CN1671744A - 低分子量过硫酸化多糖 - Google Patents

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Abstract

描述的LMW－K5－N，O－过硫酸盐具有3.2到4的硫酸化度和约3000到6000的平均分子量，其可从相应K5－N，O－过硫酸盐的解聚制得，或者从LMW－K5－N－硫酸盐开始通过其叔胺或季铵盐的O－过硫酸化以及随后对由此制得的K5－胺－O－过硫酸盐进行N－再硫酸化而制得。另外，含有这些LMW－K5－N，O－过硫酸盐的药物组合物具有抗血管形成和抗病毒活性，特别是抗HIV－1活性。还描述LMW－K5－N－硫酸盐中间体。

Description

低分子量过硫酸化多糖
发明领域
本发明涉及从K5多糖衍生的新颖N，O-过硫酸化(oversulfate)低分子量多糖，涉及其制备方法，涉及所述方法中的新颖关键中间体，还涉及含有所述过硫酸化低分子量多糖的药物组合物。更具体地说，本发明涉及具有3.2和4之间的硫酸化度和约3000到6000的平均分子量的N-脱乙酰化和N-硫酸化K5。
发明背景
葡糖胺聚糖，比如肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸软骨素和透明质酸，是从不同动物组织中工业提取的生物聚合物。
具体而言，肝素主要是从猪肠粘膜或牛肺中提取得到的，是分子量分布从约3000到30000 D的多分散性共聚物，由主要由用α-1→4或β-1→4键连接的糖醛酸(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)和氨基糖(葡糖胺)组成的混合链形成。在肝素中，糖醛酸单元可以在2位被O-硫酸化，葡糖胺单元以存在的葡糖胺单元的约0.5％被N-乙酰化或N-硫酸化，6-O硫酸化和3-O硫酸化。肝素性质及其在哺乳动物体内的自然生物合成如Lindahl等于1986年在Lane，D.和Lindahl，U.(编辑)的“肝素，化学和生物性质；临床应用”，Edward Arnold，London，第159-190页中，Lindhal，U，Feingold D.S.e Roden L在1986 TIBS，11，221-225中，和Conrad H.E.在“肝素结合蛋白质”，第二章：类肝素结构，Academic Press，1998中所述。
除了主要的抗凝血和抗血栓形成活性，肝素还能产生抗血脂，抗增殖，抗病毒，抗肿瘤和抗转移活性，但是由于其可导致出血的抗凝血活性副作用，阻碍了其作为药物的应用。
现有技术说明
已知W.F.Vann等人(1981)在欧洲生物化学杂志116，359-364中说明的从大肠杆菌菌株分离的囊状多糖(以下简称“K5”)由重复二糖单元形成的混合链组成，重复二糖单元由连接β1→4的D-葡糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺形成，而二糖单元D-葡糖醛酸基-N-乙酰基葡糖胺连接α1→4，从而显示与肝素和硫酸乙酰肝素的N-乙酰基heparosan生物合成前体相同的重复序列(A)。
Figure A0381757100121
肝素前体N-乙酰基heparosan和K5多糖之间与K5及其衍生物的生物活性无关的唯一区别是，在聚合物某些链的非还原性端基4(5)位处存在双键，如以下EP 489647和EP 544592中所述。
在最初这些文献公开之后，其他论文和专利申请描述了分子量从几千到几十万道尔顿的大肠杆菌K5多糖的制备方法。比如，可提到EP 333243，IT1230785，EP 489647，EP 544592，WO 92/17507，WO 01/02597，和M.Manzoni等人于1996年在生物技术通讯，18(4)，383-386中的论文。
文献EP 489647和EP 544592公开了具有抗凝血和抗血栓形成活性的低分子量和高分子量的N，O硫酸盐heparosan，IT 1230785，WO 92/17507，WO96/14425，WO 97/43317，WO 98/42754，WO 01/72848和US 2002/0062019描述了具有抗血栓形成活性的N-脱乙酰化-K5-N-硫酸盐的衍生物，其具有一定数量的在C5位处与艾杜糖醛酸单元成差向异构的葡糖醛单元，WO 98/09636描述了具有抗转移活性的N-脱乙酰化-K5-N-硫酸盐。
文献US 2002/0062019描述了制备表N，O-硫酸化-K5衍生物的方法，该物质具有控制凝血的活性，硫酸化度是2.3到2.9，分子量是2000到30000，或者是4000到8000，或者是18000到30000。所述方法包括以下步骤：(s-a)K5多糖的N-脱乙酰化和制得K5-胺的N-硫酸化，(s-b)N-硫酸化-K5的差向异构化，(s-c)表K5-N-硫酸盐的O-过硫酸化，(s-d)部分O-脱硫酸化，(s-e)选择性6-O-硫酸化，(s-f)制得产物的N-硫酸化，任选对步骤(s-b)-(s-f)结束时所获得的任何产物进行解聚。所述文献还描述了分子量是7400，硫酸化度是2.3到2.9的N-硫酸化-表K5，通过上述步骤(s-a)-(s-f)和(s-f)步骤之后的亚硝酸(nitrous)解聚而制得。
同一文献描述了分子量约为5000，也能进行(s-a)-(s-f)步骤反应的K5片段。
作为本申请参考文献的待审意大利专利申请MI2001A/00397(WO 02/068477)描述了硫酸化度大于3.2的K5-N，O-过硫酸-衍生物，其从不含亲脂性物质的K5或分子量约为5000的K5片段开始通过(a)N-脱乙酰化/N-硫酸化，(b)O-过硫酸化，和(c)N-再硫酸化制得。该文献提到通过K5-N，O-过硫酸盐的解聚制得的平均分子量为2000到5000的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，或者直接通过步骤(a)-(c)从上述K5片段制得的平均分子量约为6500的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
上述引用文献中都没有描述LMW-K5-N-硫酸盐，任选40％-60％被差向异构化，其中实际上不含NH2或N-乙酰基。
而且，D.Leali等在题为“成纤维细胞生长因子2拮抗活性和硫酸化大肠杆菌K5多糖衍生物的血管抑制(amgiostatic)能力”，发表于J.Biol.Chem2001(10月12日)，276(41)，37900-37908(Leali 2001)中的论文里描述了一种平均分子量为15000，硫酸化度为3.84的K5-N，O-过硫酸盐，该物质表现出很好的抗血管形成活性，对于在培养12天内形成新血管具有70％的抑制率。
为了使术语统一和本文更容易理解，在本说明书中使用了以下单数或复数形式的含义和常用表达方式。具体包括：
-“K5”或“多糖K5”是指通过发酵从大肠杆菌制得的囊状多糖，即由重复二糖单元A组成的混合链，任选在上述非还原性端基处含有双键，只要它是按照文献中所述方法，特别是按照Vann 1981，Manzoni M等在生物活性和相容性聚合物杂志，1996，11，301-311(“Manzoni 1996”)，按照WO 01/72848或US 2002/0062019 A1的实施例12中所述方法制备和提纯；本领域技术人员显然能将这里所述内容应用于任何N-乙酰基heparosan；
