ITMI20011633A1 - Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'hiv - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione avente per titolo:
“Uso di polisaccaridi batterici supersolfatati inibitori dell'HIV”.
Contesto dell'invenzione
La sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) é divenuta una pandemia globale, sebbene le morti causate dall’infezione da HIV stiano diminuendo considerevolmente nei paesi con economia di mercato stabilizzata da quando cocktails di inibitori specifici degli enzimi virali trascrittasi inversa (RT) e proteasi sono entrati nella pratica clinica. Circa una dozzina di farmaci sono attualmente disponibili sul mercato. Tuttavia, il trattamento con questi farmaci è accompagnato da pesanti effetti collaterali. Inoltre, stanno emergendo e stanno diffondendosi varianti di HIV resistenti ai farmaci in uso. Poiché la terapia antiretrovirale attuale ferma temporaneamente la replicazione virale, ma non è in grado di eradicare lo HIV dalle cellule cronicamente infettate e, quindi, dagli individui sieropositivi, è essenziale identificare nuove classi di farmaci antivirali che possono complementare ed eventualmente sostituire (in caso di resistenza farmacologica) i farmaci attualmente in uso.
Diverse tappe del ciclo replicativo di HIV sono potenzialmente vulnerabili a inibitori specifici. Queste possono essere convenzionalmente suddivise in: - Legame non specifico della particella virale (virione) alla superficie cellulare seguito dal legame specifico (binding) alle cellule CD4+ mediante l interazione della glicoproteina del mantello virale (gp120 Env) esposta sulla superficie del virione. Il binding tra gpl20 Env e CD4 permette, attraverso un cambiamento conformazionale, il legame successivo di gpl20 Env con i co-recettori CCR5 e CXCR4 e l’inserzione della componente fusogenica del mantello virale (gp41 Env) nella membrana della cellula bersaglio.
- Eventi precoci successivi all’ingresso del virus, schematicamente suddivisibili in migrazione del complesso detto di pre-integrazione dal citoplasma al nucleo contemporaneo al processo di retrotrascrizione del genoma virale da RNA a DNA, ed, infine, all’ integrazione del DNA virale nei cromosomi della cellula infettata (provirus).
- Eventi tardivi del ciclo vitale di HIV, che comprendono la trascrizione dei geni virali alla sintesi di nuove proteine virali, il loro assemblaggio alla superficie interna della cellule, la gemmazione di nuovi vinoni che si staccheranno dalla cellula infettata per iniziare un nuovo ciclo infettante. La fase più precoce del processo d’infezione è l’adesione del virione alla membrana cellulare che si verifica indipendentemente dall’interazione di gp120 Env con i recettori specifici sulla cellula ospite. Tra i diversi meccanismi proposti, quello più plausibile coinvolge l’associazione di regioni di gpl20 Env cariche positivamente con gli eparan solfati (proteoglicani) di membrana dotati di carica negativa. Infatti, i polianioni legano efficientemente la molecola gp120 Env di molti isolati virali e, pertanto, hanno potenti effetti antivirali in vitro e rappresentano potenziali agenti terapeutici.
Tecnica anteriore
E' noto che il polisaccaride capsulare K5 isolato da ceppi di Escherichia coli (qui di seguito chiamato anche semplicemente "K5") descritto da W.F. Vann et al. (1981) in Eur. J. Biochem 116, 359-364, mostra la stessa sequenza del precursore deH’eparina e dell’eparansolfato (N-acetileparosano) ed è chimicamente costituito da sequenze ripetitive di unità disaccaridiche formate da acido d-glucuronico e da N-acetilglucosamina uniti con un legame a 1-4, mentre il legame tra le diverse unità disaccaridiche d-glucoronil-N-acetilglucosamina è β 1-4. La sola differenza, del tutto ininfluente sulle proprietà biologiche del K5 e i suoi derivati, tra l'N- acetileparosano precursore dell'eparina e il polisaccaride K5 risiede nella presenza, in certe catene polisaccaridiche, di un doppio legame nella posizione 4(5) del'estremità non riducente del K5, come per esempio riportato nei documenti EP 489647 e EP 544592 qui sotto menzionati.
Dopo questa prima divulgazione, numerose altre pubblicazioni e domande di brevetto hanno descritto la preparazione di K5 da Escherichia coli aventi dei pesi molecolari variabili dalle poche migliaia alle molte centinaia di migliaia di Dalton e K5 chimicamente o enzimaticamente modificati, per esempio al fine di preparare prodotti N- e/o O-solfatati o, eventualmente, Ν,Ο-solfati ed epimerizzati nella posizione 5 dell’acido glucuronico per ottenere prodotti eparino-simili. Si citano per esempio EP 333243, IT 1230785, EP 489647, EP 544592, WO 92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 98/34958, WO 98/4WO 96/14425, WO 97/43317, WO 98/34958, WO 98/42754, WO 01/02597, nonché la pubblicazione di M. Manzoni et al. (1996), Journal Bioactive and Compatible Polymers, 11 , 301-311.
In particolare, tra questi documenti, EP 333243 descrive K5 O-solfati per i quali viene indicata la possibilità di un loro uso nel trattamento di malattie causate da virus dotati di un mantello come i virus Herpes symplex, il virus della stomatite vescicolare, lo HIV di tipo 1 (HTV-1) e di tipo 2 (HIV-2). Questo documento descrive K5 O-solfati aventi al massimo 1,25 gruppi solfato per unità saccaridica (corrispondenti a 2,5 gruppi solfato per disaccaride), un tetrasaccaride, un esasaccaride, e un ottasaccaride contenenti, rispettivamente 3,4, 3,2, e 1,5 gruppi solfato per unità disaccaridica.
Inoltre, WO 98/34958 descrive derivati O-solfatati del polisaccaride K5 aventi un rapporto solfati/carbossili tra 0,5 e 4,0 ad attività anti-metastatica ed antivirale, in particolare K5 O-solfati aventi un grado di solfatazione da 2,5 a 4. Secondo questo documento, i composti più solfatati (solfati/disaccaride>2,5) mostrano un’interessante attività anti-HIV.
