KR20240112382A - 프리바이오틱스 알터난을 생산하는 신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프리바이오틱스 알터난(alternan)을 생산하는 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 알터난을 생산하며, 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 장내부착능과 같은 프로바이오틱스 특성을 가지며, 염증 억제능 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지고 있는 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리 EC01 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

프리바이오틱스 알터난을 생산하는 신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 이의 용도{Novel Lactobacillus reuteri strain producing prebiotic alternan and uses thereof}
본 발명은 프리바이오틱스 알터난(alternan)을 생산하는 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
글로벌 마이크로바이옴 시장은 2019-2023년 사이 연평균 22.3%의 성장율을 나타낼 것으로 예상된다. 마이크로바이옴 시장에서 가장 큰 비중을 차지하는 프로바이오틱스(probiotics) 및 프리바이오틱스(prebiotics)는 가장 성장성이 높은 분야로 23년 75조원에 도달할 것으로 예상되고 있다. 이와 더불어, 축산업에서의 예방적 항생제 사용 금지 정책으로 인해, 항생제를 대체할 수 있는 마이크로바이옴의 개발 필요성이 대두되고 있다.
마이크로바이옴을 활용한 유익미생물, 프로바이오틱스 소재 등의 생산 관련 기술은 가축 및 반려동물의 건강과 복지에 효과를 발휘하는 미생물 기능성 소재로서, 국내의 축산업 및 반려동물 산업에 기여할 뿐 아니라, 향후 해외 수출을 통한 시장개척과 국내 사료 첨가 제품의 기술력 향상에 기여할 수 있을 것으로 전망된다.
그러나, 가축 및 반려동물 분야의 마이크로바이옴 연구는 현재 국내외적으로 연구 단계에서 매우 활발하지만 아직까지는 산업적으로 초기 단계에 있다. 또한, 국내 연구 자체가 개별적으로 이루어지고 있어, 이에 관하여 체계화된 연구가 절실한 실정이다.
한편, 한국공개특허 제1999-0052282호에는 '신균주 류코노스톡 메센테로이드스 씨비아이-110 및 이를 이용한 알터난의 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '프리바이오틱스 알터난을 생산하는 신규한 락토바실러스 루테리 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 프리바이오틱스를 생산하고, 그 자체로 프로바이오틱스로서 기능하는 미생물을 발굴하고자 하였다. 이를 위해, 돼지 소장 시료로부터 다수의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주들을 분리하였고, 다당체 생산 배지를 사용하여 다당체를 고수율로 생산하는 신규 균주인 락토바실러스 루테리 BR120 균주를 발굴하였으며, 상기 균주에 감마선을 조사하여 동일 조건에서 다당체 생산능이 증진된 돌연변이 균주 EC01을 선발하였다. 다당체 구조 분석을 통해 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 생산하는 다당체가 프리바이오틱스 기능을 가진 알터난(alternan)임을 확인하였으며, EC01 균주가 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 장내부착능과 같은 프로바이오틱스 특성을 가지며, 염증 억제능 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) EC01 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 알터난(alternan)의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 알터난을 유효성분으로 포함하는, 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스(probiotics) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 락토바실러스 루테리 BR120 균주 및 이에 감마선을 조사하여 알터난 생산능이 증대된 락토바실러스 루테리 EC01 균주(KCTC 15218BP)는 알터난을 고수율로 생산하는 바, 알터난의 산업적 생산에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 이로부터 생산된 알터난을 식품, 사료, 화장품, 프리바이오틱스 또는 신바이오틱스의 원료로써 활용할 수 있다. 또한, 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 우수한 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 장내 부착능을 가지므로 프로바이오틱스 균주로 활용할 수 있고, 염증 억제 효과 및 병원성 미생물 억제 효과를 가지므로, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 화장료 조성물 및 항균용 조성물 등으로 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 돼지 소장 유래 분리 유산균의 배양 모습을 보여준다.
