JPH0149280B2

JPH0149280B2 -

Info

Publication number: JPH0149280B2
Application number: JP57200585A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Oomori; Jun Saeki; Yukisuke Tamura; Shuichi Yanagidaira
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1982-11-16
Filing date: 1982-11-16
Publication date: 1989-10-24
Also published as: JPS5993092A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な蛋白多糖体、更に詳しくは制
癌作用、血液浄化作用並びに酸性蛋白の凝集作用
等の生理活性を示す蛋白多糖体に関する。近年、種々の微生物が生産する多糖類の制癌作
用についていろいろと報告されており、それらの
うちには工業的に製品化されているものもある。
しかしながら、従来、報告されているこれら多糖
類の制癌作用はその機構が未だ解明されてはいな
いが免疫賦活活性に基づくものと推定されてい
る。本発明者は、多数種の微生物が生産する多糖類
についてその制癌作用を研究した結果、子のう菌
類のノムシタケ属並びにアクレモニウム属に属す
る菌を液体培養することにより得られる培養液中
に極めて低毒性であつて腫瘍細胞の増殖を直接強
く抑制する作用を有する蛋白多糖体を見出し、本
発明をなすに至つた。以下本発明を詳しく説明する。本発明に係る蛋白多糖体（以下本物質と称す
る）は下記に示す諸性質によつて特徴づけられ
る。 (1) 元素分析値炭素（Ｃ）：42〜47％水素（Ｈ）：５〜８％窒素（Ｎ）：７〜10％ (2) 糖質部分の組成本物質を4N−HClで100℃において16時間加
水分解後アミノ酸分析計により測定した結果、
第３図に示すとおり、主としてガラクトサミン
から成るアミノ糖（70〜80重量％）と、および
本物質を4N−H₂SO₄で100℃において６時間加
水分解後、中和してトリメチルシリル化を行な
つてガスクロマトグラフイにより測定した結
果、第４図に示すとおり、グルコール、マンノ
ースおよびガラクトースから成る中性糖（５〜
10重量％）とから成ることが確認される。 (3) 蛋白質部分のアミノ酸組成本物質における蛋白質部分は５〜10重量％で
あつて、本物質10mgに6N−HCl1mlを加え真空
下に封管し、110℃で22時間加水分解後、ロー
タリーエバポレーターによりHClを除去したも
の（回収されたアミノ酸総量約30μｇ）につい
てアミノ酸分析計により測定した結果、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、スレオ
ニン、セリン、プロリン、グリシン、アラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオ
ニン、フエニルアラニン、リジンと少量のシス
テイン、メチオニンを含む。なお、総アミノ酸
量としての含量は３〜５重量％であつて、その
うちグルタミン酸およびアスパラギン酸の含量
が多い。 (4) 分子量ゲルろ過法（東洋パールHW−65を使用）に
よる測定で5000及至1000000のブロードなピー
クを示し、ピークの頂点における分子量は約
140000を示す。なお、超遠心分析（溶媒
0.2MNaCl／３％酢酸溶液）によると分子量分
布のピークが単一であることから、本物質は均
一性を示すものと言える。 (5) 呈色反応反応呈色フエノール硫酸反応赤褐色＋アンスロン反応緑色＋モーリツシユ反応青紫色＋エルソン・モーガン反応無色− （但し加水分解物について）赤紫色（＋）カルバゾール硫酸反応無色− ビユーレツト反応黄色＋トルイジンブルーＯ染色無色− ニンヒドリン反応青紫色＋ (6) 比旋光度本物質は50mM酢酸溶液中で〔α〕²⁰ _D＝＋252゜
（濃度Ｃ＝１mg／ml）を示す。 (7) 紫外線吸収スペクトル本物質の0.02M酢酸溶液についての紫外部吸
収は第１図に示すとおりである。 (8) 赤外線吸収スペクトル本物質のKBr錠剤法による赤外部吸収は第
２図に示すとおりである。なお、3600〜3200cm
^-1の吸収は水素結合に由来したrOHによるもの
であり、1600cm^-1の吸収はガラクトサミンの−
NH₂による吸収と考えられる。また、870cm^-1
にはα−配合による吸収がみられる。 (9) プロトン核磁気共鳴吸収（NMR）本物質を10mg／mlになるように重酢酸−重水
混液に溶解した溶液について測定した。結果は
第５図に示すとおりである。本物質のその他の理化学性質は次のとおりで
ある。 (10) 物質の性状淡黄色を呈する粉末であつて、Ｘ線回析によ
り非結晶性を示す。 (11) 溶解性中性乃至アルカリ性の水性液には溶解せず、
酢酸、クエン酸、コハク酸、硫酸、塩酸等の酸
性水性液には可溶であり、エタノール、アセト
ン、ｎ−ヘキサン並びにエーテルに不溶。 (12) 分解点明確な融点を示さず、220乃至240℃で褐変し
て分解する。なお、本物質における中性糖とアミノ糖との
結合状態、糖質部分と蛋白質部分の結合状態お
よび糖質部分の構成糖の構造は、本物質を下記
に示す手順に従つてそれぞれ部分酸加水分解、
アルカリ分解、過沃素酸酸化、オリゴ糖の分析
および酸素分解して調べた結果によると下記の
とおりと推定される。）部分酸加水分解本物質中の中性糖とアミノ糖が結合した状
態で存在するかもしくは混在しているかを調
べるために、本物質100mgをIN HCl40mlに
