JPH0370719B2

JPH0370719B2 -

Info

Publication number: JPH0370719B2
Application number: JP59263889A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Kikuchi; Nobuhiro Yajima; Mitsuru Niwano; Kunio Sasaki; Shinji Shimizu; Nobuo Myata
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1984-12-14
Filing date: 1984-12-14
Publication date: 1991-11-08
Also published as: JPS61141895A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、生理的活性を有する新規な核酸系高
分子物質及びその製造方法に関する。技術的背景近年、担子菌類やその他の微生物を利用して蛋
白質（ペプチドを含む）、多糖類及び蛋白質含有
多糖類から成る種々の抗腫瘍性物質を製造するこ
とが提案されており、それらのうちには実用化さ
れているものもある。本発明者は、微生物が生産する種々の物質の生
理的活性について検討している過程で、アクチノ
マジユラ属に属する微生物が生産する核酸系高分
子物質が優れた抗腫瘍活性及び抗菌活性を示すこ
とを見出し、本発明をなすに至つた。発明の目的本発明は、アクチノマジユラ属に属する微生物
を利用して、抗腫瘍活性及び抗菌活性のような生
理的活性を有する核酸系高分子物質を提供するこ
とを目的とするものである。以下本発明を詳しく説明する。発明の構成本発明に係る核酸系高分子物質は、その構成成
分としてデオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重
量％、リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖
（全還元糖として）15乃至17重量％及びアミノ酸
2.5重量％以下を含有していて、下記の理化学的
諸性質により特徴づけられる。分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
ル濾過性により、２モル塩化カリウム−0.05モ
ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
（蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
（蛋白質換算）に増大する、溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
性水溶液で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青紫
色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜紫外部及び可視部吸収スペクトル：第１図に
示すとおり。すなわち、中性水溶液中で256〜258nｍ及び
僅かに505と540nｍに吸収を有し、かつ0.1規定
苛性ソーダ水溶液中で256〜258nｍ及び僅かに
560と600nｍに吸収を有する。赤外部吸収スペクトル：第２図に示すとお
り。すなわち、3400，2950，2350，1980，
1700，1650，1075，930，670及び520の波長
（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠剤法
による）。呈色反応：ニンヒドリン反応陽性ブリツクス反応陰性エルソン・モルガン反応陰性ホーリーローリー反応陰性ジフエニルアミン反応陽性オルシノール反応陽性アンスロン反応陽性フエノール硫酸反応陽性過マンガン酸カリウム反応陽性、分解点：＞235℃ また、本発明は、アクチノマジユラ属
（Actinomadura）に属する微生物を培養し、
培養物から上記核酸系高分子物質を製造する方
法もその特徴的事項として包含するものであ
る。問題点を解決するための手段本発明の核酸系高分子物質（以下SN−07物質
と称する）は上述したような構成成分を含有する
ものであつて、デオキシリボ核酸（DNA）はシ
ユナイダー（Schneider）法に基づくジフエニル
アミン反応により定量したものであり、リボ核酸
（RNA）はシユナイダー法に基づくオルシノール
反応により定量したものである。また、糖はフエ
ノール硫酸法により全還元糖として、及びアミノ
酸はアミノ酸分析計による分析値としてそれぞれ