I derivati N, O-solfati del K5 descritti in questi riferimenti, in particolare EP 489647, EP 544592 e WO 98/09636, hanno un grado di solfatazione che va da 1,6 a 3,1, mentre il grado di solfatazione dei K5-0-solfati può arrivare anche a 4. D’altra parte, l’attività dei K5-N,0 solfati noti non è stata mai descritta. Casu et al. (1994), Carbohydrate Research, 263, 271-284 descrivono la N-deacetilazione del K5, la N-solfatazione e tre metodi di O-solfatazione indicati con B, C e AC. Secondo il metodo C, che prevede la solfatazione del K5 N-solfato utilizzando 10 moli equivalenti di agente solfatante per ossidrile libero e operando a 25-55° C per un periodo di tempo da 1 a 24 ore, si ottiene, dopo ulteriore N-solfatazione, prodotti polisolfati con rapporto solfati/carbossili massimo di 3,1.
Qui di seguito, i derivati del polisaccaride K5, verranno anche così designati: "K5-deacetilato" il polisaccaride K5 N-deacetilato, "K5-N-solfato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N-solfatato, "K5-N,O-solfato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N,O-solfato e "K5-N,0-supersolfatato" il polisaccaride K5 N-deacetilato-N,O-solfatato ad elevato grado di solfatazione ottenibile secondo il "Metodo C" della pubblicazione Casu et al. sopra citata. L'espressione "condizioni di O-supersolfatazione" indica condizioni di O-solfatazione spinta, come quella del Metodo C suddetto. Con "grado di solfatazione" si designa il numero di gruppi solfati per unità disaccaridica, espresso come rapporto solfati/carbossili (SO3-/OO-).
Sommario dell’invenzione
L’invenzione si basa sull'ipotesi che aumentando l'anionicità dei polisaccaridi Ν,Ο-solfati provenienti da K5 si possano ottenere K5-N,0-supersolfatati con elevata attività anti-HIV, atti, quindi, al trattamento della sidrome da immunodeficienza acquisita nota come AIDS. Tale ipotesi si scontra tuttavia con il fatto che la Ν,Ο-solfatazione del K5 previamente N-deacetilato avviene con difficoltà e, infatti, la letteratura descrive polisaccaridi da K5-N,0-solfati il cui grado di solfatazione non arriva a 3,2.
E' stato ora trovato che purificando il K5 ottenuto per fermentazione mediante trattamento con isopropanolo in una soluzione fortemente salina si ottiene un polisaccaride K5 puro sostanzialmente privo di sostanze lipofile e che, sottoponendo detto K5 privo di sostanze lipofile a N-deacetilazione, N-solfatazione, O-solfatazione nelle condizioni di O-supersolfatazione e, eventualmente, a una nuova N-solfatazione, si ottengono nuovi K5-N,O-supersolfatati che hanno un grado di solfatazione superiore a 3,2.
Questi K5-N,O-supersolfatati sono dotati di interessanti attività di inibizione sull’ingresso e sulla replicazione dello HIV con un favorevole rapporto rispetto alla attività anticoagulante globale e possono quindi essere utilizzati per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di infezioni da HIV, in particolare utili per combattere la sindrome da immunodeficienza acquisita a dosi in cui il rischio di effetti collaterali emorragici è estremamente ridotto.
In particolare, abbiamo dimostrato che i K5 Ν,Ο-solfati aventi un grado di solfatazione superiore a 3,2 hanno un elevato effetto inibitorio su ceppi virali dualtropici ossia che usano sia il co-recettore CCR5 e CXCR4 (ceppi R5X4) che si generano durante le fasi avanzate dell’infezione da HIV.
Tali ceppi emergono nel 50% degli individui sieropositivi nelle fasi avanzate d’infezione ed è dimostrato che possono causare una più accelerata progressione di malattia.
Descrizione dettagliata
La presente invenzione si riferisce all’uso di K5-N,O-supersolfatati aventi un grado di solfatazione maggiore di 3,2, o dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate a combattere l’infezione e la conseguente malattia da HIV/AIDS.
I K5-N,O-supersolfatati della presente invenzione esercitano una marcata attività di soppressione della replicazione di diversi ceppi di HIV-1 in cellule CD4+ primarie derivate da sangue venoso periferico di adulti sani sieronegativi isolate mediante gradiente di Ficoll, dal cui anello é stata ottenuta la frazione di cellule mononucleate (PBMC) che vengono poi stimolate con fitoemmagglutinina (PHA) per 3 giorni e successivamente mantenute in medium arricchito di interleuchina-2 (IL-2) (blasti PHA). Una seconda frazione di PBMC viene sottoposta ad un secondo gradiente di Percoli per isolare i monociti, che vengono piastrati in aderenza per 5-7 giorni al fine di ottenere macrofagi derivati in vitro (MDM) suscettibili all’infezione da parte di HIV.
In particolare, i K5 N,O solfati aventi un grado di solfatazione maggiore di 3,2 hanno un elevato effetto inibitorio su ceppi dualtropici R5X4 che si generano durante le fasi avanzate della malattia da HIV. Tale effetto inibitorio è anche superiore a quello esercitato da K5 O-solfati di pari grado di solfatazione come quelli descritti in WO 98/34958.
Vantaggiosamente, il K5 Ν,Ο-supersolfatato utilizzato per tale uso avrà un grado di solfatazione da 3,2 a 4, più vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4.
Tra i sali di detto K5-N,0-supersolfatato, i sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco sono i preferiti.
I K5-N,O-supersolfatati dell'invenzione presentano preferibilmente pesi molecolari medi compresi tra circa 2.000 e circa 65.000, vantaggiosamente tra circa 2.500 e circa 20.000 dalton (D). Tutti i pesi molecolari indicati qui di seguito sono intesi essere espressi in Dalton e calcolati secondo Harenberg et al. Journal Chromatography (1983), 261, 287-292.
I K5-N,O-supersolfatati della presente invenzione sono preparati mediante un procedimento caratterizzato dal fatto che
(a) si tratta un K5 proveniente da fermentazione con isopropanolo in soluzione acquosa fortemente salina;
(b) si sottopone il K5 cosi purificato a una N-deacetilazione mediante idrolisi alcalina ed a una successiva N-solfatazione mediante trattamento con un agente N-solfatante;
(c) si tratta un sale ammonico del K5-N-solfato così ottenuto con un agente di O-solfatazione nelle condizioni di O-supersolfatazione; e
(d) se necessario si sottopone il prodotto così ottenuto ad una N-risolfatazione e si isola il K5-N,O-supersolfatato sotto forma di sale di sodio che, se necessario, viene convertito in un altro sale.
