ES2246406T3 - Uso de polisacaridos sobresulfatados como inhibidores del hiv. - Google Patents
Uso de polisacaridos sobresulfatados como inhibidores del hiv.Info
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Abstract
Uso de un polisacárido de K5 N, O-sobresulfatado que tiene un grado de sulfatación, que se expresa como relación sulfato/carboxilo, mayor que 3, 2, para la preparación de composiciones farmacéuticas para combatir infecciones por HIV.
Description
Uso de polisacáridos sobresulfatados como
inhibidores del HIV.
El Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida
(SIDA) se ha convertido en una pandemia global, aunque las muertes
causadas por infección por HIV están decreciendo considerablemente
en los países con economía de mercado estable donde se han
introducido los cócteles de inhibidores específicos de las enzimas
virales transcriptasa inversa (RT) y proteasa en la práctica
clínica. Cerca de una docena de medicamentos están disponibles hoy
en día en el mercado. Sin embargo, se lleva a cabo el tratamiento
con tales drogas con fuertes efectos secundarios. Además, las
variantes del HIV que son resistentes a los medicamentos en uso
están emergiendo y difundiéndose. Puesto que, en la actualidad, la
terapia retroviral detiene temporalmente la replicación viral pero
no es capaz de erradicar el HIV de las células infectadas
crónicamente, y, en consecuencia, de los individuos seropositivos,
es esencial identificar nuevas clases de medicamentos antivirales
que puedan complementar y posiblemente sustituir (en el caso de la
resistencia farmacológica) los medicamentos que ahora están en
uso.
Los diferentes pasos del ciclo replicativo del
HIV son potencialmente vulnerables por inhibidores específicos.
Éstos se pueden dividir convencionalmente en:
- -
- Unión específica de la partícula viral (virión) a la superficie de la célula seguido de la unión específica a las células CD4+ mediante la interacción de la glicoproteína de la envoltura viral (gp120 Env) expuesta en la superficie del virión. La unión entre gp120 Env y CD4 permite, a través de un cambio conformacional, la unión posterior del gp120 Env con los co-receptores CCR5 y CXCR4 y la inserción del componente fusogénico de la envoltura viral (gp41 Env) en la membrana de la célula objetivo.
- -
- Eventos iniciales posteriores a la entrada del virus, subdivisibles esquemáticamente en la migración del complejo denominado de pre-integración desde el citoplasma hasta el núcleo contemporáneo al proceso de retrotranscripción del genoma viral desde el ARN hasta el ADN, y, finalmente, a la integración del ADN viral en los cromosomas de la célula infectada (provirus).
- -
- Eventos finales del ciclo de vida del HIV, que comprenden la transcripción de los genes virales para la síntesis de nuevas proteínas virales, su ensamblaje en la superficie interna de la célula, la gemación de nuevos viriones que se separarán de la célula infectada para comenzar un nuevo ciclo de infección.
La fase más temprana del proceso de infección es
la adhesión del virión a la membrana celular que ocurre
independientemente de la interacción del gp120 Env con los
receptores específicos en la célula huésped. Entre los diferentes
mecanismos que se han propuesto, el más fiable incluye la
asociación de regiones gp120 Env cargadas positivamente con los
sulfatos de heparán de membrana cargados negativamente
(proteoglicanos). De hecho, los polianiones unen eficientemente la
molécula gp120 Env de varios aislados virales y en consecuencia
tienen potentes efectos antivirales y representan agentes
terapéuticos potenciales.
Se conoce que el polisacárido capsular K5 que se
aisló a partir de una cepa de E. coli (se refiere aquí abajo
simplemente como "K5") descrita por W.F. Vann et al.
(1981) en Eur. J. Biochem. 116,
359-364, muestra la misma secuencia que el
precursor biosintético de la heparina y el sulfato de heparán
(N-acetilheparosán) y está constituido químicamente por
unidades repetitivas de disacárido formadas por ácido
D-glucurónico y N-acetilglucosamina enlazados
\alpha1-4, mientras que las unidades de disacárido
D-glucuronil-N-acetilglucosamina están
enlazadas \beta1-4. La única diferencia, que no es
importante para las actividades biológicas de K5 y sus derivados,
entre el N-acetilheparosán, precursor de la heparina, y el
polisacárido K5, es la presencia de un doble enlace en la posición
4(5) en la terminación no reductora de algunas cadenas del
polímero K5, como se describe por ejemplo en EP 489647 y EP 544592
que se mencionan aquí abajo.
Después de esta primera publicación, otros
artículos y solicitudes de patente describieron la
preparación del polisacárido K5 de E. coli que tenía rangos
de peso molecular desde varios miles hasta varios cientos de miles
de Daltons y de polisacáridos K5 modificados química o
enzimáticamente, por ejemplo para preparar productos N- y/u
O-sulfatados o, posiblemente,
N,O-sulfatados y epimerizados en la posición
5 del ácido glucurónico para obtener productos de tipo heparina. Se
citan por ejemplo EP 333243, IT 1230785, EP 489647, EP 544592, WO
92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 98/34958, WO 98/42754, WO
01/02597, WO 02/068477, el artículo de M. Manzoni et al.
Journal Bioactive Compatible Polymers 1996, 11,
301-311 y el artículo de D. Leali et al.
Journal of Biological Chemistry 2001, 276,
37900-37908.
En particular, entre estos documentos, EP 333243
describe los compuestos K5 O-sulfatados posiblemente
adecuados para el tratamiento de las patologías debidas a virus con
una envoltura como el virus Herpes Symplex, el virus de la
estomatitis vesicular, el HIV de tipo 1 (HIV-1) y
el HIV de tipo 2 (HIV-2). Este documentos describe
los polisacáridos K5 O-sulfatados que tienen como máximo
1,25 grupos sulfato por unidad de sacárido (correspondiente a 2,5
grupos sulfato por disacárido), un tetrasacárido, un hexasacárido y
un octasacárido que contengan, respectivamente, 3,4, 3,2 y 1,5
grupos sulfato por unidad de disacárido.
Además, WO 98/34958 describe los derivados
O-sulfatados del polisacárido K5 que tienen una relación
sulfato/carboxilo entre 0,5 y 4 con actividad antimetastática y
antiviral, en particular el K5 O-sulfatado que tiene un grado
de sulfatación desde 2,5 hasta 4. De acuerdo con este documento,
los compuestos más sulfatados (sulfato/disacárido > 2,5)
muestran una interesante actividad anti-HIV.
