JPS61141895A - 核酸系物質を構成成分として含有する新規な核酸系高分子物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産ｌ上坐旦王立丘 本発明は、生理的活性を有する新規な核酸系高分子物質
及びその製造方法に関する。

１五皿！見 近年、担子菌類やその他の微生物を利用して蛋白質（ペ
プチドを含む）、多ｔｉ類及び蛋白賞金を多糖類から成
る種々の抗腫瘍性物質を製造することが提案されており
、それらのうちには実用化されているものもある。

本発明者は、微生物が生産する種々°の物質の生理的活
性について検討している過程で、アクチノマジュラ属に
属する微生物が生産する核酸系高分子物質が優れた抗腫
瘍活性及び抗菌活性を示すことを見出し、本発明をなす
に至った。

皇尻虫亘血 本発明は、アクチノマジュラ属に属する微生物を利用し
て、抗腫瘍活性及び抗菌活性のような生理的活性を有す
る核酸系高分子物質を提供することを目的とするもので
ある。

以下本発明の詳細な説明する。

皇旦亘盪底 本発明に係る核酸系高分子物質は、その構成成分として
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）３５乃至４５重量％、リボ
核酸（ＲＮＡ）６乃至１２重量％、塘（全還元糖として
）１５乃至１７重量％及びアミノ酸２．５重量九以下を
含有していて、下記の理化学的諸性質により特徴づけら
れる。

■分子量；セファデックスＧ−１５０を用いたゲル濾過
法により、２モル塩化カリウム −０，０５モルトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）中で２８．
０００〜３０，０００　（蛋白質換算）を示し、０．０
５モルトリス塩酸緩衝液中では分子間会合を生じて６０
．０００〜６４．０００　（蛋白質換算）に増大する、
［２］溶解性と色間：水に易溶であるが、メタノール、
エタノール、ブタノール、 プロパツール、アセトン及びエーテ ル等の有み溶剤に不溶、中性水溶液 で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青 紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱 を生ずる、 ■旋光度：ｏ、ｓ９Ａ水溶液の〔α）：　−＋　７５°
［４］紫外部吸収スペクトル：添付の第１図に示すとお
り、 ■赤外Ｂ＠収スペクトル：添付の第２図に示すとおり、 ■呈色反応： ニンヒドリン反応　　　　　陽性 ブリックス反応　　　　　　陰性 エルソン・モルガン反応　　陰性 ホーリーローリー反応　　　陰性 ジフェニルアミン反応　　　陽性 オルシノール反応　　　　　陽性 アンスロン反応　　　　　　陽性 フェノール硫酸反応　　　　陽性 過マンガン酸カリウム反応　陽性、 ■分解点：　＞２３５℃。

また、本発明は、アクチノマジュラ属（Ａｃｔｉｎｏｍ
ａｄｕｒａ）に属する微生物を培養し、培養物から上記
核酸系高分子物質を製造する方法もその特徴的事項とし
て包含するものである。

ロ　占を　゛　るための 本発明の核酸系高分子物質（以下５Ｎ−０７物質と称す
る）は上述したような構成成分を含有するものであって
、デオキシリボｔｊ１％ｔ　（ＤＮＡ）はシュナイダー
（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）法に基づくジフェニルアミン反
応により定量したものであり、リボ核酸（ＲＮＡ）はシ
ュナイダー法に基づくオルシノール反応により定量した
ものである。また、糖はフェノール硫酸法により全還元
糖として、及びアミノ酸はアミノ酸分析計による分析値
としてそれぞれ測定したものである。なお、アミノ酸分
析計によるアミノ糖は検出されない。

因みに、５Ｎ−０７物質は、あたかも核酸様高分子物質
と活性物質が共存しているかのようにみえたが、あらゆ
る分離、精製法を通用したにもかかわらず、その分画は
不可能である。

また、５Ｎ−０７物質について上記性質のうち、紫外部
吸収スペクトルは中性水溶液中で２５６〜２５８ｎ１及
び僅かに５０５と５４０ｎｍに吸収を有し、かつ０．１
規定苛性ソーダ水溶液中で２５６〜２５８ｎ−及び僅か
に５６０と６００ｎｍに吸収を有する。赤外部吸収スペ
クトルは３，４００．２，９５０．２，３５０　、１，
９８０．１，７００．１．６５０　、１．０７５．９３
０．６７０及び５２０の波長（ｃｍ−’）に吸収を育す
る。

