JPH05271306A - 抗ウイルス性硫酸化多糖類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒト及びネズミレトロウイルス、特にヒト免疫
不全ウイルス（HIV）を含むDNA及びRNAウイルスに対す
る広範囲の抗-ウイルス活性を与える、紅藻植物網種に
属する海生藻類により産生される新規硫酸化多糖類を提
供する。 【構成】β（1→4）Ｄ-ガラクトースとα（1→3）Ｌ-ガ
ラクトースの交互繰り返しユニットからなり、塩化ナト
リウム増加勾配液を適用することによりアニオン交換ク
ロマトグラフィーで均一精製し、蒸留水で完全に透析
し、次いで凍結乾燥後、特定の特性を有するアガロイド
型の共通の主鎖を有する硫酸化多糖類及び医薬的に許容
可能なその塩。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト及びネズミレトロ
ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含むDNA
及びRNAウイルスに対する広範囲の抗ウイルス活性を与
える、紅藻植物網種に属する海生藻類により産生される
硫酸化多糖類、その抽出及び精製方法並びに、これらを
含む医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】海生藻類は、抗-ウイルス活性、主に単
純疱疹ウイルス及びインフルエンザウイルスに対してス
クリーニングされている（Deig,E.F.ら.［1974］Antimi
crob.Ag.Chemother.6:524-525；Richards,J,T.ら.［197
8］Antimicrob.Agents Chemother.14:24-30；Blunden,
G.ら.［1981］Bot.Marina 24:267-272 ）。水性抽出物
の研究から、この活性剤は、ウイルス吸着に必要な受容
体サイトをブロックまたは被覆することにより作用する
硫酸化多糖類であり（Ehresmann,D.W.ら.［1977］J.Phy
col.13：37-40）、その抗-ウイルス活性は主に多糖類の
硫酸化度に関連することが明らかになった（Ehresmann,
D.W.ら.［1979］Hoppe,H.A.,Levring,T．及びTanaka,Y.
［編集］Marine Algae in Pharmaceutical Science，W.
de Gruyter，Berlin，New York，293-302）。

【０００３】近年、HIVにより発症する後天性免疫不全
症候群（Acquired immunodeficiencysyndrome：AIDS）
に対する効果的な化学療法が緊急に必要となったため、
選択的抗-HIV硫酸化多糖類の研究を増強した。例えば、
抗-HIV活性を示すλ-カラゲナン、デキストラン硫酸及
びペントサンポリサルフェートなど。

【０００４】アガロース型の多糖類は、紅藻植物網（紅
藻）の種類に属する海生藻類により産生される。紅藻植
物網の中でも、幾つかの属（例えば、Ceramium、Gelidi
um及びGracilariaなど）は寒天の主要源であり、メトキ
シル、サルフェート及びピルビン酸基による置換度のレ
ベルが異なるアガロース型多糖類属である（Duckworth,
M及びYaphe,W.［1971］Carbohydr.Res．16：189-19
7）。

【０００５】アガロース型多糖類は、β（1→4）Ｄ-ガ
ラクトースとα（1→3）Ｌ-ガラクトースの交互繰り返
しユニットと、通常3,6-無水物形としてまたは時折Ｌ-
ガラクトース-6-サルフェートとして存在する後者の4-O
-結合糖からなり、アンヒドロ-Ｌ-ガラクトース残基の
生物学的前駆体であると考えられている（Araki,C.［19
66］Proc.Int.Seaweed Symp.5:3）。置換度が最低の分
子はアガロースと称し、全アガロース型多糖類の中でゲ
ル化ポテンシャルが最高である（Kennedy,J.F.，Griffi
ths,A.J.及びAtkins,D.P.［1984］G.O.Phillips，D.S.W
edlock及びP.A.Williams［編集］Gums and Stabilisers
for the Food Industry，Pergamon Press，Oxford，Vo
l.2，417）。

【０００６】寒天は通常、微生物培地の製造または食品
工業で主に使用される柔らかいゲルを形成するが、堅い
ゲルを形成する寒天は、主に生化学用途である（Mc Lac
hlan,J.［1985］Plant and Soil 89：137）。テングサ
の細胞壁からの抽出物は、特に貴重な成分、アガロース
及び荷電（charged）（主に硫酸化）多糖類画分（通常
アガロペクチンと言われる）からなる。寒天の製造に於
いては、冷水に溶解性の高い硫酸化画分は廃棄される。