Los derivados N,O-sulfatados de K5 que se
han descrito en estas referencias, en particular EP 489647, EP
544592 y WO 98/09636, tienen un grado de sulfatación desde 1,6
hasta 3,1, mientras que el grado de sulfatación del K5
O-sulfatado puede alcanzar 4. WO 02/068477 expone un K5
N,O-sobresulfatado que tiene un grado de sulfatación mayor
que 3,2 con actividad frente a radicales libres, así como su
preparación. Leali et al. Journal of Biological
Chemistry 2001, 276, 37900-37908
describen polisacáridos K5 altamente N,O-sulfatados con una
relación sulfato/carboxilo de 3,84 con actividad angiostática y
actividad anticoagulante baja. Por otra parte, nunca se ha descrito
la actividad anti-HIV de los derivados de K5
N,O-sulfatados que se conocen.
Casu et al. Carbohydrate Research
1994, 263, 271-284 describen la
N-desacetilación de K5, la N-sulfatación y tres
métodos de O-sulfatación que se indican como B, C y AC. Se
obtienen compuestos polisulfatados después de una mayor
N-sulfatación que tienen una relación sulfato/carboxilo
máxima de 3,1, de acuerdo con el método C, en el que se lleva a
cabo la sulfatación del K5 N-sulfato usando 10 equivalentes
molares de agente sulfatante por grupo hidroxilo libre a una
temperatura de 25-55ºC durante un período de tiempo
que oscila entre 1 y 24 horas.
También se designan aquí abajo los derivados de
K5 como sigue: "K5 N-desacetilado" el polisacárido K5
N-desacetilado, "K5 N-sulfato" el polisacárido K5
N-desacetilado-N-sulfatado, "K5
N,O-sulfatado" el polisacárido K5
N-desacetilado-N,O-sulfatado y "K5
N,O-sobresulfatado" el polisacárido K5
N-desacetilado-N,O-sulfatado con un alto grado de
sulfatación, obtenible de acuerdo con el Método C del artículo de
Casu et al. que se ha mencionado
arriba.
arriba.
La expresión "condiciones de
O-sobresulfatación" indica la condición de
O-sulfatación exhaustiva, como aquélla del Método C que se ha
mencionado arriba. Se designa como "grado de sulfatación" el
número de grupos sulfato por unidad de disacárido, que se expresa
como la relación sulfato/carboxilo (SO_{3}^{-}/COO^{-}).
La invención se basa en la hipótesis de que se
pueden obtener derivados de K5 N,O-sobresulfatados con
actividad anti-HIV elevada, adecuados de este modo
para el tratamiento del Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida que
se conoce como SIDA, incrementando la anionicidad de los
polisacáridos N,O-sulfatados de K5. Tal hipótesis, sin
embargo, se enfrenta al problema de que la N,O-sulfatación
del K5 previamente N-desacetilado ocurre con
dificultad.
dificultad.
Se ha encontrado que se obtiene un polisacárido
K5 puro sustancialmente libre de sustancias lipofílicas,
purificando el K5 que se ha obtenido mediante fermentación por
tratamiento con isopropanol en una solución altamente salina, y que
se obtienen derivados de K5 N,O-sobresulfatados que tienen
un grado de sulfatación mayor que 3,2, sometiendo dicho K5 libre de
sustancias lipofílicas a una N-desacetilación, una
N-sulfatación, una O-sulfatación bajo condiciones de
O-sobresulfatación, y opcionalmente a una mayor
N-sulfatación. Se dotan estos derivados de K5
N,O-sobresulfatados con actividades interesantes de
inhibición de la entrada y de la replicación del HIV con una
relación favorable con respecto a la actividad anticoagulante
global y, de este modo, se pueden usar para la preparación de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de infecciones por
HIV, particularmente útil para combatir la Inmuno Deficiencia
Adquirida a dosis en que se reduce extremadamente el riesgo de
efectos secundarios hemorrágicos.
Más particularmente, hemos demostrado que los
derivados de K5 N,O-sobresulfatados que tienen un grado de
sulfatación mayor que 3,2 tienen un efecto inhibitorio elevado
sobre las cepas virales dualtrópicas que usan ambos
co-receptores CCR5 y CXCR4 (cepas R5X4) que se
generan durante las últimas fases de la infección por HIV.
Dichas cepas emergen en el 50% de los individuos
seropositivos en las últimas fases de la infección y está
demostrado que pueden causar una progresión más acelerada de la
patología.
La presente invención se refiere al uso de
derivados de K5 N,O-sobresulfatados que tienen un grado de
sulfatación mayor que 3,2 o de sus sales farmacéuticamente
aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas para
combatir la infección por HIV y la consiguiente enfermedad de
HIV//SIDA, teniendo dicha infección por HIV como la causa
secundaria.
Los derivados de K5 N,O-sobresulfatados de
la presente invención exhiben una actividad marcada en la supresión
de la replicación de varias cepas de HIV-1 en
células CD4+ primarias que se derivan de la sangre venosa
periférica de adultos seronegativos sanos que se aislaron mediante
el gradiente de Ficoll, a partir del anillo del que se obtuvo la
fracción de células mononucleares (PMBC) que se estimulan entonces
con fitoaglutinina (PHA) durante 3 días y que se mantienen
posteriormente en un medio enriquecido con
interleucina-2 (IL-2) (blastos
PHA). Se somete una segunda fracción de PBMC a un segundo gradiente
de Percoll para aislar los monocitos, que se siembran en adherencia
durante 5-7 días para obtener macrófagos derivados
in vitro (MDM) susceptibles a la infección por HIV.
En particular, los derivados de K5
N,O-sulfatados que tienen un grado de sulfatación mayor que
3,2 tienen un efecto inhibitorio elevado en cepas dualtrópicas R5X4
que se genera durante las últimas fases de la patología de HIV.
Dicho efecto inhibitorio es también mayor que aquél que ejercen los
derivados de K5 O-sulfatados con el mismo grado de
sulfatación tales como aquéllos que se describen en WO 98/34958.
Ventajosamente, el K5 N,O-sobresulfatado
que se usa para tal uso tiene un grado de sulfatación desde 3,2
hasta 4, más ventajosamente desde 3,5 hasta 4, preferiblemente
desde 3,7 hasta 4.
Entre las sales de dicho K5
N,O-sobresulfatado, las sales de sodio, potasio, calcio,
magnesio, aluminio y zinc son las preferidas.
