス生成 り−グルコース　　　　＋　　　　　　−Ｌ−アラビノ
ース　　　−− Ｄ−キシロース　　　　−− Ｄ−フラクトース　　　十　　　　　　−Ｄ−ガラクト
ース　　　＋　　　　　　−Ｄ−マンノース　　　　−
− ズルクトール　　　　　−− クリセロール　　　　−→十　　　　−マニトール　　
　　　　十　　　　　　−イックトール　　　　−− マルトース　　　　　　十　　　　　　−シュクロース
　　　　　十　　　　　　−ラクトース　　　　　　十
　　　　　　−デンプン　　　　　　　　＋　　　　　
　　−リ　硝酸塩の還元　　　　　　　　陰性ｘＤ　　
硫化水素の産生　　　　　　　陰性ｘｉＤＭＲ反応　　
　　　　　　　　陰性Ｘ１ｉｉ）Ｖｐ反応　　　　　　
　　　　陰性）４ｖ）インドールの生成　　　　　　陰
性双）ＩＰＡ反応　　　　　　　　　陰性ｘｖｔ）　　
チトクロームオキシダーゼ反応　　　　　陽性冷１１）
カタラーゼ反応　　　　　　　陽性Ｎｉｌ＋）クエン酸
塩の利用　　　　　　陰性Ｘ紗酒石酸から酸の産生　　
　　　陰性ＸＸ）アルギニン脱炭酸作用　　　　陰性Ｘ
ＸＤオルニチン脱炭酸作用　　　　陰性ｘｘｉＤリジン
脱炭酸作用　　　　　　陰性ｘｘｉｌｉ）カゼインの分
解　　　　　　　陽性ＸＸ１Ｖ）プテリジンコンパウン
ド０／１２９　　　　ＩＩ　４６に対する感受性 （プテリジンコンパウンド０／１２９は２，４−ジアミ
ノ−６，７−シーイツブロビルプテリジン（シグマ）を
イ馴） 本発明では上記菌株ビブリオｓｐＭ−２３１８を、天然
海水１人工海水もしくは３％食塩水に窒素源を必須成分
として加え、更に必要に応じて炭素源および栄＃＃ｉ’
を添加した液体培地又は該液体培地を寒天で固めた固体
培地中で培養することによシ、本物質を生産する。ここ
で用いる窒素源としてはペプトン、肉エキス、カザミノ
酸等を例示し得る。

又、炭素源としてはグルコース、７２クトース。

シュクロース等？、および栄養源としては酵母エキス、
ビタミン類、更にはＦ（１８０４、Ｍｇ８０４　ｅ　Ｃ
ａＣ４のような無機塩類を例示し得る。

上記培地の培養は、好気的条件下に２５〜３０℃の温度
で行うことが好ましく、又培地のｐＨは中性付近が好ま
しい。培養期間は培地の組成、培養温度等によシ変動さ
れるが、通常は３〜４日間程度でよい。

上記培養により培養物に蓄積さ扛た本物質は、液体培地
を用いた場合には培養液中に溶存して含有されているの
で、遠心分離、Ｙ濾過のような固−液分離手段（より菌
体を除去した後、ｐ液から単離して精製するとよい。一
方固体培地を用いた場片には培養物中に蓄積された本物
質は培地表面に生成した活貝物中に含有されているので
、この粘質物を採集して１％フェノール水溶液に懸濁さ
せ、２４時間程度攪拌した後上述のようにして菌体を除
去し、得られるろ液から単離して精製するとよい。

本物質を上述のようにし′Ｃ各戸液から単離、精製する
には、従来性われている微生物の培養物から多糖体を単
離、精謝する手法を適用するとよい。

すなわち、アセトン、エタノール、メタノール等の水可
溶性の有機溶媒を用いる分別沈澱法によって本物質を沈
澱させ、これを水に溶解して得られる浴液を濃縮し、こ
の績縮液にセチルトリメチルアンモニウムプロミドのよ
うな第４級アンモニウム塩を加え、生成する沈澱物を集
め、ついでこの沈Ｓ物に塩化ナトリウム、塩化カリウム
等の水溶液を加えて溶解し、得られる溶液にアセトン、
エタノール、メタノールのような水可溶性有機溶媒を２
〜３倍量添加し、生成する沈澱物を採取し、透析−脱塩
した後凍結乾燥することにより、目的とする本物質が得
られる。