懸濁し、10℃で４時間反応させた後、反応物
を中和して濃縮したものをゲル濾過クロマト
グラフイーに付して得られたパターンから、
中性糖とアミノ糖は結合しているものと推定
される。）アルカリ分解 (イ)本物質19.8mgを0.1N NbOH4mlに懸濁し、
25℃で18時間反応させたのち中和したものを
ゲル濾過クロマトグラフイーに付し得られた
パターン、(ロ)本物質10.8mgを1N NaOH／
0.5M NbaBH₄の1.5mlに懸濁し、100℃で４
時間反応させたのち中和したものをゲル濾過
クロマトグラフイーに付して得られたパター
ン、および(ハ)本物質10mgを１％Na₂CO₃／
0.5M NaBH₄の1.5mlに懸濁し、100℃で４時
間反応させたのち中和したものをゲル濾過ク
ロマトグラフイーに付して得られたパターン
から、本物質における蛋白質部分と糖質部分
は窒素を介してＮ−グルコシド結合している
ものと推定される。）過沃素酸酸化上記）の部分酸加水分解により得られた
高分子画分（以下PAHと称する）が、中性
糖および蛋白を実質的に含まない故にアミノ
糖の構造解析に適するとの観点から、PAT
およびそのアセチル化したもの（以下
PAHNAcと称す）について、それぞれ過沃
素酸酸化を試みた結果、本物質のアミノ糖部
分はガラクトサミンの1.4結合体で構成され
ていることが推定される。）オリゴ糖の分析本物質を3N−HClを用いて100℃で４時間
分解して得れる３糖類（GaIN）₃のＮ−アセ
チル化合物（GalNAc）₃についてメチル分
析、酸素分解並びにNMR分析を行つた結
果、本物質のオリゴ糖は主としてα（１，４）
結合から成つていると推定される。）酵素分解上記）で得られた３糖類（GalNAc）₃並
びに上記）で用いたPAHNAcに、α−Ｎ
−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−Ｎ−
acetylgalactosaminidase）およびβ−Ｎ−
アセチルヘキサソサミニターゼ（β−Ｎ−
acetylhexosaminidase）をそれぞれ作用さ
せた結果、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニ
ダーゼを作用させたものでは（GalNbAc）₃
からは62％の、並びにPAHNAcから41.9％
のGalNAcがそれぞれ遊離されたのに対し、
β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用
させたものではGalNAcの遊離が殆どみられ
ないことから、α−結合をしていることが確
認された。本物質の調製本物質は、不完全菌亜門
（Deuteromycotina）、不完全糸状菌鋼
（Hyphomycetes）のノムシタケ属
（Cordyceps）、アクレモニウム属
（Acremoium）、アスペルギルス（Aspergillus）、
パエシロマイセス属（Paeculomyces）等に属す
る多糖類生産菌を液体培地中で培養することによ
り生産される。上記多糖類生産菌として下記菌株を例示し得
る。本物質の調製本物質は、不完全菌亜門
（Deuteromycotina）、不完全糸状菌綱
（Hyphomycetes）のノムシタケ属
（Cordyceps）、アクレモニウム属
（Acremonium）、アスペルギルス属
（Aspergillus）、パエシロマイセス属
（Paecilomyces）等に属する多糖類生産菌を液体
培地中で培養することにより生産される。上記多糖類生産菌として下記菌株を例示し得
る。 Cordyceps Japonica IFO9647 Cordyceps ophioglossoides IFO8992 Acremonium Inzulae IFO30343 Acremonium sp．FERM Ｐ−6601 Paceilomyces fumoss−roseus IFO7072 Aspergillus parasiticus AHU7165 これらの菌の培養に用いる液体培地は一般に微
生物の培養に適用されるもの、例えばグルコース
を炭素源とし、ペプトン、酵母エキスを含むもの
であればよく、更にビタミン、無機塩類、アミノ
酸等の微量成分を添加したものも用いられる。培
地のpHは４〜７の範囲が適当であり、培養は、
25℃の温度で３〜６日間静置培養した後、４〜６
日間振とう又は通気撹拌培養することにより行わ
れる。上述のようにして培養して得られる培養液は加
水後遠心分離により菌体を除去した後、活性炭、
透析、イオン交換樹脂等により低分子物質を除去
する。このようにして得られる溶液は極めて高い
粘性を有するので超音波処理もしくはホモブレン
ダーにより粘性を低下させた後35〜100℃の温度
に加温して液中の不純物を更に沈澱させる。この
沈澱を遠心分離により分離して得られる上澄液は
冷却後アンモニアのようなアルカリ試薬を用いて
pHをアルカリ性にすると、本物質が沈澱物とし
て得られる。このようにして得られる沈澱物を更に酢酸溶液
（50mM）に溶解後該溶液を、アンモニア等を用
いてアルカリ性にすると再び沈澱物が生成するの
で、該沈澱物を蒸留水で繰返し洗浄後凍結乾燥又
は真空乾燥すると、精製された淡黄色の粉末から
成る本物質が得られる。本物質の生理活性次に本物質の生理活性について説明する。 (1) 急性毒性マウス並びにラツトを対象として本物質の急
性毒性を試験した結果は表１のとおりである。なお、試験に供したマウスはICR−JCL系、
６〜８週令、体重25〜30ｇのものであり、ラツ
トはウイスター系、４〜５週令、体重110〜140
ｇのものであつて、各試験群25匹宛に本物質を
経口並びに腹腔内投与してそれぞれのLD₅₀値
を調べた。

