KR850001050B1 - 악타플라닌의 가비당체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

악타플라닌의 가비당체의 제조방법
도면 1은 KBr중 항생물질 A-4696 가비당체(pseudo-aglycone) 디하이드로클로라이드의 적외부 흡수 스팩트럼을 타나낸다.
본 발명은 다음 일반식( I )의 신규 항생물질 A-4696 가비당체(pseudo-aglycone) 또는 그의 약학적으로 유효한 산부가염에 관한 것이다.
Figure kpo00001
본 발명은 신규 악타플라닌의 가비당체 유도체와 관려되며 이들은 항생작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 항생물질은 또한 병아리, 돼지, 양 및 육우에서 성장촉진제로 농업적으로 응용된다.
본 발명은 신규 항생물질 및 그의 제조방법에 대해서는 1976년 4월 20일 특허된 미합중국 특허 제39520957호에 기술된 발명에, 항생물질 A-4696에 대해서는 1977년 12월 20일 특허된 미합중국특허 제 4064233호에 기술된 발명에 항생물질 A-4696의 인자 A 및 B에 대해서는 1978년 9월 19일 특허된 미합중국 특허 제 4115552호 및 항생물질 A-4696인자 B1, B2, B3, C1a, C3및 E1에 대해서는 본출원과 동일날자에 동시 출원되어 계류중에 있는 마뉴엘 데보노, 쿠르트 이. 머켈, 로버트 이. 위크스 및 헤롤드 제이. 코울 등의 미합중국특허원 제217962호에 기술된 발명과 관계가 있다.
항생물질 A-4696의 비당체 가수분해 유도체는 상기 인용된 미합중국특허 제4064233호 및 미합중국 특허 제4115552호에 기술되어 있으나 그 가수분해 유도체가 본 발명의 가비당체는 아니었다. 가비당체는 극소량(2% 또는 2 이하)이 선행특허에 기술된 가수분해 방법에 의해 생성되었을 가능성은 있으나 확실하지는 않다. 그러나 이전에 기술된 바와 같은 가수분해 조건은 가비당체 형성을 촉진하지 목하며 만일 항생물질 A-4696가비당체가 생성되었다 하더라도 그 당시에는 알아내지 못했다.
본 발명은 악타플라닌 항생물질 A-4696 복합체와 그의 인자의 새로운 가비당체 가수분해 유도체에 관한 것이다. 악타플라닌 항생물질 A-4696은 악티노플라네스 마주리엔시스(Actinoplanes missourieusis) ATCC31683(기탁번호 : 811216-00816)에 의해 생성되는 글리코펩타이드 항생물질의 복합체이다. 항생물질 A-4696복합체 또는 개별적 구성인자의 약산 가수분해결과 본 발명의 가비당체가 얻어진다. 본 출원의 목적상 항생물질 A-4696 복합체의 구성인자는 분해 생성물을 포함하지 았는다.
상기 일반식( I )의 신규 항생물질 A-4696가비당체 또는 그의 약학적으로 유효한 산부가염은 항생활성을 나타내며 충치, 치은 질병 및 기타 병원성 미생물에 의해 야기되는 건강문제 등의 치료에 유용함이 발견되었다. 그 외에도 본 발명의 할생물질은 병아리, 돼지, 양 및 육우에 있어서 성장촉진제로서 농업적으로도 응용된다.
일반식( I )의 신규 항생물질 A-4696 가비당체는 항생물질 A-4696 복합체 또는 그의 구성인자의 완화한 산 가수분해에 의해 제조된다.
본 발명의 신규 항생물질 A-4696 가비당체는 적당한 산과 염을 형성할 수 잇는 염기성 화합물이다. 예를 들면 항생물질은 항생물질 A-4696 복합체 또는 그의 인자로부터 HCl에 의한 완화한 산 가수분해에 의해 이염화수소산염을 형성시킴으로써 생성된다. 기타 약제학적으로 무독한 염은 그 분야에 공지된 방법을 사용함으로써 제조될 수도 있다.
