CN1529715A - K5多糖高硫酸化衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明叙述了通过异丙醇处理和消除亲油物质提纯大肠杆菌K5多糖。纯化的产物经过N－脱乙酰化作用后可用来制备硫酸化程度高的新型N，O－硫酸化多糖。

Description

K5多糖高硫酸化衍生物及其制备方法
技术领域
本发明叙述了通过异丙醇处理和消除亲油物质提纯大肠杆菌K5多糖。纯化的产物经过N-脱乙酰化作用后可用来制备硫酸化程度高的新型N，O-硫酸化多糖。
发明背景
众所周知，自W.F.Vann等人在European Journal ofBiochemistry 116，359-364，1981中所述的大肠杆菌株分离出来的荚膜多糖K5(下文简称“K5”)显示与肝素和硫酸类肝素的生物合成前体(N-acetylheparosan)具有相同序列，该荚膜多糖K5在化学上由D-葡萄糖醛酸和连接N-乙酰基葡萄糖胺的α1-4形成的重复二糖单位组成，而该二糖单位d-葡糖醛酸基-N-乙酰基葡萄糖胺与β1-4连接。肝素前体N-acetylheparosan和多糖K5的差别对K5及其衍生物的生物活性影响不大，如下文所引用的欧洲专利EP489647和EP 544592中所述，这种差别仅是在聚合物某些链非还原端的位置4(5)上存在双键。
自上述文章首次公开后，其他一些文章和专利申请叙述了分子量为数千到数十万道尔顿的大肠杆菌株K5多糖的制备。例如，参见EP 333243、IT 1230785、EP 489647、EP 544592、WO 92/17507、WO 01/02597以及M.Manzoni等人在Journal Bioactive CompatiblePolymers(11，第301-311页，1996)中的文章。
根据这篇文献，由大肠杆菌株发酵而成的K5经纯化去除诸如核酸、内毒素、热原或通常以各种方法得到的蛋白质。
所以，W.F.Vann等人(1981)对以季铵盐沉淀之后首次分离出的K5再用80％乙醇经过三次沉淀予以纯化。EP 333243的纯化过程是用季铵盐沉淀，提取和分离K5。EP 489647和EP 544598通过用乙醇沉淀，再经过排斥和/或离子交换层析法来提纯K5根据WO 92/17507，提纯时乙醇沉淀、透析，在离心透析溶液和除去固体后，冻干所得的溶液。M.Manzoni等人的文章和WO 01/02597叙述了在含有脱脂大豆、盐类和葡萄糖的培养基中通过发酵制备K5的步骤，纯化K5时用1M氯化钠溶液对含有用乙醇沉淀得到的含K5的溶液进行超滤和离子交换层析。
而且，由发酵而成的K5经过化学修饰得到类肝素产物。在上述文献中，WO 92/17507、EP 489647和EP 544592叙述了具有抗凝血活性和抗血栓形成活性的高低分子量N，O-硫酸化K5；IT1230785和WO 92/17507叙述了一些K5的N-脱乙酰化-N，O-硫酸化衍生物，其一定数目的葡萄糖醛酸单位受到差向异构化作用转化为艾杜糖醛酸单位，而WO 98/09636叙述了具有抗转移活性的N-脱乙酰化-N，O-硫酸化K5。
最后，对于N-硫酸化K5的O-硫酸化作用，有一文献教导了如何调整可导入二糖单位羟基基团上的硫酸根数目。具体地说，Casu等人(Carbohydrate Research，263，271-284，1994)叙述了K5的N-脱乙酰化、N-硫酸化以及三种O-硫酸化方法，该三种方法以B、C和AC表示。根据方法C，其中N-硫酸化K5用每个游离羟基10摩尔当量硫酸化试剂在温度25-55℃下进行1至24小时硫酸化作用，经过进一步的N-硫酸化作用得到聚硫酸化化合物，其最高硫酸盐/羧基之比为3.1，下文以N，O-过硫酸化K5表示。
