JPS61225125A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗腫瘍剤、詳しくは酸性ヘテロ多糖類ＡＭ−
２をイｊ効成分とする抗腫瘍剤に関する。

〔従来の技術） 一般に、抗ぜ１♀ノ剤、抗＋＋〔＋を瘍剤としては、多
くの化学療法剤が用いられ、さらに、免疫療法剤として
、ビシバニール、クレスチン、Ｂ、Ｃ，０などが、用い
られているが、前者け、副作用が強く、発熱、食欲不振
、悪心といったものが起こり、免疫機能の低下を、招く
と言われている。一方、後者も、結核菌や溶連球閑の菌
体等で、できており、活性本体以外の不純物を含む危険
１クユがあり、均一な効果を期待することが、困鮒であ
る。

才だ、酸性ヘテロ多糖類の代表としては、ザンタンガム
が知られ、特開昭５８−６２１１８号公報に抗腫瘍効果
が開示されている。また酢酸菌の生産する酸性ヘテロ多
糖類ＡＭ−１（以下Ａ　Ｍ　＝１という）（特公昭５８
−５６６４０）が知られ、これを有効成分とする抗腫瘍
剤も特開昭６０−２３３１９号公報に示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は副作用がなく、均一性のある抗ｌ１ｔｌｊ傷剤
を提供せんとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、強い抗腫瘍作用を有し、安全性の高く、
均−彦成分からなる抗腫瘍剤を得るために、鋭意検討し
た結果、酢酸菌の生産する酸性ヘテロ多糖類ＡＭ−２が
強い抗腫瘍性を有することを見い出し、これに基づいて
、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は酸性
ヘテロ多糖類ＡＭ−２を有効成分とする抗腫瘍剤である
。

本発明の有効成分である酸性ヘテロ多糖類Ａ、Ｍ−２の
理化学的性質は次の通りである。

１、　本物質は２Ｎ−トリフルオロ酢酸でｉｏｏ°Ｃ１
１８時間加水分解した後、アセトン：インプロパツール
：０１Ｍ乳酸（２：２：１）の展開溶媒を用いて薄層ク
ロマトグラフィーを行い、アニリン：ジフェニールアミ
ン：アセトン：燐酸試薬で呈色させると、グルコース、
ラムノース、マンノース、グルクロン酸が検出される。

更に本発明の多糖類のガスクロマトグラフィーによる分
析結果かラモ、少すくトモクルコース、ラムノース、マ
ンノース、グルクロン酸が主構成糖であることが確認さ
れ、そのグルコース：ラムノース：マンノース：グルク
ロン酸の構成比は約４：０９〜１１：０９〜１．１：０
．９〜１．１であることが認められる。

本発明の多糖類の１３ｃ−核磁気共鳴スばクトルで２１
．２　ｐｐｍにピークが見られることから本発明多糖類
にはアセチル基が含まれる。アセチル含量は、ヒドロキ
シルアミンを用いた比色定量法およびアルカリ処理によ
って多糖より遊離する酢酸の定量によって、４〜８係で
あることが認められる。

また本発明の多糖類は、セチルトリメチルアンモニウム
ブロマイドあるいはセチルピリジウムクロライドを添加
すると白色沈殿が生じるので、酸性である。

２、呈色反応 アンスロン反応：陽性、カルバゾール反応：陽性、エル
ソン・モルガン反応：陰性、ヨード反応：陽性 ６、溶剤に対する溶解度 水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトン等に不溶
である。

４、色及び形状 精製品は白色綿状または繊維状である。

５　粘度 水溶液は無色透明で粘性を有し、その１％溶液の粘度は
１２００〜２０００ｃｐ（２５°Ｃ、３０ｒｐｍ東京計
器製Ｂ型粘度計による）である。

６　元素分析値 Ｃ＝３９．９±１％：Ｈ−６．２＋ｌ係；Ｎ−０％；灰
分＝６．０±１．０係 Ｚ　比旋光度 〔α〕　　、０〜−１−２０　（Ｃ＝０．３３　、水溶
液）Ｉ） ８、分子量 分析用超遠心機を用いてメニスカス　デプリション　メ
ソッド（ｍｅｎｉｓｃｕｓ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｍｅ
ｔｈｏｄ　）の沈降平衡法で算出しだ平均分子量は約２
．ｌＸ１０’であり、また東洋曹達工業製高速液体クロ
マトグラフィーを用い、ゾルラン（材厚に、に、　）を
標準にして測定した平均分子量はｌＸ１０’　から２×
１０６である。したがって分子量は約１０５以上である
。