항생물질 A-4696 복합체의 완화한 가수분해 생성물의 바이오오토그라피에서는 원 물질의 소멸과 동시에 항생물질 A-4696 가비당체의 신속한 출현을 나타낸다.
본 발명의 가비당체의 한균스펙트럼은 모복합체의 항균스펙트럼과 거의 동일하다.
디하이드로클로라이드 염으로서의 항생물질 A-4696 가비당체는 약 270℃의 탄화점을 가지는 백색 결정성 화합물이다. 이는 물에 용해할 수 있으며 메탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 피리딘, 벤젠, 지방족탄화수소류 같은 용매에는 불용성이다.
이것은 pH 약 1.2 내지 9.5 범위 및 약 35 내지 85℃의 온도에서 안정하다.
항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드(C66H61O20N8Cl·2HCl6H2O)의 운소분석 수치는 다음과 같으며 나머지 값은 산소값이다.
Figure kpo00002
항생물질 가비당체 A-4696 디하이드로클로라이드의 메탄올중 자외부 흡수 최대치는 279nm에서 63.6의 E1% 1cm를 가진다.
KBr중 항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드의 적외부 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 1에 나타나 있다. 4000 내지 700cm-1의 범위에 걸쳐 관찰된 구별될 수 있는 흡수 최대치는 다음과 같다. 3374, 브로드, 3220, 1728, 1659, 1617, 1592, 1546, 1509, 1489, 1461, 1431, 1355, 1288, 1229, 1208, 1175, 1126, 1103, 1071, 1058, 1014, 986, 897, 880, 843, 816, 767, 731, 710cm-1
그 분야에 공지된 방법을 사용하여 항생물질 A-4696 가비당체의 약학적으로 무독한 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등의 무기산을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 산의 항생물질염은 예를 들면 항생물질 유리염기 용액을 원하는 산으로 산성화한 뒤 용액에 아세톤을 넣어 염을 침전시킴으로써 제조될 수 있다. 염은 마찬가지로 어떤 경우에는 이온교환 칼럼상에서 이온교환에 의해 제조될 수도 있다. 항생물질염의 기타 공지된 제조방법이 사용될 수도 있다.
신규항생물질 A-4696 가비당체는 인간, 동물 및 식물에 병원성인 많은 미생물 유기체의 성장에 대한 억제작용을 가지며 따라서 이러한 유기체의 성장억제에 유용하다. 디하이드로클로라이드로서의 항생물질 A-4696 가비당체가 예로든 유기체의 성장을 억제하는 수준이 아래 표 1에 나타나 있다. 억제수준은 한천희석시험법에 의해 결정되었으며 최소억제농도(MIC), 마이크로그램/밀리리터(mcg/㎖)로 설명된다.
한천희석 시험에서 시험유기체는 한천중 여러가지 농도의 항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로콜로라이드를 함유하는 한천 평판상에 도말 또는 이식시킨다. 시험평판을 37℃에서 48시간 배양시키며 MIC는 시험유기체의 성장이 억제된 항생물질의 최저농도를 가지는 평판으로서 결정된다.
결과는 다음과 같다.
[표 1]
Figure kpo00003
위 데이타로 알 수 있는 바와 같이 항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드는 유효한 항박테리아제 항균제이다, 따라서 항생물질 A-4696 가비당체 또는 그의 산부가염을 적당한 치약, 겔, 분말 등이나 적당한 구강세척제 또는 기타 경구 위생제제에 함유시키는 것을 박테리아 작용과 관련되는 충치 및 치주질환(齒周疾患)의 진행억제에 유용한 방법을 제공한다. 또한 항생물질 A-4606 가비당체 또는 그의 산부가염의 적당한 농도용액은 적당한 면봉법을 사용하여 치은 및 치아의 표면에 적용될 수 있다.