【表】表１にみられるように、本物質のマウス並び
にラツトに対するLD₅₀値が極めて高いことが
分る。 (2) 抗腫瘍活性本物質について下記手順により抗腫瘍活性試
験を行なつた。 (イ) in vitro抗腫瘍活性試験マウスEhrlich腹水細胞に対する増殖抑制
効果を調べる目的で、上記細胞（２×10⁵／
ml）を、本物質の５、10並びに50μｇ／mlを
それぞれ添加、含有させたRPMI−1640培地
中で37℃の温度で３日間培養を行なつた。一
方対照として本物質の代りに滅菌処理した５
％のブドウ糖液を添加した上記培地中で同様
にして培養を行なつた。その結果、本物質を含有させた培地群では
5μｇ／mlを含有する培地では３日後対照に
比して約30％に、10μｇ／mlを含む培地では
約20％にEhrlich細胞の増殖を抑制した。また、本物質を50μｇ／mlを含む培地では
実質上全てのEhrlich細胞を死滅させた。なお、マウス正常細胞L929を用いて上記
と同様な手順で培養を行なつたところ、本物
質の該細胞に対する増殖抑制は全く認められ
なかつた。 (ロ) in vivo抗腫瘍活性試験） Sarcoma180固型腫瘍に対する増殖抑
制効果を調べる目的で、マウスを用いて下
記手順により試験を行なつた。供試動物としてICR−JCL、６週令雌マ
ウス（体重25ｇ±３ｇ）を用い、
sarcoma180腫瘍細胞は該マウスの腹腔内
に腹水型で１週間毎に継代しているものを
用いた。試験に当つては、上記細胞を接種
後１週間目の腹水中の細胞を取り出し、該
細胞の約400万個を含有する生理食塩水0.1
mlを上記試験マウスの右脇腹下部皮下に移
植した。移植５日後に腫瘍の増殖が認めら
れたマウスの腫瘍内に、本物質を乳酸酸性
の５％ブドウ糖液に0.25mg／mlになるよう
に溶解して120℃の温度で15分間滅菌した
溶液を１ｇ／Kgになるように投与し、以後
10日間連続して同様に投与を行なつた。一方、対照として乳酸酸性の５％ブドウ
糖液を上記と同様にして投与を行なつた。なお、試験マウスは10匹宛を１群として
用いた。上述のようにして腫瘍移植後30日
経過してから各マウスを解剖し、増殖した
固型腫瘍を摘出してその重量を測定するこ
とにより、本物質の投与群と対照群との比
較を行なつた。その結果、本物質の投与群
では腫瘍抑制率98.3％を示し、10匹中９匹
の腫瘍は完全に消失したことが認められ
た。） Ehrlich腹水腫瘍に対する抗腫瘍効果
を調げる目的で、マウスを用いて下記手順
により試験を行なつた。供試動物としてICR−JCL、８週令雌マ
ウス（体重25ｇ±３ｇ）を用い。このマウ
ス11匹を１群とする４群の各々に１×10⁶
個のEhrlich腫瘍細胞を移植し、24時間後
対照群として１群以外の各３群に本物質を
２mg／Kg／日、0.5mg／Kg／日並びに0.25
mg／Kg／日の投与量でそれぞれ10日間腹腔
内投与を行ない、各群の延命効果および治
療効果を観察した。なお、対照群には本物
質に代えて乳酸酸性５％のブドウ糖液を同
様にして投与した。その結果は表２に示す
とおりである。