９．　　　ＩＡ中点 １９０℃で黒褐色が始−土り、２５０℃で分解する。

１０　　核磁気共鳴ヌベクトル ＩＲＣ−核磁気共［１１嘉スペクトル ューブ：１Ｑ＋ｑｍ１内部橡７シ・ニジオキサン）の主
要ピークは１　７　４．２　ｐｐｍ　、　１　０　３．
５　ｐｐｍ　、　１　０　１．　５　ｐｐｍ、７６、６
１）ｐｍ　、　７５．９ｐｐｍ　、　７３．３ｐｐｍ　
、　７０．９ｐｐｍ、６９．５ｐｐｍ　、　６１．４ｐ
ｐｍ　、　２１．２ｐｐｍ　、　１　７．６ｐｐｔｎで
ある。

１１　　本物ノ硫の主要な繰り返し構造は次の通りであ
る。

−＞４）−β署）−Ｇｌｃ　（　１−＋４　）−βーＤ
ーＧ．ｆｆｃ−（１−７↑ Ｄ　−１ｖｌａｎ ↑ Ｄ−　ＧｔｃＵＡ ↑ Ｄ−（３Ｌｃ ↑　　　　　−１−　ＯＡ．ｃ −Ｇｔｃ ｔ５　　　　　　　（ＩＬｃ　　、グルコース↑　　　
　　Ｒｈａ　　、ラムノース ｉ　　　　　　Ｍａｎ　　、マンノースＬ−Ｒ．ｈａ　
　　　　　ＯｔｃＵＡ　　、グルクロン酸ＯＡｃ　　、
　（’．１ーアセチル基 酸性ヘテロ多糖類ＡＭ−２の生産は酸性ヘテロ多糖類Ａ
Ｍ−２生産菌によって行なわれる。

例えば、本発明者らが食酢の発酵醪から新たに分離した
アセトバクターに属する細菌であるアセトバクターＭＨ
−１５９７が挙げられる。なお、アセトバクター・ＭＩ
Ｎ−１５９７株は倣工仙条寄第２８０号（　ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２８０　）としてＴ菜技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。

アセトバクター・ＭＨ−１５９７の菌学的性質は次の通
りである。

１、形態的所見 形状　　　　　桿状 大きさ　　　　ｏ．６−０．７　ｘ　１．　Ｏ　〜１．
　８μｍ集団　　　　　単独あるいは二連、 稀に数個連鎖 運動性　　　　無し 胞子形成　　　形成せず ダラム染色　　陰性 抗酸性　　　　陰性 ■．培養的所見 ■酵母エキス・ブドウ糖寒天平板培養（３０℃で５日間
培養） 形状　　　　　円形 辺縁　　　　　平滑で全線 隆起　　　　　半球状（　Ｃａｐｉｔａｔｅ　）光沢　
　　　有り 表面　　　　平滑 色調　　　　淡褐色で光沢あり ■炭酸カルシウム含有酵母エギス・ブドウ糖斜面培養（
３０℃で６日間培養） 生育の良否　　良好 隆起　　　　中程度 表面　　　　平滑 色調　　　　淡褐色で光沢あり ■酢酸エタノール含有酵母エキスーブドウ糖液体静ＩＮ
培養（６０℃で５日間培養）液体静置培養での生育は乏
しい。リングを形成し、培養液は透明。