-“K5胺”是指至少95％经过N-脱乙酰化的K5，但通常无法用目前的NMR仪器检测到乙酰基；
-“K5-N-硫酸盐”是指至少95％经过下述N-脱乙酰化和N-硫酸化的K5，但通常无法用目前的NMR仪器检测到乙酰基；
-“K5-胺-O-过硫酸盐”是指硫酸化度至少是2.2的O-硫酸化-K5-胺；
-“K5-N，O-过硫酸盐”是指硫酸化度至少是3.2的N，O-硫酸化-K5-胺。
而且：
-上述的术语和常用表达方式是指发酵后分离的K5多糖，通常其分子量分布是约1500到50000，平均分子量是12000-25000，优选是15000-25000；
-除了特定分子量分布以外，在前面用首字母缩写“LMW”(低分子量)修饰的上述术语和常用表达方式是指平均分子量最高12000的低分子量产物；
-修饰分子量的“约”是指粘度法所测得分子量±二糖单元理论分子量，包括钠的原子量，对于K5-N-硫酸盐计算值为461，对于硫酸化度为3.87的K5-N，O-过硫酸盐是765；
-后面接有“-衍生物”的上述术语和常用表达方式是指来自天然K5和低分子量K5的衍生物，不论其是从K5或其衍生物的分馏还是通过解聚而制得；
-除非另有指明，否则“硫酸化度”是指SO3-/COO-的比值，也可以用每个二糖单元的硫酸基数目表示，按照Casu B.等人在“糖类研究”，1975，39，168-176(Casu 1975)中所述电导方法测量；
-除非另有指明，否则分子量是按照Johnson等在“糖类研究”，51(1976)第119-127页中所述粘度法测量的，使用的标准样品的分子量由HPLC计算而得；
-“主要组分”是指组成LMW-K5-N-硫酸盐，K5-胺-O-过硫酸盐或LMW-K5-N，O-过硫酸盐的混合物中最具代表性的组分，由HPLC所测得分子量曲线的峰确定；
-“O-过硫酸化条件”是指例如按照B.Casu等在“糖类研究”，1994，263，271-284(Casu 1994)中所述方法C进行的O-硫酸化；
-术语“烷基”是指直链或支链烷基，而“四丁基铵”是指四(正丁基)铵基团。
发明概述
现已发现能对K5-N-硫酸盐进行解聚，获得新颖的LMW-K5-N-硫酸盐衍生物，以此作为制备新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐的有用原料。优选还能获得平均分子量非常低的新颖LMW-K5-N-硫酸盐，具体而言其平均分子量是约2000到4000，更具体地说，特定LMW-K5-N-硫酸盐是由主要化合物为十糖或十二糖或十四糖的混合物形成的。这些新颖的LMW-N-硫酸盐是制备具有抗病毒和/或抗血管形成活性，而没有抗凝血活性的LMW-K5-N，O-过硫酸盐有适用中间体。
更具体地说，已发现平均分子量约为3000到6000的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，特别是由主要组分为十糖，十二糖或十四糖的混合物所组成，硫酸化度为3.2到4的LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有比Leali 2001所述的K5-N，O-过硫酸盐更高的抗血管形成活性。
发现所述平均分子量约为3000到6000的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐，特别是由主要组分为十糖，十二糖或十四糖的混合物所组成的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，不具有抗凝血活性，但是对HIV-1病毒具有良好的活性。
另外还发现可以从所述LMW-K5-N-硫酸盐开始，制得具有高硫酸化度的新颖LMW-O-硫酸化-K5-胺，其制备过程是：制备所述LMW-K5-N-硫酸盐的叔胺或季铵盐，注意保持pH约为7，使反应混合物保护30-60分钟，然后用O-硫酸化反应物在O-过硫酸化条件下处理所制得的盐。对上述LMW-K5-胺-O-过硫酸盐进行N-硫酸化，制得新颖的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
发明详细说明
本发明的目的是提供平均分子量约为3000到6000，硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.7到3.9的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
在本发明的这些新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐中，特别令人感兴趣的是平均分子量是3750-4250，4750-5250或5750-6250的化合物。
优选化合物是由其中主要组分具有结构式I的混合链所形成的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，
Figure A0381757100151
其中q是4，5，6，7或8，R，R′和R″代表氢或SO3-基团，硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
在上下文中，术语“化学可接受”是指可用于化学合成的阳离子，比如钠，铵，四(C1-C4)烷基铵，或者用于产物提纯的阳离子，而“药物可接受”的含义是不言自明的。优选阳离子是来自碱金属，碱土金属，铵，四(C1-C4)烷基铵，铝和锌的离子。
可以通过Leali 2001中所述类型的K5-N，O-过硫酸盐的解聚和其中所述方法制备本发明的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
所述解聚是按照肝素解聚的已知方法进行的，比如按照EP 373 19，WO82/03627或EP 544592中所述N，O-硫酸化-K5的解聚方法进行。优选用亚硝酸钠和盐酸进行解聚(“亚硝酸(nitrons)解聚”)，然后用硼氢化钠原位还原。
通过适当控制解聚反应，特别是使用不同量的亚硝酸钠，能制得具有要求分子量的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
在一个优选实例中，比如从下述制备方法IV所制得的1克K5-N，O-过硫酸盐开始，将起始产物溶解在100-200毫升的去离子水中，并在4℃恒温。然后加入适量亚硝酸钠，以达到约为3000到6000的要求平均分子量。因此，从分子量为20000(其分子量是用配备了BioSil 250 Biorad柱的HPLC并使用已知分子量的肝素作为标准测得的)的K5-N，O-过硫酸盐开始，应当加入以0.2％的浓度溶解在水中的160到230毫克亚硝酸钠。使含有K5-N，O-过硫酸盐和亚硝酸钠的溶液保持4℃，加入冷却至4℃的0.1N HCl，调节pH至2。使之反应20-40分钟，然后用0.1N NaOH中和。使制得产物达到室温，并用如硼氢化钠(250-500毫克溶解在50-100毫升水中)还原剂处理，使之反应4-8小时。用0.1N HCl调节pH至5-5.5，除去过量硼氢化钠，并继续反应2-4小时。最后，用0.1N NaOH中和溶液，减压蒸发浓缩产物之后，用丙酮或乙醇沉淀回收产物。
