KR100319162B1

KR100319162B1 - 비피두스균 분열촉진용 아제티딘 유도체 및 그 제조방법

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Publication number: KR100319162B1
Application number: KR1020000043751A
Authority: KR
Inventors: 마스다다카시
Original assignee: 마스다 다카시; 도아 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2001-12-29
Also published as: JPH11269142A; KR20000071886A; US6063935A; EP0943609B1; DE69901976D1; KR100310333B1; KR19990076458A; DE69901976T2; EP0943609A1; CN1229076A

Abstract

본 발명은 장내에 항상 존재하는 유익한 세균인 비피두스균의 증식을 활성화시키는 화학식(Ⅰ)로 표시되는 3,3-디히드록시 아제티딘 또는 그의 염산염, 초산염, 나트륨염 또는 칼륨염으로 이루어지는 아제티딘 유도체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 바실루스 메센트리커스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 나토등의 바실루스속균을 배양하여 그 배양액 중에서 얻게되는 아제티딘 유도체와 3, 3-디히드록시아제티딘 또는 그 염으로부터 아제티딘 유도체를 생성하는 미생물을 배양하고, 이 배양액중에서 아제티딘 유도체를 얻고, 이를 채취함을 특징으로 하는 아제티딘 유도체에 관환 것이다.

본 발명 물질은 비피두스균을 분열촉진시키는 작용이 있으므로 비피두스균 증식인자로서의 사용은 물론, 인체와 동물에 경구투여하여 장내의 비피두스균을 활성화시켜 설사, 변비 등의 변통이상을 개선시키는 효과가 있다.

Description

비피두스균 분열촉진용 아제티딘 유도체 및 그 제조방법{Azetidine derivatives stimulating the division of Bifidus and the manufacturing method of the same}

본 발명은 비피두스균(Bifidobacterium)의 분열을 촉진시키는 신규한 아제티딘(Azetidine)유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

비피두스균(Bifidobacterium)은 건강한 생체의 분변(糞便) 1g에 대해서 100억개 이상 존재하는 상재균(常在菌)으로서, 장(腸) 상피세포의 영양원, 수분, 전해질등의 흡수를 촉진시키는 유효한 각종 단쇄(短鎖)지방산을 생성하며, 또 장관(腸管) 면역기능을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이와같이 유용한 성질을 갖는 비피두스균은 생체의 환경변화, 외적인 요인 및 나이가 많아짐에 따라 점진적으로 감소하게 된다. 그 결과 통변에 이상이 발생할 뿐만 아니라, 생체에 본래부터 상재하고 있던 비피두스균의 감소 내지 증식 활성의 저하를 부활시키는 것이 중요한 과제로 대두하게 되었다.

미생물의 증식은 원래 한 개의 세포가 분열을 반복하여 증가하게 되나, 그 지표로서 배가속도(doubling time)를 들 수 있다. 배가속도란 세포 분열로부터 다음 세포 분열까지의 1세대 간의 시간을 말하는 것으로, 평균적으로 각 미생물의 배가속도는 대장균의 경우 17분, 유산균은 20분, 바실루스속은 30분, 효모는 120분이다. 또한 분열을 촉진시키는 물질로서는 키노론 화합물등의 보효소(補酵素)를 들 수 있으나, 본래 미생물이 갖고 있는 증식 능력을 일정 수준이상 빠르게 한다는 것은 용이하지 않다. 각 미생물이 최적의 환경을 이탈할 경우, 예를 들면, 혐기성균인 비피두스균을 호기적 조건하에 장시간 방치하는 경우, 생육활성을 잃게 된다. 생체의 장내에서도 질병, 환경변화, 노화 등에 의해 장 내용물중 비피두스균이 적어지거나, 정상적인 수량의 균을 유지한다해도 통변에 이상이 생기는 경우가 있다.

이와같은 경우에는, 비피두스균의 증식활성이 떨어져 있다는 것을 예상할 수 있다.