■肉汁液体静置培養（３０℃で７日間培養）生育乏しい
。わずかにリング状に生育する。

■ブドウ糖含有肉エキス液体静置培養（３０℃で７日間
培養） 生Ｕは乏しい。リング状に生育する。

■Ｍ　Ｙゼラチン高層培養（２０℃で７日間培養） 生育良好。液化性無し。

（７）’Ｊ）マスミルク（３０℃で７日間培養）凝固性
無し。

問、生理学的性Ｔｉ ■硝酸ｆ’ＡＮの還元：照し ■脱望反応ニス１１Ｉ、し ■Ｖ　Ｐテスト：陰性 （４）インドールの生成：無し ■値、化水素の生成：無し ■デンプンの加水分解：無ｌ〜 ■クエン酸の利用： Ｃｔ＋ｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：無し■無機窒素諒の
利用： 硝酸塩：無し アンモニウム塩：無し ■培地中への色素の生成：無し ＱＯｉウレアーセ活性：無し オキシダーゼ活（４：、　：無し くＤカタラーゼ活性：有り σか生育ｐＨ範囲：６５〜Ｚ５ 最適ｐＨ範囲＝５０〜６５ ０生育部度範囲：１７−３７℃ 最適温度範囲：２８−３２℃ ０酸素に対する態度：好気的 ０５〜ケトグルコン酸の生成：有り ｏ２−ケトグルコン酸の生成：有り ０２−５−ジケトグルコン酸の生成：無しく■ジヒドロ
キシアセトンの生成：有り［相］エタノール資化性：有
り ［株］匈酢酸の資化性：翁り ０乳酸の資化性：有り （ハ）ビタミン要求性：有り （ハ）酢酸の分解性：有り ［株］乳酸の分解性：有り ９ゆ塩化第２鉄反応：陰性（グルコース培地）陰性（フ
ルクトース培地） （φホイヤー、フルト−スにエタノール培地（ビタミン
添加）での生育：無し Ｑリボイヤー、フルト−ス、グルコース培地（ビタミン
添加）での生育：有り ■、炭素源の資化性およびそれらからの酸およびガスの
生成 第１表のとおりである。

第１表 （注）＋：實化する、生成する。−：資化しない、生成
しない。　±：わずかに資化する、わずかに生成する。

本発明における酸性ヘテロ多糖類ＡＭ−２生産菌の培養
に使用する培地の炭素源としては、たとえばグルコース
、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、クリセ
ロール、マンニトール、エタノール、クエン酸、リンゴ
酸、糖蜜、各種澱粉質含有穀類の糖化液などが単独また
は混合して用いられる。

また窒素源としては、酵母エキス、ベゾトン、コーンス
テイープリカー、硫酸アンモニウムなどの有機および無
機窒素源が用いられる。

さらにカリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウ
ムなどの塩類やパントテン酸、ニコチン酸、ＦｅｌＣｏ
１Ｍ０などの微量要素が酸性ヘテロ多糖類Ａ、Ｍ−２（
以下ＡＭ−２という）の生産および粘性を高めるために
有効に使用される。

培養は、２０〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃、培地
のｐＨ３〜７．５、好ましくは５〜７において好気的条
件下で、通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行なわれ
る。培養時間は種々の条件によって異なるが、通常２４
〜１２０時間の範囲で行なわれる。

このようにして培養物中に得られたＡＭ−２の回収は公
知の方法を用いて行うことができる。たとえは、培養液
をそのま捷、または適量の水で希釈後、遠心分離、濾過
などによって菌体を分離し、メタノール、エタノール、
プロパツールあるいはアセトンなどの沈澱剤を加え繊維
状の上記￥糖類を沈澱′せしめた後、アセトン洗滌して
乾燥を行うことにより回収することができる。

またＡ、Ｍ−２は酸性物質であるので、菌体を除いた培
養液にセチル）　ＩＪメチルアンモニウムブロマイドな
どを添加してＡ、　Ｍ　−２を沈澱させることにより回
収することができる。

粗製のＡＭ−２は多糖類の精製法にしたがって精製する
ことができる。例えば粗製のＡＭ−２を水に再溶解し、
熱処理後、遠心分離して不溶物を完全に除去し、アセト
ンなどの沈澱剤で再沈澱をくり返すことにより純度の高
い白色綿状の精製されたＡＭ−２が得られる。また、セ
チル）　ＩＪメチルアンモニウムゾロマイトによる沈澱
（Ｃ’ｌ’ＡＢ処理）、透析、およびイオン交換樹脂な
どを併用して高純度の精製品を得るとともできる。