【０００７】本発明は、紅藻植物網（紅藻）種の海生藻
類から得られ、抗-ウイルス活性を与える硫酸化多糖類
を提供する。

【０００８】本発明の目的の硫酸化多糖類（以後、ASP
と称する）は、β（1→4）Ｄ-ガラクトースとα（1→
3）Ｌ-ガラクトースの交互繰り返しユニットからなるア
ガロイド型の共通の主鎖を有する。特に、塩化ナトリウ
ム増加勾配液（an increasingsodium chloride gradien
t）を適用することによるアニオン交換クロマトグラフ
ィーで均一精製し、蒸留水で完全に透析し、次いで凍結
乾燥後、以下の特性： （ａ）元素分析：炭素20〜35重量%、水素3.2〜5.5重量
%、窒素１重量%未満及び硫黄８重量%以上である（無水
化合物として計算）； （ｂ）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより測定
される分子量が10000kDa以下である； （ｃ）水、水性リン酸塩緩衝液（pH１〜13）及び水溶性
アルコール20容量%以下を含む水性溶媒に溶解性である
が、ベンゼン、クロロホルム、エチルエーテル並びに、
メチルまたはエチルアルコール80容量%以上及び塩化ナ
トリウム１g/lを含む水性アルコール性溶液に不溶であ
る； （ｄ）塩化バリウムの存在下に水に可溶であるが、水性
２Ｍ塩酸中120℃で３時間加水分解後、塩化バリウムを
添加すると硫酸バリウムの沈澱が生じる； （ｅ）全単糖類ユニットの90モル%以上が、非置換また
は置換されたガラクトース及び3,6-アンヒドロガラクト
ース残基である； （ｆ）全単糖類ユニットの30モル%以上が、２、３及び/
または６-位に置換基を保持し得る4-O-結合α-Ｌ-ガラ
クトピラノシド残基からなる； （ｇ）全単糖類ユニットの40モル%以上が、２、４及び/
または６-位に置換基を保持し得る3-O-結合β-Ｄ-ガラ
クトピラノシド残基からなる； （ｈ）全単糖類ユニットの40モル%以上が、２、３及び
６-位に置換基を保持し得る4-O-結合α-Ｌ-ガラクトピ
ラノシド残基並びに２-位に置換基を保持し得る3,6-ア
ンヒドロ-α-Ｌ-ガラクトピラノシド残基からなる； （ｉ）β-Ｄ-ガラクトピラノシド残基のO-4及びO-6を橋
かけする環状ケタールとして結合したピルビン酸（１-
カルボキシエチリデン）基が、全単糖類ユニットの10モ
ル%未満の置換基として存在する； （ｊ）単糖類ユニット当たりのメチルエーテル置換基の
モル比が0.3：１を超えない； （ｋ）サルフェートヘミエステル基が、β-Ｄ-ガラクト
ピラノシド残基の２、４及び６-位、α-Ｌ-ガラクトピ
ラノシド残基の２、３及び６-位並びに3,6-アンヒドロ-
α-Ｌ-ガラクトピラノシド残基の２-位の置換基として
存在し、全硫酸化度が常に0.6以上である；及び （ｌ）２及び４-位のサルフェートヘミエステル基の全
硫酸化度への寄与が常に0.3以上であるを有するASP並び
に医薬的に許容可能なその塩。

【０００９】ASP及びその塩は、純粋形で提供され得
る。これらは単離され得る。ASPは、D.S.が約0.9±0.1
であるのが好ましい。ガラクトース及び3,6-アンヒドロ
ガラクトース残基（ｅ）は、１〜３個の置換基で置換さ
れていてもよい。この置換基は、サルフェートヘミエス
テル、メチルエーテル、ピルビン酸（1-カルボキシエチ
リデン）及び糖基から選択されてもよい。残基（ｆ）〜
（ｈ）は、１〜３個の置換基により置換されていてもよ
く、この置換基はサルフェートヘミエステル、メチルエ
ーテル、ピルビン酸（1-カルボキシエチリデン）及び糖
基から選択されてもよい。この糖基は、ガラクトース及
び/またはキシロース残基であってもよい。