なお、５Ｎ−０７物質は、赤桃色の色調を呈する無定形
粉末であって、中性水溶液中で赤桃色を呈し、アルカリ
性水溶液中で青紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生
ずる。

５Ｎ−０７物質ノｒｊＩｉ！！！＝ 本発明に係る５Ｎ−０７物質は、アクチノマジュラ属に
属する微生物を培養することにより調製し得る。

本発明で利用する上記微生物は、神奈用県の土壌より新
たに分離したものであって、その菌学的性質を分離株（
ＳＮ−０７株と称する）について説明すると下記のとお
りである。因みに、５Ｎ−０７株は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研菌寄第７８９０号（ＦＥＲＭ　Ｐ
−７８９０）　として寄託されている。

１）形態上の性質 基中国糸は、よく分岐して伸張し、通常の条件下では、
分断しない、気菌糸は、オートミール寒天培地（ＩＳＰ
　Ｎ１５）の培地上で！富に着生し、胞子形成も良好で
ある。気菌糸の分枝は単純分枝であって、車軸分枝はみ
られない、胞子のう、菌種、鞭毛胞子は観察されない、
気菌糸の先端の胞子の連鎖は１〜１．５回転しており、
１０〜１５ケの胞子がａ察される。

電子顕微鏡下でのＷｉ察では、胞子は円筒型〜卵型であ
って、０．４〜０．６　Ｘｏ、６〜１．０　ミクロンの
大きさををし、胞子表面は平滑状である。

２）各種培地上の生育状態 各種培地で２８〜３０℃の温度に１４〜２１日間培養し
た結果、５ＩＪ−０７株は、オートミール寒天培地、酵
母エキス・麦芽エキス寒天培地及びペプトン・酵母エキ
ス・鉄寒天培地には生育するが、他の寒天培地上での生
育はきわめて不良である。

そこで、培地組成としてオートミール又は酵母エキスを
欠いている培地に対しては酵母エキスを０．１％になる
ように添加したものでの生育状態を観察した。結果は表
１に示すとおりである。

３）生理的性質 ｉ）生育温度：オートミール寒天において２０〜〜４５
℃の温度範囲で生育し、２５ 〜４１℃において良好に生育し、 特に３２〜４０℃での生育が速い。

ｉｉ）ゼラチンの液化：　　　　陰性 ｉｉ　）デンプンの分解ｓｌｉ性 ｉｖ）脱脂乳のヘプトン化：　　陽性 同上凝固　：陽性 Ｖ）メラニン様色楽の生成：　陰性 ｖｉ）硝酸塩の還元：　　　　　陽性 ４）炭！：源の同化性 シュクロース・硝酸塩寒天培地（Ｗａｋｓｗａｎ　Ｎａ
１）からシュクロースを除去して、代わりに酵母エキス
０．１％を添加したものを基礎培地として用い、それに
各種炭素源をそれぞれ０．１％添加したものについての
同化性をｉｉ察した。

Ｄ−グルコース　　　　　　同化する Ｄ−フラクトース　　　　　間化する Ｄ一番シロース　　　　　　間化する し一アラビノース　　　　　同化する ！−イノシトール　　　　　同化する サリシン　　　　　　　　同化する シュクロース　　　稍々同化するも不明確Ｄ−マンニト
ール　　　　　同化せず し一ラムノース　　　　　　同化せず ラフィノース　　　　　　同化せず ５）ｉｔ胞型壁組 成ラカー等の方法（Ａｐｐｌ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．　＋
　１２＋４２１〜４２３．１９６４）及びルシバリエ等
の方法（Ｉｎｔｅｒ。

Ｊ、ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ　　２０．４３５〜４４３．１９７０）により分
析した。

ｉ）全細胞中の２．６−ジアミノ ピメリン酸：　　　　　　　　　　メソ型ｉｊ）全［１
）中のｗＩニゲルコース、マンノースの他に少量のマジ
ュロースを 含み、アラビノース、キシ ロースを含まない。

上述した性状からみて、５Ｎ−０７株は形態的にはスト
レプトミセスＷｂ　（Ｓｔｒｅｐｔｏ＋ｍｙｃｅｓ）に
類似するが、細胞壁中にメソ型２．６−ジミノピメリン
酸を含むことからストレプトミセス属とは明りように区
別され、また、細胞壁中の糖にアラビノースを含まない
ことからノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）　とも区
別される。