得られたＡ、　Ｍ　−２は可溶性粉末であるので、粉剤
、注射剤としても使用が可能であり、賦形剤を加えれば
、錠剤ともなる。また、他の化学療法剤、免疫療法剤と
併用することも可能である３、本発明品は、粉剤として
経口投与では１０ｍｇ〜１ｇ／Ｅ１人の投与で、特にＩ
　Ｄ　Ｏ〜５　Ｄ　Ｄ　ｍｇ／日・人が好適である。溶
液の静脈内投与では０１〜１００　ｍｇ　／日・人の投
与で、特に０５〜２５ｍｇ／日０人が好適である。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ リン酸１カリ０１２、リン酸２カリ０１１、イヒｃ酸マ
グネシウム７水地０．２！Ｍ、塩化第２鉄０．００！Ｍ
’、酵４せエキス２１、クエン酸２ナトリウム５７およ
びシュクロース３０ｒを１ｔの純水に溶解して培地とし
た。この培地３ｔを調製し、ｐＨヲ６．０としたのち、
５を容のジャーファーメンタ−に注入し、１２０℃で２
０分間殺菌した。

上記と同一組成の培地を用い、坂ロフラスコで前培養し
たアセトバクターＭｌ（−１５９７、ＦＥ　Ｉ充ＭＢＰ
−２８０を上記ジャーファーメンタ−に接種し、培養温
度３０℃、通気量０．５　Ｖ　Ｖ　Ｍで９６時間培養し
た。培養終了液のｐＨは７８、Ｂ型粘度計による粘度は
５６　Ｄ　Ｏｃｐであった。

９６時間の培養の後、培養終了液に水を加えて１０ｔと
し、１０．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体お
よび固形物を除去したのち、１ｓｔのエタノールを除々
に加えると白色の繊維状沈澱が得られた。沈澱を採取し
、アセトンで洗浄し、減圧乾燥した。このようにして得
た白色繊維状の粗製のＡＭ−２の収量は４６．２ｒ（収
率２５％）であった。

このようにして得だ粗製のＡＭ−２，２Ｏｒを再び水２
ｔに溶解し、これにセチル）　ＩＪメチルアンモニウム
ブロマイドを加えＡ　Ｍ　−２をセチルトリメチルアン
モニウムブロマイドとの複合体として沈澱させた。この
複合体を水およびエタノールで十分洗浄して過剰のセチ
ル）　ＩＪメチルアンモニウムプロマイドを除いた後、
飽和塩化すトリウム水溶液を加えて接合体を溶解した。

この溶液に６倍量のエタノールを加えてＡＭ−２を沈澱
させた。

沈澱を分離し、減圧乾燥後、再び水に溶解した。

得られた溶液を透析用七ロノ１ンチューブに入れ６日間
流水中で透析を行なった後、３倍幇のア七トンを加えて
ＡＭ−２を沈澱させ、沈澱物を分取、減圧乾燥を行い精
製されたＡＭ−２１８，５４を得た。

次の実施例２〜５では実施例１で得たＡ、　Ｍ−２を用
いて動物（マウス）実験を行った。ＡＭ−２は生理食塩
水に溶解して用いた。

実施例２゜ （実験方法） ｄｄｙ♂マウス（４週令）にて継代したエールリッヒ１
復水癌卸１胞を同マウス腹腔に接４′￥に後１週間目に
腹水をとり出し、試験に用いるｄｄｙδマウス４ユ）ω
令の腹腔にマウスあたりｌＸＩＤ５細胞を接種する。Ａ
Ｍ−２はＩｃｇ体重あたり１０１ｎｙ隔日に１０回腹腔
内に投与し、延命効果を調べた。コントロールには生理
食塩水を投与し、ほかにＡ、　Ｍ　−１、ザンタン（犬
日本製薬発売エコーガム）、シイタケ由来のレンチナン
（各１ｏｍｙ隔日１０回腹腔内投与）と比較した。

結果は第１図に示す通りである。

ここにおける生存率は下記の式により算出した。

実験結果は第１図のように、Ａ、Ｍ−２はエールリッヒ
腹水腫瘍に対してＡＭ−１、ザンタン、レンチナンより
強い延命を有していた。

実施例６ （実験方法） Ｃ３Ｈ／　Ｈｅ　ｓｔｃ♂６週命マウスで継代したＭＭ
４６腫瘍細胞をマウス当り１Ｘ１０′１個の細胞をＣ３
Ｈ／　Ｈｅマウスに接種する。接種前５日間に１日１回
、Ａ、　Ｍ−２をＩｃｆｊ体重当たり１１００ＴＲを腹
腔投与した。対照としてレンチナンをｋｇ体重当たり２
５■及びＡ、　Ｍ　−１をに９体重当たり１００ｍｇを
接柚前１日１回５日間腹腔投与し延命効果を比較した。