항생물질 A-4696 가비당체는 또한 성장촉진 작용도 나타내며 가금, 돼지, 양 및 육우에서 성장속도를 촉진시키고 영양효율을 증가시킨다. 예를들면 가금 및 돼지에게 본 발명의 항생물질을 일일 체중당 약 0.5mg 내의 약 25mg/kg의 양으로 섭취시키면 활성제를 가하지 않은 동일한 기본식량을 먹인 동물이 나타내는 것보다 더 빠른 성장 및 더 큰 영향효율을 가져온다.
"기본식량"이라 함은 동물의 총사료 섭취량을 말하며 여러가지 사료, 농축물, 보충물, 무기물, 비타민 또는 약물 예비혼합물, 섬유질 함유사료 및 동물의 식이 필수물을 함유하는 물질 등으로 구성된다. 가금 및 돼지에 대한 대표적 기복식량은 미합중국특허 제 4115552호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 중요 태양(態樣)에서 항생물질 A-4696 가비당체 또는 그의 적당한 산부가염은 적당한 사료중 총사료 톤당 약 2 내지 200그람의 양으로 경구투여되어 증가된 영양효율 및 성장촉진 작용을 나타낸다. 동물사료에 본 발명의 활성항생물질의 첨가는 예비혼합물 파운드당 약 1 내지 100그람의 항생물질 A-4696 가비당체 또는 그의 산부가염을 함유하는 적당한 예비혼합물(예를 들면 미합중국특허 제4115552호에 기술되어 있다)을 제조함으로써 바람직하게 수행된다. 이어서 수득된 예비혼합물을 최종량으로 배합한다. 또한 중간농축물이나 활성제를 함유하는 사료보충물을 사료중에 혼합한 수 있다.
신규 항생물질 A-4696 가비당체는 여러가지 다른 면에서도 유용하나 특히 항생물질로서 유효하다. 이런 형태의 작용을 나타내는 물질들은 충치 및 치은질환의 치료뿐 아니라 기타 세균과 관련된 건강문제의 치료에 반드시 필요하다.
신규 항생물질 A-4696 가비당체는 이에 함유된 인자들 중 어떤 인자의 완화한 산가수분해에 의해서도 생성될 수는 있으나 항생물질 A-4696 복합체의 완화한 산가수분해에 의해 가장 잘 생성된다. 항생물질 A-4696 복합체는 악티노플라네스(Actinoplanes)속의 유기체를 배양배지가 상당한 항생활성을 가질 때까지 적당한 배양배지 중에서 호기성 조건하에 배양시킴으로써 수득될 수 있다. 항생물질은 그 분야에서 통상 사용되고 이해되는 여러가지 분리 및 정제방법에 의해 회수될 수 있다.
항생물질 A-4696 가비당체의 제조용 출발물질로 융용한 항생물질 A-4696 복합체의 제조에 사용되는 미생물은 악티노플라나세아에(Actinoplanaceae)과의 악티노플라네스 미주리엔시스 군주로서 확인되었다. 악티노플라나세아에는 다음 참조문헌에서 닥터 존.엔.키우치에 의해 최초로 기술되었던 방선균(Actincmycetales)목의 미생물과이다.
[Juor. Elisha Mitchell Sci. Soc. 65, 315-318(1949) ; 및 66,87-92(1950) ; Trans. New York Acad Sci., 16, 315-318(1954) ; Juor. Elisha Mitchell Sci. Soc.71, 148-155 및 269(1955) ; Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7th Edition, 825-829(1957) 및 Juor. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53-70(1963) 참조].
항생물질 A-4696 출발물질의 제조에 유용한 악티노플라네스 미주리엔시스 균주는 메릴랜드, 록크빌, 스톡칼춰클렉션에 기탁되어 그 일부를 구성하고 있으며 이곳으로부터 ATCC 31683의 번호로 제한없이 대중에게 이용될 수 있다.
악티노플라네스 미주리엔시스 균주 ATCC 31683은 다음 단락에서 밝혀진 바의 물리적 및 배양성질로 특징지워진다.