Los derivados de K5 N,O-sobresulfatados de
la invención muestran preferiblemente pesos moleculares promedio en
el rango entre 2.000 y 65.000, ventajosamente entre 2.500 y 20.000
dalton (D). Se pretende expresar todos los pesos moleculares que se
indican aquí abajo en dalton y calcularlos de acuerdo con Harenberg
et al. Journal of Chromatography A 1983, 261,
287-292.
Se preparan los derivados de K5
N,O-sobresulfatados de la presente invención mediante un
proceso que comprende:
- (a)
- Tratar un K5 de fermentación con isopropanol en una solución salina fuerte;
- (b)
- Someter el K5 que se ha purificado de este modo a una N-desacetilación mediante hidrólisis alcalina y a una N-sulfatación posterior mediante el tratamiento con un agente N-sulfatante;
- (c)
- Tratar una sal de amonio del K5 N-sulfato que se ha obtenido de este modo con un agente O-sulfatante en las condiciones de O-sobresulfatación;
- (d)
- Someter el producto que se ha obtenido de este modo, si se necesita, a una N-sulfatación y aislar el K5 N,O-sobresulfatado como una sal de sodio que se convierte, si es necesario, en otra sal.
En el paso (a), el material de partida de K5
puede ser uno de los productos que se ha obtenido por fermentación
de cepas de Escherichia coli naturales o clonadas,
produciendo K5. En particular se puede usar el K5 que se describe en
la literatura como aquéllos que se han citado arriba,
ventajosamente aquéllos descritos por Manzoni et al.
Journal of Bioactive and Compatible polymers 1996,
11, 301-311 y aquél que se ilustra en la
Preparación 1 de aquí abajo.
Más ventajosamente, el material de partida de K5
tiene un peso molecular bajo, en particular con una distribución de
peso molecular desde 1.500 hasta 15.000, preferiblemente desde
2.000 hasta 9.000, con un peso molecular promedio de 5.000, o un
peso molecular promedio mayor, en particular con una distribución
desde 10.000 hasta 50.000, preferiblemente desde 20.000 hasta
40.000, con un peso molecular promedio de 30.000. Preferiblemente,
el material de partida de K5 tiene una distribución de peso
molecular desde 1.500 hasta 50.000 con un peso molecular promedio
de 20.000-25.000.
Se propone el peso molecular de K5 y de los
derivados de él que aquí se describen tal como se calcula usando
fracciones de heparina de peso molecular conocido como
estándares.
El producto de partida puede ser un K5 que se ha
purificado previamente a partir del que, por ejemplo, se han
eliminado las endotoxinas, los pirógenos u otras impurezas mediante
métodos que se conocen.
Similarmente, si se usa el K5 que se ha obtenido
al final del paso (a) con propósitos farmacéuticos o para la
preparación de K5 N,O-sulfatado para uso farmacéutico, se
puede purificar a partir de pirógenos y endotoxinas.
Prácticamente, se disuelve el K5 de partida en
una solución salina 2-5 M, preferiblemente de
cloruro de sodio, a una concentración desde 0,5 hasta 10% y se trata
la solución que se ha obtenido así, que se ha llevado hasta
2-4 M mediante una mayor adición de sal,
preferiblemente cloruro de sodio, con 1-3 volúmenes
de isopropanol a una temperatura de 0-8ºC.
Después de 1-18 horas a la misma
temperatura, el producto del paso (a) precipita completamente y se
aísla mediante filtración o centrifugación. Si la pureza del
producto no es satisfactoria, se repite el procedimiento del paso
(a). Se redisuelve el producto sólido que se ha obtenido así en
agua y se recupera mediante ultrafiltración sobre una membrana.
Al final del paso (a), se obtiene un K5 que tiene
las mismas características que el material de partida, pero estando
sustancialmente libre de sustancias lipofílicas.
\newpage
Prácticamente, el K5 libre de sustancias
lipofílicas es obtenible mediante un proceso que comprende (a1)
tratar un K5 de la fermentación, que se ha disuelto en una solución
4 M de cloruro de sodio a 4ºC con 1 volumen de isopropanol, (a2)
llevar la solución salina hasta 3 M añadiendo la cantidad calculada
de solución saturada de cloruro de sodio, (a3) manteniendo la
solución a 4ºC durante una noche y (a4) aislando el producto
mediante centrifugación y eliminando las sales mediante
ultrafiltración.
Mediante la purificación con isopropanol es
posible de este modo obtener un K5 libre de sustancias lipofílicas
con una pureza superior al 99%. Este K5 permite obtener una
O-sulfatación elevada en el siguiente paso (c).
En el paso (b), se lleva a cabo la
N-desacetilación de acuerdo con los métodos que se conocen
de hidrólisis alcalina, por ejemplo con sulfato de hidracina en
hidracina o con una base tal como un hidróxido alcalino, por
ejemplo hidróxido de sodio o de potasio, en agua. Se lleva a cabo
preferiblemente la reacción en una solución acuosa de hidróxido de
sodio a una temperatura de 40-80ºC, controlando el
curso de la reacción. En general, después de 30 horas como máximo,
pero prácticamente después de 12-24 horas, la
N-desacetilación es completa y se neutraliza la alcalinidad
del medio por tratamiento con un ácido, preferiblemente ácido
clorhídrico.
Se trata posteriormente la solución que contiene
el K5 y las sales con un agente N-sulfatante tal como el
aducto de una base orgánica terciaria con anhídrido sulfúrico
(trióxido de sulfuro), tal como un trióxido de
sulfuro\cdotpiridina (C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3}) o un
trióxido de sulfuro\cdottrialquilamina tal como el trióxido de
sulfuro\cdottrimetilamina en presencia de un carbonato alcalino
tal como el carbonato de sodio. Se puede llevar a cabo la reacción
a temperatura ambiente (20-30ºC), pero también es
posible trabajar a temperaturas mayores (hasta 65ºC) para reducir
el tiempo de reacción. Se puede llevar a cabo la adición del
carbonato alcalino y del agente sulfatante concurrentemente o se
introduce el carbonato alcalino a granel y posteriormente el agente
sulfatante, paso a paso, durante un período de tiempo que puede
durar desde 5 minutos hasta 12 horas. Al final de la reacción, se
lleva la mezcla, a temperatura ambiente, hasta pH
7,5-8 con un ácido, preferiblemente ácido
clorhídrico y se eliminan las sales por ejemplo mediante
diafiltración. Se puede pasar la solución que se ha obtenido así,
que contiene el K5 N-sulfato como una sal alcalina, hasta el
paso posterior (c), o se puede concentrar y se puede aislar el K5
N-sulfato como una sal de sodio con métodos convencionales.