結果は第２図に示す通りである。

第２図から明らかなように、ＡＭ−２はＡＭ−１、レン
チナンより強い延命効果を有しているのがわかる。

実施例４゜ （実験方法） Ｃ３１１／　Ｈｅ　ｓｔｃ♂６週令マウスにＡ、　Ｍ　
−２をに９体重当たり１００　Ｉａｙを生理食塩水に溶
解し連日５回腹腔投与する。対照群はレンチナンを連日
６回、麹体重当たり２５■／ｋｇ腹腔投力した翌日Ｈａ
ｎｋｓＢＳＳにて腹腔浸出細胞を採取し、マウス当りの
腹混合し、残存放射活性より細胞傷害性を調べた。

その結果は＠６図と次の第２表に示される。

第２表　Ａ　Ｍ　ｅ　１とＡＭ−２で誘導される腹腔浸
出細胞２表に示すようにＡＭ−１、ＡＭ−２で誘導され
る腹腔浸出細胞数たりのＭＭ４６腫瘍細胞への障害性は
同程度であるが、第６図に示すように誘導されてくる浸
出細胞の総数がＡＭ−２投与の方が多く、マウス全体で
のＭＭ４６細胞障害活性はＡＭ−２が最もすぐれている
と考えられ、実施例３．０結果を裏付けるものと言える
。以上のようにＡＭ−２は細胞障害活性を有する腹腔浸
出細胞数を増加させ、ＭＭ４６腫瘍に対する抗腫瘍性を
発現するものと考えられる。

実施例５゜ 実験に用いたＡＭ−２の安全性について確認を行なった
。ＳＤラット６６週＋ｄｄｙマウス８６週令を用いて経
口投与、静脈投与のルートで急性毒性を調べた。

結果は次の第３表に示される。

第３表 Ａ、　Ｍ　−２は高濃度水溶液と々ると、高粘度となシ
、物理的な投与限界があり、ＬＤ５０　　を求めるため
に最高濃度で投与したが、上表のように限界量投与して
も死亡例をみなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２におけるエールリッヒ腹水癌担癌マウ
スの生存率を求めたグラフであり、第２図は実施例３に
おけるＭＭ４６腫瘍担癌マウスの生存率を求めたグラフ
であり、第６図は実施例４におけるマウス当シの腹腔浸
出細胞数を示すグラフである。第４図はＡＭ−２の赤外
吸収スペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する酸性ヘテロ多糖類Ａ
   Ｍ−２を有効成分とする抗腫瘍剤。 １、グルコース、ラムノース、マンノース、グルクロン
   酸およびアセチル基を主構成成分とし、その構成糖比が
   グルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸＝
   ４：０．９〜１．１：０．９〜１．１：０．９〜１．１
   で、アセチル基含量が４〜８％である酸性ヘテロ多糖類
   。 ２、赤外吸収スペクトルは第４図に示す通りである。 ３、呈色反応 アンスロン反応：陽性、カルバゾール反応：陽性、エル
   ソン−モルガン反応：陰性、ヨード反応：陽性 ４、溶剤に対する溶解度 水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトン等に不溶
   である。 ５、色及び形状 精製品は白色綿状または繊維状である。 ６、粘度 水溶液は無色透明で粘性を有し、その１％水溶液の粘度
   は１２００〜２０００（２５℃、３０ｒｐｍ東京計器製
   Ｂ型粘度計による）である。 ７、元素分析値 Ｃ＝３９．９±１％；Ｈ＝６．２±１％：Ｎ＝０％；灰
   分＝３．０±１．０％ ８、比旋光度 〔α〕＾２＾７＿Ｄ：０〜＋２０（Ｃ＝０．３３、水溶
   液）９、分子量 約１０＾５以上である。 １０、融点 １９０℃で黒褐色が始まり、２５０℃で分解する。