【００１０】従って、ASPのアガロイド骨格は、分枝ユ
ニットとして幾つかの鎖から出たガラクトース残基（５
モル%以下）を有してもよく、10モル%以下の4-O-結合α
-Ｌ-ガラクトピラノース残基は、4-O-結合α-Ｄ-ガラク
トピラノースユニットと置換されていてもよい。

【００１１】精製ASP中、５モル%を超えない極少量のキ
シロースは、よく検出される。存在する場合、キシロー
スは分枝ユニットとして存在するが、酸化（KIO₄）、次
いで還元（NaBH₄）及び温和な加水分解（H⁺）により除
去し得る。ASPの生化学的特性にはこの成分が存在して
もしなくても実質的に影響を及ぼさないので、キシロー
スの存在ははっきりした特徴であるとは考えられない。

【００１２】ASPは、比較的均一な化学的性質として挙
動するが、MW/MN比が通常２以上で且つMPが100〜300kDa
の多分散系である。MWは重量平均分子量を表す。MNは数
平均分子量を表す。MPは最大ピーク分子量を表す。従っ
て、MPは、高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより
決定されるように、最大濃度の硫酸化多糖類を含む画分
の分子量を表す。画分は、この目的に関してレゾルシノ
ール-硫酸法により分析し得る。

【００１３】本発明の多糖類または医薬的に許容可能な
その塩は、 （１）紅藻、寒天または未精製寒天の製造残渣を水性溶
媒で抽出し； （２）前記多糖類を得るために、抽出物を精製処理及び
カラムでの溶離処理または、分画沈澱（fractional pre
cipitation）にかけ、次いで （３）所望により、このようにして得られた多糖類を医
薬的に許容可能なその塩に転化させることからなる方法
により製造し得る。

【００１４】従って、本発明の硫酸化多糖類は、アガロ
ースを製造し得る紅藻類、寒天の製造残渣（水性抽出
物）または精製されていない一般用の市販の寒天から許
容可能な量で直接単離し得る。ASPは、休止状態で収集
した藻類または、古い藻類組織から製造した抽出物また
は寒天から得るのが好ましい。

【００１５】（１）段階で使用した水性溶媒は、リン酸
塩緩衝液またはNaClの水溶液で、（２）段階で使用した
精製処理は、遠心分離、濾過、有機溶媒での沈澱、透
析、凍結乾燥及び限外濾過から選択される少なくとも１
種の処理であると好ましい。

【００１６】本発明は、テングサ、寒天または寒天の製
造残渣からASPを選択的抽出且つ精製するのに有用且つ
ぴったりの２種類の異なった好ましい方法を提供する。

【００１７】第１の方法は、アニオン交換クロマトグラ
フィーをベースとしており、水性の粗抽出物に適用す
る。藻類から出発する際、空気中で乾燥した海草を細か
い粉末に粉砕し、アセトンで洗浄し、風乾して、室温で
0.01M EDTA-Na₂及び0.1M NaClを含む0.01M 水性リン酸
塩緩衝液（pH 6.9）で抽出すると、水性抽出物が得ら
れ、これをガラスウールでの濾過、次いで遠心分離によ
り透明にする。同様にして、寒天の製造残渣から出発す
ると同様の水性抽出物が得られ、これを透明にする。こ
のような水性抽出物は、真空で濃縮して体積を減らし、
遠心分離により透明にし、メタノール80%（v/v）で沈澱
させ、水中に再溶解させ、遠心分離により透明にし、蒸
留水で透析し（遮断膜：10kDa）次いで凍結乾燥して、
「水性の粗抽出物」を得る。寒天から出発する際、これ
を0.05M NaCl水溶液中に懸濁させ、30℃に温度調節した
ジャケット付きカラムに注ぐ。蠕動性ポンプ及び0.05M
NaCl溶液を含む外部貯蔵所を介して、溶離液を完全に再
循環させる。溶離液を濃縮し、凍結乾燥して、寒天から
水性の粗抽出物を得る。上記記載の水性の粗抽出物をい
ずれも、0.1M リン酸塩緩衝液（pH 7.4）に溶解し、0.1
リン酸塩緩衝液（pH7.4）で平衡させたFractogel TSK D
EAE-650Mカラムまたは同等物に充填する。開始緩衝液か
ら0.1M リン酸塩緩衝液（pH 7.4）中の２M NaClまでの
勾配溶離を室温で実施する。溶離画分を収集し、全炭水
化物含量（フェノール-硫酸法）及びHSV-１感染細胞に
対するin vitro活性の両方をモニターする。通常１〜1.
5M NaCl濃度範囲で溶離する活性画分をプールし、透析
または限外濾過し（遮断膜：10kDa）、次いで凍結乾燥
して、精製したASPを得る。