El K5 N-sulfato que se ha obtenido así está sulfatado al
90-100%.
En el paso (c), se pasa una solución que contiene
el K5 N-sulfato alcalino tal como se ha obtenido en el paso
(b) por una resina de intercambio catiónico, como el IR 120 H^{+}
hasta pH acídico. Se trata la solución acídica que se ha obtenido
así con una base orgánica terciaria o cuaternaria, por ejemplo con
una trialquilamina como la tributilamina, o con un hidróxido de
tetraalquilamonio, preferiblemente hidróxido de tetrabutilamonio, se
reduce hasta el volumen mínimo y se seca al frío. Se suspende la
sal de amonio del K5 N-sulfato que se ha aislado de este
modo en un disolvente aprótico polar tal como dimetilformamida o
dimetilsulfóxido y se trata con un agente O-sulfatante, por
ejemplo con el aducto C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3}. Se puede usar
el aducto C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3} ya sea en estado sólido o
en solución en el mismo disolvente aprótico polar. Se lleva a cabo
la sulfatación a una temperatura que puede variar desde temperatura
ambiente (20-30ºC) hasta 70ºC, preferiblemente desde
40 hasta 60ºC, durante un período de tiempo desde 2 hasta 24
horas.
horas.
Al final de la reacción, se trata la solución a
temperatura ambiente con acetona saturada de cloruro de sodio hasta
la precipitación completa. Se separa el precipitado del disolvente
mediante filtración, se disuelve en la cantidad mínima de agua
desionizada, por ejemplo 100 ml, y se añade cloruro de sodio a la
solución hasta concentración 0,2 M. Se lleva la solución hasta pH
7,5-8 con hidróxido de sodio 2 N y se trata con
acetona hasta la precipitación completa. Se disuelve el sólido
después de la filtración en 100 ml de agua desionizada y se
purifica a partir de las sales residuales mediante ultrafiltración
tal como se ha descrito en el paso (b).
Si a partir del análisis por
RMN-^{13}C de una muestra secada al frío del
producto que se ha obtenido de este modo parece que ocurrió una
N-desulfatación parcial durante la sobresulfatación, se
somete el producto al paso (d).
En el paso (d), se trata el producto que se ha
obtenido al final del paso (c) con un agente N-sulfatante
operando bajo las condiciones del paso (b) hasta la
N-sulfatación completa, repitiendo el procedimiento si la
N-sulfatación no es completa.
Se aísla el K5 N,O-sobresulfatado que se
ha obtenido de este modo como la sal de sodio, que se puede
convertir en otra sal, como sales de potasio, calcio, magnesio,
aluminio, zinc o complejas mediante métodos que se conocen, por
ejemplo mediante intercambio iónico con una resina adecuada,
mediante precipitación con disolventes o mediante ultrafiltración a
través de membranas.
Se puede ensayar la pureza del nuevo K5
purificado de la fermentación mediante un espectro de
RMN-^{1}H, mediante un espectro UV, por reacción
con carbazol, o mediante un kit para la determinación de proteínas.
Se demostró mediante estos ensayos que el K5 que se obtuvo al final
del paso (a) tiene, como característica esencial, un espectro de
RMN-^{1}H en el que las señales en el campo por
debajo de 1,5 ppm están ausentes. Además los ácidos nucleicos no
son detectables, (absorbancia 0 a 260 nm con un espectrofotómetro UV
estándar) y las proteínas no son mayores que 0,5%, ventajosamente
por debajo de 0,25%, más ventajosamente por debajo de 0,1%,
preferiblemente por debajo de 0,03% de acuerdo con el kit
BioRad.
De hecho, el nuevo K5 puro que se obtuvo al final
del paso (a) está libre de sustancias lipofílicas y ácidos
nucleicos. El uso de "sustancialmente", referido a la ausencia
de sustancias lipofílicas y de "no detectable" referido a los
ácidos nucleicos tiene en cuenta la sensibilidad de los
instrumentos que se han usado que no revelaron la presencia de las
impurezas que se han mencionado arriba.
Se estableció de este modo que el espectro de
RMN-^{1}H del polisacárido K5 puro que se obtuvo
de este modo carece de las señales a <1,5 ppm características del
grupo metilo de las sustancias lipofílicas.
Los nuevos compuestos K5 que se han purificado de
este modo, que permiten la preparación de K5
N,O-sobresulfa-
tados con un grado elevado de sulfatación, tienen preferiblemente un peso molecular bajo, en particular con una distribución desde 1.500 hasta 15.000, preferiblemente desde 2.000 hasta 9.000, con un peso molecular promedio de 5.000, o un peso molecular mayor, en particular con una distribución desde 10.000 hasta 50.000, preferiblemente desde 20.000 hasta 40.000 con un peso molecular promedio de 30.000. Preferiblemente el material de partida K5 tiene una distribución de peso molecular desde 1.500 hasta 50.000 con un peso molecular promedio de 20.000-25.000.
tados con un grado elevado de sulfatación, tienen preferiblemente un peso molecular bajo, en particular con una distribución desde 1.500 hasta 15.000, preferiblemente desde 2.000 hasta 9.000, con un peso molecular promedio de 5.000, o un peso molecular mayor, en particular con una distribución desde 10.000 hasta 50.000, preferiblemente desde 20.000 hasta 40.000 con un peso molecular promedio de 30.000. Preferiblemente el material de partida K5 tiene una distribución de peso molecular desde 1.500 hasta 50.000 con un peso molecular promedio de 20.000-25.000.
Los derivados de K5 N,O-sobresulfatados
que se obtuvieron de acuerdo con el proceso que se ha mencionado
arriba, especialmente en su forma farmacéuticamente aceptable, son
productos altamente aniónicos útiles para la preparación de
composiciones farmacéuticas con actividad antiviral,
particularmente adecuados para el tratamiento de la infección por
HIV y del SIDA, que es su consecuencia.
Dichos derivados de K5 N,O-sobresulfatados
tienen un grado de sulfatación mayor que 3,2, ventajosamente desde
3,2 hasta 4, más ventajosamente desde 3,5 hasta 4, preferiblemente
desde 3,7 hasta 4.