이 경우 비피두스균의 배가속도를 빠르게 하는 인자의 공급은 유효한 수단이 된다. 현재까지 비피두스균 증식촉진 인자에 대해서는 수 많은 보고가 있지만, 특히 올리고당을 중심으로 한 배당체는 십여종이 이미 시중에 나와있지만, 이들 비피두스균 증식촉진 물질은 선택적인 영양원으로서 특색이 강하고, 증식활성이 떨어지는 비피두스균을 부활시킨다는 점에서는 불충분하다. 또한 현재까지 비피두스 인자라고 불리워지는 인자는 복용하더라도 비피두스균 증식에 의한 제반작용은 완화되므로 기대효과를 얻기까지는 상당한 시간을 요하는 등의 결점이 있다.

본 발명은 이상과 같이 장내에 안정적으로 공급이 가능하며, 특이하게 비피두스균의 분열을 빠르게하는 작용을 하게 되고, 개개인이 원래부터 갖고 있는 비피두스균의 증식을 촉진시켜 즉효성을 기대할 수 있게된다.

본 발명은 비피두스균의 분열증식을 촉진시킬 수 있는 화합물, 이로부터 비피두스균 분열촉진 조성물과 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 바실루스 메센테리커스(Bacillus mesentericus)의 대사산물중에서 각종 비피두스균(Bifidobacterium longum, B. breve, B. infantis, B. adolescentis등)에 대해 증식분열을 촉진하는 작용이 있는 추정 분자량 800∼900인 물질을 발견하고 (특개평5-344882호), 바실루스 메센테리커스의 배양상청중에서 분자량이 90인 신규한 물질인 아제티딘(azetidine)유도체가 비피두스균 분열촉진작용을 갖는다는 것을 찾아내고 공업적 생산방법을 확립하여 본 발명에 이른것이다. 즉 본 발명은 화학식(Ⅰ)로 표시되는 3,3-디히드록시 아제티딘 또는 그 염으로 이루어지는 아제티딘 유도체, 상기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 아제티딘 유도체를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 비피두스균 분열촉진 조성물 및 상기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 아제티딘 유도체를 생산하는 미생물을 배양시키고, 배양액 중에서 상기 아제티딘 유도체를 생성시켜 이를 채취하는 것을 특징으로 하는 비피두스균 증식 촉진용 아제티딘 유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

..........화학식(Ⅰ)

도 1 은 비피도박테리움 롱검 M101-2 (Bifidobacterium longum M101-2)의 증식속도에 대한 BM-S의 영향을 나타내는 그래프.

본 발명에서 신규한 아제티딘 유도체로는 상기 화학식(Ⅰ)으로 표시되는 3, 3 -디히드록시 아제티딘 또는 그 염으로 이루어지는 것으로, 이 경우, 염은 예를들면 염산염, 초산염, 나트륨염, 칼륨염등의 부가염을 들 수 있다.

본 발명 물질의 생산은 미생물에 의한 발효생산이 효율적이다. 본 발명 물질을 생산할 수 있는 균주로서는 바실루스속균, 예를들면 바실루스 메센테리커스(Bacillus mesentericus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 나토(Bacillus natto)등을 들수 있으나, 바실루스 메센테리커스 TO-A(工技生工寄 FERM P-8934)가 가장 적합한 균주이다.

이하 본 발명 물질의 제조방법에 대해 설명하면 다음과 같다.

즉, 전술한 균주를 호기성균을 증식시키기 위해 자주 사용되는 영양원으로 이루어지는 배지에서 호기적으로 배양한다. 그 중 가장 알맞는 배지성분으로 고기 엑기스, 펩톤, 자당 등으로 이루어지는 배지이며, 배양방법은 호기성 배양이 사용되어지나, 특히 통기교반배양이 더욱 적합하다. 배양온도는 30∼37℃, 배지의 PH는 중성이 바람직하며, 배양시간은 12시간 배양하면 충분하고, 그 이상의 배양은 본 발명 물질의 생산량에는 영향을 주지 않는다. 다만, 배양종료후 배양 상청(上靑)과 균체를 분리하고, 배양 상청을 분리 정제로 사용한다.