对K5-N，O-过硫酸盐进行亚硝酸解聚然后用例如硼氢化钠还原所制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，大部分所述混合链的还原端基处存在具有结构(a°)的硫酸化2，5-脱水甘露(anhydromano)单元，
Figure A0381757100161
其中X′代表甲酰基或羟甲基，R ″代表氢或SO3 -。
具体地说，优选产物LMW-K5-N，O-过硫酸盐是通过K5-N，O-过硫酸盐的亚硝酸解聚和任选随后用例如硼氢化钠还原而制得的，该LMN-K5-N，O-过硫酸盐由其中主要组分是具有结构式I°的化合物的混合链组成，
Figure A0381757100162
其中m是4，5或6，R，R′和R″是氢或SO3 -，X′是甲酰基或羟甲基，硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9，相应的阳离子是化学或药物可接受的。每种混合物的平均分子量优选是3750-4250，4750-5250，5750-6250。
这些新颖的LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有与总抗凝血活性成较佳比例的高抗血管形成活性，能用于制备治疗血管形成依赖病症的药物组合物，其使用剂量能显著降低出血副作用的风险。在人类中存在病症中能用LMW-K5-N，O-过硫酸盐进行治疗的血管形成依赖病症是，例如糖尿病性视网膜病，移植角膜的新血管形成，新生血管性青光眼，沙眼，晶状体后纤维发育不良，牛皮癣，脓性青光眼，动脉粥样斑块的发展，血管瘤和血管纤维瘤，动脉-静脉畸形，关节炎，和实体肿瘤的组合治疗中。
更具体地说，本发明的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐对Ribatti D.等在J.Vasc.Res.1997，34，455-463(Ribatti 1997)中所述抑制鸡胚胎绒膜尿囊膜(CAM)上血管形成的体内测试是活性的。在这个测试中，在生长的第8天将Gelfoam(Upjohn)的海绵植入物施加于鸡胚胎的CAM上，然后立刻施加含有50微克LMW-K5-N，O-过硫酸盐的3微升生理盐水溶液，或者作为Leali 2001中所述分子量为15000，硫酸化度是3.84的K5-N，O-过硫酸盐的参考化合物。每天检查海绵，直到培养的第12天。通过在不同的生长日对海绵周围观察到的宏观血管进行计数和化合物对其为活性的胚胎(蛋)进行计数，得到血管形成的数目。观察到在嵌入LMW-K5-N，O-过硫酸盐的海绵周围生长的血管数量等于在嵌入K5-N，O-过硫酸盐的海绵周围形成的血管数目，但是对LMW-K5-N，O-过硫酸盐对其为活性的胚胎数量更多。
还可以按照未在文献中描述的方法制备平均分子量约为3000到6000的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，通常该方法对制备平均分子量约为3000到12,000的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐是适用的。所述新颖方法和新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐是本发明的另一方面。
因此，本发明还提供了一种制备硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐的方法，所述方法包括：
(a)用叔胺或氢氧化季铵处理酸性形式的LMW-K5-N-硫酸盐，使反应混合物静置30-60分钟，由此保持溶液pH为7，分离具有所述有机碱的盐；
(b)在O-过硫酸化条件下用O-硫酸化反应物处理由此制得的所述LMW-K5-N-硫酸盐的叔胺或季铵盐；
(c)用N-硫酸化试剂处理由此制得的产物，并分离制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。通常最终产物被分离为任选被转化成另一种化学或药物可接受的盐的钠盐形式。
从K5制备LMW-K5-N-硫酸盐实际上要完成以下步骤：N-脱乙酰化，然后N-硫酸化，和最后亚硝酸解聚，随后还原LMW-K5-N-硫酸盐，如上所述，将LMW-K5-N-硫酸盐作为本发明方法的原料。所述还原是必需的，因为LMW-K5-N-硫酸盐在随后的反应中，对2，5脱水甘露糖基团中甲酰基的影响是未知的。这时，如上所述控制解聚反应，就能制得平均分子量约为1500到10000，优选约为1500到7500的LMW-K5-N-硫酸盐，平均分子量是从13C-NMR谱通过对2，5脱水甘露醇的C2所对应信号进行积分和对多糖链中葡糖胺的异头碳所对应信号进行积分而计算得到的。
平均分子量约为1500到7500的LMW-K5-N-硫酸盐及其化学或药物可接受的盐是可用作中间体的新颖产物，也是药物活性的。所述LMW-K5-N-硫酸盐的分子量分布约为1000到10,000。
在常用方法中，例如从1克K5-N-硫酸盐开始，将起始产物溶解在100-200毫升去离子水中，并在4℃恒温。然后加入适量亚硝酸钠，以达到约2000到4000的要求平均分子量。因此，从分子量为20000(分子量是用配备有BioSil250 Biorad柱的HPLC和已知分子量的肝素标准测得的)的K5-N-硫酸盐开始，应当加入以0.2％的浓度溶解在水中的330到480毫克亚硝酸钠。将含有K5-N-硫酸盐和亚硝酸钠的溶液保持在4℃，加入冷却至4℃的0.1N HCl，使pH等于2。反应20-40分钟，然后用0.1N NaOH中和。将制得的产物升温至室温，并用如硼氢化钠(250-500毫克溶解在50-100毫升水中)还原剂处理，反应4-8小时。用0.1N HCl调节pH至5-5.5，除去过量硼氢化钠，并再反应2-4小时。最后，用0.1N NaOH中和溶液，减压蒸发浓缩产物之后，用丙酮或乙醇沉淀回收产物。
类似地，能够确定从1克K5-N-硫酸盐，制得分子量约为4000到7500，更优选至少是6000(6000-7500)的LMW-K5-N-硫酸盐所需要的亚硝酸钠量。
K5-N-硫酸盐频繁出现在文献中，本文提到的这些上述文献说明了现有技术状况。上述原料必定通过这样制得的K5-胺的N-脱乙酰化和随后N-硫酸化而制得。但是注意到，若作为原料的K5是特别纯的，特别是若其不含亲脂性物质则制备实际上不含乙酰基或NH2的K5-N-硫酸盐是容易的。而且发现，从不含亲脂性物质的K5制得的K5-N-硫酸盐更容易发生过硫酸化，如待审专利申请IT MI2001A00397(WO 02/068477)中所述。优选从按照以下制备方法I所述提纯的K5所制备的K5-N-硫酸盐开始进行解聚。所述K5-N-硫酸盐的13C-NMR谱没有显示痕量乙酰基或NH2，这在以下制备方法II进行说明。
本发明方法的优选原料是通过K5的亚硝酸解聚和随后例如用硼氢化钠还原所制得的新颖LMW-K5-N-硫酸盐，该盐由混合链组成，其中至少90％的所述链具有结构式II，
Figure A0381757100191
其中n代表2到20的数值，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
更优选的原料是由其中主要组分具有结构式II′的混合链组成的新颖LMW-K5-N-硫酸盐，