Ventajosamente dicho K5 N,O-sobresulfatado
tiene un peso molecular bajo, particularmente con una distribución
desde 2.000 hasta 16.000, preferiblemente desde 2.500 hasta 10.000
con un peso molecular promedio de 6.500, o un peso molecular de
algún modo mayor, en particular con una distribución desde 13.000
hasta 65.000, preferiblemente desde 25.000 hasta 50.000 con un peso
molecular promedio de 40.000. Preferiblemente el material de
partida K5 N,O-sobresulfatado de la presente invención tiene
una distribución de peso molecular desde 2.000 hasta 65.000, con un
peso molecular promedio de 25.000-30.000. También el
K5 N,O-sobresulfatado que tiene un peso molecular promedio
muy bajo, por ejemplo desde 2.000 hasta 5.000, que se ha obtenido
mediante despolimerización, constituyen productos muy
interesantes.
Se puede llevar a cabo la despolimerización que
permite la preparación de los derivados de K5
N,O-sobresulfatados con peso molecular promedio desde 2.000
hasta 5.000 al final de uno de los pasos (b)-(d) del proceso que se
ha ilustrado arriba, preferiblemente al final del paso (b) o sobre
el K5 N,O-sobresulfatado final.
Se puede llevar a cabo la despolimerización de
acuerdo con cualquiera de los métodos que se conocen para la
despolimerización de la heparina, por ejemplo mediante ácido
nitroso y posterior reducción con borohidruro de sodio (EP 37319),
mediante peryodato (EP 287477), mediante radicales libres (EP
121067) o mediante \beta-eliminación (EP 40144).
Se lleva a cabo la despolimerización ventajosamente, en el caso de
K5 N,O-sobresulfatado, sobre un K5 N-sulfato que se
ha obtenido al final del paso (b) con ácido nitroso y posterior
reducción con borohidruro de sodio tal como se detalla en EP 544592.
Al final de la despolimerización y la reducción, se somete el
producto de peso molecular bajo que se ha obtenido de este modo a
los pasos (c) y, opcionalmente, (d) y se aísla el K5
N,O-sobresulfatado.
Alternativamente, se puede aplicar el mismo
procedimiento de despolimerización y reducción sobre un K5
N,O-sobresulfatado con peso molecular elevado y se obtiene el
producto de peso molecular bajo correspondiente.
Entre las sales de los derivados de K5
N,O-sobresulfatados que se han mencionado arriba, las sales
de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y zinc son las
preferidas.
Los medicamentos que se usan hoy en día para la
terapia de la infección por HIV interfieren en dos fases
fundamentales del ciclo de vida del virus: la retrotranscripción y
la descomposición de la poliproteína Gag en sus formas maduras por
la proteasa viral. Debido al descubrimiento de los receptores de
quemoquina CCR5 y CXCR4 como co-receptores obligados
del HIV para la infección de los linfocitos y los macrófagos CD4+,
una nueva clase potencial de medicamentos antivirales comprende
moléculas capaces de inhibir la unión del virus a la molécula CD4
y/o al receptor de quemoquina y/o de inhibir el proceso de fusión de
las membranas celulares y virales mediado por la glicoproteína de
envoltura gp41 (Moore, J.P. and Stevenson, M. Nat. Rev. Mol.
Cell. Biol. 2000, 1, 40-49). En
este contexto, el desarrollo de inhibidores de la entrada de virus
dialtrópicos R5X4, de este modo capaz de infectar las células CD4+
interaccionando con CCR5 o CXCR4, tiene una gran relevancia en la
prevención de la evolución del HIV-1 del grupo B,
dominante en USA, Canadá, Australia y Europa, estando asociada la
evolución a una progresión acelerada de la patología (Koot, M.
et al. Ann. Intern. Med. 1993, 118,
681-688). Se probó la actividad anti HIV en el virus
HIV-1 tanto en blastos PHA (blastos) como en
macrófagos derivados de la adhesión de monocitos (MDM) de sangre
periférica. Se usó la cepa viral HIV-1_{Bal},
usando solamente el co-receptor CCR5, tanto para la
infección de blastos como de MDM, mientras que se usó la cepa
dualtrópica usando el co-receptor CXCR4 además del
CCR5 (virus R5X4) y la cepa usando sólo el
co-receptor CXCR4 (cepa X4) justamente para la
infección de los blastos. Se generan estas cepas (R5X4 y X4)
durante las últimas fases de la infección, y el virus puede
extender su capacidad infectiva a las células expresando el receptor
CXCR4 además del CCR5.
Se añaden los virus a la multiplicidad de la
infección (m.o.i.: número de unidades virales infectivas/número de
células objetivo) de 0,1. Se recogen alícuotas de los sobrenadantes
de los cultivos cada 48-72 horas y se prueba la
actividad viral RT presente en el sobrenadante del cultivo tal como
describen Vicenzi et al. (J. Virol. 1999,
73, 7515-7523). Puesto que el enzima RT está
asociado en un 99% a los viriones, la determinación de su actividad
es equivalente a la determinación de la presencia de las partículas
virales en dicho fluido. La actividad RT alcanza un pico y entonces
disminuye debido al efecto citopático del virus sobre las células
objetivo. Entonces se usa el pico de actividad RT como un índice
para evaluar la concentración del agente antiviral potencial.
Se comparó el K5 N,O-sobresulfatado que se
ha obtenido de acuerdo con la Preparación III, representativo de la
presente invención, que tiene un grado de sulfatación de 3,84 y que
se ha designado como K5-N,OS(H), con otros
dos derivados del polisacárido K5, en particular con un K5
N,O-sulfatado que tiene un grado de sulfatación de 1,77 y que
se ha designado como K5-N,OS(L), que se ha
obtenido tal como se ha descrito en la Preparación V, y con un K5
O-sulfatado que tiene un grado de sulfatación de 3,77, que se
ha designado como K5-OS(H) y que se ha
preparado tal como se ha descrito en la Preparación VI.
La replicación del HIV-1 tanto en
los blastos PHA como en MDM está inhibida por los compuestos que se
probaron in vitro a concentraciones en el rango entre 1 y
100 \mug/ml. Sin embargo, el compuesto representativo de la
presente invención, K5-N,OS(H), inhibe las
cepas R5X4 dualtrópicas que se generan durante las etapas avanzadas
de la infección en un 99% ya a una concentración de 1 \mug/ml,
mientras que los dos productos de referencia,
K5-OS(H) y K5-N,OS(L),
inhiben las mismas cepas en un 98% a la concentración de 10 y 100
\mug/ml, respectivamente. Además el
K5-N,OS(H), tanto como el
K5-OS(H), es activo en todas las demás cepas
que se han usado a concentraciones de 1-10
\mug/ml, mostrando ser siempre más activo que el
K5-N,OS(L).