Nel passaggio (a), il K5 utilizzato come materiale di partenza può essere uno qualsiasi dei prodotti ottenuti per fermentazione di ceppi di Escherichia coli selvaggi o ricombinanti, produttori di K5. In particolare, possono essere impiegati i K5 descritti in letteratura come quelli sopra citati, vantaggiosamente quelli descritti da M. Manzoni et al. Journal Bioactive and Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 e quello illustrato nella PREPARAZIONE I qui di seguito.
Più vantaggiosamente, il KS di partenza avrà un peso molecolare basso, in particolare con una distribuzione da circa 1.500 a circa 15.000, preferibilmente da circa 2.000 a circa 9.000, con un peso molecolare medio di circa 5.000, oppure un peso molecolare medio, in particolare con una distribuzione da circa 10.000 a circa 50.000, preferibilmente da circa 20.000 a circa 40.000, con un peso molecolare medio di circa 30.000. Preferibilmente, il K5 di partenza avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 1.500 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di 20.000-25.000.
Il peso molecolare del K5 e quello dei suoi derivati qui descritti è inteso calcolato utilizzando come standard delle frazioni di eparina a peso molecolare noto.
Il prodotto di partenza può essere un K5 previamente purificato da cui, per esempio, sono state eliminate le endotossine, le sostanze pirogene o altre impurezze mediante metodi noti.
Analogamente, nel caso in cui il K5 ottenuto al termine del passaggio (a) dovesse essere impiegato per scopi farmaceutici o per la preparazione di K5-Ν,Ο-solfati ad uso farmaceutico, esso potrebbe essere liberato dalle sostanze pirogene e dalle endotossine.
In pratica, il K5 di partenza viene disciolto in una soluzione salina 2-5 M, preferibilmente di cloruro di sodio, ad una concentrazione da 0,5 a 10% e la soluzione così ottenuta, portata a 2 - 4M mediante ulteriore aggiunta di sale, preferibilmente cloruro di sodio, viene trattata con 1-3 volumi di isopropanolo ad una temperatura di 0 - 8°C.
Dopo 1 - 18 ore alla stessa temperatura, il prodotto del passaggio (a) precipita completamente e viene isolato mediante filtrazione o centrifugazione. Se la purezza del prodotto non è soddisfacente, il procedimento del passaggio (a) viene ripetuto. Il prodotto solido così ottenuto viene ridisciolto in acqua e recuperato mediante ultrafiltrazione su membrana.
Alla fine del passaggio (a) si ottiene un K5 avente le stesse caratteristiche del prodotto di partenza ma che è sostanzialmente privo di sostanze lipofìle.
In pratica, il K5 privo di sostanze lipofìle è ottenibile mediante un procedimento caratterizzato dal fatto che (al) si tratta un K5 proveniente da fermentazione, disciolto in una soluzione di cloruro sodico 4 M a 4°C con 1 volume di isopropanolo, (a2) si porta la soluzione salina a una concentrazione 3M per aggiunta della quantità calcolata di una soluzione satura di cloruro sodico, (a3) si lascia la soluzione a 4°C per una notte e (a4) si isola il prodotto per centrifugazione e si eliminano i sali per ultrafiltrazione.
Mediante la purificazione con isopropanolo è così possibile ottenere un K5 privo di sostanze lipofile che ha una purezza superiore al 99%. Questo K5 permette di ottenere, nel successivo passaggio (c), una O-solfatazione elevata. Nel passaggio (b), la N-deacetilazione viene effettuata secondo le procedure di idrolisi alcalina note, per esempio con idrazina solfato in idrazina oppure con una base come un idrossido alcalino, per esempio l'idrossido di sodio o di potassio, in acqua. Preferibilmente, la reazione viene condotta in una soluzione acquosa di idrossido sodico ad una temperatura di 40-80°C, controllando l'andamento della reazione. In generale, dopo al massimo 30 ore, ma in pratica dopo 12-24 ore, la N-deacetilazione è completa e ralcalinità del mezzo viene neutralizzata mediante trattamento con un acido, preferibilmente acido cloridrico.
La soluzione contenente il K5 e i sali viene successivamente trattata con un agente di N-solfatazione come l'addotto di una base organica terziaria con anidride solforica (triossido di zolfo), per esempio piridina.triossido di zolfo (C5H5N.SO3) o una trialchilammina.triossido di zolfo, come trimetilammina.triossido di zolfo in presenza di un carbonato alcalino, per esempio il carbonato sodico. La reazione può essere effettuata a temperatura ambiente (20-30°C), ma è possibile anche operare a temperature più elevate (fino a circa 65°C) al fine di abbreviare i tempi di reazione. L'addizione del carbonato alcalino e dell'agente solfatante può essere effettuata contemporaneamente oppure il carbonato alcalino viene introdotto tutto in una volta e l'agente solfatante viene aggiunto successivamente, a porzioni, in un periodo di tempo che può andare dai cinque minuti alle 12 ore. Alla fine della reazione la miscela, a temperatura ambiente, viene portata ad un pH di 7,5-8 mediante un acido, preferibilmente acido cloridrico ed i sali presenti vengono eliminati per esempio mediante diafiltrazione. La soluzione così ottenuta, contenente il K5-N-solfato sotto forma di sale alcalino, può essere passata al successivo passaggio (c), oppure può essere concentrata e il K5-N-solfato può essere isolato come sale di sodio secondo metodi convenzionali. H K5-N-solfato così ottenuto è solfatato al 90-100%.
Nel passaggio (c) una soluzione contenente K5-N-solfato, così come ottenuto nel passaggio (b), viene passata su resina a scambio cationico, come IR 120 H+ fino a un pH acido. La soluzione acida così ottenuta viene trattata con ima base organica terziaria o quaternaria, per esempio con una trialchilammina come tributilammina, o con l'idrossido di un tetraalchilammonio, preferibilmente tetrabutilammonio idrossido, ridotta a minimo volume e liofilizzata. Il sale di ammonio del K5-N-solfato così isolato viene sospeso in un solvente polare aprotico come dimetilformamide o dimetilsolfossido e trattato con un agente O-solfatante, per esempio con l'addotto C5H5N.SO3. L'addotto C5H5N.SO3 può essere utilizzato sia allo stato solido che in soluzione nello stesso solvente aprotico polare. La solfatazione viene condotta ad una temperatura che può variare dalla temperatura ambiente (20-30°C) a 70°C, preferibilmente da 40 a 60°C, per un periodo di tempo da 2 a 24 ore.