균주는 미합중국특허 제4115552호에 이미 기술되어 있는 ATCC 23342로부터 일련의 돌연변이에 의해 유도된다. 본 군주는 유사한 기질 도는 균사를 생성하며 형태는 모균주의 형태와 거의 구별할 수 없다. 어떠한 공중 2차균사도 포자낭도 관찰되지 않으며 더우기 화분(花粉)상의 성장과 같은 기술도 마찬가지로 어떠한 포자낭을 생성하지 못한다.
균주 ATCC 31683의 분류학적 연구에 사용되는 방법은 그 분야의 숙련가들에게는 잘 알려져 있으며 대부분은 쉴링과 곳트립에 의해 다음 문헌에 기술된 인터내셔날 스트렙토 마이세스 프로젝트[International Spertomyces Project (ISP)]에 추천된 방법이다. [1966, Interen. J. of Systematic Bacteriol. 16(3) : 313-340]
효소결정은 블라제빅과 에더러의 방법[1975, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic, Microbiology, John Wiley and SonsSonsInc., New York]에 따라 수행되었으며 색명, 약어 및 번호는 켈리와 쥬드의 ISCC-NBS 방법(1976, The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No.2106, U.S.Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington D.C.)을 사용하여 배정되었다. 리소질내성과 카제인, 에스큐린, 하이포크산틴, 티로신 및 크산틴의 분해는 베르그의 방법을 사용하여 측정되었다(1973, Appl. Microbiol. 25 : 665-681). 탄소이용을 연구 또한 완성되었으며 다음과 같이 채점된다.
++=글루코오즈 대조와 같거나 그 이상이다 : 양성이용율
+=글루코오즈 대조보다 낮다. 무탄소 대조보다 높다 : 양성이용율
(+)=성장의 심, 확실치 않은 이용율
=전혀 성장하지 않음 : 음성이용율
따라서 본 발명의 악티노플라네스 군주의 배양상 및 생리학상 특징을 포함하는 분류학적 기재사항이 다음표 형태로 주어진다.
악티노플라네스 균주 ATCC 31683의 일반적 배양 및 생리학적 특성
Figure kpo00004
Figure kpo00005
* 멸균탄수원은 최종농도 1.0%가 되도록 가한다.
악티노플라네스 미주리엔시스 균주 ATCC 31683은 여러가지 다른 배양배지중 어느 하나에서도 성장할 수 있다. 그러나 항생제 출발물질의 제조비용상 최대수율상 및 분리용이상 특정한 배양배지가 바람직하다. 따라서 예를 들면 전분은 바람직한 탄수화물원중 하나이며, 효모는 바람직한 질소원중 하나이다. 사용될 수 있는 기타 탄수화물원에는 당밀, 글루코오즈, 덱스트린, 글리세롤 등이 포함된다. 질수원에는 아미노산 혼합물, 펩톤 등이 포함된다.
배양배지에 함유될 수 있는 영양무기염에는 나트륨, 칼륨암모니아, 칼슘, 인산염, 염화물, 황산염 등의 이온을 생성할 수 있는 통상의 염류가 포함된다. 부가해서, 증류가용물 및 효모추출물같은 성자인자원 등은 항생물질 A-4696의 제조에 유리한 효과를 갖도록 함유될 수 있다.
기타 미생물의 성장 및 발육에 필요한 것과 마찬가지로 본 발명에 사용되는 악티노플라네스속 성장용 배양배지에는 필수미량원소가 함유되어야 한다. 이러한 미량원소는 배지의 기타 성분첨가에 부수되는 불군물로서 보통 공급된다.
가비당체 제조용 항생물질 A-4696을 제조하는데 사용되는 유기체는 비교적 넓은 pH 범위에서 성장할 수 있다. 그러나 약 6.5 내지 7.0 사이의 pH를 가지는 배지중에 유기체를 배양하는 것이 바람직하다. 기타 방선균족과 마찬가지로 성장배지의 pH는 성장기간 동안 서서히 변화하며 발효기말의 pH는 보통 약 -6.5 내지 7.5 범위에 있다.