【００１８】ASPの抽出及び精製の第２の方法は、第４
級アンモニウムによる沈澱をベースとする。ポリアニオ
ンは、第４級アンモニウム洗剤により水溶液から沈澱し
得る。本発明者らは、セチルトリメチル臭化アンモニウ
ム（CTA臭化物、CTABまたは“Cetavlon”）を使用して
限定範囲の硫酸化度（D.S.）で硫酸化多糖類の分画沈澱
を実施し、種々の塩（NaCl）濃度で錯体を沈澱及び/ま
たは溶解させた。この出発物質は、テングサの「水性の
粗抽出物」、寒天の製造残渣、即ち「アガロペクチン」
または市販の寒天のいずれの源であってもよく、このよ
うな抽出物は上記の通りに得られる。寒天から出発する
際、室温で撹拌しながら0.5M NaCl水溶液で直接抽出
し、次いでガラスウールで濾過し得る。一方、任意の
「水性の粗抽出物」を0.5M NaClに溶解させる。６%（w/
v）CTA臭化物の水溶液を、ASP-CTAの毛房状沈澱が形成
するまで水溶液にゆっくり添加する。0.5M NaClが存在
すると、ペクチン及び電荷密度の低いポリサルフェート
（D.S.＜0.3）が沈澱しなくなる。沈澱を遠心分離によ
り収集し、4M NaClに溶解し、遠心分離により透明にす
る。NaCl濃度が１Mに下がるまで、よく撹拌しながら水
をゆっくり添加する。形成したASP-CTAの均一な沈澱
（D.S.＞0.6）を遠心分離により収集し、4M NaClに再溶
解させる。撹拌しながら、ナトリウム塩としてASPが沈
澱する84%（v/v）濃度までメタノールを添加すると、上
清中にCTA全部とNaClが殆ど遊離する。沈澱を遠心分離
により収集し、水に溶解させ、濾過して完全に透明にし
て、NaClを全部除去するために84%MeOHで再び沈澱させ
る。最後に95%MeOH及び100%MeOHで洗浄し、ASPの精製ナ
トリウム塩を脱水する。

【００１９】これらの２種類の方法は好ましいが、本発
明の目的生成物のASPは、種々の電荷密度のポリアニオ
ンを識別し得る任意の他の方法により得ることができ、
且つD.S.が0.6以上のガラクタンサルフェート分子だけ
を収集することを目的とする。

【００２０】本目的の生成物は、１〜5000kDaの範囲の
ＭＷを超える多分散であることが知見されたが、本発明
者らは、ASPの抗-ウイルス活性に於ける鎖長の影響につ
いて研究した。高性能サイズ排除クロマトグラフィーを
種々の分子量の18 ASP画分の個々のコレクションに適用
し、これを透析して回収し、凍結乾燥して、抗-HSV-１
活性について試験した。結果は、予想通り、活性は分子
量が下がるにつれて低下したが、興味深いことに低いM.
W.画分（＜10 kDa）でも明らかに活性があった（HSV-１
CPE IC50＝0.6〜0.8μg/ml）（表２参照）。