Alla fine della reazione, la soluzione, a temperatura ambiente, è trattata con acetone saturato con cloruro sodico fino a completa precipitazione. I precipitato è separato dal solvente per filtrazione, disciolto nella minima quantità (per esempio 100 ml) di acqua deionizzata ed alla soluzione viene aggiunto cloruro sodico fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione è portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2N e trattata con acetone fino a completa precipitazione. Dopo filtrazione, il solido viene sciolto in 100 mi di acqua deionizzata e purificato dai sali residui mediante ultrafiltrazione come sopra descritto nel passaggio (b).
Se, dall'analisi mediante <13>C-RMN di un campione liofilizzato del prodotto così ottenuto, si constata che durante la supersolfatazione si è verificata una parziale N-desolfatazione, il resto del prodotto viene sottoposto al passaggio (d).
Nel passaggio (d), il prodotto ottenuto al termine del passaggio (c) viene trattato con un agente di N-solfatazione operando nelle condizioni del passaggio (b) suddetto fino a N-solfatazione completa, ripetendo l’operazione se l'Ν-solfatazione non risulta completa.
Il K5-N,0-supersolfatato così ottenuto viene isolato sotto forma di sale sodico, che può essere trasformato in un altro sale, come il sale di potassio, di calcio, di magnesio, di alluminio, di zinco, o in sali complessi secondo metodi noti, per esempio mediante scambio ionico con opportuna resina, mediante precipitazione con solventi oppure mediante ultrafiltrazione attraverso membrane.
La purezza del nuovo K5 purificato privo ottenuto per fermentazione può essere verificata sia mediante esame dello spettro di RMN del protone, sia mediante esame dello spettro ultravioletto, sia mediante un esame secondo il test al carbazolo, sia mediante un kit per la determinazione delle proteine. In questi esami, è stato dimostrato che il K5 ottenuto alla fine del passaggio (a) ha, come caratteristica essenziale, uno spettro <1>H-RMN in cui sono assenti segnali nella zona inferiore a 1,5 ppm. Inoltre gli acidi nucleici sono non determinabili, (assorbenza 0 a 260 nm con uno stettrofotometro UV standard) e le proteine sono inferiori a 0,5% secondo kit Biorad.
In effetti, il nuovo K5 puro ottenuto alla fine del passaggio (a) è privo di sostanze lipofile e di acidi nucleici. L'uso di "sostanzialmente", riferito all'assenza di sostanze lipofile, e di "non determinabile", riferito agli acidi nucleici tiene conto della sensibilità degli strumenti impiegati che non hanno rivelato le impurezze suddette.
Si è dunque constatato, che lo spettro di RMN del protone del polisaccaride K5 puro così ottenuto manca di segnali a ppm < 1,5 propri del metile di sostanze lipofile.
I nuovi K5 così purificati, che permettono la preparazione di K5-N,O-supersolfatati a elevato grado di solfatazione, hanno di preferenza un peso molecolare basso, in particolare con una distribuzione da circa 1.500 a circa 15.000, preferibilmente da circa 2.000 a circa 9.000, con un peso molecolare medio di circa 5.000, oppure un peso molecolare un po' più elevato, in particolare con una distribuzione da circa 10.000 a circa 50.000, preferibilmente da circa 20.000 a circa 40.000 con un peso molecolare medio di circa 30.000. Preferibilmente, il K5 di partenza avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 1.500 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di 20.000-25.000.
I K5-N,O-supersolfatati ottenuti secondo il procedimento suddetto, specialmente sotto forma dei loro sali farmaceuticamente accettabili, sono prodotti altamente anionici utilizzabili per preparare composizioni farmaceutiche ad attività antivirale, in particolare destinate al trattamento dell’infezione da HIV e dell’AIDS che ne è la conseguenza.
Detti K5-N,O-supersolfatati hanno un grado di solfatazione superiore a 3,2, vantaggiosamente, da 3,2 a 4, più vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4.
Vantaggiosamente, detti K5-N,O-supersolfatati hanno un peso molecolare basso, in particolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000 preferibilmente da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500, oppure un peso molecolare un po' più elevato, in particolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000, preferibilmente da circa 25.000 a circa 50.000 con un peso molecolare medio di circa 40.000. Preferibilmente, il K5-N,O-supersolfatato della presente invenzione di partenza avrà una distribuzione di peso molecolare da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000. Anche K5-N,0-supersolfatati aventi un peso molecolare medio molto basso, per esempio da 2.000 a 5.000, ottenuti per depolimerizzazione, costituiscono prodotti particolarmente interessanti.
La depolimerizzazione che permette di preparare i K5-N,O-supersolfatati di peso molecolare medio da 2.000 a 5.000 può essere effettuata alla fine di uno dei passaggi (b)-(d) del procedimento sopra illustrato, preferibilmente alla fine del passaggio (b) oppure sul K5-N,O-supersolfatato finale.
La depolimerizzazione può essere effettuata secondo uno dei metodi noti per la depolimerizzazione dell'eparina, per esempio mediante acido nitroso e successiva riduzione con boroidruro di sodio (EP 37319), mediante periodato (EP 287477), mediante radicali liberi (EP 121067) o mediante β-eliminazione (EP 40144). Secondo un modo di procedere preferenziale, la depolimerizzazione viene condotta su un K5-N-solfato, ottenuto al termine del passaggio (b), con acido nitroso e successiva riduzione con sodio boroidruro come descritto in dettaglio in EP 544592. Al termine della depolimerizzazione e riduzione, il prodotto a basso peso molecolare così ottenuto viene sottoposto ai passaggi (c) e, eventualmente, (d) e si isola il K5-N,0-supersolfatato a basso peso molecolare.
Alternativamente, lo stesso procedimento di depolimerizzazione e riduzione può essere applicato a un K5-N,0-supersolfatato ad elevato peso molecolare e si ottiene direttamente il corrispondente prodotto a basso peso molecolare. Tra i sali dei K5-N,0-supersolfatati suddetti, i sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco sono i preferiti.