도 2는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) BR120 균주의 분류학적 계통도를 보여준다.
도 3은 락토바실러스 루테리 BR120 균주의 회분식 배양시 다당체 생산량 및 균체 성장량을 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 회분식 배양시 다당체 생산량 및 균체 성장량을 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 유가식 배양시 다당체 생산량 및 균체 성장량을 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 생산하는 다당체의 구조 분석을 위한 13C NMR 및 1H NMR 분석 결과이다.
도 7은 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 내산성(a), 내담즙성(b), 장내 부착능(c)을 나타낸 것이다. GG: 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG ATCC53103 균주.
도 8은 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 염증 억제 효과(a), ABTS 라디칼 소거능(b) 및 DPPH 라디칼 소거능(c)을 확인한 것이다. PC: PBS만 처리한 양성 대조군, NC: PBS + LPS (lipopolysaccharide) 처리 음성 대조군, GG: 락토바실러스 람노서스 GG ATCC53103 균주, AA: 2 mM 아스코르브산.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) EC01 균주를 제공한다.
본 발명에서는 돼지 소장 시료로부터 락토바실러스 루테리 균주들을 분리하였고, 분리된 균주 중 수크로스(sucrose)로부터 다당체 생산성이 뛰어난 BR120 균주를 선발하였으며, 상기 BR120 균주의 16s rRNA 유전자 서열(서열번호 1)을 분석하여 BR120 균주가 락토바실러스 루테리 JCM 1112 (AP007281)와 유사성이 99%임을 확인하였다. 그 후, 상기 BR120 균주에 방사선을 조사하여 다당체 생산성이 향상된 1종의 돌연변이 균주 EC01을 선발하였고, 상기 EC01 균주가 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 장내부착능과 같은 프로바이오틱스 특성을 가지며, 염증 억제능 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 가지고 있음을 확인하여, 상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) EC01 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 12월 5일자에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 15218BP).
본 발명의 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주 및 이의 모균주인 락토바실러스 루테리 BR120 균주가 생산하는 다당체는 알터난(alternan)으로 확인되었다.
알터난은 글루코스 단위로 구성된 다당류로, 글루코스 단위는 α-1,3-과 α-1,6 -글라이코시딕(glycosidic) 결합으로 서로에 연결되고, 상기 두 유형의 결합이 교차적으로 나타난다. 알터난은 분지(branch)를 포함할 수 있고(Seymour et al., Carbohydrate Research 1979, 74:41-62), 알터난을 생산하는 미생물 및 알터난의 생산 방법이 당해분야에 공지되어 있다(U.S. Pat. No. 05702942; U.S. Pat. No. 07524645; PCT/EP2008/051760). 알터난은 프리바이오틱스, 저점도 증량제(low-viscosity bulking agent) 및 저산 안정제(low-acid stabilizer)로의 기능이 있는 것으로 보고되었다(Science and Technology of Food Industry, 2013, 02:357-360).
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 알터난(alternan)의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "배양"은 본 발명의 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 알터난의 생산방법은, 균주를 배양하는 단계 이후 균주 배양물로부터 알터난을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 회수는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 배양된 균체 및/또는 배양액으로부터 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 알터난을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC (high performance liquid chromatography) 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 알터난을 회수할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 알터난의 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 알터난 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 생산방법에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 수크로스로부터 시간당 0.5 g/L·h 이상의 생산량으로 알터난을 생산하는 것이 특징이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 5 L 발효조에서 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 배지로 회분식 배양한 결과, 배양 12시간째 최종적으로 6.3 g/L의 알터난을 생산하였으며, 수크로스로부터 알터난의 생산수율과 시간당 생산성은 0.157 g/g 수크로스와 0.525 g/L·h임을 확인하였다(도 4). 또한, 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 5 L 발효조에서 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 배지로 유가식 배양한 결과, 배양 60시간째 최종적으로 54.3 g/L의 알터난을 생산하였으며, 수크로스로부터 알터난의 생산수율과 시간당 생산성은 0.208 g/g 수크로스와 0.905 g/L·h임을 확인하였다(도 5).