次に、上述のようにして得られる本物質の有用性として
の生理活性について説明する。

（幻　本物質の急性毎性 本物質のマクスに対する急性擁性を試験した結果は表１
に示すとおりである。

なお、試験に供したマウスはＩＣＲ系並びにＣＤＦ、系
のものであって、各試験群５匹宛に本物質を腹腔内投与
して調べた。

表　　　　１ 注）投与量はＣＤＦ、についてはｉｏｏ・り／縁を１日
１回の割合で５日間投与し、ＩＣＲでは５０・ｎｇ／Ｋ
ｇを１日１回の割合で９日間投与した。

（２）本物質の抗ｍ瘍活性 本物質について下記手順によシ抗種瘍活性試験を行った
。なお、供試物質には後記実施例で得られたものを用い
た。

１）ザルコーマ１８０腹水腫瘍に対する活性ザルコーマ
腹水＋Ｉｉ瘍＃Ｉ胞（１０６個／マウス）を６週令雌の
ＩＣＲ系マウス（１群５匹）の腹腔内に移植し、その翌
日から本物質５０ダ／匂を１日１回の割合で９日間に亘
って腹腔内に投与し、生存日数を観察した。その結果、
腫瘍による死亡例はみられなかった。

なお、本物質を投与しない対照群（１群５匹）では頓傷
細１＠移植後１４日目に全マウスが腫瘍により死亡した
。

１リ　ザルコーマ１８０固型腫瘍に対する活性■　ザル
コーマ腹水腫瘍細胞（１０６個／マウス）を７週令のＩ
ＣＲ系雌マウス（１群６匹）の皮下に移植し、それから
１週間後本物質１００１ｎ９／Ｋｆを、１日１回で１４
回に亘って峠４部に直接投与した。その結果、本物質の
投与により、腫瘍細胞の移植から６週後には植５の増殖
は号に縮少し、試験群の％にはｊ１！ｉｊ瘍の完全退縮
が認められた。

■　ザルコーマ腹水腫瘍細胞（１０６個／マウス）ｔ−
６週令のＩＣＲ系雌マウス（１群６匹）の皮下に移植し
、その翌日から１日１回の割合で合計１０回、本物質の
５ダ／Ｋｆを腹腔内に投与した。

その結果、本物質の投与により１，１虫瘍細胞の移植か
ら３５日目に腫瘍の増殖はＨに抑制された。

１ｉＤｐ−ａｓｓ白血病に対する活性 ｐ　−３８８腹水腫瘍細胞（１０６個／マウス）を雄の
ＣＤＦ、マウス（１群３匹）の腹腔内に移植し、本物質
１２．５　ｍ９７　Ｋｇを１日１回の割合で９日間に亘
って腹腔内投与した。その結果、本物質の投与群では生
命延長率（Ｔ／Ｃ）は１６５％であった。

以上の試験結果から、本物質の抗１這瘍活性が認められ
る。

なお、本物質の抗ＩＩ！ｉｍ剤としての有効投与量は５
ｍｙ／Ｋｙ／日”’　１００　ｍ９　／　’ｊ！４７日
のｍｌ用である。

又、本物質は、その抗幀瘍活性を利用して抗Ｉ龍瘍剤（
制癌剤）として用いるには、公知の製剤化手法を適用し
て、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤並びに注射形態の
液剤等に製剤化し得る。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例 本物質の製造 ペプトン０．５ｗｔ％、酵母エキス０．１ｗｔ％および
ショ糖３ｗｔ％を添加、含有させた海水から成る培地を
、試験管（１８Ｘ１８０ｍ）４本にそれぞれ１０−づつ
分注し、１２０℃で１５分間オートクレーブで滅菌した
ものに、ビブリオｓｐＭ−２３１８（ＦＥＲＭ−Ｐ−７
０８６）を接種し、２７℃で３日間振とう培養を行った
。