測定したものである。なお、アミノ酸分析計によ
るアミノ糖は検出されない。因みに、SN−07物質は、あたかも核酸様高分
子物質と活性物質が共存しているかのようにみえ
たが、あらゆる分離、精製法を適用したにもかか
わらず、その分画は不可能である。また、SN−07物質について上記性質のうち、
紫外部吸収スペクトルは中性水溶液中で256〜
258nｍ及び僅かに505と540nｍに吸収を有し、か
つ0.1規定苛性ソーダ水溶液中で256〜258nｍ及び
僅かに560と600nｍに吸収を有する（第１図参
照）。赤外部吸収スペクトルは3400，2950，2350，
1980，1700，1650，1075，930，670及び520の波
長（cm^-1）に吸収を有する（第２図参照）。なお、SN−07物質は、赤桃色の色調を呈する
無定形粉末であつて、中性水溶液中で赤桃色を呈
し、アルカリ性水溶液中で青紫色を呈し、酸性水
溶液中では沈澱を生ずる。 SN−07 物質の調製：本発明に係るSN−07物質は、アクチノマジユ
ラ属に属する微生物を培養することにより調製し
得る。本発明で利用する上記微生物は、神奈川県の土
壌より新たに分離したものであつて、その菌学的
性質を分離株（SN−07と称株する）について説
明すると下記のとおりである。因みに、SN−07
株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第7890号（FERM Ｐ−7890）として寄託され
ている。 (1) 形態上の性質基中菌糸は、よく分枝して伸張し、通常の条
件下では、分断しない。気菌糸は、オートミー
ル寒天培地（ISP No.３）の培地上で豊富に着
生し、胞子形成も良好である。気菌糸の分枝は
単純分枝であつて、車軸分枝はみられない。胞
子のう、菌核、鞭毛胞子は観察されない。気菌
糸の先端の胞子の連鎖は１〜1.5回転しており、
10〜15ケの胞子が観察される。電子顕微鏡下での観察では、胞子は円筒型〜
卵型であつて、0.4〜0.6×0.6×1.0ミクロンの
大きさを有し、胞子表面は平滑状である。 (2) 各種培地上の生育状態各種培地で28〜30℃の温度に14〜21日間培養
した結果、SN−07株は、オートミール寒天培
地、酵母エキス・麦芽エキス寒天培地及びペプ
トン・酵母エキス・鉄寒天培地には生育する
が、他の寒天培地上での生育はきわめて不良で
ある。そこで、培地組成としてオートミール又
は酵母エキスを欠いている培地に対しては酵母
エキスを0.1％になるように添加したものでの
生育状態を観察した。結果は表１に示すとおり
である。

【表】つて示した。
(3) 生理的性質 () 生育温度：オートミール寒天において20
〜45℃の温度範囲で生育し、25〜41℃におい
て良好に生育し、特に32〜40℃での生育が速
い。 () ゼラチンの液化：陰性 () デンプンの分解：陽性 () 脱脂乳のプトン化：陽性同上凝固：陽性 () メラニン様色素の生成：陰性 () 硝酸塩の還元：陽性 (4) 炭素源の同化性シユクロース・硝酸塩寒天培地（Waksman
No.１）からシユクロースを除去して、代わり
に酵母エキス0.1％を添加したものを基礎培地
として用い、それに各種炭素源をそれぞれ0.1
％添加したものについての同化性を観察した。Ｄ−グルコース同化するＤ−フラクトース同化するＤ−キシロース同化するＬ−アラビノース同化するＩ−イノシトール同化するサリシン同化するシユクロース稍々同化するも不明確Ｄ−マンニトール同化せずＬ−ラムノース同化せずラフイノース同化せず (5) 細胞壁組成ベツカー等の方法（Appl.Microbiol.、12，
421〜423、1964）及びルシバリエ等の方法
（Inter.J.of Systematic Bacteriology 20、
435〜443、1970）により分析した。 () 全細胞中の２，６−ジアミノピメリン
酸：メソ型 () 全細胞中の糖：グルコース、マンノース
の他に少量のマジユロースを含み、アラビノ
ース、キシロースを含まない。上述した性状からみて、SN−07株は形態的に
はストレプトミセス属（Streptomyces）に類似
するが、細胞壁中にメソ型２，６−ジミノピメリ
ン酸を含むことからストレプトミセス属とは明り
ように区別され、また、細胞壁中の糖にアラビノ
ースを含まないことからノカルデイア属
（Nocardia）とも区別される。したがつて、これらの重要な性質上の特徴か
ら、SN−07株はアクチノマジユラ属
（Actinomadura）に属する菌株であることが判
明した。なお、野々村等のアクチノマジユラ属の
分類「J.Ferment.Technol.、49（11）904〜912