【００２１】生物学的活性 上記記載の生成物ASPの抗-ウイルス活性は、Hep #2細胞
の単層で成長させた呼吸器の合胞体ウイルス、セムリキ
森林熱（Semliki forest）ウイルス、単純疱疹ウイル
ス、１型（HSV-1）及び２型（HSV-2）及びワクシニアウ
イルスに於いて“in vitro”で立証された。さらに、抗
-ウイルス活性は、BHK21細胞の単層で成長させたA0イン
フルエンザウイルス、ネズミbalb/3T3細胞の培地のモロ
ニー肉腫（Moloney sarcoma）ウイルス（MSV）及び初期
ヒトリンパ球の培地のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で
も知見された。

【００２２】以後報告される結果は、ASPlot 8682/54の
生物検定に関するが、試験したASPのその他総てのロッ
トでも殆ど同一結果であった。

【００２３】表３は、TC IC50、CPE IC50及び選択性指
数（SI）（即ち、活性（CPE IC50）に対する細胞毒性
（TC IC50）の割合である）として測定したDNAウイルス
に対するASPの抗-ウイルス活性を示している。この試験
は、デキストラン硫酸（M.W.8kDa）、即ち広範囲の抗-
ウイルス活性を与える公知の硫酸化多糖類と比較して実
施した。実験データは、ASPが組織培地で十分に耐性で
あることを示している。Hrp＝２の細胞でのTC IC50は、
742μg/mlであったが、CPE IC50は0.1〜7.1μg/mlであ
った。試験した総てのウイルスに於いて、ASPはデキス
トラン硫酸よりもより活性であった。

【００２４】RNAウイルスに於けるASPの抗-ウイルス活
性と、デキストラン硫酸の抗-ウイルス活性との比較を
表４に示す。これらの結果は、ASPがRNAウイルスに対し
てデキストラン硫酸よりも強く作用することを示してい
る。これは、感染性ウイルスに関する表５のデータによ
っても確認される。

【００２５】MSVに対するASP、デキストラン硫酸及びペ
ントサンポリサルフェートの効能は、殆ど同一である
（表６）。ASPは、HIVに対しても強い活性を示す（表
７）。

【００２６】HSV-１で腹腔内（i.p.）感染させたネズミ
で実施した予備“in vivo”試験に於いて、ASP（25〜50
mg/kg）をアサイクロバー（Acyclovir：25または50また
は100mg/kg）と比較した。これらの結果から、i.p.経路
により（Acyclovirとして）１日２回３日間投与する
と、ASPは、参照化合物と少なくとも同じ位効果があっ
た。ASPを静脈内（i.v.）経路でCD-１ネズミ（雄及び
雌）に50mg/kgの用量で投与する本発明の物質の予備毒
性試験では、総てのネズミが投与後14日の観察期間中生
存していた。これらの処理に於いて、ASPは、末梢及び
中枢神経系（Irwin試験）には全く活性を示さなかっ
た。ネズミを１日２回３日間、i.p.経路で50mg/kgの用
量で処理しても悪影響は観察されなかった。ASPは、毒
性の低い安全な物質である。

【００２７】使用 ASPまたは医薬的に許容可能なその塩は、ヒトまたは動
物体の治療法で有用である。ASPは、抗-ウイルス活性を
有する。ASPまたはその塩は、ヒト及び他の哺乳類でヒ
ト及びネズミレトロウイルスを含むDNA及びRNAウイル
ス、例えば、上記記載のウイルスに対して使用し得る。
HIVに対するASPまたはその塩の活性の点からみて、ASP
またはその塩の１種を、AIDS、AIDS関連複合性疾患及び
関連症候群の治療に於いて使用し得る。ASPまたはその
塩は、患者、例えばウイルスに感染したヒト患者の状態
を改善するために使用し得る。ASPは、毒性の低い安全
な物質である。本発明は、活性成分としてＡＳＰまたは
医薬的に許容可能なその塩と、医薬的に許容可能なキャ
リヤまたは希釈剤からなる医薬組成物も提供する。

【００２８】抗-ウイルス薬として人類及び動物にASPを
投与する好適な方法は、非-経口経路であり、緩慢なi.
v.注入によるのがより好ましい。本発明によるASPの投
与用量は、被験者がヒトまたは動物であるかに依存し、
且つ年令、個々の違い、病気の状態などの因子に従って
変動するが、通常、被験者がヒトである場合、用量は１
日当たり0.05〜５mg/kgであり、この量のASPは１〜３回
で与えられる。ASPは、好適なアジュバントと混合でき
且つ皮膚用医薬配合物中に投与し得る。