下文所述的其他K5衍生物中N-脱乙酰化K5多糖也称为“N-脱乙酰化K5”，N-脱乙酰化N-硫酸化K5多糖也称为“N-硫酸化K5”，N-脱乙酰化-N，O-硫酸化K5多糖也称为“N，O-硫酸化K5”，例如按照上述Casu等人(1994)所述的方法C制成的硫酸化程度高的N-脱乙酰化-N，O-硫酸化K5多糖也称为“N，O-过硫酸化K5”。
发明内容
根据方法C进行N-硫酸化K5的O-硫酸化作用，发现类肝素化合物(即其具有一定百分比的糖醛酸单位是艾杜糖醛酸)和K5可以达到硫酸化程度较高，而所得的N-硫酸化K5和N，O-过硫酸化K5的硫酸化程度为每个二糖单位的硫酸根低于3.2。这一证据解释了没有任何文献提及每个二糖单位具有超过3.2个硫酸根的N，O-过硫酸化K5，其产物的阴离子化程度可能较高。
业已发现，在高盐水溶液中以异丙醇处理提纯发酵而成的K5，可得到实际上不含亲油物质的纯K5多糖。
还发现，按照方法C使由此所得的不含亲油物质的K5进行N-脱乙酰化、N-硫酸化、O-硫酸化，以及任选地进行另一次N-硫酸化，可以得到硫酸化程度高于3.2、一般等于或高于3.5的新型N，O-过硫酸化K5化合物。
附图说明
图1所示为由发酵而成纯度为80％的K5的1H-NMR谱图。
图2所示为由发酵而成不含亲油物质且纯度大于99％的K5的1H-NMR谱图。
具体实施方式
所以，本发明的其中之一在于提供一种硫酸化程度高于3.2的新型N，O-过硫酸化K5的制备方法，其包括以下步骤：
(a)在高盐水溶液中以异丙醇处理由发酵而成的K5；
(b)通过碱性水解使所纯化的K5受到N-脱乙酰化作用，然后用N-硫酸化试剂处理使其再受到N-硫酸化作用；
(c)在O-过硫酸化条件下，以O-硫酸化试剂处理所得的N-硫酸化K5铵盐；以及
(d)若需要，使所得的化合物再次受到N-硫酸化作用，并将N，O-过硫酸化K5以钠盐形式分离出来，可任选地将所述的钠盐转化为另一种盐。
术语“硫酸化程度”指每个二糖单位的硫酸根数目，以硫酸盐/羧基之比表示。
术语“过硫酸化”指使例如用方法C所得的N-硫酸化K5过硫酸化。
在步骤(a)中，用作原料的K5可以是通过能够产生K5的野生或克隆大肠杆菌株发酵而得到的任何一种产物。具体地说，可采用上述引用文献所述的K5，优选为M.Manzoni等人(JournalBioactive Compatible Polymers，1996，11，301-311)或下文制备方法I所列出的K5。
较适宜的K5原料具有较低分子量，特别是分子量分布在约1,500到约15,000范围内，优选约2,000到约9,000，平均分子量约5,000，或者具有较高分子量，特别是分子量分布在约10,000到约50,000范围内，优选约20,000到约40,000，平均分子量约30,000。优选的K5原料的分子量分布在约1,500到约50,000范围内，平均分子量为20,000到25,000。
本文所述的K5及其衍生物的分子量采用已知分子量的肝素组分作为标准来计算，本发明的所有分子量均以道尔顿(D)表示。
原料可以是预先纯化的K5，例如，该纯化的K5已经用已知的方法除去了内毒素、热原或其他杂质。
同样地，如果步骤(a)结束时所得的K5用作药物用途或用来制备作药物用途的N，O-硫酸化K5，它也要提纯除去热原和内毒素。
实际上，将K5原料溶于2-5M溶液中，最好是浓度为0.5-10％的氯化钠溶液，并在0-8℃下用1-3体积的异丙醇处理，再加入盐最好是氯化钠将所得的溶液配成2-4M。
保持在同样的温度1-18小时后，步骤(a)的产物完全沉淀，经过滤或离心分离出来。若产物的纯度未达到要求，重复步骤(a)。将所得的固体产物重溶于水中，用膜超滤回收。
步骤(a)结束时得到一种K5，其具有与原料相同的性质，但基本上不含有亲油物质。
实际上，用一种方法可获得不含亲油物质的K5，该方法包括(a1)在4℃用1体积异丙醇处理K5，该K5由发酵而成并溶于4M氯化钠溶液中，(a2)加入计算量的氯化钠饱和溶液将所得的盐溶液配成3M，(a3)该溶液在4℃放置过夜，以及(a4)离心分离产物，超滤除去盐类。
