JPH04308531A - 抗エイズウイルス活性を有する硫酸化βグルカンのレトロウイルス感染症治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はレトロウイルスに起因す
る感染症、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因
するエイズ（ＡＩＤＳ）の治療の新規薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】現今、人類が直面している難病の一つで
ある後天性免疫不全症候群（ＡＣＱＵＩＲＥＤ　　ＩＭ
ＭＵＮＥ　　ＤＥＦＩＣＩＥＮＣＹ　　ＳＹＮＤＲＯＭ
Ｅ：ＡＩＤＳ）はレトロウイルスに属するヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）に起因することが解明されている。

【０００３】世界保険機構（ＷＨＯ）によると１９９０
年の時点においてエイズウイルス感染者数は８００万人
、発病者又は死亡者数は８０万人以上であり、我国にお
いても１９９０年１２月３１日の時点で３７１人の患者
が確認され、その内、発症にいたらないが、該ウイルス
に感染者数は１６２７人となっている。

【０００４】しかし、本病の治療法は全く不明であり本
病ウイルスとしては現在ＨＩＶ−１と、ＨＩＶ−２型の
２例が発見されているが、このウイルスが変異している
ことによりワクチン開発の実施化は非常な困難に直面し
ている、そこで抗ＨＩＶ剤による治療および予防的効果
が要求されている現況である。

【０００５】抗ＨＩＶ剤として唯一実用化されているも
のは、アジトチミジン（ＡＺＴ）がある（Ｎａｔｕｒｅ
　　３２６，４３０，１９８７）ＨＩＶの逆転写酵素の
阻害効果に基づく抗ＨＩＶ剤であるが、この薬剤は、生
体に強い副作用を示し、患者の造血作用を阻害すること
が明らかになると共に多くの患者に極度の貧血症が発現
している。近年、硫酸化デキストランのように多糖体類
を硫酸化することにより一部のウイルスに対して抗ウイ
ルス作用を示すことが確認されている（Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ
，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ　　１３，３６５，１９６５）

【０
００６】

【発明が解決しようとする課題】生理活性能が分子量に
依存するデンプンやデキストラン等のα−グルゴッド結
合を有する多糖体は体内酵素によって分解される、以上
の理由を考え、本発明者等は体内酵素の分解を受けにく
い、β−１．３結合の分枝鎖を高頻度に有するβ−１．
６およびβ−１．６分枝鎖結合をもつβ−１．３グルカ
ンを硫酸化することにり強い抗ＨＩＶ作用を有する薬剤
の開発を勘案した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は上述の事由に鑑
み本発明者等は、硫酸化βグルカンはヒト、Ｔ細胞由来
株（ＭＴ−４）を用したＩｎ　　ｖｉｔｒｏにおける抗
ＨＩＶ活性テストによりＨＩＶの増殖を完全に抑えるこ
とを明らかにし、なお、最小有効濃度は１０ｍｇ／ｍｌ
であり、従来より最も有効であると言われる硫酸デキス
トランの最小有効濃度に比較しても同等である。

【０００８】

【作用】即ちマイタケから得た多糖タンパク体をクロル
スルフオン酸法で硫酸化し、抗ＨＩＶ活性をもつ物質の
発明に至った。本発明薬剤の実施例に示す様にＨＩＶ（
ヒト免疫不全ウイルス）としてＨＩＶ−１（ＬＡＶ又は
ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ）を用いているがこの他ＨＩＶ−２
（２型エイズウイルス）にも同様の効果を有するもので
あり、非硫酸化物がＭパーＴ細胞（Ｔ４細胞）の活性を
賦活化することを発見していることからＨＩＶによって
変性を受けるＴ４細胞の変性が軽減されることにより抗
ＨＩＶ作用が示し得るものである。