I farmaci attualmente in uso per la terapia dell’infezione da HIV interferiscono in due fasi fondamentali del ciclo vitale del virus: la retrotrascrizione e la scomposizione della poliproteina Gag nelle sue forme mature ad opera della proteasi virale. In seguito alla scoperta dei recettori chemochinici CCR5 e CXCR4 quali co-recettori obbligati di HIV per l’infezione di linfociti e macrofagi CD4+, una potenziale classe di nuovi farmaci antivirali comprende molecole in grado di inibire il legame del virus alla molecola CD4 e/o al corecettore chemochinico e/o il processo di fusione delle membrane virali e cellulare mediato dalla glicoproteina del mantello virale gp41 (Moore JP, and Stevenson M. Nat Rev Mol Celi Biol 2000, 1 :40-49). In questo contesto, lo sviluppo di inibitori dell’ingresso di virus dualtropici R5X4, in grado cioè di di infettare le cellule CD4+ interagendo o con CCR5 o con CXCR4, ha grande rilevanza nel prevenire l’evoluzione di HIV-1 di gruppo B, dominante in USA, Canada, Australia ed Europa, evoluzione associata ad un’ accelerata progressione di malattia (Koot M, et al., Ann. Intem. Med. 1993, 118:681-688).
L'attività anti-HIV è stata saggiata sul virus HIV-1 sia su blasti PHA (blasti) sia in macrofagi derivati da dall’adesione di monociti (MDM) di sangue periferico. Il ceppo virale HIV- 1 Bal, che usa solamente il co-recettore CCR5 è stato utilizzato sia nell’infezione dei blasti che MDM, mentre il ceppo dualtropico che usa il corecettore CXCR4 oltre al CCR5 (virus R5X4) e il ceppo che usa solamente il corecettore CXCR4 (ceppo X4) sono stati usati solamente nell’ infezione dei blasti. Questi ceppi (R5X4 e X4) si generano durante le fasi avanzate dell’ infezione, il virus può estendere la propria capacità infettante a cellule esprimenti il recettore CXCR4 oltre che al CCR5. I virus vengono aggiunti alla molteplicità di infezione (m.o.i.: n. di unità infettanti virali/n. di cellule bersaglio) di 0,1. Aliquote dei sovranatanti di coltura vengono raccolti ogni 48-72 h e l’attività di RT virale presente nel supematante di coltura viene testata come descritto in Vicenzi et al. (J. Virol.
73:7515-7523, 1999). Poiché l’enzima RT é associato per il 99% ai virioni, la determinazione della sua attività equivale ad una determinazione della presenza di particelle virali nel fluido in oggetto. L’attività di RT raggiunge un picco per poi scendere a causa dell’effetto citopatico del virus sulle cellule bersaglio. Il picco di attività RT viene quindi usato come indice per valutare la concentrazione del potenziale agente antivirale.
Il K5-N,O-supersolfatato ottenuto secondo la PREPARAZIONE ΙII , rappresentativo della presente invenzione, avente un grado di solfatazione rispettivamente di 3,84 e designato K5-N,OS(H), è stato confrontato con due altri derivati del polisaccaride K5, in particolare con un K5-N,0-solfato avente un grado di solfatazione di 1,77 e designato K5-N,OS(L), ottenuto come descritto nella PREPARAZIONE V, e con un K5-0-solfato avente un grado di solfatazione di 3,77, designato K5-OS(H) e preparato come descritto nella PREPARAZIONE VI.
La replicazione di HIV-1 sia in blasti PHA che in MDM è inibita dai composti saggiati in vitro a concentrazioni comprese tra 1 e 100 μg/ml.
Tuttavia, il composto rappresentativo della presente invenzione, il K5-N,OS(H), già alla concentrazione di 1 μg/ml inibisce del 99% i ceppi dualtropici R5X4 che si generano durante le fasi avanzate dell’ infezione, mentre i due prodotti di riferimento K5-OS(H) e K5-N,OS(L) inibiscono del 98% gli stessi ceppi rispettivamente alle concentrazioni di 10 e 100 pg/ml. Inoltre il K5-N,OS(H), come del resto il K5-OS(H), è attivo su tutti gli altri ceppi utilizzati a concentrazioni di 1-10 μg/ml, dimostrandosi sempre superiore al K5-N,OS(L).
Per i previsti impieghi terapeutici i K5-N,O-supersolfatati suddetti e i loro sali saranno formulati secondo tecniche convenzionali in adatte forme di somministrazione quali ad esempio soluzioni sterili, forme di dosaggio topiche e, in generale, in tutte quelle forme fino ad oggi proposte per derivati di tipo polisaccaridico o di glicosamminoglicani. Anche i dosaggi terapeutici saranno scelti in analogia a quelli già studiati per i composti naturali noti. La somministrazione del K5-N,0-supersofatato può avvenire per via orale, transcutanea o, preferibilmente parenterale, in particolare sottocutanea, intramuscolare o endovenosa, oppure topica.
Nell'uomo, il dosaggio giornaliero per la somministrazione parenterale è previsto in 0,5 - 500 mg/Kg/die, vantaggiosamente in 5 - 250 mg/Kg/die, preferibilmente in 10 - 150 mg/Kg/die, mentre il dosaggio previsto per via topica è di . 1 - 1000 mg/Kg/die, vantaggiosamente 10 - 500 mg/Kg/die, preferibilmente 20 - 100 mg/Kg/die.
Per la loro somministrazione, i K5-N,0-supersolfatati aventi un grado di solfatazione maggiore di 3,2, vantaggiosamente da 3,2 a 4, più vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4, o i loro sali, costituiscono dunque principi attivi che vengono formulati in composizioni farmaceutiche atte al trattamento delle infezioni da HIV, in particolare della sindrome di immuno deficienza acquisita.
Così, secondo un altro dei suoi aspetti, la presente invenzione concerne una composizione farmaceutica per il trattamento dell’ infezione da HIV che comprende, in qualità di un suo principio attivo, una quantità farmacologicamente efficace di un K5-N,O-supersolfatato avente un grado di solfatazione superiore a 3,2, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile, in miscela con un veicolo o eccipiente farmaceutico.
Detto K5-N,O-supersolfatato può avere una delle altre caratteristiche di grado di solfatazione e di peso molecolare qui sopra illustrate.
Un sale scelto nel gruppo consistente nei sali di sodio, potassio, calcio, magnesio, alluminio e zinco costituisce valido principio attivo delle composizioni della presente invenzione.