用异丙醇提纯可得到不含亲油物质、纯度高于99％的K5。这种K5在随后步骤(c)中可被高度硫酸化。
在步骤(b)中，按照已知的碱性水解方法进行N-脱乙酰化作用，例如，含有硫酸肼的肼，或碱如碱性氢氧化物，象氢氧化钠或氢氧化钾水溶液。最好在40-80℃下在氢氧化钠水溶液中控制反应过程来进行反应。一般来说，最多30小时但实际上经过12-24小时后就会完成N-脱乙酰化，用酸最好是盐酸中和介质的碱性。
然后，在碱性碳酸盐如碳酸钠存在下用N-硫酸化试剂处理含有K5和盐类的溶液，例如，N-硫酸化试剂是带有硫酐(三氧化硫)的叔有机碱加成物，象吡啶·三氧化硫(C5H5N·SO3)加成物或者三烷基胺.三氧化硫加成物，象三甲胺·三氧化硫加成物。反应可在室温(20-30℃)下进行，但也可在较高的温度(最高约65℃)下进行以缩短反应时间。可同时加入碱性碳酸盐和硫酸化试剂，或者先将碱性碳酸盐加入母液，再在5分钟至12小时内逐滴加入硫酸化试剂。反应结束时在室温下用酸最好是盐酸将混合液调pH为7.5-8，并通过例如渗滤除去盐类。所得到的溶液含有碱性盐N-硫酸化K5，对该溶液实施下面的步骤(c)，或者可将它浓缩，用常规方法以钠盐形式分离出N-硫酸化K5。所得到的90-100％N-硫酸化K5被硫酸化。
在步骤(c)中，使步骤(b)中得到的含碱性N-硫酸化K5的溶液通过阳离子交换树脂如IR 120 H+中和至酸性pH值。所得的酸性溶液用有机叔或季碱处理，例如三烷基胺，象三甲胺，或者四烷基氢气化铵，最好是四丁基氢氧化铵，浓缩至最小体积，冻干。所分离的N-硫酸化K5铵盐悬于极性疏质子溶剂如二甲基甲酰胺或二甲亚砜中，用O-硫酸化试剂如加成物C5H5N·SO3处理。该加成物C5H5N·SO3可为固态或在溶于同一种极性疏质子溶剂中。硫酸化作用可在室温(20-30℃)至70℃之间，最好在40至60℃之间进行2至24小时。
反应结束时，溶液在室温下用氯化钠饱和丙酮溶液处理直至完全沉淀。过滤分离沉淀物与溶剂，沉淀物溶于最小量的去离子水(例如100毫升)中，加入氯化钠配成0.2M溶液。该溶液用2N氢氧化钠调至pH7.5-8，并加入丙酮直到完全沉淀。过滤后，将固体溶于100毫升去离子水中，按步骤(b)所述的方法从残留的盐超滤纯化该固体。
对所得的产物的冻干样本作13C-NMR分析，如果发现在过硫酸化期间有部分发生N-脱硫酸化作用，使该产物进行步骤(d)。
在步骤(d)中，将步骤(c)结束时所得的产物在步骤(b)的条件下用N-硫酸化试剂处理，直至完成N-硫酸化作用，若N-硫酸化未完成，重复该步骤。
所得的N，O-过硫酸化K5以其钠盐形式分离出来，用已知的方法例如装有适当树脂的离子交换、用溶剂沉淀或通过膜超滤等方法可将钠盐转化为另一种盐，如钾盐、钙盐、镁盐、铝盐、锌盐或复合盐。
本发明的另一方面在于提供一种由发酵而成基本上不含亲油物质的纯K5。
通过1H-NMR谱图、紫外光谱、咔唑反应或测定蛋白质的试剂盒可分析测定由发酵制成的新型纯K5的纯度。这些分析证实了步骤(a)结束时所得到的K5的基本性质是其1H-NMR谱图不存在低于1.5ppm区段的信号。而且也检测不到核酸(用标准紫外线分光光度计测得260纳米处的吸光值为0)，根据BioRad试剂盒测得蛋白质不高于0.5％，宜低于0.25％，优选低于0.1％，最好低于0.03％。
事实上，步骤(a)结束时所得到的新型纯K5不含有亲油物质和核酸。所用的“基本上”指没有亲油物质，“检测不到的”指核酸的含量是所使用的仪器灵敏度无法显示上述杂质的存在。
所以，业已确定，以此方式得到的纯K5多糖的1H-NMR谱图没有低于1.5ppm亲油物质甲基的信号。
所得的新型纯化K5化合物优选具有较低分子量，特别是分子量分布在约1,500到约15,000范围内，优选约2,000到约9,000，平均分子量约5,000，或者具有较高分子量，特别是分子量分布在约10,000到约50,000范围内，优选约20,000到约40,000，平均分子量约30,000。优选的K5原料的分子量分布在约1,500到约50,000范围内，平均分子量为20,000到25,000，所述的K5化合物可以制备硫酸化程度高的N，O-过硫酸化K5。