본 발명은 또한, 상기 방법으로 생산된 알터난을 유효성분으로 포함하는, 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "프리바이오틱스"는 건강에 유익한 효과를 내는 장내 유익한 미생물의 생장을 촉진하거나 활성화시키는 성분을 의미한다.
본 발명의 프리바이오틱스 조성물은 프리바이오틱스 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 다른 프리바이오틱스와 병용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스(probiotics) 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "프로바이오틱스(probiotics)"는 건강에 유익한 효과를 내는 살아있는 미생물을 통칭하는 개념으로, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 장 기능 개선, 면역력 증진 등 건강에 유익한 효과를 내는 미생물을 포함하는 조성물을 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 건강에 유익한 효과를 내는 미생물은 본 발명의 신규 균주인 락토바실러스 루테리 EC01 균주일 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 알터난을 생산하며, 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 장내 부착능 및 항염 활성을 갖는 균주로, 시판 프로바이오틱스인 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG ATCC53103 (LGG)보다 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 장내 부착능 및 항염 활성이 모두 우수하게 확인되었다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 프로바이오틱스 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 다른 프로바이오틱스와 병용할 수 있고, 종래의 프로바이오틱스와는 순차적으로 또는 동시에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항균(antimicrobial)"은 세균(bacteria)의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명에 따른 항균용 조성물에 있어서, 상기 병원성 미생물은 바람직하게는, 리스테리아(Listeria) 속 미생물, 바실러스(Bacillus) 속 미생물, 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 미생물 및 엔테로박터(Enterobacter) 속 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로 상기 리스테리아 속 미생물은 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)이고, 바실러스 속 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이고, 에스케리키아 속 미생물은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)이고, 엔테로코커스 속 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)이고, 엔테로박터 속 미생물은 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항염증용 조성물에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 항염 활성이 우수한 균주로, 염증 유발원에 의한 면역세포(대식세포)의 염증인자(산화질소) 생성을 현저히 억제할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 용어, "항염증"이란, 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미하며, 상기 용어, "염증"은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 염증성 질환을 유발하는 원인이다.
상기 염증성 질환은, 본 발명의 항염증용 조성물에 의하여 증상이 완화, 경감, 개선 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증, 전신성 경피증 또는 궤양성 대장염일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 항염증용 조성물은 염증을 억제하거나 감소시키는 활성을 나타냄으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항염증용 조성물에서, 상기 조성물은 약학, 의약외품, 화장품, 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 알터난(alternan)을 생산하며, 프로바이오틱스 특성을 가지고 있으며, 항염 활성 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성이 있다.