（1971）」によると、５種類の菌株が記載されてい
る。これらのうち、アクチノマジユラ・ロゼオヴ
イオラセア（Actinomadura roseoviolaceae）
がSN−07株と比較的類似しているが、各種培地
での生育状態、炭素源の利用及びデンプン分解性
等の点で若干相違が認められるので、SN−07株
については種の確定には至らず、したがつて、本
菌株をアクチノマジユラ・スピーシーズ
（Actinomadura sp.）SN−07と命名した。而して、SN−07株は他の放線菌の場合と同様
に、その性質が変化し易く、人工的変異処理で容
易に変異し得るので、いずれの変異株であつても
SN−07物質の生産能を有する菌株はすべて本発
明において利用し得るものである。上記Actinomadura sp.を利用してSN−07物質
を調製するには、該菌株を、通常の微生物が利用
し得る公知の栄養源を含有する培地中で培養す
る。培地としては、例えば、グルコース、グリセリ
ン、デンプン、デキストリン、オートミール、マ
ルトース、シユクロース、その他の糖類、及び油
脂類等を炭素源として含み、大豆粉、綿実粕、肉
エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンステイー
プリカー、落下生粉、カゼイン、アンモニウム
塩、硝酸、尿素等を窒素源として含み、その他必
要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン
酸塩等の無機塩類を添加したものを用い得る。培養方法としては、一般に行なわれる放線菌の
培養方法と同様に好気的条件下での液体深部培養
が適している。また、培養条件としては、25〜37
℃、好ましくは28〜34℃の温度で振とう培養もし
くは通気培養を行なうとよく、２〜４日の培養で
目的とするSN−07物質が最高濃度で産生するに
至る。因みに、培養物中のSN−07物質の検出には、
大腸菌の薬剤高感受性変異株（Eschericha coli
BE1186）を用いるペーパーデイスク平板法又は
ヒーラ（Hela）細胞による細胞培養法によつて
行なう。上記培養により得られた培養物からSN−07物
質を採取するに当つては、塩析、溶剤抽出、吸着
剤による処理、イオン交換処理、ゲル濾過法等を
適用して抽出及び精製を行なう。例えば、培養物を濾過もしくは遠心分離などに
より菌体固形分を分離して得られた濾液に硫酸ア
ンモニウム等の塩析剤を用いて塩析し、得られた
SN−07物質を含む沈澱物を濾取し、これを水又
は緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液
等）に溶解し、ついでこの溶液をセロフアン膜や
限外濾過膜を用いて脱塩した後、ジエチルアミノ
エチル（DEAE）−セルロースあるいはセフアデ
ツクス等の弱塩基性イオン交換樹脂に吸着せし
め、この吸着物を食塩のような中性塩乃至リン酸
緩衝液等を用いて溶出する。ついでこのようにし
て得られたSN−07物質を含む水性液に当量の80
％フエノールを混和し、よく撹拌して上層の水層
部を分取し、これにエタノールを加えてSN−07
物質を含む沈澱物を得る。この沈澱物を水に溶解
し、必要に応じて水に対して透析し、更に、フエ
ニルセフアロースCL−4Bのような疎水クロマト
グラフイー、または、バイオゲルHTのようなハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフイー、ある
いはセフアデツクスＧ−75、Ｇ−100、Ｇ−150等
のようなゲル濾過クロマトグラフイーで処理する
ことにより高純度なSN−07物質を得ることがで
きる。上述したように、培養物について上記各処理を
組合わせて精製したSN−07物質を凍結乾燥する
と赤桃色無定形粉末として得られる。因みに、このようにして得られたSN−07物質
が単一物質であることは、セフアデツクスＧ−
150カラムクロマトグラフイーでの対称的な溶出
像、超遠心分析（20℃で50000rpm、30分間）に
よる沈降パターンでの単一ピーク、及びイオン交
換型DEAE−SPWカラムによる高速液体クロマ
トグラフイーでの単一ピークにより立証し得る。発明の有用性次に、本発明によるSN−07物質の生理活性に
ついて説明する。 () 抗菌作用表２に示すとおり、SN−07物質は、グラム
陽性細菌、特に、ミクロコツカス・ルテウスを
強く阻止し、バチルス・ズブチリスではDNA
修復能欠損株（rec^-）に対する作用が大きい。
なお、グラム陰性細菌に対する作用は大きくな
いが、サルモネラ菌のリポポリサツカライド
（LPS）欠損株や大腸菌薬剤高感受性株を強く