したがって、これらの重要な性質上の特徴から、５Ｎ−
０７株はアクチノマジュラ属（Ａｃｔｉｎｏ＋ｍａｄｕ
ｒａ）に属する菌株であることが判明する。なお、野々
村等のアクチノマジュラ属の分類ｒＪ、Ｆｅｒｍｅｎｔ
、Ｔｅｃｈｍｏ１．、４９　（１））　９０４〜９１２
　（１９７１）Ｊによると、５種類の菌株が記載されて
いる。これらのうち、アクチノマジェラ・ロゼオヴィオ
ラセア（Ａｃｔｉｎｏｓａｄｕｒａ　ｒｏｓ＠ｏｖｉｏ
ｌａｃｅａｅ）がＳト０７株と比較的類似しているが、
各種培地での生育状態、炭素源の利用及びデンプン分解
性等の点で若干相違が認められるので、５Ｎ−０７株に
ついては種の確定には至らず、したがって、本菌株をア
クチノマジュラ・スピーシーズ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕ
ｒａ　ｓｐ、）ＳＮ−０７と命名した。

而して、５Ｎ−０７株は他の放線菌の場合と同様に、そ
の性質が変化し易く、人工的変異処理で容易に変異し得
るので、いずれの変異株であっても５Ｎ−０７物質の生
産能を有する菌株はすべて本発明において利用し得るも
のである。

上記Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｓｐ、を利用して５Ｎ
−０７物質を調製するには、該菌株を、通常の微生物が
利用し得る公知の栄養源を含有する培地中で培養する。

培地としては、例えば、グルコース、グリセリン、デン
プン、デキストリン、オートミール、マルトース、シュ
クロース、その伯のＦ１類、及び油脂類等を炭素源とし
て含み、大豆粉、綿実粕、肉エキス、酵母エキス、ペプ
トン、コーンステイープリカー、落下生粉、カゼイン、
アンモニウム塩、硝酸、ＲＲ等を窒Ｓ源として含み、そ
の他必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン
酸塩等の無機塩類を添加したものを用い得る。

培養方法としては、一般に行なわれる放線菌の培養方法
と同様に好気的条件下での液体深部培養が適している。

また、培養条件としては、２５〜３７℃、好ましくは２
８〜３４℃の温度で振とう培養もしくは通気培養を行な
うとよく、２〜４日の培養で目的とする５Ｎ−０７物質
が最高濃度で産生ずるに至る。

因みに、培養物中の５Ｎ−０７物質の検出には、大Ｘｉ
ｌの薬剤高感受性変異株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏ
ｌｉ　ＢＥ１）８６）を用いるペーパーディスク平板法
又はヒーラ（Ｈｅｌａ）　１）胞による１ｉｌｆｉ［培
養法によって行なう。

上記培養により得られた培養物から５Ｎ−０７物質を採
取するに当っては、塩析、溶剤抽出、吸着剤による処理
、イオン交換処理、ゲル濾過法等を通用して抽出及び精
製を行なう。

例えば、培ｌｌ物を濾過もしくは遠心分離などにより国
体固形分を分離して得られた濾液に硫酸アンモニウム等
の塩析剤を用いて塩析し、得られたＳト０７物質を含む
沈澱物を濾取し、これを水又は緩衝液（例えばリン酸緩
衝液、トリス緩衝液等）に熔解し、ついでこの溶液をセ
ロファン膜や限外濾過膜を用いて脱塩した後、ジエチル
アミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースあるいはセファ
デックス等の弱塩基性イオン交換樹脂に吸着せしめ、こ
の吸着物を食塩のような中性塩乃至リン酸緩ＩｆＩＷ！
、等を用いて溶出する。ついでこのようにして得られた
５Ｎ−０７物質を含む水性液に当量の８０％フェノール
を混和し、よく攪律して上層の水層部を分取し、これに
エタノールを加えて５Ｎ−０７物質を含む沈澱物を得る
。この沈澱物を水に溶解し、必要に応じて水に対して透
析し、更に、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂのような
疎水クロマトグラフィー、または、バイオゲルＨＴのよ
うなハイドロキシアパタイトクロマトグラフイー、ある
いはセファデックスＧ−７５、Ｇ−１００、Ｇ−１５０
等のようなゲル濾過クロマトグラフィーで処理すること
により高純度な５Ｎ−０７物質を得ることができる。

上述したように、培養物について上記各処理を組合わせ
て精製した５Ｎ−０７物質を凍結乾燥すると赤桃色無定
形粉末として得られる。

因みに、このようにして得られた５Ｎ−０７物質が単一
物質であることは、セファデックスＧ−１５０カラムク
ロマトグラフイーでの対称的な溶出像およ超遠心分析（
２０℃で５０．００Ｏｒｐｍ　、３０分間）による沈降
パターンでの単一ピーク、及びイオン交換型ＤＥＡＲ−
５ＰＩＩカラムによ、る高速液体クロマトグラフィーで
の単一ピークにより立証し得る。