Para los usos terapéuticos previstos se formulan
los derivados de K5 N,O-sobresulfatados que se han
mencionado arriba y sus sales de ello de acuerdo con las técnicas
convencionales en formas de administración adecuadas tales como
soluciones estériles, formas de dosificación tópica y, en general,
en todas aquellas formas que se han propuesto hasta hoy para
derivados de polisacáridos o glicosaminoglicanos. También se escogen
las dosis terapéuticas por analogía con aquéllas que ya se han
estudiado para los compuestos naturales que se conocen.
La administración del K5
N,O-sobresulfatado puede ocurrir por ruta transdérmica o,
preferiblemente, parenteral, en particular por ruta subcutánea,
intramuscular o intravenosa o tópica.
En humanos, se prevé la dosis diaria para la
administración parenteral en 0,5-500 mg/Kg/día,
ventajosamente 5-250 mg/Kg/día, preferiblemente
10-150 mg/Kg/día, mientras que la dosis prevista
por la ruta tópica es 1-1000 mg/Kg/día,
ventajosamente 10-500 mg/Kg/día, preferiblemente
20-100 mg/Kg/día.
Para su administración, los derivados de K5
N,O-sobresulfatados que tienen un grado de sulfatación mayor
que 3,2, ventajosamente desde 3,2 hasta 4, más ventajosamente desde
3,5 hasta 4, preferiblemente desde 3,7 hasta 4, o sus sales,
constituyen de este modo ingredientes activos que se formulan en
composiciones farmacéuticas adecuadas para el tratamiento de las
infecciones por HIV, en particular del Síndrome de Inmuno
Deficiencia Adquirida.
Dicho K5 N,O-sobresulfatado puede tener
una de las características del grado de sulfatación que se han
ilustrado arriba.
Una sal que se selecciona a partir del grupo que
consiste en sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y
zinc constituye un ingrediente activo adecuado de las
composiciones.
En las composiciones farmacéuticas para la
administración oral, subcutánea, intravenosa, transdérmica, o
tópica, se administran preferiblemente los ingredientes activos en
forma de unidad de dosificación, en mezcla con los excipientes o
vehículos farmacéuticos clásicos. La dosis puede cambiar
ampliamente en función de la edad, el peso, y las condiciones de
salud del paciente, tanto como de la severidad de la infección y la
ruta de administración. Esta dosis comprende la administración de
una unidad de dosificación desde 1 hasta 1.000 mg, ventajosamente
desde 10 hasta 750 mg, preferiblemente desde 250 hasta 500 mg de
ingrediente activo, desde una hasta tres veces por día mediante ruta
intravenosa, subcutánea, oral, transdérmica o tópica.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Preparación
I
Primero se lleva a cabo una fermentación en un
matraz usando el siguiente medio:
| Soja desgrasada | 2 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 9,7 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 2 g/l |
| MgCl_{2} | 0,11 g/l |
| Citrato de sodio | 0,5 g/l |
(Continuación)
| Sulfato de amonio | 1 g/l |
| Glucosa | 2 g/l |
| Agua | 1.000 ml |
| pH = 7,3 |
Se esteriliza el medio a 120ºC durante 20
minutos. Se prepara la glucosa separadamente como una solución que
se esteriliza a 120ºC durante 30 minutos y se añade estéril al
medio. Se inocula el matraz con una suspensión de células de E.
coli Bi 8337/41 (O10:K5:H4) a partir de un slant que se ha
mantenido en agar tríptico de soja, y se incuba a 37ºC durante 24
horas bajo agitación controlada (160 rpm, 6 cm de recorrido). Se
mide el crecimiento bacteriano contando las células con un
microscopio. En un paso posterior, se inocula un fermentador
Chemap-Braun con un volumen de 14 litros que
contiene el mismo medio que arriba con el 0,1% el cultivo del
matraz de arriba y se lleva a cabo la fermentación con aeración
lvvm (vvm = volumen de aire por volumen de líquido por minuto),
agitación a 400 rpm y temperatura de 37ºC durante 18 horas. Durante
la fermentación se mide el pH, el oxígeno, la glucosa residual, el
polisacárido de K5 que se ha producido y el crecimiento bacteriano.
Se separan las células del medio mediante centrifugación a 10.000
rpm y se ultrafiltra el sobrenadante a través de un módulo SS 316
(MST) equipado con membranas PES con un tamaño nominal de 800 y
10.000 D para reducir el volumen hasta 1/5. Entonces se precipita
el polisacárido K5 añadiendo 4 volúmenes de acetona a 4ºC y se deja
sedimentar durante una noche a 4ºC y finalmente se centrifuga a
10.000 rpm durante 20 minutos o se filtra. Entonces se lleva a cabo
una desproteinización usando una proteasa del tipo II de
Aspergillus orizae en NaCl 0,1 M y ácido
etilendiaminotetraacético 0,15 M (EDTA) a pH 8 que contiene
dodecilsulfato de sodio al 0,5% (SDS) (10 mg/l de filtrado) a 37ºC
durante 90 minutos. Se ultrafiltra la solución sobre un módulo SS
316 con una membrana de tamaño nominal de 10.000 D con 2
extracciones con NaCl 1 M y se lava con agua hasta que la
absorbancia desaparece en el ultrafiltrado. Entonces se precipita
el polisacárido de K5 con acetona y se obtiene un rendimiento de 850
mg/l de fermentador. Se mide la pureza del polisacárido mediante la
determinación de ácido uró-
nico (método del carbazol), RMN de protón y carbono, UV y contenido de proteína. La pureza es mayor que un 80%.
nico (método del carbazol), RMN de protón y carbono, UV y contenido de proteína. La pureza es mayor que un 80%.
El polisacárido que se ha obtenido de este modo
está compuesto por dos fracciones con peso molecular diferente,
30.000 y 5.000 D respectivamente tal como se ha obtenido a partir
de la determinación de HPLC usando una columna Pharmacia 75 HR y una
fracción única con un tiempo de retención de aproximadamente 9
minutos usando dos columnas de Bio-sil SEC 250 en
serie (BioRad) y Na_{2}SO_{4} como fase móvil a temperatura
ambiente y a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. Se lleva a
cabo la determinación frente a una curva que se ha obtenido con
fracciones de heparina con peso molecular conocido.
El espectro de RMN-^{1}H de K5
que se ha obtenido de este modo muestra que en la región por debajo
de 1,5 ppm están presentes varias señales atribuibles a los grupos
metilo de las sustancias lipofílicas.