阻止する。なお、ここで用いたSN−07物質の100mc
ｇ／ml水溶液での505nｍにおける吸光度0D₅₀₅
＝0.03である。

【表】

【表】 () 抗腫瘍作用 P388の腫瘍細胞を１×10⁶含む浮遊液0.1mlを
BDF₁マウスの腹腔内に移植した後、SN−07
物質を移植１日目から９日目まで連続して上記
腹腔内に投与した。その結果は表３に示すとお
りである。

【表】表中の延命率は対照群の平均生存日数に対す
るSN−07物質投与群の平均生存日数の百分率
で示したものである。叙上のとおり、本発明のSN−07物質は、抗
菌活性においてミクロコツカス・ルテウス及び
エセリシヤ・コリー薬剤高感受性を強く阻止
し、その他のグラム陽性細菌を阻止する。また、SN−07物質は、抵腫瘍活性において
も微量でP388及びL1210担癌マウス延命効果を
ゆうする。従来知られている高分子の抗腫瘍剤の全てが
タンパク質（ペプチドを含む）、多糖類乃至こ
れから成る化合物や混合物であるのに対して、
SN−07物質は核酸系物質を構成成分とするこ
とに鑑み、従来の高分子抗腫瘍剤と組成及び性
状を明らかに異にする新規な抗菌性及び抗腫瘍
性を有する物質であると判断される。以下に実施例を示して本発明のSN−07物質
の調製法を更に具体的に説明する。実施例培養：乾燥オートミール15ｇ、グリセリン15ｇ、乾
燥酵母５ｇ、リン酸−カリウム３ｇ、リン酸水
素二ナトリウム７ｇ、硫酸鉄１ｇ、及び硫酸マ
グネシウム0.5ｇを含有し、PHを7.5に調整した
液体培地１を、50ml容試験管に15ml宛分注
し、常法に従つて滅菌した。上記各培地に、SN−07株の寒天培地上の胞
子を接種して27℃で４〜７日間振とう培養し、
第一種菌を得た。同様に前記組成の液体培地を
100ml入れた500ml容フラスコで30℃で２〜３日
間振とう培養を行なつて第二種菌を得た。次い
で、30容ジヤーフアーメンタ−に前記組成の
液体培地を20入れて滅菌した後、第二種菌
400mlを接種し、培養温度32℃、通気量20／
分、及び撹拌器回転数300〜500rpmの条件下
で、３日間培養を行なつた。培養により産生し
た物質の活性の検定はエセリシヤ・コリー
BE1186株の寒天平板培養における生育阻止を
もつて判定した。抽出及び精製：培養終了後、20培養液を濾過して濾液15
を得、これに3.9Kgの硫酸アンモニウム（培養
液１当り２モル硫酸アンモニウム）を加え、
４℃で16時間静かに撹拌した。生じた沈澱物を
遠心分離によつて除去し、清澄液14を得た。
次いで、上記清澄液に2.7Kgの硫酸アンモニウ
ム（はじめの培養液１当り1.5モル硫酸アン
モニウム）を加え、充分撹拌後、４℃で24時間
静置すると、液表面に不溶物がペレツト状に生
じた。このペレツト状不溶物を濾布でこし取つ
て、５の0.05モルリン酸緩衝液PH6.5に溶解
した。予め同上の緩衝液で平衡化しておいた
400mlサイズのジエチルアミノエチル−セフア
デツクスＡ−25カラムに負荷し、活性画分を吸
着させ、同上の緩衝液で充分洗浄した後、緩衝
液中の塩化カリウム濃度を０モルから徐々に１
モルまで高めることによつて、活性画分の溶出
を行なつた。活性を示す溶出液2.5に対して
80％フエノールを等量加えてよく混和した。上
層の水層部を分取し、これにエタノールを注加
しつつ沈澱物を生じさせた。得られた沈澱物を
集めて0.05モルリン酸緩衝液１に溶解して２
モルの硫酸アンモニウムを含有せしめた同上緩
衝液10に対して４℃で透析を行なつた。次い
で、同上の硫酸アンモニウム含有リン酸緩衝液
で平衡化した100mlサイズのフエニルセフアロ
ースCL−4Bカラムに負荷し、活性画分を吸着
させ、同緩衝液中の硫酸アンモニウムを２モル
濃度から徐々に減少させることによつて、活性
画分の溶出を行なつた。活性を示す溶出液0.5
を、蒸留水５に対して４℃で16時間透析を
行なつた。透析内液を25mlまで濃縮して径2.5
cm、長さ105cmサイズのセフアデツクスＧ−150
カラムに負荷し、0.05モルリン酸緩衝液PH6.5
でゲル濾過を行ない、活性画分として15ml、乾
物として赤桃色粉末46mgの精製されたSN−07
物質を得た。培養液に対するSN−07物質の収
率は2.3％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のSN−07物質の水溶液（実
線）及び0.1規定カセイソーダ水溶液（破線）
の紫外部及び可視部吸収スペクトルを示す。第
２図はSN−07物質の臭化カリウム錠剤法で測
定した赤外部吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１デオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重量％、
リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖（全還元
糖）15乃至17重量％及びアミノ酸2.5重量％以下
を構成成分として含有し、下記の性質を示すこと
を特徴とする核酸系高分子物質；分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
ル濾過法により、２モル塩化カリウム−0.05モ
ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
（蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
（蛋白質換算）に増大する、溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
性水溶液中で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青
紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜紫外部及び可視部吸収スペクトル：中性水溶
液中で256〜258nｍ及び僅かに505と540nｍで
吸収を有し、かつ0.1規定苛性ソーダ水溶液中
で256〜258nｍ及び僅かに560と600nｍに吸収
を有する。赤外部吸収スペクトル：3400，2950，2350，
1980，1700，1650，1075，930，670及び520の
波長（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠
剤法による）。呈色反応：ニンヒドリン反応陽性ブリツクス反応陰性エルソン・モルガン反応陰性ホーリーローリー反応陰性ジフエニルアミン反応陽性オルシノール反応陽性アンスロン反応陽性フエノール硫酸反応陽性過マンガン酸カリウム反応陽性、分解点：＞235℃ ２アクチノマジユラ属（Actinomadura）に属
する次の性質を示す核酸系高分子物質の生産能を
有する微生物を培養し、培養物から該核酸系高分
子物質を採取することを特徴とする核酸系高分子
物質の製造方法。デオキシリボ核酸（DNA）35乃至45重量％、
リボ核酸（RNA）６乃至12重量％、糖（全還元
糖）15乃至17重量％及びアミノ酸2.5重量％以下
を構成成分として含有し、下記の性質を示す核酸
系高分子物質；分子量：セフアデツクスＧ−150を用いたゲ
ル濾過法により、２モル塩化カリウム−0.05モ
ルトリス塩酸緩衝液（PH７）中で28000〜30000
（蛋白質換算）を示し、0.05モルトリス塩酸緩
衝液中では分子間会合を生じて60000〜64000
（蛋白質換算）に増大する、溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノー
ル、エタノール、ブタノール、プロパノール、
アセトン及びエーテル等の有機溶剤に不溶、中
性水溶液中で赤桃色及びアルカリ水溶液中で青
紫色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を生ずる、旋光度：0.5％水溶液の〔α〕²⁰ _D＝＋76゜紫外部及び可視部吸収スペクトル：中性水溶
液中で256〜258nｍ及び僅かに505と540nｍで
吸収を有し、かつ0.1規定苛性ソーダ水溶液中
で256〜258nｍ及び僅かに560と600nｍで吸収
を有する、赤外部吸収スペクトル：3400，2950，2350，
1980，1700，1650，1075，930，670及び520の
波長（cm^-1）で吸収を有する（臭化カリウム錠
剤法による）、呈色反応：ニンヒドリン反応陽性ブリツクス反応陰性エルソン・モルガン反応陰性ホーリーローリー反応陰性ジフエニルアミン反応陽性オルシノール反応陽性アンスロン反応陽性フエノール硫酸反応陽性過マンガン酸カリウム反応陽性、分解点：＞235℃ ３アクチノマジユラ属に属する微生物が菌株
Actinomadura sp.SN−07（微工研菌寄第7890号）
である特許請求の範囲第２項記載の製造方法。４培養を25〜37℃、好ましくは28〜34℃の温度
で２〜４日間行なう特許請求の範囲第２項記載の
製造方法。５培養物を、塩析、フエノール処理、エタノー
ル沈澱、イオンクロマトグラフイー、疎水クロマ
トクラフイー、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフイー及びゲル濾過クロマトグラフイーから
成る群から選択される少くとも２種を組合わせて
精製する特許請求の範囲第２項記載の製造方法。