【０００９】［製造例１］本件出願人が実施を容認され
た、特許第１５１４１１４号に基づく製法は、（１）マ
イタケの子実体または菌糸体を粉砕し３００ｇの乾燥粉
末を得た後、これに３ｌの蒸溜水を加え、１００℃で６
時間の熱水抽出、また１．２気圧、温度１２０℃で１時
間加熱処理し、冷却後遠心分離法によって得た上澄液に
等量のエタノールを加え、温度４℃、２０時間放置後、
１４．５ｇの沈殿を集めた。この沈殿１ｇに対し、水４
４０ｍｌを加えて溶解し、ｐＨ１２になるようセチルト
リメチルアンモニュウムヒドロキシドを添加し、１３．
８ｇの沈殿物を得た。これを３０％及び５０％の酢酸で
処理し、酸可溶物を除いて３ｇの酸不溶物を得た。ここ
に６％水酸化ナトリウムを加えアルカリ可溶物を集めた
。これに４倍量の９９％エタノールを加えて沈殿を得た
。この物質にクロロホルム−メタノール混液（２：１）
を加え、タンパクを除いた後エタノールを４倍量添加後
、温度４℃で２０時間放置し、遠心分離により、約１ｇ
の沈殿を得た。該物質は、冷水に難溶な淡褐色粉末でア
ンスロン反応は陽性であり、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法
により約２２％のタンパク質が検出されたことから、ブ
ロテオグルカンであることが確認された。 （２）次に、この糖タンパク質を先ず、セファロース（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ，２、５×４５ｃｍカ
ラムを用いてゲル濾過し、分子量２００×１０４の高分
子糖タンパク質を得た。更に、この物質をＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ２、０×４．５　　カラムに吸着
させ、ｐＨ７．２の１／１５Ｍリン酸緩衝液で溶出され
る物質を得た。この物質をセルロース透析チューブを用
いて４℃で精製水に対して透析し、さらにセフアデック
スＧ−２５．３×３７ｃｍカラムで完全に脱塩した。こ
れを蒸発乾固させ、淡褐色無定形粉末状の目的物を得た
。この物質は、０．６％のタンパク質を含む多糖であっ
た。 （３）次に、前記（２）で得た物質の化学構造を明らか
にした。即ち前記の物質１ｍｇを採り、５％塩酸−メタ
ノール１ｍｌに溶解し、温度１００℃で６時間封管分解
した後、分解物にトルエン−エタノール（１：１）混液
を添加して減圧下で蒸発乾固させた。これにトリメチル
けい素化剤を添加して温度７０℃で１０分間反応させ、
ＳＥ−２０（シリコンゴムＧＥ）を充填剤とするガスク
ロマトグラフ分析にかけたところ、グルコースのみが検
出された。さらに、この物質をエクソーβ−１，３−グ
ルカナーゼをｐＨ５．０でマツキュルビン緩衝液の下で
反応させたところ、４８時間後に構成グルコース残基の
約４５％が遊離した。以上の結果から、この物質はβ−
１．３結合を有するグルカンであることが確認された。

【００１０】（４）つづいて、この物質を箱守法により
完全メチル化した後、この完全メチル化物を５％塩酸−
メタノールによってメタノリシスした。これをネオペン
チルグリコールサクシネート（Ｎｅｏｐｅｎｔｙｌｇｌ
ｙｃｏｌ　　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を充填剤とするガス
クロマトグラフ分析したところ、β−１．３結合に由来
する２，４，６−トリー−０−メチル、β−１．６結合
に由来する２，３，６−トリ−０−メチル、１，３，４
結合に由来する２，４−ダイ−０−メチル及び非還元末
端に由来する２，３，４，６−テトラ−０−メチルグル
コース誘導体の存在が認められた。

【００１１】以上の結果から、マイタケ子実体を熱水抽
出して得られたこの物質は、β−１．６結合を主鎖とし
、これに高頻度のβ−１．３分枝鎖を有する化学的構成
よりなる多糖タンパクおよびβ−１．６分枝鎖をもつβ
−１．３多糖タンパクからなるものと結論した。ここで
得られた硫酸化β−１．６グルカンの分子量はマナーズ
法（Ｍａｎｅｒｓ　　Ｅｔ　　Ａｌ．１９７１）の改変
法を用いて約２２万と測定された。

【００１２】［製造例２］ 硫酸化β−１．６グルカンの調整 製造例１の方法で得られたβ−プロテオグルカン（ＭＴ
−Ｓ）を以下のようにして硫酸化物に変換した即ち３０
０ｍｌの丸底フラスコにピリジン２５ｍｌを入れ−１０
℃に冷却、攪拌をしながらクロスルホン酸５ｍｌを徐々
に加え１５〜２０分反応させ固化した反応物を６０〜７
０℃のオイルバスに浸し溶解する。この溶解物を約１時
間激しく攪拌した後冷水１００ｍｌを加えて飽和炭酸ナ
トリウム溶液で中和する。中和後５倍量のアセトンを加
えて上澄液と沈殿物に分画する。この沈殿物を５０ｍｌ
の水に溶解しＩＲ１２０Ｂイオン交換樹脂に通し炭酸ナ
トリウムでｐＨ９〜１０に調整したのち５倍量のアセト
ンを加え上澄液と沈殿物に分画する。沈殿物を水に溶解
させ凍結乾燥し収量０．１４ｇを得た。調整した分枝鎖
を有する硫酸化−βプロテオグルカン（ＭＴ−Ｓ）は、
保存性の面からアルカリ金属塩又はアンモニュウム塩の
適当な塩の形にしておくのが望ましい。以上に述べた方
法で調整したイオウ含量の測定法を得られた。