심부호기성 배양조건이 항생물질 A-4696 출발물질 제조에 바람직하다. 비교적 소량의 항생물질은 진탕 플라스크에 배양에 의해 제조될 수 있다. 그러나 대량제조를 위해서는 멸균탱크 중 심부호기성 배양이 바람직하다. 멸균탱크에서 배양배지는 균사 단편현탁액으로 접종시킬 수 있다.
따라서 비교적 소량의 배양배지를 유기체의 균사 단편으로 접종함으로써 유기체의 영양접종물을 제조하며 어린 활성영양 접종물이 수득되면 이를 대형탱크에 무균적으로 옮기는 것이 바람직하다. 영양접종물이 성장하는 배지는 기타 배지들이 사용될 수 있으나, 대규모 제조에 이용되는 것과 동일한 것일 수 잇다.
악티노플라네스 미주리엔시스 균주 ATCC 31683은 항생물질, A-4696 출발물질의 대부분 양의 약 30℃의 온도에서 생성되는 것 같기는 하나 20℃와 40℃사이의 온도에서 성장한다.
심부호기성 배양방법에서는 배양배지를 통해 멸균공기를 불어 넣는다. 배양배지에 불어 넣은 공기의 양은 배양배지 용량당 약 0.1 내지 1.0 용량의 공기/분이다. 가장 효과적인 성장 및 항생물질 제조는 공기양이 배지용량당 최소 1/2 용량의 공기/분일 때이다.
배양배지 중 항생활성의 생성속도 및 농도는 성장기간 중 항생물질에 감수성이 있는 것으로 알려진 유기체에 대해 항생활성을 위한 발효육즙 시료를 시험함으로써 추적될 수 있다. 이와 같은 유용한 검정유기체는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이다. 생물학적 검정은 표준 컵-평판법에 의하거나 한천평판상 페이퍼 디스크 검정에 의해 수행될 수 있다.
일반적으로 항생물질의 최대생성은 진탕 플라스크 또는 심부호기성 배양발효에서 약 4 내지 6일 이내에 일어난다.
항생물질 A-4696 가비당체 제조용 출발물질로서 유용한 항생물질 A-4696은 배양배지로부터 회수되어 존재할 수 있는 기타의 물질로부터 흡착법 및 추출법에 의해 분리될 수 있다. 흡착기법은 추출법에서 요구되는 대량에 용매사용을 피할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명의 항생물질 A-4696 가비당체는 다음 실시예에 의해 더 설명된다.
[제조실시예 1]
항생제 A-4696 가비당체 제조를 위해 출발물질로 사용된 항생제 A-44696 복합체 및 개별적 구성인자의 제법
A. 진탕플라스크 발효
균주 ATCC 31683로 설명되는 약티노플라네스 미주리엔시스의 균사단편을 다음 조성을 가지는 영양 한천 사면상에 접종시킨다.
Figure kpo00006
ATCC 31683로 접종시킨 사면배지를 30℃에서 6일간 배양시킨다. 배양균은 포자를 형성하지 않으므로 균사뭉치를 멸균피펫으로 침연(浸軟)시키는 것이 필요하다. 침연된 성숙 배양균을 멸균증류수로 완전히 덮은 뒤 피펫이나 멸균봉으로 조심스럽게 긁어서 균사현탁액을 얻는다.
이와같이 수득된 균사 현탁액은 다음 조성을 가자는 멸균영양배지 100㎖를 접종하는데 사용된다.
Figure kpo00007
* 뉴트리소이플라우어는 일리노이 62526 덱카투어 4666 파리스 파크웨이, 아커 다니엘스 미들랜드 캄파니로부터 수득.
접종된 영양배지를 250rpm으로 작동하는 회전진탕기상에서 30℃에서 48시간 동안 성장시킨다. 10㎖의 접종된 영양배지를 다음 조성을 가지는 100㎖의 멸균 "범프(bump)" 배지에 접종시킨다.
Figure kpo00008
* Sag 471은 일리노이스 60606 시카고 리버사이드 플라자 120 유니온 카바이드 캄파니로부터 수득될 수 있는 기지의 실리콘 발포억제제이다.