분리정제방법은 우선 원심분리법에 의해 배양 상청을 분리하고 여과한 다음, 'DEAE-Sepharose CL-6B'칼럼에 흡착시키고, 완충액을 유출시킨 다음 자외선 흡수 스펙트럼의 흡수 피크에 의해 3개로 분획(分劃)한다. 특히, 비피두스균 분열촉진 활성(이하 '활성'이라고 한다)이 가장 센 획분을 농축시킨 다음, 세파덱스 G-25 수퍼파인(Sephadex G-25 Super fine)에 의해서 또 4개의 분획을 얻는다. 그 중 가장 활성이 센 획분을 '활성획분'으로 하여 시료로 한다. 얻어진 시료를 에테르로 추출하고 농축 건조시켜 백색의 침상결정을 얻게 되는데, 이것이 본 발명 물질인 아제티딘 유도체가 된다.

본 발명의 아제테딘 유도체는 원래 생균제제(비오스리: 일본 토아야쿠힌고교가부시키가이샤 제품의 상품명)에 포함되는 균주로 부터 얻어지는 것이므로, 안전성에는 아무런 문제가 없고, 특이적으로 비피두스균을 분열촉진시켜 장내 세균의 개선으로 통변이상을 개선시키는 것을 목적으로 하는 의약품, 식품, 건강식품, 기능성 식품 또는 특정 보건용 식품 등에 응용할 수 있다.

또한 공업적으로는 비피두스균을 생산할 때, 장기 보존하여 생육활성이 저하된 시이드주(종균)를 부활시키는 증식 자극제로서 유효하며, 경우에 따라서는 대량 배양시 비피두스균의 영양 보조제로도 유효하다.

본 발명 물질은 100℃, 30분간의 가열에도 내성을 나타내므로 제품의 형태는 여러가지의 것으로 생각할수 있다. 예를 들면, 분말, 정제, 과립은 물론이고 노인용 식품으로 유효한 액상제로도 이용할 수 있고, 가열공정을 요하는 펠레트제제로도 사용할 수 있다.

본 발명 유도체는 종래의 비피두스 인자의 성상과는 다르며, 비피두스균의 분열증식을 촉진시키는 것이 특징이므로 증식활성이 저하된 비피두스균을 부활시킬 수 있다. 실제로 본 발명자가 실시한 비피두스균 증식활성 측정방법에 따르면, 공기에 폭로되어 증식활성이 저하된 비피두스균의 균체를 배양하는 경우, 본 발명 물질을 첨가함으로써 원래와 같은 수준의 증식활성의 재현이 이루어지고, 비피두스균의 분열촉진 작용이 본 발명의 가장 큰 특징이라 할 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예 1

균주는 바실루스 메센테리커스 TO-A(Bacillus mesentericus TO-A. 이하 'BM'이라 약칭한다)를 사용하여 121℃에서 1.5분간 고압증기로 멸균시킨 보통액체 배지(일본 '榮硏株式會社' 제품)10ml에 접종하여 37℃에서 12시간 배양시켜 종균을 얻었다. 계속하여 121℃에서 15분간 고압증기로 멸균시키고, 냉각시킨 BM배지(고기 엑기스1%, 펩톤 1%, 자당 1%, 염화나트륨 0.5%(PH 7.0)) 500ml에 종균을 접종시키고, 37℃에서 24시간 침투 배양한다. 배양이 끝난후 원심분리기(5000rpm, 10분간)에 의해 균체와 상청을 분리하고, 얻어진 상청을 0.22㎛의 멤블레인필터로제균(除菌)여과시킨 다음, 조추출액 (이하 'BM-S'라 약칭함) 약 100ml를 얻었다.