Nelle composizioni farmaceutiche della presente invenzione per la somministrazione orale, sottocutanea, endovenosa, transdermica o topica, i principi attivi sono preferibilmente somministrati sotto forma di unità di dosaggio, in miscela con i classici eccipienti o veicoli farmaceutici. La posologia può variare ampiamente in funzione dell'età, del peso, e delle condizioni di salute del paziente, come pure della gravità dell'infezione e dalla via di somministrazione. Questa posologia comprende la somministrazione di una unità di dosaggio da 1 a 1.000 mg, vantaggiosamente da 10 a 750 mg, preferibilmente da 250 a 500 mg da una a tre volte al giorno per via endovenosa, sottocutanea, orale, transdermica o topica.
Infine, secondo un suo aspetto ulteriore la presente invenzione fornisce un metodo per trattare l' infezione da HIV, che comprende il somministrare al paziente che abbisogna di un tale trattamento una quantità efficace di un K5-Ν,Ο-supersolfatato avente un grado di solfatazione maggiore di 3,2, vantaggiosamente da 3,2 a 4, più vantaggiosamente da 3,5 a 4, preferibilmente da 3,7 a 4, o di un suo sale farmaceuticamente accettabile.
Particolarmente vantaggiosi K5-N,O-supersolfatati sono quelli aventi le distribuzioni di pesi molecolari e i pesi molecolari medi qui sopra illustrati. Il metodo per trattare l’infezione da HIV comprende anche la somministrazione delle composizioni farmaceutiche qui sopra illustrate, vantaggiosamente quelle delle rivendicazioni 14-24.
L'invenzione fornisce inoltre un metodo per trattare l’infezione da HIV, in cui detto trattamento viene condotto somministrando al paziente una composizione farmaceutica formulata con diluenti o diluenti farmaceuticamente accettabili per somministrazione parenterale o applicazione topica. Vantaggiosamente, per la somministrazione parenterale è prevista una posologia da 0,5 a 500 mg/Kg/giomo e per la somministrazione topica è prevista ima posologia da 1 a 1.000 mg/Kg/giomo.
I seguenti esempi illustrano l'invenzione.
PREPARAZIONE I
Preparazione del polisaccaride K5 da Escherichia coli
Viene dapprima eseguita una fermentazione in beuta utilizzando il seguente medium:
Farina di soia degras sata 2 g/1
K2HPO4 9,7 g/1
KH2PO4 2 g/1
MgC12 0,11 g/1
Sodiocitrato 0,5 g/1
Ammonio solfato 1 g/1
Glucosio 2 g/1
Acqua di fonte 1000 mi
pH = 7,3
Il medium viene sterilizzato a 120°C per 20 minuti. Il glucosio viene preparato separatamente in forma di soluzione che viene sterilizzata a 120°C per 30 minuti e addizionata sterilmente al medium. La beuta viene inoculata con una sospensione di cellule di E. coli Bi 8337/41 (O10:K5:H4) proveniente da uno slant tenuto in Triptic soy agar, e incubata a 37°C per 24 ore sotto agitazione controllata (160 rpm, 6 cm di corsa). La crescita batterica si misura contando le cellule con il microscopio. In un’operazione successiva, un fermentatore Chemap-Braun da 141 contenente lo stesso medium di cui sopra, viene inoculato allo 0,1% con la coltura della beuta di cui sopra e si effettua la fermentazione mediante aerazione di 1 wm, (wm = volume di aria per volume di liquido per minuto) agitazione 400 rpm e temperatura di 37°C per 18 ore. Durante la fermentazione vengono misurati il pH, l’ossigeno, il glucosio residuo, il polisaccaride K5 prodotto e la crescita batterica. Alla fine della fermentazione la temperatura viene portata a 80°C per 10 minuti. Le cellule vengono separate dal medium tramite centrifugazione a 10.000 rpm e il sumatante viene ultrafiltrato usando un modulo SS 316 (MST) equipaggiato con membrane PES con cut-off nominale di 800 e 10.000 D per ridurre il volume a 1/5. Il polisaccaride K5 viene quindi precipitato mediante addizione di 4 volumi di acetone a 4°C e lasciato a sedimentare per una notte a 4°C. Infine viene recuperato mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 20 minuti o filtrazione. Si esegue poi la deproteinizzazione del solido ottenuto utilizzando una proteasi di tipo II da Aspergillus orizae in tampone di NaCl 0,1 M e EDTA 0,15 M a pH 8 contenente SDS (sodio dodecil solfato) allo 0,5% (10 mg/1 di filtrato) a 37°C per 90 minuti. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su modello SS 316 con membrane a cut-off nominale di 10.000 D con 2 estrazioni con NaCl 1M e lavata con acqua fino a scomparsa dell’ assorbenza nell’ultrafiltrato. Il polisaccaride K5 viene quindi precipitato con acetone e si ottiene una resa di 850 mg per litro di fermentatore. La purezza del polisaccaride ottenuto viene misurata tramite la determinazione degli acidi uranici (metodo al carbazolo), NMR al protone e al carbonio 13, UV e contenuto di proteine. La purezza risulta maggiore dell’ 80%.
Il polisaccaride ottenuto, avente un peso molecolare medio di circa 15.000 è composto da due frazioni a diverso peso molecolare, rispettivamente 30.000 e 5.000 D come risulta dalla determinazione mediante HPLC impiegando una colonna Pharmacia Superdex TM 75 HR e una frazione singola con un tempo di ritenzione di circa 9 minuti usando due colonne in serie di Bio-sil SEC 250 (Bio Rad) e Na2SO4 come fase mobile a temperatura ambiente e flusso di 0,5 ml/minuti. La misura viene effettuata contro una curva standard ottenuta con frazioni di eparina a peso molecolare noto.
Lo spettro 1H- RMN del K5 così ottenuto mostra che nella zona sotto 1,5 ppm sono presenti diversi segnali attribuibili a metili di sostanze lipofile.