【００１３】その含量は下記の通りである。 イオウ含量の測定 試量をよく乾燥し、その約３ｍｇを精密に量り水３ｍｌ
及び過酸化水素水３滴を吸収液とし酸素フラスコ燃焼法
（日本薬局方、一般試験法）によりＳｕｌｆａｔａ中の
イオン含量を測定する。 ［表１］ 以上に述べた方法で得られた硫酸化β−プルテオグルカ
ン（ＭＴ−Ｓ）について抗ＨＩＶ活性の評価を以下の実
施例で実施した。

【実施例】抗ＨＩＶ活性の測定（ウイルスによる細胞変
性抑制活性のテスト） 国立予防衛生研究所エイズセンターエイズウイルス室で
実施されている方法を用いた。即ち１次スクリーニング
としてＭＴ−４細胞のＨＩＶ感染による細胞障害性の抑
制を指標にしたマイクロプレート法を用い、ここで活性
が認められた試料に関しては他の方法により抗ＨＩＶ活
性の確認及び作用メカニズムの解析を行った。 （マイクロプレート法）ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
Ｂ　　Ｓｔｒａｉｎ）およびＨＩＶ−２（ＨＩＶ［ＧＨ
−１］）に対して高い感受性を持つＭＴ−４細胞（ＣＤ
４抗原陽性・ＨＴＬＶ−１陽性細胞）は感染後３〜５日
間でＣＰＥが出現し、ほとんどの細胞が死滅する。顕微
鏡下でＣＰＥを判定し、添加した試料によってこのＣＰ
Ｅの発現を抑制するかどうかを調べるが１次スクリーニ
ングとしてこの方法を用いた。すなわち丸底９６ウエル
マイクロプレート（Ｎｕｎｃ）の左端８ウエルに所定の
濃度に希釈した試料溶液２００ｍｌを加える。試料の希
釈は１０％Ｆｃｓ添加ＲｐｍＩ　　１６４０培地で行う
。のこりのウエルには培地を１００ｍｌづつ入れておく
、８連ピペットで左端のウエルから１００ｍｌをとり右
隣のウエルに移しよく攪拌する。これを繰返し試料の２
倍段階希釈液（１００ｍｌ／ウエル１２段階）とする次
に対数増殖期にあるＭＴ−４細胞をプレート１枚あたり
６００万個遠心分離により集め、ごく少量の培地に懸濁
する。この細胞浮遊液に遠心管内で１００ＴＣＩＤ　　
５０／ｍｌとなるようにＨＩＶを加えて３７℃で１時間
吸着させる。ＨＩＶは持続感染Ｍｏｌｔ−４／ＨＩＶ細
胞の培養上清を２２μｍミリポアフイルターで濾過し−
８０℃に保存したもので、あらかじめＭＴ−４細胞にた
いする感染価を決めておいたものを用いる。３７℃で１
時間吸着後プレート１枚あたり１０ｍｌの培地を加え１
００μｌ／ウエルを試料希釈液に添加する。このときの
細胞濃度は約３０万個／ｍｌに設定する。非感染細胞と
、無添加試料感染細胞を対照としておき５％ＣＯ２存在
下、３７℃で培養する。ＨＩＶ感染後３日目に検鏡で試
料による細胞毒性を調べると共に感染時と同じ試料の２
倍段階希釈のプレートを用意し、３日間培養したプレー
トから１／３〜１／５の細胞を取り出し移し替える。感
染後６日目に判定を行う。検鏡によりＨＩＶ感染による
ＣＰＥの発現の有無を観察する。試料が細胞毒性を示さ
ない濃度でＨＩＶ感染によるＣＰＥの発現を抑制した場
合効果が認められるものとした。 ［表２］

【００１４】

【発明の効果】マイタケ由来硫酸化β−プロテオグルカ
ン（ＭＴ−Ｓ）に強い抗ＨＩＶ活性を示した。以上の方
法により培養後ウイルスによる細胞毒性の有無を確認し
た結果対照群では、ウイルスによる細胞変性が認められ
たが硫酸化β−１．６グルカンを１６〜６３μｇ／μｌ
の少量を添加した場合でも、ウイルスによる細胞変性が
認められなかった。この結果はウイルスによる細胞変性
の抑制活性すなわち抗ＨＩＶ活性が本発明薬剤に存在す
ることを確認するものである。以上本発明薬剤であるマ
イタケ中に存在するβ−グルカン−タンパク多糖体は明
らかにＨＩＶによる細胞変性を抑制することが判明した
ものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイタケ子実体及び菌糸体中に含まれるタ
   ンパクを約０．６％含有する１．３結合の分枝鎖を有す
   るβ−１．６グルカンおよび１．６結合の分枝鎖をもつ
   β−１．３グルカンを硫酸化して得られるマイタケ由来
   の硫酸化多糖タンパク体がヒト、エイズウイルスを含む
   レトロウィルスに対しその感染症を治療することを特徴
   とする、抗エイズウイルス活性を有する硫酸化βグルカ
   ンのレトロウイルス感染症治療用薬剤。