【表】薬剤投与群マウスの平均生存
日数−対照群マウスの平均生
存日数
延命率＝

Claims

【特許請求の範囲】１主としてガラクトサミンから成るアミノ糖
と、グルコース、マンノースおよびガラクトース
から成る中性糖とから成る糖質成分と、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、アルギニン、スレオニ
ン、セリン、プロリン、グリシン、アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、フ
エニルアラニン、リジン、システインおよびメチ
オニンのアミノ酸組成を有する蛋白質部分とから
構成されていて、下記の元素分析値を示し、Ｃ：42〜47％Ｈ：５〜８％Ｎ：７〜10％ゲルろ過法による測定で5000及至1000000の分子
量を示し、フエノール硫酸反応、アンスロン反
応、モーリツシユ反応、ビユーレツト反応および
ニンヒドリン反応でそれぞれ陽性の呈色反応を示
し、エルソン−モーガン反応、カルバゾール硫酸
反応およびトルイジンブルーＯ染色でそれぞれ陰
性の呈色反応を示し、比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋252゜
（50mM酢酸溶液中で）を示し、且つ第１図に示
すとおりの紫外線吸収スペクトル、第２図に示す
とおりの赤外線吸収スペクトルおよび第５図に示
すとおりのプロトン核磁気共鳴吸収スペクトルを
示すことを特徴とする蛋白多糖体。２アミノ糖、中性糖および蛋白部分の組成割合
が70〜80：５〜10：５〜10である特許請求の範囲
第１項記載の蛋白多糖体。