こ扛とは別に、ペプトン０．５　ｗ　ｔ　９に　＋酵母
エキス０．１ｗｔ％、ショ［３ｗｔ％および寒天１．５
ｗｔ％を添加、言有させた海水から成る培地を３００−
容の三角）２スフ４本にそれぞれ２５０ｄづつ分注し、
１２０℃で１５分間オートクレーブで滅菌したものを、
予め滅菌しである４個のアルミ製バット（縦１８濯、横
２６ｃＩＩＬ、深さ３．５　ａｎ　）にそれぞれ江き゛
放冷後、上記培養により得られた培養物の谷１０−づつ
を上記各バット上の固化した寒天平板上に接種して拡散
させ、２７℃で４日間培養を有った。培養終了後寒天平
板上に生成した粘質物をかき集め、これを１％フェノー
ル水溶液にｉ鍾濁させ、１日攪拌を行った後遠心分離（
３０，００Ｏｒｐｍ＋３時間）によ）菌体を除去した。

得られた上澄液にエタノールの３倍量を加え糸状の沈澱
を生成させ、この沈澱をガラス棒にからめて採取して脱
イオン水に溶解した後、この溶液に５％セチルトリメチ
ルアンモニウムプロミドを添加しながらガラス棒で攪拌
してガラス棒に付着した（堅くまつわるように付Ｎする
）沈澱を集めて４　Ｍ　−ＮａＣ１，水溶液に溶解した
。得られた溶液を冷所で２日間攪拌した後、これに３倍
量のエタノールを加え、生成した沈＃を脱イオン水に溶
解した。この溶液を流水中で２日間透析した後凍結乾燥
して白色の粉末を得た。収斂は上記寒天培地１を当り３
００〜４００ηである。

次に、このようにして得られた本物質の主な物性を測定
した結果を示すと下記のとおｐでちるつｌ）分子量 セファロース４Ｂカラムクロマトグラフイ分析による測
定でｔｏｏ、ｏｏｏ〜ｔ、ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　。

２）比旋光度 ０．５４％水溶液での比旋光度〔α〕：：。＝＋２７゜
３）呈色反応 本明細書の本文に掲載したとおり。

４）構成成分 アミノ糖（グルコサミン換算）　２６重量％中性および
酸１鴨（ガシクトース換算）３０ｉ量％蛋白質（卵アル
ブミン換算）　　２０重量％５）赤外線吸収スペクトル 添附の第１図に示すとおり。

６）紫外線吸収スペクトル 添附の第２図に示すとお９゜

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は本発明に係る含窒素多糖体の赤り１線吸
収スペクトルを示し、第２図は同じく紫夕１籾鼓収スペ
クトルを示す。 １′１１・？・仏αに？）雪印乳業株式会社代理人　　
宮　　１）　広　　豊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１主としてグルコサンおよびガラクトサミンとから
   成るアミノ糖と、主としてガラクトースおよびグルコー
   スとから成る中性糖およびウロン酸とを組成分とする糖
   質部分と、リジン、ヒスジン。 アルギニン、アスパラギン酸、スレオニン、セ１ノン、
   グルタミン酸、グリシン、アラニン、ツクリン。 イソロイシンおよびロイシンのアミノ酸組成を有する蛋
   白賞部分とから構成されており：セファロース４Ｂカラ
   ムクロマトグラフィ分析による測定で１００，０００乃
   至ｉ、ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏの平均分子量を示し；呈
   色反応がアンスロン反応、モーリッシュ反応、システィ
   ン値叡反応、フェノール硫酸反応。 ＷＡ７オー’）ン反応、カルノくゾール反応および塩酸
   加水分解後のニンヒドリン反応並びにエルジンモルガン
   反応につい−〔いずれも陽性を示し；添付図の第１図に
   示すとおりの赤外線吸収スペクトルおよび第２図に示す
   とおりの紫外線吸収スペクトルを示すことを特徴とする
   含窒素多糖体。 （２１ビブリオ属（’Ｉ／１ｂｒｌｏ　）に属する８ｐ
   Ｍ−２３１８株を培養し、培養物から特許請求の範囲第
   １項に記載の含窒素多糖体を採取することを特徴とする
   新規な含窒素多糖体の製造方法。 （３）　　培養をｐＨを中性附近に調整した、塩化ナト
   リウムおよび窒素源と炭素源を含有する液体もしくは固
   体培池中で２５〜３０℃の１７Ｍ［で３〜４日間行う特
   許請求の範囲第（２）項記載の製造方法。