위와 같이하여 얻은 'BM-S'를 'DEAE-Sepharose CL-6B'칼럼(칼럼 길이 3㎝, 칼럼의 직경 20㎝. '파루마시아' 제품)을 사용한 이온교환 크로마토그라피에 의해 분석하였다. 0.02M Tris-HCl(PH 7.2)로 세척한 다음, 0.1M, 0.2M, 0.3M 및 0.4M NaCl-0.02M Tris-HCl을 용출액으로 하여 각각 100ml씩 용출하였다. 280㎚의 자외선 흡수 스펙트럼에 의해 3개의 피크를 얻었다. 얻어진 분획을 후술하는 비피두스균 분열촉진작용 측정법에 의해 생물학적 분석(bioassay)을 한결과 FII분획(이하 'FII'이라 약칭함)에서 활성이 확인되었다.

계속하여 'FII' 50ml를 진공건조시켜 1/10용량까지 농축시키고 이 1ml을 겔여과칼럼 'Sephadex G-25 Super fine (칼럼의 길이 70㎝, 칼럼의 직경 1.6㎝'파루마시아'제품)에 충진시켰다.

0.02M Tris-HCl(PH 7.2)를 용출액으로 유속 30ml/시간, 분획싸이즈 5ml/시험관의 조건으로 하여 분획하였다.

자외부 흡수를 측정한 결과 네개의 피크를 얻었으며, 활성이 가장 큰 G-4를 얻었다.

이와 같이 하여 얻은 'G-4'를 농축시켜 16mg의 결정을 얻었다. 이를 다시 탈염하고 'Bond Elut C18' 카트리지를 사용하여 정제물을 얻고, 이를 분석한 결과 다음과 같은 이화학적 성상을 나타내었다.

(1) 분자식 : C₃H₈O₂NCl

(2) 분자량 : 125.5 (M⁺m/z 90.0618, C₃H₈O₂N⁺)

(3) 융점 : 145 ∼ 147℃

(4) 적외선 흡수 스펙트럼 :

수산기 : 3250 ㎝^-1및 1040 ㎝^-1,

암모늄 : 3000∼2000 ㎝^-1및 1640㎝^-1

(5) 500MHz¹H 핵자기공명스펙트럼 :

[용매: CD₃OH, 내부표준물질 : (CH₃)₄Si]

δ: 3.669(s)

3.308( ddd, J=1.7Hz )

(6) 125MHz¹³C 핵자기공명스펙트럼 :

[용매: CD₃OH, 내부표준물질 : (CH₃)₄Si]

δ: 61.06(메틸렌탄소)

62.80(4급탄소)

(7) 용해성 :

메탄올 : 용해

클로로포름: 난용

피리딘 : 난용

물 : 쉽게 용해

(8) 성상 및 외관 : 무색 판상결정

상기와 같은 분석결과에 따라 얻어진 정제물은 화학식(Ⅰ')로 표시되는 염산3,3-디히드록시 아제티딘 유도체임을 확인하였다.

..........화학식(Ⅰ')

실시예 2

비피두스균 분열 촉진작용에 대하여 설명한다. 121℃에서 15분간 고압증기로 멸균시킨 PY액체 배지 [트립티케이스 1%, 효모엑기스(Difco) 0.5%, 염류용액4%, L-시스테인 0.05%(PH 7.2)]10ml에 비피두스균 롱검 M 101-2 (Bifidobacterium longum M 101-2)를 접종하고 기상을 CO₂가스로 치환한 후, 37℃에서 24시간동안 배양하여 비피두스균 롱검(B.longum) 배양액을 얻었다.

나사입구가 달린 L자형 시험관에 무균으로 분지한 PY배지조성에 대해 실시예 1에서 얻은 BM-S를 0.1% 첨가한 배지에 상기 배양액을 접종시키고, 비피두스균 롱검(B.longum)이 1×10⁴CFU가 되도록 하였다.

접종 후 기상을 CO₂가스로 치환하고, 밀폐한 후 37℃에서 바이오포토레코더 TN-2612(아도반테크)내에서 배양했다. 배양중에는 10분마다 660㎚에서 흡광도를 측정할 수 있도록 조건을 기억시키고 비피두스균의 증식곡선을 작성하였다. 또 이를 대조 하기 위하여 BM-S 대신에 신선한 BM배지를 혼화시켜 시험을 하였다.