접종된 "범프"배지를 250rpm으로 작동하는 회전진탕기 상에서 일정하게 진탕시키면서 30℃에서 24시간동안 배양시킨다.
4/10㎖의 "범프"배지를 500㎖의 삼각플라스크중에 함유된 다음 조성을 가지는 100㎖의 제조배지에 접종시키고 121℃에서 30분간 멸균시킨다.
Figure kpo00009
* 프로플로는 텍사스 76101 포르트워스 피. 오. 박스 1837 트레이더스 오일일 캄파니 트레이더스 프로테인 디비젼으로부터 수득.
제조발효액을 250rpm으로 작동하는 회전진탕기상에서 30℃의 온도로 약 96시간 동안 진탕시킨다. 발효회로 말의 pH는 약 8.0이다.
B. 40-리터 탱크 발효
접종물의 제조는 상기 A항에서 상술된 "범프(bump)" 배지의 배양을 거쳐 진행된다. 상기에서 개괄된 25ℓ의 제조배지를 121℃에서 30분간 고온고압 증기멸균시킨 뒤 40ℓ의 발효탱크에 넣는다. 100㎖의 접종된 "범프"배지를 멸균 제조배지에 접종시킨다.
접종된 제조배지를 30℃에서 4일 동안 발효시킨다. 발효시 배양배지 용량당 1분에 약 1/2 용량의 멸균공기를 통한다. 발효하는 제조배지를 적당한 크기를 추진기를 이용하여 적당한 rpm에서 회전하여 공기를 배지와 적당히 혼합하도록 하는 혼합기로 진탕시킨다.
배양배지의 pH는 발효가 진행됨에 따라 약 6.5-1 초기 수준에서 약 8.0으로 점차 증가된다.
C. 항생물질 A-4696 복합체의 분리
상기에 따라 제조된 발효육즙(3800ℓ)을 5%(w/v) 여과보조물(셀라이트 545)을 첨가한 뒤 여과한다. 여과케익을 탈이온수(3600ℓ)에 재현탁시키고 수성 현탁액의 pH를 수산화나트륨 수용액을 사용하여 10.5로 조정한다. 현탁된 고체를 여과해서 분리시킨 뒤 물로 세척한다. 여액 및 세액을 합치고 결과로 생긴 용액을 20%(w/v) 수성황산을 사용하여 pH4.5로 산성화시킨다.
산성용액을 1% 여과보조물(셀라이트 545)을 사용하여 여과시켜 맑은 용액으로 한다. 무명용액을 350ℓ의 앰버라이트 IR-116(Na+형)를 함유하는 칼럼(1.8+5피이트)을 통과시키고 칼럼을 탈이온수(1200ℓ)로 세척한다. IR-116수지를 칼럼으로부터 제거시키고 수산화나트륨수용액(총 1000ℓ)을 사용하여 pH 10.5에서 배취식으로 용출시킨다. 수지용출액을 20%(w/v) 수성황산으로 중화(pH 7)시킨 뒤 탈이온수(총 150ℓ)로 3회 세척한다. 수성세액을 중화시키고 중화된 용출액과 합친다. 결과로 생긴 용액을 농축시킨 뒤 동결 건조시킨다. 조(組) 복합체의 제조액은 색에 있어 황갈색부터 암갈색까지 다양하다.
D. 조(組) 항생물질 A-4696 복합체로부터 염류의 제거
조 복합체(1.0kg)을 심하게 교반하면서 탈이온수(1.5ℓ)에 서서히 가한다. 생성된 현탁액을 20분간 교반한뒤 10% 수산화암모늄 수용액을 사용하여 중화(pH 7)시킨다. 불용성 항생물질 A-4696 복합체를 진공여과에 의해 분리해서 탈이온수로 세척하고 동결건조시킨다.
건조 탈염시킨 복합체를 약 80% 수율(생물학적 활성에 근거)로 회수한다.