본 발명의 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함게 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 식품 조성물은 바람직하게는, 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 건강기능식품(functional food)이란, 특정 보건용 식품(food for special health, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의료 효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 건강기능식품은 정제, 켑슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물에서 유효성분인 락토바실러스 루테리 EC01 균주 또는 이의 배양액의 함량은 사용 목적에 따라 당업자에 의해 적합하게 결정될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 구체적으로는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 알터난(alternan)을 생산하고, 프로바이오틱스 특성을 가지고 있으며, 항염 활성 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성이 있는 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 유효성분으로 포함하므로, 본 발명의 사료 첨가제는 기존의 항생제를 대체하고 유해한 병원성 미생물의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 면역력을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명의 사료 첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료 첨가제는 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 급여 동물(가축)의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(L. reuteri) EC01 균주 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 증량제 및 안정제로 기능하는 알터난(alternan)을 생산하고, 항산화 활성, 항염 활성 및 병원성 미생물에 대한 항균 활성이 있는 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 포함하고 있으므로, 염증 완화 또는 항균용 화장료의 형태로 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "배양액"은 배양물 그 자체, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물을 모두 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규 락토바실러스 루테리 BR120 균주의 분리
돼지 소장 시료를 채취하여, 1 g의 시료에 생리식염수 10 ㎖을 가하여 현탁한 후 1×10-6배까지 희석하여 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple)이 함유된 MRS 고체배지(10 g/L의 프로테오스 펩톤 NO.3, 10 g/L의 쇠고기 추출물, 5 g/L의 효모 추출물, 20 g/L의 덱스트로스, 1 g/L 의 폴리솔베이트 80, 2 g/L의 암모늄 시트레이트, 5 g/L의 소듐 아세테이트, 0.1 g/L의 마그네슘 설페이트, 0.05 g/L의 망가니즈 설페이트, 2 g/L의 디포타슘 포스페이트, 0.04 g/L의 브로모크레졸 퍼플 및 20 g/L의 아가 함유)에 각각 100 ㎕씩 도말 후, 37℃에서 Bactron Anaerobic Chamber (SHEL LAB, Cornelius, OR. USA)를 이용하여 24시간 동안 혐기 상태로 배양하여 얻어진 콜로니들을 새로운 MRS 배지에 재접종하여 균주를 순수분리한 후 MALDI Biotyper (Bruker Daltonik, Billerica, MA. USA)로 120종의 락토바실러스 루테리 균주를 분리하였다.
분리된 120종의 락토바실러스 루테리 균주의 다당체 생산 배지로는 수크로스(sucrose)가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 고체배지(40 g/L 수크로스, 10 g/L 프로테오스 펩톤 NO.3, 10 g/L 쇠고기 추출물, 5 g/L 효모 추출물, 1 g/L 폴리솔베이트 80, 2 g/L 암모늄 시트레이트, 5 g/L 소듐 아세테이트, 0.1 g/L 마그네슘 설페이트, 0.05 g/L 망가니즈 설페이트, 2 g/L 디포타슘 설페이트 및 20 g/L의 아가 함유)에 도말한 다음 37℃에서 2일간 배양 후 점성을 띄며 다당체를 형성하는 균주들을 1차적으로 선별하였다(도 1). 상기의 방법으로 선별된 균주들을 전술한 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 액체배지 100 ㎖에 접종하여 Bactron Anaerobic Chamber를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 혐기 상태로 배양하였다. 이후 균주 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 에탄올 침전법으로 다당체 생산량을 측정하고, 다당체 생산량이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다(표 1).
신규 분리 다당체 고생산 락토바실러스 루테리 균주의 특성
strain Cell growth (OD600nm) Polysaccharide (g/L)
Lactobacillus reuteri BR120 7.56 2.76
최종적으로 선별된 다당체 생산이 가장 우수한 균주 BR120의 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 게놈 DNA 추출 키트(Invitrogen, Germany)를 이용하여 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 락토바실러스 16S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 2) 및 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 3)을 이용하여 PCR법으로 16S rRNA 유전자 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 2.5 U의 Ex Taq 폴리머라제(Takara, Japan), 폴리머라제 버퍼, 각 1 mM의 dNTP 혼합물, 100 pmol 농도의 각 프라이머 1 ㎕, 주형 DNA 500 ng을 함유하는 PCR 반응용액 (50 ㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기(Takara)로 96℃ 30초, 50℃ 1분, 72℃ 2분 조건으로 30회간 수행하였다. PCR 반응액을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하고 pGEM-TEasy 벡터(Promega, USA)를 이용하여 대장균 EPI300으로 형질전환 하였다. 형질전환된 재조합 대장균들로부터 플라스미드 DNA를 추출(Qiagen, USA)하고, 제한효소 EcoRI을 처리하여 원하는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 것을 확인하였으며, 염기서열을 결정하였다(서열번호 1). 염기서열의 상동성 분석 결과를 토대로 분리한 균주가 종래 락토바실러스 루테리 JCM 1112 (AP007281) 균주와 유사성이 99%인 것으로 확인되어, 최종적으로 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) BR120로 명명하였다(도 2).