【００２９】抗-ウイルス薬としてASPを使用する際、こ
れは、遊離酸の形または塩（例えば、ナトリウム、カリ
ウム、カルシウム等）の形であり得るが、通常且つ好ま
しくはナトリウム塩の形である。ASPは、任意の所望の
形の製剤とし得る。注射する場合、本組成物は、安定
剤、緩衝剤、防腐剤、等張剤などの添加剤を含み得、単
位用量アンプルの形または複数回用量容器にすることも
できる。本組成物は、水溶液、懸濁液、溶液、油性また
は水性ビヒクル中エマルション等の形であってもよい。
活性剤としてASPを含む製剤は、使用時、医薬的に許容
可能なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水ま
たは生理食塩水）に治療に有効な濃度で再溶解させる粉
末であってもよい。

【００３０】ASPは、通常の効能を低下させることな
く、１種以上の他の公知の抗-ウイルス剤（例えば、AZ
T、acyclovirなど）と組み合わせても使用し得る。この
ような組み合わせ使用は、実際、病気の治療に有効な手
段である。

【００３１】

【実施例】以下の製剤及び実施例は、本発明を説明する
ものである。

【００３２】ASPの物理化学的特性 Schoniger法を使用して分析した硫黄と元素分析を通常
通り実施した。

【００３３】中性の糖含量を、レゾルシノール-硫酸法
（Monsigny,M.,Petit,C.及びRoche A.C.［1988］Anal.B
iochem．175：525-530）及びYaphe及びArsenaultによる
3,6-アンヒドロガラクトース（Yaphe,W.及びArsenault,
G.P.［1965］Anal.Biochem.13：143-148）を使用して測
定した。

【００３４】単糖類組成物を、酸加水分解（0.5M TFA,
３時間,130℃）後、ペーパークロマトグラフィー（6:4:
3 v/v/v n-ブタノール:ピリジン:水，Filtrak FN 11;ア
ニリンハイドロゲンフタレート,5分,105℃による検
出）、ダンシル-誘導体の逆相HPLC（Mopper,K及びJohns
on,L.［1983］J.Chromatogr.256:27-38）及びオキシム-
トリメチルシリル誘導体のGC分析（Vanlaeke,G.,Cuppen
s,H.,Leyssens,L.及びRaus,J.［1989］J.of Phram.＆Bi
omed.Analysis 7:1641-1649）により決定した。

【００３５】酸加水分解（0.5M TFA,３時間,130℃）、
水酸化バリウムとの中和次いでシロップ状に濃縮後、ガ
ラクトースを、ブタン-1-オール:酢酸:水（4:1:5，上
層）溶媒を用いてWhatman 54フィルターペーパーによる
ペーパークロマトグラフィーで単離した。Ｄ-対Ｌ-ガラ
クトースの比は、Ｄ-ガラクトースオキシダーゼ（Sigma
製，cat# G-3385）を使用してSchlegelの方法により決
定した（Schlegel,R.A.，Gerbeck,C.M.及びMontgomery,
R.［1968］Carbohydr.Res．7：193-199）。

【００３６】変形したHakomori方法（Harris,P.J.，Hen
ry,R.J.，Blakeney,A.B.及びStone,B.A.［1984］Carboh
ydr.Res．127：59-73）、過メチル化多糖類の還元加水
分解（Stevenson,T.T.及びFurneaux,R.H.［1991］Carbo
hydr.Res．210：277-298）及び部分的にメチル化したア
ルドノニトリル（aldononitrile）誘導体のGC-MS分析
（Stortz,C.A.，Matulewicz,M.C.及びCerezo,A.S.［198
2］Carbohydr.Res．111：31-39）によりメチル化分析を
実施した。