其中q是4，5，6，7，或8，相应的阳离子是化学或药物可接受的。构成本发明有利方面的LMW-K5-N-硫酸盐是从K5-N-硫酸盐通过亚硝酸解聚和随后例如用硼氢化钠还原而制得的。其平均分子量约为2000到4000。
从亚硝酸解聚步骤和随后用例如硼氢化钠还原而制得LMW-K5-N-硫酸盐，意味着在大部分所述混合链的还原端基处存在结构(a′)的2，5脱水甘露醇单元。
Figure A0381757100193
因此，事实上可以用结构式(b)表示大部分混合链的还原端基。
结构(a′)的存在对LMW-K5-N-硫酸盐及其衍生物的性质没有影响，因为可能的硫酸化只包括可能引入一个或多个硫酸基团而不会显著影响O-硫酸化衍生物的硫酸化度。优选的LMW-K5-N-硫酸盐事实上不含乙酰基。特别优选的本发明LMW-K5-N-硫酸盐是由其中主要组分是具有结构式II′的化合物混合链形成的，
Figure A0381757100202
其中m表示4，5或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
本发明另一方面涉及制备新颖LMW-K5-N-硫酸盐及其化学或药物可接受的盐的方法，其包括：对K5-N-硫酸盐进行受控的亚硝酸解聚，任选随后进行还原，并分离制得的产物。所述产物通常是以其钠盐形式，能被转化成另一种化学或药物可接受盐。在构成该硫酸盐的大部分链的还原端基处，所述LMW-K5-N-硫酸盐具有结构(a)的2，5-脱水甘露单元，
Figure A0381757100203
其中X代表甲酰基或羟甲基，优选该MLW-K5-N-硫酸盐由其中至少90％链具有结构式II的混合链或者由其中主要组分具有结构式II′或II″的混合链形成。
这些新颖LMW-K5-N-硫酸盐可以用作药物组合物的活性组分。
如果结构(a)中X代表羟甲基，则该新颖LMW-K5-N-硫酸盐是本发明制备LMW-K5-N，O-过硫酸盐方法的原料。
优选LMW-K5-N-硫酸盐具有从约1000到10000的分子量分布。
本发明方法原料LMW-K5-N-硫酸盐优选以其钠盐形式使用，除非已经有按照上述步骤(a)所制备的叔胺或季铵盐，优选是四丁基铵盐。
在本发明方法的另一个优选实例中，步骤(a)是，使原料LMW-K5-N-硫酸钠溶液通过酸性离子交换树脂，比如是IR-120 H+型的树脂，收集还含有树脂废物的洗出液，用叔胺或氢氧化季铵，优选用四丁基氢氧化铵的水溶液中和洗出液。使该溶液静置1小时，同时加入相同的碱使pH保持7，冷冻干燥分离所制得的盐。
在步骤(b)中，在20到70℃的温度下，用过量O-硫酸化试剂在极性非质子溶剂中在长达24小时的期间内进行O-过硫酸化。优选将步骤(a)中所制得LMW-K5-N-硫酸叔胺或季铵盐溶解在二甲基甲酰胺中，并在40-60℃的温度下对每个自由羟基用2-10摩尔O-硫酸化试剂处理10-20小时。优选用吡啶·SO3加合物作为O-硫酸化试剂，对每个自由羟基使用2.5-5摩尔，优选是2.5-4摩尔，优选在50-60℃进行反应，更优选在55℃反应过夜。通过加入0.1-1体积的水，并优选用氢氧化钠进行中和，用氯化钠的饱和丙酮溶液沉淀，过滤之后任选进行超滤，分离在反应结束时制得的产物。
如此制得的产物优选是硫酸化度为2.3到3的LMW-K5-胺-O-过硫酸钠盐。如此制得的钠盐可以被转化成另一种盐。这种产物的平均分子量约为3500到11000。
在步骤(c)中，用碳酸钠和N-硫酸化试剂，比如(C1-C4)三烷基胺·SO3或吡啶·SO3处理其水溶液，对LMW-K5-胺-O-过硫酸盐进行N-硫酸化，将混合物在30-50℃保持8-24小时，比如通过渗滤法分离LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
只采用上述方法的步骤(a)和(b)所制得的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐及其化学或药物可接受盐是桅本发明另一方面的新颖产物。令人吃惊地发现，LMW-K5-胺-O-过硫酸盐不仅是有用的中间体，还具有药物生物活性。
因此，本发明还提供了硫酸化度为2.3到3的新颖LMW-K5-胺-O-过硫酸盐及其化学或药物可接受的盐。优选其平均分子量约为3500到10000，更优选是大约3500到5200。
优选它们基本不含N-乙酰基。
如果使用由其中至少90％的链具有上述结构式II的混合链组成的LMW-K5-N-硫酸盐作为原料，则步骤(b)结束时制得新颖LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，该LMW-K5-胺-O-过硫酸由其中至少90％的混合链具有结构式III的混合链组成，
其中n是从2到20的整数，R，R′和R″代表氢或SO3-基团，硫酸化度是2.2到3，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
如果使用由链中主要组分具有结构式II″的混合链组成的LMW-K5-N-硫酸盐作为原料，则步骤(b)结束时制得新颖LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，该LMW-K5-胺-O-过硫酸盐由链中主要组分具有结构式III′的混合链组成，
Figure A0381757100222
其中q是4，5，6，7，或8，R，R′和R″如上文所定义，硫酸化度是2.3到3，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
这些LMW-K5-胺-O-过硫酸盐是制备其N-硫酸化衍生物时可作为中间体的新颖产物，但是它们本身具有令人感兴趣的药理性质，特别是抗自由基。
用从亚硝酸解聚和随后例如硼氢化钠还原制得的LMW-K5-N-硫酸盐制备新颖的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐时，在大部分所述混合链的还原端基处存在结构(a″)的2，5脱水甘露醇硫酸化单元，
其中R″代表氢或SO3 -。
因此，大部分所述混合链的还原端基可以用结构(b′)表示。
在上述新颖LMW-K5-胺-O-过硫酸盐中，由其中主要组分是具有结构式(III″)的化合物的混合物组成的物质是优选的，
其中R，R′，R″是氢或SO3 -，X″是OH或OSO3 -，硫酸化度是2.2到3，m是4，5，或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
在本发明中，能从K5-N-硫酸盐开始制备LMW-K5-N，O-硫酸盐及其化学或药物可接受的盐，其制备方法包括：
(i)对K5-N-硫酸盐进行亚硝酸解聚，然后例如用硼氢化钠进行还原；
(ii)用叔胺或氢氧化季铵处理酸性形式的LMW-K5-N-硫酸盐，使反应混合物静置30-60分钟，由此保持溶液pH为7，并分离相应的叔胺或季铵盐；
(iii)在O-过硫酸化条件下用O-硫酸化反应物处理所述LMW-K5-N-硫酸盐的叔胺或季铵盐；
(iv)用N-硫酸化试剂处理由此制得的产物并分离所制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