PREPARAZIONE II
Preparazione di un K5 privo di sostanze lipofile
In 100 mi di una soluzione acquosa contenente cloruro di sodio 4 M e termostatata a 4°C vengono sciolti 5 g del K5 ottenuto alla fine della PREPARAZIONE I e alla soluzione così ottenuta viene addizionato 1 volume di isopropanolo freddo. La concentrazione salina della soluzione viene portata a 3 M mediante aggiunta della quantità calcolata di una soluzione satura di cloruro sodico e si lascia la soluzione ottenuta in ambiente freddo (circa 4°C) per una notte. Il precipitato formatosi viene separato mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 20 minuti e la purezza del prodotto viene controllata mediante dialisi per una notte e successivo esame dello spettro 1H-RMN, da cui devono essere assenti segnali nella regione sotto 1,5 ppm. Se necessario, l'operazione di dissoluzione in acqua contenete NaCl 4 M e precipitazione con isopropanolo viene ripetuta. Il precipitato viene sciolto in acqua e ultrafiltrato su membrana Miniplate Millipore cut off 10.000 D fino a scomparsa dei sali. Si ottiene così un K5 avente una purezza di almeno il 99% nel cui spettro 1H-RMN non si nota alcuna traccia di impurezze lipofile nella regione sotto 1,5 ppm.
Il contenuto in proteine calcolato con il kit BioRad risulta essere 0.02 % e gli acidi nucleici non determinabili (assorbenza 0 a 260 nm).
PREPARAZIONE ΙI
Preparazione di un K5-N O-supersolfatato
(i) N-Deacetilazione
Dieci grammi di polisaccaride K5 puro preparato come descritto nella PREPARAZIONE I e purificato come descritto nella PREPARAZIONE I vengono solubilizzati con 1.000 mi di sodio idrossido 2N e la soluzione così preparata viene lasciata a 60 °C per 24 ore. La soluzione viene portata a temperatura ambiente quindi a pH neutro (pH 7) con acido cloridrico 6N. (ii) N-solfatazione
Alla soluzione contenente il K5 deacetilato, mantenuta a 40 °C, vengono aggiunti 16 g di sodio carbonato e successivamente in 4 ore, 16 g di piridina.solfotriossido. Alla fine della reazione, dopo 24 ore, la soluzione viene portata a temperatura ambiente, poi a pH 7,5-8 con una soluzione al 5% di acido cloridrico. Il prodotto viene purificato dai sali mediante diafiltrazione usando una membrana a spirale avvolta da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore). Il processo viene terminato quando la conducibilità del permeato è inferiore a 1.000 μS, preferibilmente inferiore a 100 μS. L’intradialisi si riduce fino ad ottenere una concentrazione del polisaccaride del 10% usando lo stesso sistema da dialisi in concentrazione. La soluzione concentrata viene essiccata mediante liofilizzazione. All'analisi dello spettro <13>C-RMN non appaiono N-acetili o ΝH2 residui.
(iii) O-supersolfatazione
Il prodotto liofilizzato ottenuto alla fine del passaggio (ii) viene disciolto in 100 mi di acqua deionizzata, e la soluzione portata a 10 °C con bagno raffreddato quindi passata su resina a scambio cationico IR- 120 H<+ >(100 ml). Sia la colonna che il contenitore dell’eluato sono mantenuti a 10°C. Dopo il passaggio della soluzione contenente il campione la resina viene lavata con acqua deionizzata fino a che il pH del permeato è maggiore di 6 (circa 3 volumi di acqua deionizzata). La soluzione acida viene portata a neutralità (pH 7) con tetrabutilammonio idrossido (soluzione acquosa al 15%) quindi ridotta a volume minimo e liofilizzata. Il sale di tetrabutilammonio viene disciolto in 400 mi di dimetilformamide e addizionato con 35 g di addotto C5H5N.SO3 in forma solida. La soluzione viene mantenuta a 50°C per 24 ore. Alla fine della reazione la soluzione viene raffreddata a temperatura ambiente e addizionata con 3 volumi di acetone saturato con sodio cloruro, raffreddata a 4°C fino a completa precipitazione (12 ore). Il precipitato viene separato dal solvente tramite filtrazione, solubilizzato con la minima quantità di acqua deionizzata (circa 100ml) e alla soluzione si aggiunge sodio cloruro fino ad ottenere una soluzione 0,2 M. La soluzione viene portata a pH 7,5-8 con sodio idrossido 2 N e trattata con due volumi di acetone fino a completa precipitazione. Il precipitato viene separato dal solvente mediante filtrazione. Il solido ottenuto viene solubilizzato con 100 mi di acqua deionizzata e purificato dai sali residui tramite ultrafiltrazione come descritto nel passaggio (ii) usando una membrana a spirale avvolta da 1.000 D (prepscale cartridge-Millipore).
(iv) N-solfatazione
La soluzione così ottenuta, contenente il prodotto O-solfatato, viene trattata come descritto in precedenza nel passaggio (ii) per la N-solfatazione. Il K5Ν,Ο-supersolfatato così preparato, designato K5-N,OS(H) presenta un peso molecolare medio di 15.000 D e un rapporto solfati/carbossili di 3,84. La distribuzione dei gruppi solfati, determinata allo spettro 13C-RMN, è la seguente: l'unità glucosamminica del disaccaride costitutivo è N-solfatata e 6-O-solfatata al 100%, mentre, per quanto riguarda le unità glucuroniche, il 70% è O-disolfato e il 30% è mono O-solfato.
PREPARAZIONE IV
Preparazione di un K5-N,0-supersolfatato
Operando come descritto nella PREPARAZIONE ΙII , a partire da un K5 ottenuto e caratterizzato come descritto da M. Manzoni et al. (1996), purificato come descritto nella PREPARAZIONE II , si ottiene un K5 Ν,Ο-supersolfatato, designato K5-N,OS(H1) avente peso molecolare medio di 13.000 e un rapporto solfati/carbossili di 3,54.
PREPARAZIONE V
Preparazione di un K5-N, O-solfatato
Operando come descritto nella PREPARAZIONE II Ι , ma utilizzando nel passaggio iii) 7 g di addotto C5H5N.SO3, si ottiene un K5 N,0 solfatato, designato K5-N,OS(L) avente un peso molecolare medio di 14.000 e un rapporto solfati/carbossili di 1,7.
PREPARAZIONE VI
Preparazione dì un K5-Osupersolfatato
Operando come descritto nel passaggio (iii) della PREPARAZIONE II I su un K5 ottenuto come descritto nella PREPARAZIONE I e purificato come descritto nella PREPARAZIONE II , si ottiene un K5 O-supersolfatato, designato K5-OS(H) avente un peso molecolare medio di 18.000 e un rapporto solfati/carbossili di 3,77.