３里皇宜尻立 次に、本発明による５Ｎ−０７物質の生理活性について
説明する。

ｉ）抗菌作用 表２に示すとおり、５Ｎ−０７物質は、グラム陽性細菌
、特に、ミクロコツカス・ルテウスを強く阻止し、バチ
ルス・ズブチリスではＤＮＡ修復能欠損株（ｒｅｃ−）
に対する作用が大きい、なお、ダラム陰性細菌に対する
作用は大きくないが、サルモネラ菌のりポボリサツカラ
イド（ＬＰＳ）欠損株や大腸菌薬剤高感受性法を強く阻
止する。

ｉｉ）抗腫瘍作用 Ｐ２Ｓ５のｉｔ瘍ｍ胞をＩ　Ｘ　１０’含む浮遊液０．
１ｍｌをＢＤＰ　ＩマウスのｔＸＩｉ内に移植した後、
５Ｎ−０７物質を移植１日目から９日目まで連続して上
記ｔｔ腔内に投与した。その結果は表３に示すとおりで
ある。

表３ 表中の廷命五は対照群の平均生存日数に対する５Ｎ−０
７物質投与群の平均生存日数の百分率で示したものであ
る。

畝上のとおり、本発明の５Ｎ−０７物質は、抗菌活（生
においてミクロコ・ンカス・ルテウス及びエセリシャ・
コリー薬剤高感受性法を強く阻止し、その他のグラム陽
性細菌を阻止する。

また、５Ｎ−０７物質は、抗腫瘍活性においても微量で
Ｐ２Ｓ５及びＬ１２１０担癌マウスの延命効果をゆうす
る。

従来知られている高分子の抗！ｔｇＩｊ剤の全てがタン
パク質（ペプチドを含む）、多ｔｒｉ乃至これから成る
化合物や混合物であるのに対して、５Ｎ−０７物質は核
酸系物質を構成成分とすることに鑑み、従来の高分子抗
腫瘍剤と組成及び性状を明らかに異にする新規な抗菌性
及び抗腫瘍性を有する物質であると判断される。

以下に実施例を示して本発明の針−０７物質の調製法を
更に具体的に説明する。

大土史 培養： 乾燥オートミール１５ｇ、グリセリン１５ｇ１乾燥酵母
５ｇ　、リン酸−カリウム３ｇ　、リン酸水棄二ナトリ
ウム７ｇ、硫酸鉄１ｇ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ
を含有し、ｐＨを７．５に調整した液体培地１）を、５
Ｑｍｌ容試験管に１５−１宛分注し、常法に従って滅菌
した。

上記各培地に、５Ｎ−０７株の寒天培地上の胞子を接種
して２７℃で４〜７日間振とう培養し、第一種菌を得た
。同様に前記組成の液体培地を１００ｍ　ｌ入れた５０
０ｍ　ｌ容フラスコで３０℃で２〜３日間振とう培養を
行なって第二種菌を得た０次いで、３０１容ジャーファ
ーメンタ−に前記組成の液体培地を２０１入れて滅菌し
た後、第二種菌４００ｗ　ｌを接種し、培養温度３２℃
、通気量２０１７分、及び攪拌器回転数３００〜５００
　ｒｐｍの条件下で、３日間培養を行なった。培養によ
り産生じた物質の活性の横定はエセリシャ・コリーＢと
１）８６株の寒天平板培養における住冑阻止をもって判
定した。

抽出及び精製： 培養終了後、２０７培養液を濾過して濾液１５１を得、
これに３．９ｋｇのｆＬ酸アンモニウム（培養液１）当
り２モル硫酸アンモニウム）を加え、４℃で１６時間静
かに攪拌した。生じた沈澱物を遠心分離によって除去し
、清澄液１４Ｊｔを得た０次いで、上記清澄液に２．７
ｋｇの硫酸アンモニウム（はじめの培養Ｗ１．１）当り
１．５モル硫酸アンモニウム）を加え、充分攪捧後、４
℃で２４時間静置すると、液表面に不溶物がペレット状
に生じた。このベレット状不溶物を濾布でこし取って、
５１の０．０Ｓモルリン酸緩衝液ｐＨ６，５に熔解した
。予め同上の緩衝液で平衡化しておいた４００ｗ　ｌサ
イズのジエチルアミノエチル−セファデックスＡ−２５
カラムに負荷し、活性画分を吸着させ、同上の緩衝液で
充分洗浄した後、’１ｆｉｉｆｔ液中の塩化カリウム濃
度を０モルから徐々に１モルまで高めることによって、
活性画分の溶出を行なった。活性を示す溶出液２．５１
に対して８０％フェノールを等量加えてよく混和した。