在本发明过程结束时获得的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐通常是以钠盐形式存在的。所述钠盐能被转化成另一种化学或药物可接受的盐。比如，可以使用超滤膜进行与钙离子的交换。优选碱金属，碱土金属，铵，四(C1-C4)烷基铵，铝，和锌的盐。特别优选钠，钙和四丁基铵的盐。
由本发明方法制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐由其中至少90％的链具有结构I′的混合链组成，
其中n是2到20的整数，R，R′和R″代表氢或SO3 -基团，其中大部分所述链的还原端基具有结构(a″)，硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
在本发明方法所制得的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐中，由其中主要组分具有结构式I而且大部分链的还原端基具有结构(a″)的混合链组成的物质是特别优选的。
本发明方法所制得LMW-K5-N.O-过硫酸盐中，优选LMW-K5-N，O-过硫酸盐由其中主要组分是具有结构式I″，化合物的混合链组成，
Figure A0381757100241
其中R，R′和R″是氢或SO3-，X″是OH或OSO3-，硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9，m是4，5或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
由于本发明的新颖LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有抗病毒，特别是抗HIV-1的活性和很好的抗血管形成活性，因此其作为可用于治疗的活性组分是令人感兴进趣的。更令人感兴趣的是分子量为3750-4250(m＝4)，4750-5250(m＝5)，或5750-6250(m＝6)而且硫酸化度是3.5到3.9的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
由于上述LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有抗病毒和抗血管形成活性，因此它们都能作为治疗上述病症的药物。对于预定的治疗用途，按照常规技术以适当给药形式，如灭菌溶液，局部剂型，以及目前一般对粘多糖型衍生物提出的各种剂型对本发明的活性组分及其盐进行配制。还可以用类似于对已知天然化合物已研究的剂型选择治疗剂型。
活性组分的给药可以通过口服，经皮肤，或优选非经肠，具体而言是皮下，肌肉内或静脉内，或局部途径进行。
对于人类，非经肠给药的预定每日剂量是0.5-500毫克/千克/天(die)，优选是5-250毫克/千克/天，更优选是10-150毫克/千克/天，而局部途径给药剂量是1-1000毫克/千克/天，优选是10-500毫克/千克/天，更优选是20-100毫克/千克/天。
因此，本发明另一方面提供了一种药物组合物，该组合物包括作为活性组分的药理有效量的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，或者其药理有效量的药物可接受的盐，并与药物载体混合，优选LMW-K5-N.NO-过硫酸盐由其中主要组分是具有结构式I，I°，I″的化合物的混合链或由其中至少90％的链具有结构式I′的混合链组成，其硫酸化度是3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9。所述LMW-K5-N，O-过硫酸盐及其盐主要如上所述。优选的药物可接受盐是钠，钾，钙，镁，铝和锌盐。
在本发明用于口服，皮下，静脉内，经皮肤或局部给药的药物组合物中，优选将活性组分以单位剂量与传统赋形剂或药物载体混合事约药。可根据患者的年龄，体重，和健康状况，以及感染严重程度和给药途径改变剂量。该剂量包括通过静脉内，肌肉内，皮下，口服，经皮肤，转化粘液质或局部途径每天给药1到3次，单位剂量是1到1000毫克，优选是10到750毫克，更优选是250到500毫克。
本发明的药物组合物与适用于各种给药途径的药物载体配制在一起。制剂形式可以是适合局部给药的乳膏，香膏剂，软膏，凝胶，阴道栓剂，栓剂，溶液或悬浮剂。
具体而言，本发明提供了一种用于治疗血管形成依赖病症或治疗HIV感染的药物组合物，该组合物包括作为活性组分的药理有效量的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，或者一种其药理学有效量的药物可接受的盐，并与药物载体混合，优选LMW-K5-N.O-过硫酸盐由其中主要组分是具有结构式I，I°，I″的化合物的混合链或者至少90％的链具有结构式I′的混合链组成，其硫酸化度为3.2到4，优选是3.5到4，更优选是3.5到3.9。
最后，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包括作为其活性组分的新颖LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，或者是一种其药物可接受的盐，并与药物载体混合该LMW-K5-胺一O-过硫酸盐通过上述方法的步骤(a)和(b)制得，特别是LMW-K5-胺一O-过硫酸盐的硫酸化度为2.2到3，平均分子量宜约为3500到11000，更优选约为3500到5200，优选LMW-K5-胺-O-过硫酸盐由其中至少90％的链具有结构式III，或者其中主要组分是具有结构式III′或III″的化合物的混合链组成。优选所述硫酸的化合物的混合链组成化度是2.2到3的LMW-O-过硫酸化-K5-胺基本不含N-乙酰基。
以下实施例对本发明进行说明而不是限制。
制备方法I
将按照US 2002/0062019实施例12第[0251]和[0252]段所述制备的1克K5溶解在100毫升氯化钠饱和水溶液中，在4℃恒温，该K5的1H-NMR谱(图3)中由亲脂性物质所产生的信号位于低于1.5ppm的区域内。向所制得的溶液中加入3倍体积的冷异丙醇。加入计算量的饱和氯化钠溶液，使溶液的盐浓度为3M，将冷却的溶液在低温下(约4℃)静置过夜。以10000转/分的速率离心20分钟，分离所形成的沉淀，通过渗析过夜，并随后进行1H-NMR分析以确认在低于1.5ppm的区域内没有信号来控制产物的纯度。需要的话，重复溶解在含4M NaCl水溶液中和用异丙醇沉淀的过程。沉淀溶解于水并在Miniplatemembrane Millipore仪器上以10000 D切分进行超滤，直到盐消失。制得K5的纯度至少是99％，其1H-NMR谱中在低于1.5ppm的区域内的痕量亲脂性杂质是不可检测的。
制备方法II
制备K5-N-硫酸盐
(i)N-脱乙酰化
将按照制备方法I所述制得的1克纯K5多糖溶解在100毫升2N氢氧化钠中，使制得溶液在60℃保持24小时。使溶液温度达到室温，然后用6N盐酸使pH值为中性。
(ii)N-硫酸化
在4小时内，向保持在40℃的含脱乙酰化K5的溶液中加入1.6克碳酸钠，并随后加入1.6克吡啶·三氧化硫。在反应结束24小时之后，使溶液达到室温，然后用5％的盐酸溶液使pH为6.5-7。用1000 D的螺旋膜(PrepscaleCartridge-Millipore)通过渗滤法从盐中提纯所制得的K5-N-硫酸盐。当渗透液的电导率低于1000微西门子，优选低于100微西门子时，终止该过程。与浓度渗析系统相同，直到多糖浓度达到10％为止降低内渗析。将浓缩溶液冷冻干燥。K5-N-硫酸盐的13C-NMR谱没有显示任何残留N-乙酰基或NH2基团的信号。