이와같이 실시한 배양곡선은 도1과 같이 대조구와 비교하면, 대폭적인 유도기(誘導期)의 단축과 대수 증식기의 비증식속도(比增殖速度)가 크게 향상되었다는것을 알 수 있다.

본 발명 물질에 있어서, 이와같은 확인방법을 써서 측정한 결과, 적정한 희석농도에서 비피두스균의 분열촉진 작용이 더욱 강하게 나타났다. 즉 4×10^-2㎍/ml인 경우 비피두스균의 분열촉진작용은 강하게 확인되었다.

그 결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

※발명물질의 최적농도

시험균주	본 발명 물질의 농도 (㎍/ml)
시험균주	0	4×10	4×10^-2	4×10^-5	4×10^-8	4×10^-10
비피도박테리움 롱검 M 101-2(Bifidobacterium longum M 101-2)	*0.515	1.074	1.268	1.257	1.153	1.035

* 배양개시후 26시간 후의 탁도 (O.D.= 600㎚)

실시예 3

본 발명 물질의 장내 세균에 대한 영향은 다음과 같다. 실시예 2와 같은 방법에 의해 비피두스균 롱검, 비피도박테리움 아도레센티스(B.adolescentis), 비피도박테리움 인펀티스(B.infantis), 비피도박테리움 서모필룸(B.thermophilum), 비피도박테리움 비피둠(B.bifidum), 비피도박테리움 프세도롱검(B.pseudolongum), 비피도박테리움 서브타일(B.subtile), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 수이스(B.suis), 비피도박테리움 그로보섬(B. globosum), 비피도박테리움 프세도카테눌라툼(B.pseudocatenulatum), 락토바실루스 카세이(Lactobacills casei), 락토바실루스 아시도필루스(L.acidophilus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프세도모나스 아에루기노사 (Psudomonas aeruginosa), 크렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 프로테우스 불가리스(proteus vulgaris)에 대한 영향을 검토하였다.

그 결과 각종 비피두스균 및 락토바실루스에 대해서는 분열촉진 작용을 하는것이 확인되었지만 에스케리키아 콜라이, 프세도모나스 아에루기노사에 대해서는 억제적이고, 기타 세균에 대해서는 아무런 작용이 없었다. 그 결과를 표 2 와 표 3에 나타내었다.

[표 2]

※ 각종 비피두스균에 대한 본 발명 물질의 영향

시험균주	본 발명 물질의 농도 (㎍/ml)
시험균주	0	4×10^-2
비피도박테리움 롱검 M101-2	0.515 *	1.268
비피도박테리움 아도레센티스 A234-4	0.518	1.002
비피도박테리움 인펀티스 I-10-5	0.500	0.652
비피도박테리움 서모필룸 IV-29	0.520	0.581
비피도박테리움 비피둠 A234-4	0.407	0.578
비피도박테리움 수도롱검 IV-70	0.073	0.730
비피도박테리움 서브타일 IV110	0.502	0.635
비피도박테리움 브레브 I-53-8	0.471	0.466
비피도박테리움 수이스 ATCC27533	0.705	1.275
비피도박테리움 그로보섬 IV-91	0.308	0.451
비피도박테리움 수도카테눌라툼 BB-110	0.533	1.010

* O.D.= 600㎚

[표 3]

※ 장내의 각종 세균에 대한 본 발명물질의 영향

시험균주	본 발명 물질의 농도 (㎍/ml)
시험균주	0	4×10^-2
락토바실루스 카세이 NRIC 1042	0.420 *	0.420
락토바실루스 아시도필루스 NRIC 1030	0.403	0.542
살모넬라 티피무리움 TA 98	0.190	0.190
에스케리키아 콜라이 EF 72	0.408	0.250
수도모나스 아에루기노사 PAO	0.390	0.290
크렙시엘라 옥시토카 GIFU 3162	0.435	0.388
프로테우스 불가리스 IID 824	0.330	0.340