所以，本发明的另一方面在于是提供一些硫酸化程度高于3.2的新型N，O-过硫酸化K5化合物及其盐类。该新型N，O-过硫酸化K5多糖的硫酸化程度优选为3.2至4，更优选为3.5至4，最好是3.7到4。该新型N，O-过硫酸化K5的盐类最好是药学上可接受的。
所述N，O-过硫酸化K5优选具有较低分子量，特别是分子量分布在约2,000到约16,000范围内，优选约2,500到约10,000，平均分子量约6,500，或者具有较高分子量，特别是分子量分布在约13,000到约65,000范围内，优选约25,000到约50,000，平均分子量约40,000。本发明的N，O-过硫酸化K5的分子量最好分布在约2,000到约65,000范围内，平均分子量为25,000-30,000。此外，通过解聚而得到的具有极低平均分子量如约2,000到5,000的N，O-过硫酸化K5化合物构成令人非常感兴趣的产物。
在上述方法的步骤(b)-(d)之一结束时，最好在步骤(b)结束时或者对最终的N，O-过硫酸化K5进行解聚作用，这种解聚可以制备平均分子量为2,000到5,000的N，O-过硫酸化K5。
该解聚步骤可按照公知的肝素解聚方法进行，例如用亚硝酸，再与硼氢化钠起还原反应(EP 37319)、用高碘酸钠(EP 287477)、游离基(EP 121067)或消除β位(EP 40144)。根据一优选实施例，按EP544592详细叙述的方法用亚硝酸对步骤(b)结束时所得的N-硫酸化K5进行解聚，再用硼氢化钠还原。解聚和还原结束时，使所得的低分子量产物进行步骤(c)，可任选地进行步骤(d)，并分离N，O-过硫酸化K5。
另外，这种解聚和还原方法也适用于具有高分子量的N，O-过硫酸化K5，可直接得到相应的低分子量产物。
在上述的N，O-过硫酸化K5化合物的盐类中，优选为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锌盐。
本发明的另一方面在于提供由以下方法制成的新型N，O-过硫酸化K5多糖，其硫酸化程度高于3.2，特别是3.2到4，优选为3.5到4，最好是3.7到4，所述的方法包括：
(a)在高盐水溶液中以异丙醇处理由发酵而成的K5；
(b)通过碱性水解使所得的K5受到N-脱乙酰化作用，然后用N-硫酸化试剂处理使其再受到N-硫酸化作用；
(c)在O-过硫酸化条件下，用O-硫酸化试剂处理所得的N-硫酸化K5铵盐；以及
(d)若需要，使所得的产物受到N-硫酸化作用，并将N，O-过硫酸化K5以钠盐形式分离出来，若需要可转化为另一种盐。
由上述方法得到的N，O-过硫酸化K5的硫酸化程度为3.2到4，优选为3.5到4，最好是3.7到4。
根据本发明方法得到的新型N，O-过硫酸化K5化合物，特别是其盐类，是高度阴离子化产物，可用作化妆品工业的共同佐剂，防止头发脱落，以及用作药物工业上能够捕获游离基的产物。
所述的N，O-过硫酸化K5化合物在葡萄糖胺单位的位置6-O-和2-NH-上被完全硫酸化，而在葡萄糖醛酸单位中，它们在位置2，3-O-上被硫酸氢化或者(2-O-或3-O-)被单硫酸化，葡萄糖醛酸单位中硫酸根的百分比取决于硫酸化程度。
所以，本发明的另一个目的在于提供由混合链组成的新型N，O-过硫酸化K5，其中所述链的至少90％以下列一般式(I)表示，
Figure A0280888700161
式中，n是3到100，R和R’是氢或SO3 -，R和R’至少之一不是氢，附带条件是：
-R和R’二者均为SO3 -在n单位中占60％到100％；
-R和R’其中之一为氢，另一个为SO3 -，在n单位中占0到40％；硫酸化程度是3.2到4，以及
相应的阳离子是化学上或药学上可接受的阳离子。