Esempio 1
L'attività anti-HIV è stata saggiata su blasti PHA (blasti) utilizzando il ceppo virale HIV- 1Bal, in grado di usare solamente il co-recettore CCR5 (virus monotropico R5).
Un K5-N,0-supersolfatato rappresentativo della presente invenzione, il K5-N,OS(H) ottenuto secondo la PREPARAZIONE ΙII , e avente un grado di solfatazione di 3,84 è stato confrontato con due altri derivati del polisaccaride K5, in particolare con un K5-N,O-solfato avente un grado di solfatazione di 1,77 e designato K5-N,OS(L), ottenuto come descritto nella PREPARAZIONE V, e con un K5-0-solfato avente un grado di solfatazione di 3,77, designato K5-OS(H) e preparato come descritto nella PREPARAZIONE VI. I risultati relativi agli effetti dei tre K5-derivati sull’infezione di cellule ottenute da un singolo donatore e testate in triplicato per ogni concentrazione di agente, rappresentativi di quelli ottenuti in cellule isolate da tre donatori indipendenti, sono riportati nella Tabella 1. Tutti e tre i prodotti testati raggiungono l’inibizione massima di RT alla dose di 10 μg/ml. TABELLA 1
Esempio 2
I prodotti in esame sono stati testati su blasti PHA utilizzando il ceppo virale HIV-1 LAV/TTTB che usa solamente il corecettore CXCR4 (virus monotropico X4).
I ceppi X4 si possono generare, anche se infrequentemente, durante le fasi avanzate dell’infezione prima dell’evoluzione della malattia ad AIDS conclamato.
I risultati riportati in Tabella 2, mostrano che alla concentrazione di 10 μg/ml, tanto il K5-OS(H) che il K5N,OS(H) inibiscono quasi completamente l’attività RT. Alla dose di 1 μg/ml, il K5-OS(H) inibisce quasi completamente l’attività RT mentre il K5-N,OS(H) dà un’inibizione del 55%.
TABELLA 2
Esempio 3
I prodotti in esame sono stati testati su blasti utilizzando il ceppo virale HIV-1 89.6 che usa sia il corecettore CCR5 che CXCR4 (virus dualtropici R5X4). I ceppi dualtropici R5X4 si possono generare durante le fasi avanzate dell’infezione in ca. il 50% degli individui infettati da HIV-1 di gruppo B, e possono derivare sia da una miscela di specie monotropiche R5 ed X4, che da virus in grado di utilizzare simultaneamente entrambi i corecettori (S. Ghezzi et al. Virology, 280:253-261, 2001)
I risultati sono riportati nella Tabella 3 che mostra come il K5-N,OS(H) inibisca quasi completamente l’attività RT alla concentrazione di 1 μg/ml mentre il K5-OS(H), a questa concentrazione, ha un’attività molto bassa, anche inferiore a quella del K5-N,OS(L).
TABELLA 3
Esempio 4
L’attività anti-HIV è stata saggiata sul virus HIV-1 in macrofagi derivati da monociti di sangue periferico (MDM), infettati con il ceppo virale HIV-1Bal sa solamente il corecettore CCR5 (virus monotropico R5).
I risultati di inibizione della RT sono riportati in Tabella 4 dove K50S(H) e K5N,OS(H) risultano essere sostanzialmente equipotenti, mentre il K5-N,OS(L) ha un’attività molto bassa.
TABELLA 4
Claims (24)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di un K5-N,O-supersolfatato avente un grado di solfatazione maggiore di 3,2, per la preparazione di composizioni farmaceutiche destinate a combattere l' infezione da HIV.
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,2 a 4.
- 3. Uso secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,5 a 4.
- 4. Uso secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto K5-Ν,Ο-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,7 a 4.
- 5. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che detta infezione da HIV è l’unica causa della sindrome da immunodeficienza acquisita detta AIDS.
- 6. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-5, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,0-supersolfatato è sotto forma di uno dei suoi sali farmaceuticamente accettabili.
- 7. Uso secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto sale farmaceuticamente accettabile è scelto tra il gruppo comprendente i sali di sodio, di potassio, di calcio, di magnesio, di alluminio e di zinco.
- 8. Uso secondo ima delle rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000.
- 9. Uso secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detta distribuzione è da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500.
- 10. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caraterizzato dal fato che deto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000.
- 11. Uso secondo la rivendicazione 10, caraterizzato dal fato che detta distribuzione è da circa 25.000 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di circa 40.000.
- 12. Uso secondo una delle rivendicazioni 1-7, caraterizzato dal fato che deto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000.
- 13. Uso secondo ima delle rivendicazioni 1-7, caraterizzato dal fato che deto K5-N,O-supersolfatato è otenuto per depolimerizzazione e ha un peso molecolare medio da 2.000 a 5.000.
- 14. Composizione farmaceutica per il trattamento dell’ infezione da HIV che comprende, in qualità di un suo principio ativo, una quantità farmacologicamente efficace di un K5-N,O-supersolfatato avente un grado di solfatazione superiore a 3,2, in miscela con un veicolo o eccipiente farmaceutico.
- 15. Composizione secondo la rivendicazione 14, caraterizzata dal fato di essere in unità di dosaggio.
- 16. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14 e 15, caraterizzata dal fato che deto K5-N,O-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,2 a 4.
- 17. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14 e 15, caraterizzata dal fato che deto K5-N,O-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,5 a 4.
- 18. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14 e 15, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato ha un grado di solfatazione da 3,7 a 4.
- 19. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-18, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 16.000.
- 20. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, caratterizzata dal fatto che detta distribuzione è da circa 2.500 a circa 10.000, con un peso molecolare medio di circa 6.500.
- 21. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-18, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 13.000 a circa 65.000.
- 22. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 21, caratterizzata dal fatto che detta distribuzione è da circa 25.000 a circa 50.000, con un peso molecolare medio di circa 40.000.
- 23. Composizione farmaceutica secondo una delle rivendicazioni 14-18, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato ha un peso molecolare con una distribuzione da circa 2.000 a circa 65.000, con un peso molecolare medio di 25.000-30.000.
- 24. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23, caratterizzata dal fatto che detto K5-N,O-supersolfatato è ottenuto per depolimerizzazione e ha un peso molecolare medio da 2.000 a 5.000.
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