실시예 2. 신규 락토바실러스 루테리 BR120 균주의 발효조 배양을 통한 다당체 생산
다당체를 생산하는 락토바실러스 루테리 BR120 균주를 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 액체배지를 이용하여 5 L 발효조에서 회분식 배양하였다. 회분식 배양은 배양부피 3 L, 초기 접종량 10 %(v/v), 배양온도 37℃, 교반속도 100 rpm 및 공기주입은 하지 않는 조건으로 수행하였다.
그 결과, 배양 12시간째 최종적으로 4.8 g/L의 다당체를 생산하였으며, 수크로스로부터 다당체의 생산수율과 시간당 생산성은 0.119 g/g 수크로스와 0.400 g/L/h를 나타냈다(도 3).
실시예 3. 감마선 조사에 의한 다당체 생산 증가 유산균 변이주 분리
앞서 분리한 락토바실러스 루테리 BR120 균주의 다당체 생산량을 증진시키기 위해 감마선 조사를 수행하였다. 락토바실러스 루테리 BR120 균주를 50 ㎖ 플라스크에서 24시간 배양 후 균체를 회수하여 PBS 버퍼 10 ㎖에 현탁 후, 감마선을 조사하였다(조사 선량: 1∼3 kGy). 감마선을 조사한 균체 현탁액을 적절히 희석하여 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 고체배지에 평판 도말 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 도말한 플레이트에서 자란 콜로니 중 모균주 대비 콜로니의 크기와 점액질이 증가한 단일 콜로니를 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 액체배지를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 다당체 생산이 가장 높은 균주 1종을 최종 선별하였으며, 선별된 최종 균주는 락토바실러스 루테리 EC01로 명명하였다. 선별된 최종 균주 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 2022년 12월 5일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15218BP를 부여받았고, 이후 락토바실러스 루테리 유래 다당체 생산을 위해 사용하였다.
감마선 조사를 통한 변이주 선별
strain Cell growth (OD600nm) Polysaccharide (g/L)
L. reuteri BR120 7.56 2.76
L. reuteri EC01 7.50 3.94
최종 선별된 돌연변이 균주 락토바실러스 루테리 EC01을 수크로스가 첨가되고 글루코스가 제외된 MRS 액체배지를 이용하여 5 L 발효조에서 회분식 배양을 수행하였다. 회분식 배양의 조건은 상기 실시예 2와 동일하게 진행하였다.
그 결과, 배양 12시간째 최종적으로 6.3 g/L의 다당체를 생산하였으며, 수크로스로부터 다당체의 생산수율과 시간당 생산성은 0.157 g/g 수크로스와 0.525 g/L·h를 나타냈다(도 4).
실시예 4. 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 5 L 발효조 유가식 배양을 통한 다당체 생산
다당체 생산이 증진된 돌연변이 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 이용하여 수크로스가 첨가된 MRS 배지를 이용하여 5 L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양은 배양부피 3 L, 초기 접종량 10 %(v/v), 배양온도 37℃, 교반속도 100 rpm, 공기주입은 하지 않는 조건에서 수행하였다. 유가식 배양의 기질공급은 900 g/L 수크로스를 이용하여 간헐적으로 공급하였다.
그 결과, 배양 60시간째 최종적으로 54.3 g/L의 다당체를 생산하였으며, 수크로스로부터 다당체의 생산수율과 시간당 생산성은 0.208 g/g 수크로스와 0.905 g/L·h를 나타냈다(도 5).