制备方法III
LMW-K5-N-硫酸盐
用亚硝酸降解方法对制备方法II中所制得的产物进行解聚，并随后还原形成的醛。将1克K5-N-硫酸盐溶解在200毫升蒸馏水中，并加入480毫克溶解在240毫升蒸馏水中的亚硝酸钠。然后将溶液冷却至4℃，用0.1N HCl调节pH至2，并保持30分钟。反应结束时，用0.1N NaOH调节溶液pH至7，并使之达到室温。向溶液中加入450毫克NaBH4，使之反应4小时。用HCl将pH调节至5-6，除去过量NaBH4。用0.1M NaOH中和，用3倍体积的丙酮在4℃沉淀回收产物，用玻璃漏斗过滤并在40℃真空烘箱中干燥。这样制得平均分子量约为2000的900毫克LMW-K5-N-硫酸盐。
制备方法IV
K5-N，O-过硫酸盐
将按照制备方法II所述制得的1克K5-N-硫酸盐溶解在100毫升去离子水中，用冷却浴将该溶液冷却至10℃，然后通过阳离子交换树脂IR 120 H+或等效装置(50-200毫升)。柱和洗出液储器都保持10℃。含有样品的溶液通过之后，用去离子水洗涤树脂直到渗出液的pH高于6(约3倍体积的去离子水)。用四丁基氢氧化铵(15％水溶液)使酸性溶液为中性，然后浓缩至最小体积并冷冻干燥。将四丁基铵盐溶解在40毫升DMF中，加入固体形式的3.5克吡啶·SO3加合物。将溶液在50℃保持24小时。在反应结束时将溶液冷却至室温，并加入3倍体积的氯化钠饱和丙酮溶液，直到完全沉淀。用过滤从溶剂中分离沉淀，使沉淀溶解在最少量的去离子水中(比如100毫升)，并加入氯化钠形成0.2M的溶液。用2N氢氧化钠使溶液pH达到7.5-8，并加入2倍体积的丙酮直到完全沉淀。通过过滤从溶剂中分离沉淀。将得到的固体溶解在100毫升去离子水中，并用1000 d切分的螺旋膜(prepscale cartridge-Millipore)通过超滤从残余盐中提纯。
按照制备方法II步骤(ii)中所述对含有O-硫酸化产物的溶液进行N-硫酸化。按照Casu等的电导分析法所测得的产物中硫酸根对羧基的比值是3.87，用分子排阻HPLC测得平均分子量是20000。
实施例1
将按照制备方法IV所制得的1克K5-N，O-过硫酸盐溶解在200毫升去离子水中，并在4℃恒温。然后加入以0.2％的浓度溶解在水溶液中的230毫克亚硝酸钠。向保持在4℃的含有K5-N，O-过硫酸盐和亚硝酸钠的溶液中加入冷却至4℃的0.1N HCl，调节pH至2。使溶液在缓慢搅拌下反应30分钟，然后用0.1NNaOH中和。如此制得的含LMW-K5-N，O-过硫酸盐溶液由主要组分是结构式I°的十糖(其中m是4，X′是甲酰基)的混合链组成，使其温度达到室温，用溶解在50毫升水中的250毫克硼氢化钠对其处理，并反应4小时。用0.1N HCl调节pH至约5，除去过量的硼氢化钠，再静置2小时。结束时用0.1N NaOH中和溶液，减压蒸发浓缩产物之后，用丙酮沉淀回收产物。如此制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有与K5-N，O-过硫酸盐原料相似的硫酸化特征，粘度法测得的平均分子量约为4250，并且其由其中的主要组分是具有结构式I′的十糖(其中m是4，X′是CH2OH)的混合链组成。
实施例2
按照实施例1中所述，用200毫克亚硝酸钠对按照制备方法IV所制得的1克K5-N，O-过硫酸盐进行处理。所制得的产物与K5-N，O-过硫酸盐原料具有相似的硫酸化特征，粘度法测得的平均分子量约为5000，并且其由其中主要组分是具有结构式I′的十二糖(其中m是5，X′是CH2OH)的混合链组成。
实施例3
按照实施例1中所述，用160毫克亚硝酸钠对按照制备方法IV所制得的1克K5-N，O-过硫酸盐进行处理。所制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐具有与K5-N，O-过硫酸盐原料相似的硫酸化特征，粘度法测得的平均分子量约为6000，并且其由其中主要组分是具有结构式I′的十四糖(其中m是6，X′是CH2OH)的混合链组成。
实施例4
(a)LMW-K5-N-硫酸四丁基铵
将按照制备方法III所制得的500毫克LMW-K5-N-硫酸盐在50毫升水中的溶液以4℃恒温，然后通过用4℃水预处理过的IR 120 H+离子交换树脂。获得的洗出液是125毫升pH约为2的溶液，用15％的四丁基氢氧化铵溶液进行中和，并在室温下静置1小时，加入15％的四丁基氢氧化铵溶液，保持pH为7，最后冷冻干燥。制得1克LMW-K5-N-硫酸四丁基铵。
(b)LMW-K5-胺-O-过硫酸盐
使所制得的1克盐在20毫升二甲基甲酰胺中的溶液保持55℃，用含有1.7克吡啶·SO3加合物的20毫升二甲基甲酰胺进行处理。在55℃反应过夜，然后向混合物中加入40毫升水。用1N NaOH中和之后，用3倍体积的NaCl饱和丙酮溶液沉淀产物，并保持4℃过夜。在G4玻璃漏斗上过滤回收沉淀，然后用1000 d切分的TFF Millipore系统进行超滤，并减压干燥。由此制得683.2毫克LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，其由其中主要组分是具有结构式III ″的十糖(其中m是4)的混合链组成，硫酸化度约为2.9。
(c)LMW-K5-N，O-过硫酸盐
向步骤(b)中所制得的500毫克LMW-K5-胺-O-过硫酸盐在30毫升水中形成的溶液中加入800毫克碳酸钠，然后在4小时内向由此制得的溶液中逐渐加入固体形式的800毫克吡啶·SO3加合物。将反应混合物保持55℃过夜，然后加入0.1N HCl调节pH至7，使反应停止。在1000 D薄膜上进行超滤之后，加入3倍体积的NaCl饱和丙酮溶液，以5000转/分的速率离心5分钟回收沉淀。由此制得502毫克LMW-K5-N，O-过硫酸盐，粘度法测得的平均分子量约为4100，并且其由其中主要组分是具有结构式I″的十糖(其中m是4)的混合链组成，硫酸度约为3.9。
实施例5
按照实施例4步骤(a)和(b)中所述处理由制备方法III所制得的1克LMW-K5-N-硫酸盐。用3倍体积的NaCl饱和丙酮溶液沉淀回收LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，将沉淀溶解在水中，在1000 d切分的膜上进行超滤，并冷冻干燥。由此制得的产物是LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，粘度法测得的平均分子量约为3600，并且其由其中主要组分是具有结构III″的十糖(其中m是4)的混合链组成。

Claims (55)

1.一种LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征是其平均分子量约为3000到6000，硫酸化度是3.2到4。
2.如权利要求1所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分具有结构式I的混合链组成，
Figure A038175710002C1