E. 탈염 항생물질 A-4696 복합체의 정제
건조 탈염된 복합체(300g)을 탈이온수(2ℓ)에 현탁시키고 현탁액의 pH를 3N 수성염산을 가해 pH 2.7로 조정한다. 산성화된 용액을 2500rpm에서 40분간 원심분리시킨다. 상등액을 경사시켜 6ℓ의 탈색수지(Duolite 761)를 함유하는 칼럼(8×85cm)에 붓는다. 항생물질을 탈이온수를 사용하여 30㎖/분의 유출속도로 용출시킨다.
용출은 박층크로마토그라피로 검정한다. 항생물질 A-4696을 함유하는 유출액을 농촉(3mm, 35℃)시켜서 3ℓ 용량으로 하여 동결건조시킨다. 탈색된 복합체를 백색 내지 황갈색 고체로서 약 70% 수율(생물학적 활성에 근거)로 회수한다.
F. 개별 항생물질 A-4696 인자의 분리
건조 탈색된 항생물질 A-4696복합체(10g)를 약 100㎖ 증류수에 용해시킨다. 생성된 수성용액을 여과하고 역상흡착제 예를 들면 정지상으로서 Li 크로프레프RRP-18*(* 독일 다린슈타트 이. 메르크로부터 구입할 수 있음) 및 이동상으로서 트리에틸아민포스페이트를 함유하는 수성아세토니트릴 변화율을 사용하여 칼럼크로마토그라피시켜 분리한다. 그 분야의 숙련가들은 특정한 발효조성에 따라 아세토니트릴 농도변화울을 변화시키는 것을 이해하고는 있으나 바람직한 농도변화는 10 내지 40%이다.
칼륨유출액은 UV-활성도로 검지하고 개별인자를 함유하는 획분을 모은다. 아세토니트릴을 고진공하 증발 제거시키고 결과로 생긴 수성용액을 동결 건조시킨다. 동결건조된 크로마토그라피 획분을 증류수에 재용해시키고 역상 흡착제 예를 들면 Sep pakRC18 카트릿지**(매사츄세츠, 밀포드, 워터스 어쏘시에이츠인크로부터 구입할 수 있음)상에 흡착시키고 수성 메탄올로 용출시킨다. 개별 항생물질 A-4696 성분을 함유하는 수성용액을 증발 건조시키고 정제된 항생물질 A-4696 인자를 건조 무정형 고체로서 회수한다.
[실시예 1]
항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드염의 제조
제조실시예 1A-E의 방법에 따라 제조된 2.0g의 항생물질 A-4696 복합체를 50㎖의 5% 메탄올성 염산에 용해시키고 70분간 환류시킨다. 반응혼합물을 감압하 35 내지 40℃에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 소량의 물로 희석하고 고체를 형성시킨 뒤 여과에 의해 분리한다. 고체를 공기중 건조시키고 소량의 메탄올에 용해시킨 뒤 입상고체가 형성될 때까지 아시토니트릴을 가하여 재침전시킨다. 원하는 생성물을 여과하여 건조시키고 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)시키면 단일한 균질생성물임을 알 수 있다. 원하는 생성물의 확인 및 구조는 혈장탈착 질량스펙트로스코피, 양자핵질량 공명 및 원소분석에 의해 확인된다.
항생물질 A-4696가비당체 디하이드로클로라이드 염은 항생물질 A-4696 복합체에 함유된 개별적 구성인자 또는 구성인자의 혼합물의 완화한 산가수분해에 의해 제조되기도 한다. 항생물질 A-4696 가비당체의 연속제조용 출발물질로 유용한 여러가지 개별 항생물질 A-4696인자의 분리는 항생물질 A-4696인자, B1, B2, B3, C1a, C3, 및 E1에 대해서 본 출원과 같은 날자에 동시출원되어 현재 계류중인 마뉴엘 데보노, 쿠르트 이. 머켈, 로버트 이.위크스 및 헤롤드 제이. 코올의 미합중국특허원 제217962호에 지적되어 있다. 또 다른 분리 및 단리방법은 제조실시예 1F에 기술되어 있다. 항생물질 A-4696 복합체중에 함유된 여러 구성인자의 개별체 또는 혼합물로부터 항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드 염의 제조는 상기 기술된 항생물질 A-4696 복합체로부터 직접 가비당체를 제조하는 것과 거의 동일하다.