실시예 5. 락토바실러스 루테리 EC01 유래 다당체의 구조 분석
다당체 생산이 증진된 돌연변이 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 생산하는 다당체의 구조 분석을 위해서 13C NMR 및 1H NMR 분석을 수행하였다. NMR 분석을 위한 다당체는 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 유가식 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 준비하였다. 배양 상등액은 에탄올 침전법을 이용하여 3회 침전하여 건조한 후, 중수(D2O)에 10 ㎎/㎖ 농도로 녹여 NMR 분석에 사용하였다.
그 결과, 락토바실러스 루테리 EC01 균주 유래 다당체는 α-1,6 결합 (67.3%)과 α-1,3 결합 (32.7%)으로 구성된 덱스트란(dextran) 구조인 알터난 (alternan)으로 확인되었다(도 6).
실시예 6. 유산균 변이주 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 프로바이오틱스 특성
락토바실러스 루테리 EC01 균주의 프로바이오틱스 특성을 확인하기 위해 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 분석을 하였다. 항산화 활성 분석은 ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능 검사로 나누어 진행하였다. 활성 분석을 위한 대조군 균주로는 상업용으로 사용되는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG ATCC53103 (LGG)를 사용하였다.
6-1. 내산성 및 내담즙성 검사
락토바실러스 루테리 EC01 균주의 내산성 특성을 보기 위해 1 N 염산을 이용하여 만든 pH 2.5의 MRS 액체배지(10 g/L의 프로테오스 펩톤 NO.3, 10 g/L의 쇠고기 추출물, 5 g/L의 효모 추출물, 20 g/L의 덱스트로스, 1 g/L 의 폴리솔베이트 80, 2 g/L의 암모늄 시트레이트, 5 g/L의 소듐 아세테이트, 0.1 g/L의 마그네슘 설페이트, 0.05 g/L의 망가니즈 설페이트, 2 g/L의 디포타슘 포스페이트)를 사용하였다. MRS 액체배지(pH 5.5)에서 배양한 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 pH 2.5의 MRS 액체배지에 1:1 비율로 접종하고 3시간 배양한 후 생균수를 측정하였다. 대조군 균주는 LGG 균주를 사용하였다. 그 결과, 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 pH 2.5에서 3시간 배양 후 121.6%의 생균수를 나타내었으며, LGG 균주는 108.7%의 생균수를 보였다(도 7a).
내담즙성은 0.3% oxgall을 첨가한 MRS 액체배지를 사용하였다. MRS 액체배지에서 배양한 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 0.3% oxgall을 첨가한 MRS 액체배지에 1:1 비율로 접종하고, 37℃에서 24시간 정치 배양 후 0시간과 24시간의 생균수를 비교하였다. 대조군으로 LGG 균주를 사용하였다.그 결과, 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 24시간 배양 후 73.4%의 생균수를 보였고, LGG 균주는 79.3%의 생균수를 보였다(도 7b).
상기 결과를 통해 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 대조군으로 사용한 LGG 균주보다 내산성 및 내담즙성이 더 우수한 것을 확인하였다. 이를 통해 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 내산성과 내담즙성 환경에서 효과를 보이는 프로바이오틱스 균주임을 확인하였다.
6-2. 장내 부착능 및 염증 제어 효과 분석
유산균의 장내 부착능을 확인하기 위해 분화 과정 중 점액을 분비하는 HT-29 세포주를 사용하였으며, 대조군으로는 LGG 균주를 이용하였다. 인간 유래 대장암 세포 HT-29 세포주 배양은 DMEM (dulbeccco's modified eagle medium)에 20% 소혈청알부민(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린, 및 1% 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 활성화된 HT-29 세포주를 24 웰 플레이트의 각 웰 당 5x104이 되도록 로딩한 후 24~48시간 동안 배양하고 여기에 락토바실러스 루테리 EC01 균주 또는 대조군 균주를 1x108 CFU/㎖ 되도록 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 2시간이 지난 후 부착되지 않은 세균을 제거하기 위해 진탕 배양기를 이용하여 PBS를 첨가하여 300 rpm에서 3분 교반하면서 2회 세척하였다. 0.5% Triton X-100을 1 ㎖ 첨가하여 부착된 세균을 떼어낸 후 멸균수를 이용하여 적절히 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 최종적으로 장내 부착능을 측정하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 LGG 균주의 장내 부착능을 1%로 보았을 때 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 장내부착능이 약 2배 높게 측정되는 것을 확인하였다(도 7c).