其中q是4，5，6，7，或8，R，R′和R″代表氢或SO3-基团，硫酸化度是3.2到4，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
3.如权利要求1或2所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是3750-4250。
4.如权利要求1或2所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是4750-5250。
5.如权利要求1或2所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是5750-6250。
6.如权利要求1或2所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式I°的化合物的混合链组成，
Figure A038175710002C2
其中R，R′和R″代表氢或SO3 -，X′代表甲酰基或羟甲基，硫酸化度是3.2到4，m代表4，5或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
7.如权利要求6所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是3750-4250。
8.如权利要求6所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是4750-5250。
9.如权利要求6所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其平均分子量是5750-6250。
10.如权利要求1到9中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其硫酸化度是3.5到4。
11.如权利要求1到9中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其硫酸化度是3.5到3.9。
12.一种制备硫酸化度是3.2到4的LMW-K5-N，O-过硫酸盐的方法，所述方法包括：
(a)用叔胺或氢氧化季铵处理酸性形式的由K5-N-硫酸盐的亚硝酸解聚和随后还原所制得的LMW-K5-N-硫酸盐，保持溶液pH为7使反应混合物静置30-60分钟，并分离具有所述有机碱的盐；
(b)在O-过硫酸化条件下用O-硫酸化试剂处理所述多糖的叔胺或季铵盐；
(c)用N-硫酸化试剂处理由此制得的产物，并分离由此制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法包括：
(i)对K5-N-硫酸盐进行亚硝酸解聚，然后例如用硼氢化钠还原；
(ii)用叔胺或氢氧化季铵处理酸性形式的LMW-K5-N-硫酸盐，使反应混合物静置30-60分钟，由此保持溶液pH为7，并分离相应的叔胺或季铵盐；
(iii)在O-过硫酸化条件下用O-硫酸化反应物处理所述LMW-K5-N-硫酸盐的叔胺或季铵盐；
(iv)用N-硫酸化试剂处理由此制得的产物并分离制得的LMW-K5-N，O-过硫酸盐。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述还原反应是用硼氢化钠进行的。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于使用LMW-K5-N-硫酸盐作为原料，该LMW-K5-N-硫酸盐由其中至少90％的链具有结构式II的混合链组成，
Figure A038175710004C1
其中n是2到20的整数，所述大部分混合链的还原端基处含有结构(a′)的2，5脱水甘露醇单元，
Figure A038175710004C2
相应的阳离子是化学和药物可接受的。
16.如权利要求12到14中任一项所述的方法，其特征在于所述K5-N-硫酸盐原料不含亲脂性物质。
17.如权利要求12和14到16中任一项所述的方法，其特征在于以其钠盐的形式使用LMW-K5-N-硫酸盐原料。
18.如权利要求12和14到16中任一项所述的方法，其特征在于所述K5-N-硫酸盐原料由其中主要组分是具有结构式II′的化合物的混合链组成，
其中q是4，5，6，7，或8，所述大部分混合链的还原端基处含有结构(a′)的2，5脱水甘露醇单元，
相应的阳离子是化学或药物可接受的。
19.如权利要求12和14到18中任一项所述的方法，其特征在于所述K5-N-硫酸盐原料由其中主要组分是具有结构式II″的化合物的混合链组成，
其中m代表4，5或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
20.如权利要求12到19中任一项所述的方法，其特征在于LMW-K5-N，O-过硫酸盐是以其钠盐形式制得的，并任选转化成另一种化学或药物可接受的盐。
21.一种LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，或其化学或药物可接受的盐，该LMW-K5-胺-O-过硫酸盐可按照权利要求12到20中任一项所述方法的步骤(a)和(b)制得。
22.一种LMW-K5-胺-O-过硫酸盐或一种其化学或药物可接受盐，该LMW-K5-胺-O-过硫酸盐的硫酸化度是2.2到3。
23.如权利要求21和22中任一项所述的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐或者其化学或药物可接受的盐，该LMW-K5-胺-O-过硫酸盐的平均分子量约为3500到11000。
24.如权利要求2 1到23中任一项所述的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于其硫酸化度是2.2到3，平均分子量是3500到5200。
25.如权利要求21到24中任一项所述的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于其基本不含N-乙酰基。
26.如权利要求20到24中任一项所述的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于其由其中至少90％的链具有结构式III的混合链组成，
Figure A038175710005C2
其中R，R′和R″代表氢或SO3-基团，n是2和20之间的数值，在大部分所述混合链的还原端基处含有结构(a″)的2，5-脱水甘露醇单元，
Figure A038175710005C3
硫酸化度是2.2到3，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
27.如权利要求26所述的LMW-K5-胺-O-过硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式III′的化合物的混合物组成，
Figure A038175710006C1
其中q是4，5，6，7，或8，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