本文的术语“化学上可接受的”指一种用于可作进一步合成的阳离子，如铵或(C1-C4)三烷基铵离子，或者指一种用于纯化产物的阳离子，优选的阳离子是以上所述的钠离子、钾离子、镁离子、铝离子和锌离子。
在所述混合链多达10％的剩余链中，为了达到一定的硫酸化程度，葡萄糖胺单位中一定量的硫酸根可自2位处分开并转移到所述葡萄糖胺单位的3-OH基团上。
它们的阴离子含量高导致本发明的N，O-过硫酸化K5多糖对游离基团具有良好的活性。由于它们的毒性低，所以它们可用作制备药物和化妆品组合物的活性成分。
所以，本发明还提供一些药物组合物，其活性成分为药学上有效量的N，O-过硫酸化K5或其药学上可接受的盐类之一，并掺有药学赋形剂，所述N，O-过硫酸化K5的硫酸化程度高于3.2，优选为3.2到4，更优选为3.5到4，最好是3.7到4。
在供口服、皮下、静脉、肌肉内、经皮或局部给药的本发明的药物组合物中，活性成分最好以剂量单位形式给予，并掺有常规的药学载体或介质。
服药量可随患者的年龄、体重和健康状况而改变。这种服药量包括经静脉、皮下、口服、肌肉内、经皮或局部途径给药的剂量为1到1,000毫克，优选为10到750毫克，最好为250到500毫克，1日1次到3次。
本发明的又一方面内容涉及一种化妆品组合物，该组合物的活性成分之一为N，O-过硫酸化K5或其药学上可接受的盐类之一，并掺有化妆品赋形剂，所述N，O-过硫酸化K5的硫酸化程度高于3.2，优选为3.2到4，更优选为3.5到4，最好是3.7到4。
选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锌盐的一种盐构成本发明组合物的有效活性成分。
最后，本发明的又一方面还在于提供一些含有本发明新型纯化的K5为活性成分的药物和化妆品组合物。
制备方法I
由大肠杆菌制备K5多糖
首先采用下列培养基在烧瓶进行发酵：
脱脂大豆                   2克/升
磷酸氢钾                   9.7克/升
磷酸二氢钾                 2克/升
氯化镁                     0.11克/升
柠檬酸钠                   0.5克/升
硫酸铵                             1克/升
葡萄糖                             2克/升
水                                 1,000毫升
pH＝7.3
培养基在120℃灭菌20分钟。另外准备葡萄糖溶液，在120℃灭菌30分钟，在灭菌条件下将该溶液加到培养基中。向烧瓶中倾倒地注入大肠杆菌细胞Bi 8337/41(O10∶K5∶H4)悬浮液，所述悬浮液含胰蛋白大豆琼脂的斜面，并且在37℃恒定搅拌(160rpm，每转6厘米)保温24小时。测量细菌生长，用显微镜计算细胞。在另一步骤中，把0.1％上述烧瓶培养基倒入含有上述同一种培养基的14升Chemap-Braun发酵罐中，在下列条件发酵18小时：曝气1vvm(vvm是每分钟每液体体积的空气体积)、搅拌速度400rpm、温度37℃。测量发酵期间的pH值、氧气、残留的葡萄糖、产生的K5多糖及细菌生长。发酵结束时将温度升到80℃，保持10分钟。以10,000rpm的转速离心分离细胞与培养基，上清液用SS 316(MST)组件超滤，体积减至1/5，所述组件配有公称截留分子量为800到10,000D的PES滤膜。再在4℃加入4体积丙酮沉淀K5多糖，沉淀物4℃放置一晚，最后10,000rpm离心20分钟或过滤。接着，在37℃用Aspergillus Orizae的II型蛋白酶在含0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.1M氯化钠和0.15M pH8乙二胺四乙酸(EDTA)(10毫克/升滤液)中去蛋白90分钟。