락토바실러스 루테리 EC01 균주의 염증 제어 효과를 분석하기 위해 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포주를 이용하였다. RAW 264.7 세포주의 배양은 DMEM에 20% FBS, 1% 페니실린, 및 1% 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후, Raw264.7 세포주를 24 웰 플레이트의 각 웰 당 1x105 되도록 로딩한 후 배양하고 24시간 후 LPS (lipopolysaccharide)를 10 ㎍/㎖ 농도로 2시간 동안 처리한 후 여기에 락토바실러스 루테리 EC01 균주 또는 대조군 균주를 1x108 CFU/㎖ 되도록 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이때 양성 대조군은 PBS만을 처리하였고, 음성 대조군은 PBS와 함께 LPS를 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 염증을 유발하였다. 24시간 후 락토바실러스 루테리 EC01 균주 및 대조군 균주를 처리한 배양액을 원심분리하여 상층액 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 옮기로 여기에 동량의 그리스 시약(griess regent) I (sulfanilamide solution)과 그리스 시약 Ⅱ (NED solution)을 동량 넣어 10분간 반응시킨 후 ELISA 리더기를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 음성대조군과 비교해 보면 대조군으로 사용한 LGG 균주보다 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 염증을 제어하는 효과가 높게 나타남을 확인하였다(도 8a).
6-3. 항산화 활성 분석
유산균은 활성산소로부터 자신을 보호할 수 있는 항산화 활성을 가지고 있다고 알려져 있는데 활성산소는 짝을 이루지 못한 전자를 가지고 있어 불안정한 상태의 산소로 인체 내에서 가장 흔하게 발생하는 라디칼이다. 우수한 항산화능을 가지고 있다고 알려진 0.2 mM 아스코르브산(ascorbic acid)을 대조군으로 사용하여 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 ABTS 라디칼 및 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.
ABTS 라디칼 소거능 측정은 7.4 mM ABTS (2,2'-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)를 제조하여 1:1 비율로 섞어준 후 20시간 동안 상온 암실에 방치하여 ABTS 라디칼을 생성하도록 하였다. 그 후, 734 nm에서 흡광도가 0.9 정도가 나오도록 희석하여 이용하였다. 희석된 ABTS 라디칼과 유산균 배양액을 500 ㎕씩 1:1 비율로 섞어 37℃에서 30분간 반응한 후 원심분리하여 상등액을 흡광도 734 nm에서 측정하였다. 대조군은 0.2 mM 아스코르브산과 LGG 균주 배양액을 이용하였다. ABTS 라디칼 소거능 측정결과, 0.2 mM 아스코르브산은 80.11%, LGG 균주 배양액은 87.04%, 락토바실러스 루테리 EC01 균주 배양액은 87.71%의 ABTS 라디칼 소거능을 보였다(도 8b). 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 라디칼 소거능은 LGG 균주의 라디칼 소거능과 유사하며 대조군으로 사용된 0.2 mM 아스코르브산보다 높은 라디칼 소거능을 보였다.