28.如权利要求27所述的LMW-O-过硫酸化-K5胺，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式III″的化合物的混合物组成，
Figure A038175710006C2
其中，R，R′和R″是氢或SO3 -，X″是OH或OSO3 -，硫酸化度是2.2到3，m是4，5或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
29.一种LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其可按照权利要求12到20中任一项所述的方法制得。
30.一种LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其由其中至少90％的链具有结构I′的混合链组成，
Figure A038175710006C3
其中，n是2到20的整数，R，R′和R″代表氢或SO3 -基团，大部分所述混合链的还原端基具有结构(a″)
其中R″是氢或SO3 -基团，硫酸化度是3.2到4，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
31.如权利要求30所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式I的化合物的混合链组成，
其中，q是4，5，6，7，或8，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
32.如权利要求31所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式I″的化合物的混合物组成，
其中m是4，5，6，R，R′和R″是氢或SO3 -，硫酸化度是3.2到4，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
33.如权利要求29到32中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于所述阳离子是碱金属，碱土金属，铵，四(C1-C4)烷基铵，铝和锌的离子。
34.如权利要求33所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于所述阳离子是钠，钙或四丁基铵的离子。
35.如权利要求29到34中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其硫酸化度是3.5到4。
36.如权利要求29到34中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，其特征在于其硫酸化度是3.5到3.9。
37.一种制备LMW-K5-N-硫酸盐及其化学或药物可接受的盐的方法，所述方法包括对K5-N-硫酸盐进行受控的亚硝酸解聚并任选随后进行还原并分离所制得的产物。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于以任选被转化成另一种化学或药物可接受的盐的钠盐形式分离所述K5-N-硫酸盐。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于所述其他盐是碱金属，碱土金属，铵，四(C1-C4)烷基铵，铝和锌的盐。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于所述其他盐是钠，钙或四丁基铵的盐。
41.一种LMW-K5-N-硫酸盐，其可按照权利要求37到40中任一项所述的方法制得。
42.一种LMW-K5-N-硫酸盐，其可按照权利要求37到40中任一项所述的方法制得在大部分所述混合链的还原端基处含有结构(a′)的2，5脱水甘露醇单元。
Figure A038175710008C1
43.一种LMW-K5-N-硫酸盐或者其化学或药物可接受的盐。
44.如权利要求43所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其由其中至少90％的链具有约1500到7500的平均分子量的混合链组成。
45.如权利要求44所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其具有约1000到10,000的分子量分布。
46.如权利要求41到45中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其含有0到不超过5％的乙酰基。
47.如权利要求41到46中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其具有约2000到4000的平均分子量。
48.如权利要求41到46中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其由其中具有约4000到7500的平均分子量。
49.如权利要求41到46中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其由其中至少90％的链具有结构式II的混合链组成，
Figure A038175710009C1
其中n是2到20的数值，大部分所述混合链中含有结构(a)的单元，
Figure A038175710009C2
其中X代表甲酰基或羟甲基，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
50.如权利要求41到46中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式II′的化合物的混合链组成
Figure A038175710009C3
其中q是4，5，6，7或8，大部分所述混合链中含有结构(a)的单元
其中X代表甲酰基或羟甲基，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
51.如权利要求41到46中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于其由其中主要组分是具有结构式II″的化合物的混合链组成，
Figure A038175710009C5
其特征在于X代表甲酰基或羟甲基，m代表4，5，或6，相应的阳离子是化学或药物可接受的。
52.如权利要求49到51中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其中，结构(a)中的X是羟甲基。
53.如权利要求41到52中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于所述盐或阳离子是碱金属，碱土金属，铵，四(C1-C4)烷基铵，铝和锌的盐或离子。
54.如权利要求41到52中任一项所述的LMW-K5-N-硫酸盐，其特征在于所述盐或阳离子是钠，钙或四丁基铵的盐或离子。
55.一种药物组合物，其特征在于其包括作为活性组分的如权利要求1到11或28到35中任一项所述的LMW-K5-N，O-过硫酸盐，与药物载体混合。
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