该溶液在配有公称截留分子量为10,000D的SS 316组件上超滤，用1M氯化钠提取2次，用水洗至超滤液的吸收消失。再次用丙酮沉淀K5多糖，发酵罐的产率为850毫克/升。通过测定糖醛酸(咔唑方法)、质子和碳核磁共振、紫外线及蛋白含量来测量多糖的纯度。测得的纯度超过80％。由此所得的多糖由两种不同分子量的组分组成，用75HRPharmacia层析柱通过高效液相色谱法测定它们的分子量分别是30,000和5,000D，采用两根串联Bio-sil SEC 250柱(BioRad)测得单一组分的停留时间约9分钟，室温下以硫酸钠为流动相，流动速度为0.5毫升/分钟。这种测量是对照已知分子量的肝素组分的曲线而进行。
所得到的纯化K5的质子核磁共振1H-NMR见图1。
应注意，低于1.5ppm的区域中有许多由亲油物质的甲基产生的信号。
实施例1
K5的纯化
将5克制备方法1结束时所得到的K5溶于100毫升含4M氯化钠的水溶液中，4℃恒温，然后向所得到的溶液加入1体积冷却异丙醇。加入计算量的氯化钠饱和溶液配成3M盐溶液，冷却溶液低温(约4℃)放置过夜。以10,000rpm的转速离心20分钟分离所形成的沉淀，透析一晚，然后作1H-NMR分析，其低于1.5ppm的区域必须无信号，以此控制产物的纯度。若需要，可重复溶于4M氯化钠水溶液和用异丙醇沉淀的步骤。将沉淀物溶于水中，在截留分子量为10,000D的微型板滤膜(Millipore)上超滤直到盐消失。得到的K5的纯度至少为99％，其1H-NMR谱图见图2。
可以看出，低于1.5ppm的区域没有任何亲油性杂质。
用BioRad试剂盒计算蛋白质含量为0.02％，但检测不到核酸(260纳米处吸光值为0)。
实施例2
N，O-过硫酸化K5的制备
(i)N-脱乙酰化作用
取10克实施例1制成的纯K5多糖，溶于1,000毫升2N氢氧化钠溶液中，所制成的溶液在60℃保持24小时。溶液冷却至室温，再用6N盐酸中和pH值。
(ii)N-硫酸化作用
40℃下将16克碳酸钠加入含脱乙酰化K5的溶液中，然后在4小时内加入16克吡啶.三氧化硫。经过24小时反应结束，溶液冷却至室温，再用5％盐酸溶液调pH值为7.5-8。采用截留分子量为1,000D的螺旋膜(Prepscale Cartridge-Millipore)通过渗滤从盐纯化该产物。当渗透液的导电率少于1,000μS优选少于100μS时中止纯化过程。用同一个浓缩透析系统减少内部透析，直到多糖浓度为10％。将浓缩溶液冻干。13C-NMR分析显示没有N-乙酰残基或NH2残基。
(iii)O-过硫酸化作用
将步骤(ii)结束时所得到的冻干产物溶于100毫升去离子水中，冷浴使该溶液冷却至10℃，再通过阳离子交换树脂IR120H+(100毫升)。层析柱和容器都保持在10℃。待含有该样本的溶液通过后，用去离子水清洗树脂直到渗透液的pH值大于6(约3体积去离子水)。酸性溶液用四丁基氢氧化铵(15％水溶液)调至中性(pH值为7)，然后浓缩至最小体积并冻干。将四丁基铵盐溶于400毫升二甲基甲酰胺中，加入35克固体形式C5H5N·SO3。溶液在50℃保持24小时。反应结束时将溶液冷却至室温，加入3体积氯化钠饱和丙酮溶液，冷却至4℃直至完全沉淀(12小时)。过滤分离所得的沉淀物与溶剂，将沉淀物溶于最小量的去离子水(约100毫升)中，加入氯化钠配成0.2M溶液。
该溶液用2N氢氧化钠调pH为7.5-8，并用2体积丙酮处理直到完全沉淀。过滤分离沉淀物与溶剂。将所得的固体溶于100毫升去离子水中，如步骤(ii)所述那样用1,000D的螺旋膜(Prepscale Cartridge-Millipore)从残留的盐中超滤纯化该固体。
(iv)N-硫酸化作用
按照步骤(ii)中进行N-硫酸化作用的方法，处理所得含O-硫酸化产物的溶液。该产物的平均分子量为15,000D，硫酸盐/羧基之比为3.84。通过13C-NMR确定硫酸根的分布如下：组成性二糖的葡萄糖胺单位被全部N-硫酸化和6-O硫酸化，而葡萄糖醛酸单位有30％被单硫酸化，70％被硫酸氢化。