항생물질 A-4696 인자의 개별체 또는 혼합물로부터 제조된 원하는 생성물의 확인은 혈장탈착 질량스펙트로스코피, 양자핵 질량공명 및 원소분석에 의해 확인된다.
디하이드로클로라이드 염으로서의 항생물질 A-4696 가비당체는 약 270℃ 탄화점을 가지는 백색결정성 화합물이다. 이것은 물에 가용성이며 메탄올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 피리딘, 벤젠, 지방족탄화수소류등과 같은 용매에는 불용성이다. 이것은 약 1.2 내지 9.5의 pH 범위 및 약 35 내지 85℃의 온도에서 안정하다.
항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드(C66H61O20N8Cl·2H6ClH2O)의 원소분석수치는 다음과 같으며 나머지 값은 산소값이다.
Figure kpo00010
항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드의 메탄올중 자외부 흡수 최대치는 279nm에서 63.6의 E1% 1cm를 가진다.
KBr 중 항생물질 A-4696 가비당체 디하이드로클로라이드의 적외부 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 1에 나타나 있다. 4000 내지 700cm-1의 범위에 걸쳐 관찰된 구별될 수 있는 흡수 최대치는 다음과 같다 : 3374, 브로드, 3220, 1728, 1659, 1617, 1592, 1546, 1509, 1489, 1461, 1431, 1355, 1288, 1229, 1208, 1175, 1126, 1103, 1071, 1058, 1014, 986, 897, 880, 843, 816, 767, 731, 710cm1
[실시예 2]
항생물질 A-4696 가비당체 설페이트염의 제조
제조실시예 1A-E의 방법에 따라 제조된 2.0g의 항생물질 A-4696 복합체를 50㎖의 5% 메탄올성 황산에 용해시키고 70분간 환류시킨다. 잔류물을 소량의 물로 희석하여 고체를 형성시킨 뒤 여과에 의해 분리한다. 고체를 공기중 건조시키고 소량의 메탄올에 용해시킨 귀 입상고체가 형성될 때까지 아세토니트릴을 가하여 재침전시킨다. 원하는 생서울을 여과하여 건조시키고 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)시키면 단일한 균질생성물임을 알 수 있다. 원하는 생성물의 확인 및 구조는 혈장탈착 질량스펙트로스코피, 양자핵질량 공명 및 원소분석의해 확인된다.
항생물질 A-4696 가비당체 설페이트염을 항생물질 A-4696 복합체에 함유된 개별적 구성인자 또는 구성인자의 혼합물의 완화한 산가수분해에 의해 제조되기도 한다. 항생물질 A-4696 가비당체의 연속제조용 출발물질로 유용한 여러가지 개별 항생물질 A-4696 인자의 분리는 실시예 1 및 제조실시예 1F에 기술되어 있다. 항생물질 A-4696 복합체 중에 함유된 여러 구성인자의 개별치 또는 혼합물로부터 항생물질 A-4696 가비당체 설페이트염의 제조는 상기 기술된 항생물질 A-4696 복합체로부터 직접 가비당체를 제조하는 것과 거의 동일하다.
항생물질 A-4696 인자의 개별적 또는 혼합물로부터 제조된 원하는 생성물의 확인은 혈장탈착 질량스펙트로스코피, 양자핵질량 공명 및 원소분석에 의해 확인된다.

Claims (3)

  1. 항생제 A-4696 복합체 또는 복합체내의 구성인자를 약산 가수분해시킴을 특징으로 하여 다음 일반식( I )의 A-4696 가비당체 또는 그의 약학적으로 유효한 산부가염을 제조하는 방법
    Figure kpo00011
  2. 제 1 항에 있어서, 산부가염이 디하이드로클로라이드인 일반식( I )의 A-4696 가비당체를 제조하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 산부가염이 설페인트인 일반식( I )의 A-4696 가비당체를 제조하는 방법.
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