Preparación
II
Se disuelven 5 g del K5 que se ha obtenido al
final de la Preparación I en 100 ml de una solución acuosa que
contiene cloruro de sodio 4 M y que está termostatizada a 4ºC y se
añade 1 volumen de isopropanol frío a la solución que se ha obtenido
de este modo. Se lleva la concentración de sal de la solución hasta
3 M añadiendo una cantidad calculada de una solución saturada de
cloruro de sodio y se mantiene la solución enfriada a temperatura
fría (aproximadamente 4ºC) durante una noche. Se separa el
precipitado que se ha formado mediante centrifugación a 10.000 rpm
durante 20 minutos y se controla la pureza del producto por
diálisis durante una noche y posterior análisis por
RMN-^{1}H a partir del cual las señales en la
región por debajo de 1,5 ppm están ausentes. Si es necesario, se
repite el procedimiento de disolución en agua que contiene NaCl 4 M
y la precipitación con isopropanol. Se disuelve el precipitado en
agua y se ultrafiltra sobre una membrana Millipore Miniplate con un
tamaño de 10.000 D hasta la desaparición de las sales. Un K5 que
tiene una pureza de como mínimo un 99% y en cuyo espectro de
RMN-^{1}H no hay trazas de impurezas lipofílicas
en la región por debajo de 1,5 ppm.
El contenido de proteína que se ha calculado
usando el kit BioRad es de un 0,02% y los ácidos nucleicos no son
detectables (absorbancia desde 0 hasta 260 nm).
Se disuelven diez gramos de polisacárido K5 puro
que se preparó tal como se ha descrito en la Preparación I y se
purificó tal como se ha descrito en la Preparación II con 1.000 ml
de hidróxido de sodio 2 N y se mantiene la solución que se ha
preparado de este modo a 60ºC durante 24 horas. Se lleva la
solución hasta temperatura ambiente y entonces hasta pH neutro con
ácido clorhídrico 6 N.
Se añaden 16 g de carbonato de sodio y
seguidamente 16 g de trióxido de azufre-piridina en
4 horas, sobre la solución que contiene el K5 desacetilado,
mantenida a 40ºC. Al final de la reacción, después de 24 horas, se
lleva la solución hasta temperatura ambiente y entonces hasta pH
7,5-8 con una solución de ácido clorhídrico al 5%.
Se purifica el producto de sales mediante diafiltración usando una
membrana espiral de 1.000 D (Prepscale
Cartridge-Millipore). Se acaba el proceso cuando la
conductividad del filtrado está por debajo de 1.000 \muS,
preferiblemente por debajo de 100 \muS. Se reduce la intradiálisis
hasta una concentración de polisacárido del 10% usando el mismo
sistema de diálisis en la concentración. Se seca al frío la
solución concentrada. El análisis del RMN-^{13}C
no muestra grupos N-acetilo o NH_{2} residuales.
Se disuelve el producto liofilizado que se ha
obtenido al final del paso (ii) en 100 ml de agua desionizada y se
lleva la solución hasta 10ºC con un baño refrigerante, entonces se
pasa sobre una resina de intercambio catiónico IR120H^{+} (100
ml). Se mantiene tanto la columna como el depósito a 10ºC. Se lava
la resina después del paso de la solución que contenía la muestra
con agua desionizada hasta que el pH del filtrado es mayor que 6
(aproximadamente 3 volúmenes de agua desionizada). Se lleva la
solución acídica hasta la neutralidad (pH 7) con hidróxido de
tetrabutilamonio (solución acuosa al 15%), entonces se reduce hasta
el volumen mínimo y se seca al frío. Se disuelve la sal de
tetrabutilamonio en 400 ml de dimetilformamida y se añaden 35 g de
C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3} en forma sólida. Se mantiene la
solución a 50ºC durante 24 horas. Se enfría la solución al final de
la reacción hasta temperatura ambiente y se añaden 3 volúmenes de
acetona saturada en cloruro de sodio, se enfría a 4ºC hasta la
precipitación completa (12 horas). Se separa el precipitado a partir
del disolvente mediante filtración, se solubiliza con la cantidad
mínima de agua desionizada (aproximadamente 100 ml) y se añade
cloruro de sodio a la solución hasta una concentración 0,2 M. Se
lleva la solución hasta pH 7,5-8 con hidróxido de
sodio 2 N y se trata con 2 volúmenes de acetona hasta la
precipitación completa. Se separa el precipitado del disolvente
mediante filtración. Se solubiliza el sólido que se ha obtenido con
100 ml de agua desionizada y se purifica de las sales residuales
mediante ultrafiltración tal como se describió en el paso (ii)
usando una membrana espiral de 1.000 D (Prepscale Cartridge
Millipore).
Se trata la solución que se ha obtenido de este
modo, que contiene el producto O-sulfatado, tal como se ha
descrito previamente en el paso (ii) para la N-sulfatación.
El producto muestra un peso molecular promedio de 15.000 D y una
relación sulfato/carboxilo de 3,84. La distribución de los grupos
sulfato, determinada con el RMN-^{13}C es la
siguiente: la unidad de glucosamina del disacárido constitutivo está
N-sulfatada y 6-O sulfatada al 100%, mientras que,
para las unidades de glucurónico, un 30% están mono
O-sulfatadas y un 70% son O-disulfatadas.
Se obtiene un K5 N,O-sobresulfatado, que
se ha designado como K5-N,OS(H1), que tiene
un peso molecular promedio de 13.000 y una relación de sulfato
respecto a carboxilo de 3,54, operando tal como se ha descrito en
la Preparación III partiendo de un K5 que se ha obtenido y
caracterizado tal como ha descrito M. Manzoni et al. (1996),
y que se ha purificado tal como se ha descrito en la Preparación
II.
Preparación
V
Se obtiene un K5 N,O-sulfatado, que se ha
designado como K5-N,OS(L), que tiene un peso
molecular promedio de 14.000 y una relación de sulfato respecto a
carboxilo de 1,7, operando tal como se ha descrito en la
Preparación III, pero usando 7 g del aducto
C_{5}H_{5}N\cdotSO_{3} en el paso (iii).
Se obtiene un K5 O-sobresulfatado, que se
ha designado como K5-OS(H), que tiene un
peso molecular promedio de 18.000 y una relación sulfato/carboxilo
de 3,77, operando tal como se ha descrito en el paso (iii) de la
Preparación III sobre un K5 que se ha obtenido tal como se ha
descrito en la Preparación I y que se ha purificado tal como se
describió en la Preparación II.