实施例3
N，O-过硫酸化K5的制备
以M.Manzoni等人(1996)所述的方法得到并作特性分析的K5为原料。该制成的K5采用实施例1所述的方法提纯，得到了纯K5，它不存在低于1.5ppm的信号，不含核酸，蛋白质含量为0.5％。按实施例2所述的方法操作，得到平均分子量为13,000D且硫酸盐/羧基之比为3.54的N，O-过硫酸化K5。

Claims (33)

1.一种硫酸化程度高于3.2的N，O-过硫酸化K5的制备方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)在高盐水溶液中使发酵而成的K5与异丙醇反应；
(b)使所纯化的K5受到N-脱乙酰化作用，然后再用N-硫酸化试剂处理使其受到N-硫酸化作用；
(c)在O-过硫酸化条件下，以O-硫酸化试剂处理所得到的N-硫酸化K5铵盐；以及
(d)若需要，使所得的化合物受到N-硫酸化作用，并将N，O-过硫酸化K5分离出来。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：原料K5的分子量分布在约1,500到约15,000范围内。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的分子量分布在约2,000到约9,000范围内，平均分子量约5,000。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：原料K5的分子量分布在约10,000到约50,000范围内。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的分子量分布在约20,000到约40,000范围内，平均分子量约30,000。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：原料K5的分子量分布在约2,000到约50,000范围内，平均分子量为20,000-25,000。
7.如权利要求1至6中任何一项所述的方法，其特征在于：在步骤(b)中用氢氧化钠进行碱性水解。
8.如权利要求1至7中任何一项所述的方法，其特征在于：吡啶·三氧化硫或三甲胺·三氧化硫加成物用作N-硫酸化试剂。
9.如权利要求1至8中任何一项所述的方法，其特征在于：在步骤(c)中，四丁基铵盐用作铵盐。
10.如权利要求1至9中任何一项所述的方法，其特征在于：在步骤(c)中，吡啶·三氧化硫加成物用作硫酸化试剂。
11.如权利要求1至10中任何一项所述的方法，其特征在于：N，O-过硫酸化K5以其钠盐形式分离出来。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的钠盐可转化为另一种盐。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的其他盐选自钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锌盐。
14.一种基本上不含亲油物质的纯K5多糖或其盐。
15.如权利要求14所述的纯K5，其特征在于：所述K5在1H-NMR谱图中低于1.5ppm的区域没有信号。
16.如权利要求15所述的K5多糖，其特征在于：在紫外光谱260纳米处检测不到核酸，而蛋白质含量低于0.5％。
17.由一种方法可获得的基本上不含亲油物质的K5多糖，其特征在于：在所述的方法中(a1)用1体积异丙醇处理在4℃4M氯化钠溶液中溶解的发酵而成的K5；(a2)加入计算量的氯化钠将该盐溶液配成3M；(a3)该溶液在4℃放置过夜；以及(a4)离心分离该产物，超滤除去盐类。
18.一种可由以下方法获得的硫酸化程度高于3.2的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述的方法包括：