上層の水層部を分取して、これにエタノールを注加しつ
つ沈澱物を生じさせた。得られた沈澱物を集めて０．０
５モルリン酸緩士液１）に熔解して２モルのｉｊＫ酸ア
ンモニウムを含有せしめた同上緩衝液１０１に対して４
℃で退行を行なった０次いで、同上のｉＦＬ酸アンモニ
ウム含有リン酸緩衝液で平衡化したＬｏｏｍ　ｌサイズ
のフェニルセファロースＣＬ−４８゛　カラムに負荷し
、活性画分を吸着させ、同緩衝液中のｔＬｒｉＬｒ上ニ
ウムを２モル濃度から徐々に減少させることによって、
活性画分の溶出を行なった。活性を示す溶出液０．５１
を、蒸留水５１に対して４℃で１６時間透析を行なった
。透析内液を２５■ｌまで濃縮して径２．３０、長さ１
０５国サイズのセファデックスＧ−１５０カラムに負荷
し、０．０５モルリン酸緩衝液ｐＨ６，５でゲル濾過を
行ない、活性画分として１５■ｌ、乾物として赤桃色粉
末４６■ｇの精製された５Ｎ−０７物質を得た。培養液
に対するＳＮ、０７物賞の収率は２．３９（であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の５Ｎ−０７ｖＡ質の水溶液（実線）及
び０．１規定カセイソーダ水溶液（破線）の紫外部及び
可視部吸収スペクトルを示す、！＠２図は５Ｎ−０７物
質の臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクト
ルを示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）３５乃至４５重量％
   、リボ核酸（ＲＮＡ）６乃至１２重量％、糖（全還元糖
   ）１５乃至１７重量％及びアミノ酸２．５重量％以下を
   構成成分として含有し、下記の性質を示すことを特徴と
   する核酸系高分子物質； ［１］分子量：セファデックスＧ−１５０を用いたゲル
   濾過法により、２モル塩化カリウム −０．０５モルトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）中で２８，
   ０００〜３０，０００（蛋白質換算）を示し、０．０５
   モルトリス塩酸緩衝液 中では分子間会合を生じて６０，０００〜 ６４，０００（蛋白質換算）に増大する、 ［２］溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノール、
   エタノール、ブタノール、プロ パノール、アセトン及びエーテル等 の有機溶剤に不溶、中性水溶液中で 赤桃色及びアルカリ水溶液中で青紫 色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を 生ずる、 ［３］旋光度：０．５％水溶液の〔α〕＾２＾０＿Ｄ＝
   ＋７６°［４］紫外部吸収スペクトル：添付の第１図に
   示すとおり、 ［５］赤外部吸収スペクトル：添付の第２図に示すとお
   り、 ［６］呈色反応： ニンヒドリン反応　陽性 ブリックス反応　陰性 エルソン・モルガン反応　陰性 ホーリーローリー反応　陰性 ジフェニルアミン反応　陽性 オルシノール反応　陽性 アンスロン反応　陽性 フェノール硫酸反応　陽性 過マンガン酸カリウム反応　陽性、 ［７］分解点：＞２３５℃。
2. （２）アクチノマジュラ属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ
   ）に属する特許請求の範囲第（１）項に記載の核酸系高
   分子物質の生産能を有する微生物を培養し、培養物から
   該物質を採取することを特徴とする上記核酸系高分子物
   質の製造方法。
3. （３）アクチノマジュラ属に属する微生物が菌株Ａｃｔ
   ｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｓｐ．ＳＮ−０７である特許請求
   の範囲第（２）項記載の製造方法。
4. （４）培養を２５〜３７℃、好ましくは２８〜３４℃の
   温度で２〜４日間行なう特許請求の範囲第（２）項記載
   の製造方法。
5. （５）培養物を、塩析、フェノール処理、エタノール沈
   澱、イオンクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
   ー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びゲ
   ル濾過クロマトグラフィーから成る群から選択される少
   くとも２種を組合わせて精製する特許請求の範囲第（２
   ）項記載の製造方法。