Se ensayó la actividad anti-HIV
en blastos PHA (blastos) usando la cepa viral
HIV-1_{Bla} capaz de usar solamente el
co-receptor CCR5 (virus monotrópico R5).
Se comparó un representante de K5
N,O-sobresulfatado de la presente invención, el
K5-N,OS(H) que se ha obtenido de acuerdo con
la Preparación III, y que tiene un grado de sulfatación de 3,84,
con otros dos derivados del polisacárido K5, en particular con un
K5 N,O-sulfatado que tiene un grado de sulfatación de 1,77 y
que se ha designado como K5-N,OS(L), que se
ha obtenido tal como se ha descrito en la Preparación V, y con un K5
O-sulfatado que tiene un grado de sulfatación de 3,77 que se
ha designado como K5-OS(H) y que se ha
preparado tal como se ha descrito en la Preparación VI. Se informa
en la Tabla 1 de los resultados de los efectos de los tres
derivados de K5 en la infección de las células que se han obtenido
a partir de un dador único y que se han probado por triplicado para
cada concentración de derivado, representativos de aquéllos que se
han obtenido en células aisladas a partir de tres dadores
independientes. Las tres muestras que se han probado alcanzan la
inhibición máxima de RT a la concentración de 10 \mug/ml.
| Concentración (\mug/ml) | K5-OS(H) (referencia) | K5-N,OS(H) | K5-N,OS(L) (referencia) |
| 0,1 | 62,5 | 30,7 | 4,8 |
| 1 | 81,2 | 40,8 | 31,3 |
| 10 | 98,5 | 96 | 98,7 |
| 100 | 98,9 | 99 | 99 |
Se probaron los productos bajo examinación en
blastos PHA usando la cepa viral HIV-1_{LAV/IIIB}
que usa solamente el co-receptor CXCR4 (virus
monotrópico X4). Se puede generar la cepa X4, aunque raramente,
durante las últimas fases de la infección antes de la evolución de
la patología para eliminar el SIDA.
Los resultados que se muestran en la Tabla 2,
muestran que a la concentración de 10 \mug/ml, tanto el
K5-OS(H) como el
K5-N,OS(H) inhiben casi completamente la
actividad RT. A la concentración de 1 \mug/ml, el
K5-OS(H) inhibe casi completamente la
actividad RT, mientras que el K5-N,O(H) la
inhibe en un 55%.
| Concentración (\mug/ml) | K5-OS(H) (referencia) | K5-N,OS(H) | K5-N,OS(L) (referencia) |
| 0,1 | 44,8 | 28,5 | 30 |
| 1 | 99,2 | 55 | 31,8 |
| 10 | 99,1 | 98,9 | 85,1 |
| 100 | 99,2 | 98,7 | 98,7 |
Se probaron los productos bajo examinación en
blastos usando la cepa viral HIV-1 89,6 que usa
tanto el co-receptor CCR5 como el CXCR4 (virus
dualtrópicos R5X4). Se pueden generar las cepas dualtrópicas R5X4
durante las últimas fases de la infección en aproximadamente un 50%
de los individuos infectados por HIV-1 del grupo B,
y pueden derivar tanto de una mezcla de las especies monotrópicas
R5 y X4 como de virus capaces de usar simultáneamente ambos
receptores (Ghezzi, S. et al. Virology 2001,
280, 253-261).
Se muestran los resultados en la Tabla 3, que
muestran como K5-N,OS(H) inhibe casi
completamente la actividad RT a la concentración de 1 \mug/ml,
mientras que K5-OS(H), a esta concentración,
tiene una actividad muy baja, como mínimo menor que aquélla del
K5-N,OS(L).
| Concentración (\mug/ml) | K5-OS(H) (referencia) | K5-N,OS(H) | K5-N,OS(L) (referencia) |
| 0,1 | 15,77 | 14,4 | 40,3 |
| 1 | 25 | 96,1 | 56 |
| 10 | 97,1 | 96,7 | 68,8 |
| 100 | 99 | 98,7 | 77,9 |
Se probó la actividad anti-HIV en
el virus HIV-1 en macrófagos derivados de
monocitos de sangre periférica (MDM), infectados con la cepa viral
HIV-1_{Bal} que usa solamente el
co-receptor CCR5 (virus monotrópico R5).
Se muestran los resultados de la inhibición RT en
la tabla 4 donde K5-OS(H) y
K5-N,OS(H) son sustancialmente equipotentes,
mientras que K5-N,OS(L) tiene una actividad
muy baja.
| Concentración (\mug/ml) | K5-OS(H) (referencia) | K5-N,OS(H) | K5-N,OS(L)(referencia) |
| 0,1 | 41 | 30,7 | 39,5 |
| 1 | 61,9 | 40,8 | 44,3 |
| 10 | 94,1 | 96 | 40,1 |
| 100 | 95,8 | 99 | 46,4 |
Claims (10)
1. Uso de un polisacárido de K5
N,O-sobresulfatado que tiene un grado de sulfatación, que se
expresa como relación sulfato/carboxilo, mayor que 3,2, para la
preparación de composiciones farmacéuticas para combatir infecciones
por HIV.
2. El uso de la reivindicación 1, donde dicho K5
N,O-sobresulfatado tiene un grado de sulfatación desde 3,2
hasta 4.
3. El uso de la reivindicación 2, donde dicho K5
N,O-sobresulfatado tiene un grado de sulfatación desde 3,5
hasta 4.
4. El uso de la reivindicación 2, donde dicho K5
N,O-sobresulfatado tiene un grado de sulfatación desde 3,7
hasta 4.
5. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde dicha infección por HIV
es la única causa del Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida que
se llama SIDA.
6. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde dicho K5
N,O-sobresulfatado está en forma de una de sus sales
farmacéuticamente aceptables.
7. El uso de la reivindicación 6, donde se
selecciona dicha sal farmacéuticamente aceptable a partir del grupo
que consiste en sales de sodio, potasio, calcio, magnesio,
aluminio, y zinc.
8. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde dicho K5
N,O-sobresulfatado tiene un peso molecular promedio en el
rango entre 2.000 y 65.000 dalton (D).
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
donde dicho rango está entre 2.500 y 20.000 dalton (D).
10. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde se obtiene dicho K5
N,O-sobresulfatado por despolimerización y tiene un peso
molecular promedio desde 2.000 hasta 5.000 dalton (D).
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