DPPH 라디칼 소거능 측정은 0.2 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picryhydrazy) 용액과 유산균 배양액을 500 ㎕씩 1:1 비율로 섞어주고 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응물을 원심분리하여 상등액을 흡광도 517nm에서 측정하였다. 대조군은 ABTS 라디컬과 동일하게 사용하였다. 측정결과, 0.2 mM 아스코르브산은 84.17%, LGG 균주 배양액은 25.43%, 락토바실러스 루테리 EC01 균주 배양액은 33.83%의 DPPH 라디칼 소거능을 보였다(도 8c). DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능을 비교하였을 때, ABTS 라디칼 소거능이 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있다. 이는 자유 라디칼을 소거하는 정도를 측정하여 항산화능을 측정할 수 있다는 공통점을 가지지만 서로 다른 성질의 라디칼을 가지고 있어 라디칼의 입체 선택성과 같은 요소에 의해 다른 결과가 나온 것으로 보여진다. 기존에 보고된 연구 결과에서도 항산화 활성 측정 시 DPPH 라디칼 소거능보다 ABTS 라디칼 소거능이 더 뛰어나다고 알려져 있다.
실시예 7. 식품 유해 미생물에 대한 항균활성 측정
항균 활성을 조사하기 위해 락토바실러스 루테리 EC01 균주를 MRS 액체배지에 접종하였고 37℃에서 24시간 배양 후, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.45 μm 시린지 필터로 제균한 후, 30K 아미콘을 이용하여 2배 농축하였다. 분리 균주의 상등액을 페이퍼 디스크(6 mm)에 총 200 ㎕ 점적하였고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 억제환의 크기를 측정하였다. 8종의 지시균주를 각각 배양한 후 100배 희석하여 향균활성 측정을 위한 고체배지에 접종하였다. 총 8종의 식품 유해 미생물에 대한 락토바실러스 루테리 EC01의 항균 활성을 측정한 결과, 본 발명의 균주가 다양한 식품 유해 미생물에 대하여 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다(표 3). 락토바실러스 루테리 EC01 균주는 특히 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 및 99999엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)에서 높은 항균 효과를 나타내었다. 이는 GRAS (Generally Recognized as Safe) 미생물인 락토바실러스 루테리 EC01 균주가 미생물 증식 억제제로 사용될 수 있음을 의미한다. 다양한 식품 유해 미생물에 항균 활성을 갖는 락토바실러스 루테리 EC01 균주의 사용은 식품 제조업 분야에서 병원성 미생물에 의한 오염의 문제 해결에 유용하게 사용될 수 있다. 더불어 천연식품 보존제나 사료보존제로서 뿐만 아니라 새로운 항생제 대체 의약소재로의 응용을 기대할 수 있다.
락토바실러스 루테리 EC01 균주의 항균활성
No. 식품 유해 미생물 억제환의 크기
1 Micrococcus luteus KCCM 2177 -
2 Enterobacter aerogenes KCCM 12117 +
3 Listeria monocytogenes KCCM 43155 ++
4 Bacillus cereus KCCM 40935 ++
5 Enterococcus faecalis KCCM 11814 +
6 Escherichia coli KCCM 11234 ++
7 Enterococcus faecium KCTC 3095 ++
8 Escherichia coli ATCC 10798 ++
+ : ＜0.5 cm, ++ :　＞0.5 cm
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15218BP 20221205
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 기탁번호가 KCTC 15218BP인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) EC01 균주.
  2. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 알터난(alternan)의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 균주를 배양하는 단계 이후 균주 배양물로부터 알터난을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 알터난의 생산방법.
  4. 제2항 또는 제3항의 방법으로 생산된 알터난을 유효성분으로 포함하는, 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  5. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스(probiotics) 조성물.
  6. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물에 대한 항균용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 리스테리아(Listeria) 속 미생물, 바실러스(Bacillus) 속 미생물, 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 미생물 및 엔테로박터(Enterobacter) 속 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 병원성 미생물에 대한 항균용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리스테리아 속 미생물은 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)이고, 바실러스 속 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)이고, 에스케리키아 속 미생물은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)이고, 엔테로코커스 속 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)이고, 엔테로박터 속 미생물은 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)인 것을 특징으로 하는, 병원성 미생물에 대한 항균용 조성물.
  9. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  10. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  11. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제.
  12. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
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