* O.D. = 600㎚실시예 4

각종 바실루스(Bacillus)속균의 비피두스균의 증식촉진효과에 대하여 검토하였다. 시험할 각종의 바실루스속균을 실시예1에 기재된바와 같이 바실루스 메센테리커스 TO-A의 조 추출액 작성법에 따라 각각의 배양구액을 작성하고, 생물학적 분석을 하였다. 14시간 뒤 대조구에 대한 각각의 바실루스 배양구액의 비피도박테리움 증식 촉진작용은 본 발명 물질을 생산하는 바실루스 메센테리커스 TO-A가 가장 높은 값을 나타내었다.

그 결과는 표 4와 같다.

[표 4]

※ 각종 바실루스 속균의 배양구액의 비피도박테리움 증식촉진 효과

시험균주	O.D(= 600㎚)	대조구에 대한 비율
대조구(對照區)	0.515 *	-
바실루스 메센테리커스TO-A	1.144	2.22
바실루스 서브틸리스(나토) A	1.01	1.96
바실루스 서브틸리스(나토) B	0.736	1.43
바실루스서브틸리스 1AM 1168	0.881	1.71
바실루스 서브틸리스 1FO 3009	1.035	2.01
바실루스서브틸리스 1FO 3034	1.067	2.07
바실루스 서브틸리스 IFO 13179	1.031	2.00

* O.D. = 600㎚

실시예 5

HM 팩틴 10g, 젤라틴 1g, 자당 10g 및 본발명 물질 0.001g를 혼화시키고 충분히 교반한다. 혼합물을 원형모양의 셀룰로이드제의 형(型)(직경40mm)에 유입시킨후 냉각시켜 젤리식품 500알을 제조하였다.

실시예 6

유산균 50g, 낙산균 20g, 당화균 20g, PSL(감자 전분과 유당과의 혼합 조립품) 910g 및 본 발명물질 0.001g를 잘 혼합시킨 다음, 타정기를 사용하여 1정당 200mg의 정제를 4000정 제조하였다.

본 발명 유도체는 비피두스균의 분열을 촉진시키는 작용이 있으므로 생체외에서 비피두스균 증식 인자(비피두스균 증식자극제 또는 비피두스균 부활화제등)로서는 물론, 사람과 동물에 경구 투여하여 장내에 서식하고 있는 비피두스균을 활성화시킬수 있다. 그 때문에 장내 세균의 환경을 개선시켜 설사, 변비등의 변통 이상을 개선할 수 있게 된다.

Claims

화학식(Ⅰ)로 표시되는 3, 3-디히드록시 아제티딘 또는 그의 염산염, 초산염, 나트륨염 또는 칼륨염으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 아제티딘 유도체

..........화학식(Ⅰ)
청구항 1에 있어서, 아제티딘 유도체가 염산 3, 3-디히드록시 아제티딘임을 특징으로 하는 아제티딘 유도체
청구항 1에 있어서, 아제티딘 유도체를 유효성분으로 하는 비피두스균 분열촉진 조성물이 비피두스균 증식촉진을 목적으로 하는 식품임을 특징으로 하는 아제티딘 유도체
상기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 3,3-디히드록시 아제티딘 또는 그의 염산염, 초산염, 나트륨염 또는 칼륨염으로 이루어지는 아제티딘 유도체를 생산하는 미생물을 배양하고, 배양액 중에 상기 아제티딘 유도체를 생성시켜 이를 채취하는 것을 특징으로 하는 아제티딘 유도체의 제조방법.

..........화학식(Ⅰ)
청구항 4에 있어서, 아제티딘 유도체의 생산균으로서, 바실루스속 균중 바실루스 메센트리커스(B. mesentricus), 바실루스 서브틸리스(B.subtilis), 바실루스 나토(B.natto)중 어느 1종을 사용하는 것으로 특징으로 하는 아제티딘 유도체의 제조방법.