(a)在高盐水溶液中，以异丙醇处理由发酵而成的K5；
(b)使所得的纯化K5受到N-脱乙酰化作用，然后再用N-硫酸化试剂处理受到N-硫酸化作用；
(c)在O-过硫酸化条件下，用O-硫酸化试剂处理所得的N-硫酸化K5铵盐；以及
(d)若需要，使所得的产物受到N-硫酸化作用，并将N，O-过硫酸化K5以其钠盐形式分离出来，若需要可将钠盐转化为另一种盐。
19.一种硫酸化程度高于3.2的N，O-过硫酸化K5多糖或其盐。
20.如权利要求19所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述K5多糖的硫酸化程度为3.5到4。
21.如权利要求20所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述K5多糖的硫酸化程度为3.7到4。
22.如权利要求19-21中任何一项所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述K5多糖的分子量分布在约2,000到约16,000范围内。
23.如权利要求22所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述的分子量分布在约2,500到约10,000范围内，平均分子量约6,500。
24.如权利要求19-21中任何一项所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述K5多糖的分子量分布在约13,000到约65,000范围内。
25.如权利要求24所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述的分子量分布在约25,000到约50,000范围内，平均分子量约40,000。
26.如权利要求19-21中任何一项所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述K5多糖的分子量分布在约2,000到约65,000范围内，平均分子量为25,000-30,000。
27.如权利要求19-21中任何一项所述的N，O-过硫酸化K5多糖，其特征在于：所述的K5多糖通过解聚获得，其平均分子量为2,000到5,000。
28.一种权利要求19-27所述的N，O-过硫酸化K5在药学上可接受的盐。
29.如权利要求28所述的盐，其特征在于：所述的盐选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锌盐。
30.由一种混合链组成的N，O-过硫酸化K5，其特征在于：所述链至少90％以下列一般式表示：
式中，n是3到100，R和R’是氢或SO3 -，R和R’至少之一不是氢，附带条件是R和R’二者均为SO3 -在n单位中占60％到100％，R和R’之一为氢，另一个为SO3 -，在n单位中占0到40％；硫酸化程度是3.2到4，相应的阳离子是化学上或药学上可接受的阳离子。
31.如权利要求30所述的N，O-过硫酸化K5，其特征在于：所述的阳离子选自钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铝离子和锌离子。
32.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括如权利要求19-31中任何一项所述的药理学上有效量的N，O-过硫酸化K5，作为其一活性成分，并掺合药学赋形剂或载体。
33.一种化妆品组合物，其特征在于：所述化妆品组合物包括如权利要求19-31中任何一项所述的化妆上有效量的N，O-过硫酸化K5，作为其一活性成分，并掺合化妆品赋形剂或载体。
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