【００３７】ASPの赤外スペクトルを、KBrディスクを使
用して通常通り記録した。更に、特に800〜850cm^-1の範
囲ではっきりしたピークが過メチル化（Harris,P.J.，H
enry,R.J.，Blakeney,A.B.及びStone,B.A.［1984］Carb
ohydr.Res．127：59-73）または過フェニルカルバモイ
ル化（Hirase,S.及びWatanabe,K.［1972］Bull.Chem.So
c.Japan 45:1529-1533）ASP誘導体のIRスペクトルから
得られた。

【００３８】50mg/ml ASPのD20溶液のプロトンデカップ
ル13C-NMRスペクトルを、55℃でVarian VRX-400-S装置
（100.6 MHz）、スペクトル幅24KHz及び緩和遅延（rela
xation delay）1.5ｓで記録した。

【００３９】ASPの高性能サイズ排除クロマトグラフィ
ー（HPSEC）分析を、オートサンプラー及びオートイン
ジェクターを装備したHewlett Packard 1090A液体クロ
マトグラフで実施した。移動相中のASPの10mg/ml溶液25
μlを、50℃に温度設定した、Shodex OHpak KB-800Pプ
レカラム（50×8mm ID）を備えたShodex OHpak KB-805
カラム（300×8mm ID）に注入した。移動相［アセトニ
トリル：0.2M NaClを含んだ0.01M リン酸塩緩衝液（pH
6.9）水溶液の10:90（v/v）混合物］を１ml/分で流し、
既知サイズの溶離画分を収集して、レゾルシノール-硫
酸マイクロ法を使用して全炭水化物含量を分析した（Mo
nsigny,M.，Petit,C.及びRoche A.C.［1988］Anal.Bioc
hem．175：525-530）。分子量分布の狭いプルランのシ
リーズをキャリブレーションに使用した（Fishman,M.
L.，Damert,W.C.，Phillips,J.G.及びBarford,R.A.［19
87］Carbohydr.Res．160：215-225）。

【００４０】Rees（Rees,D.A.［1961］J.Chem.Soc.5168
-5171）により、アルカリ性で不安定なサルフェートを
総て除去するために、ASPのアルカリ処理を以下の如く
実施した。ASP200mgを水20mlに溶解させ、水素化ホウ素
ナトリウム40mgを添加し、室温で一晩還元した。次いで
3M NaOH（10ml）、さらにNaBH₄ 100mgと一緒に添加し、
混合物を緩やかに撹拌しながら100℃で４時間加熱し
た。アルカリ性溶液を、Amberlite IR-200（H⁺）樹脂を
使用して中和し、蒸留水で完全に透析して、最終的にア
ルカリ-処理したASPを凍結乾燥して回収した。

【００４１】製造法Ａ：２月に収集したGracilaria ver
rucosaからの粗抽出物 紅藻植物網Gigartinales目Gracilariceae科Gracilaria
属に属するGracilariaverrucosaを、２月に北アドリア
海で収穫し、空気で乾燥する前に注意深く手で分類し
た。

【００４２】海草（200g，乾燥重量）を細かい粉末に粉
砕し、アセトンで２回洗浄し（各２リットル、一晩撹
拌）、空気乾燥し、0.01M EDTA-Na₂及び0.1M NaClを含
む0.01M水性リン酸塩緩衝液（pH 6.9）3000ml中に懸濁
させた。室温で一晩、十分に撹拌しながら抽出した。海
草残渣をガラスウールを通して濾過して除去し、濾液を
元の容積の5分の１まで真空濃縮し、さらに遠心分離で
透明にした。薄い黄茶色の上清（600ml）をメタノール
（2400ml）で沈澱させ、水（500ml）に再溶解させ、遠
心分離し、蒸留水で透析し、次いで凍結乾燥すると、粗
抽出物（E-GVF）25g（乾燥重量）が得られた（収率12.5
%：乾燥重量ベース;HSV-１CPE IC50＝4μg/ml）。

【００４３】製造法Ｂ：９月に収集したGracilaria ver
rucosaからの粗抽出物 Gracilaria verrucosa の第２のサンプルを、北アドリア
海で９月に収穫し、空気乾燥する前に注意深く手で分類
した。

【００４４】製造法Ａで記載したように加工した海草
（200g）は、粗抽出物38gとなった（E-GVS；収率19% 乾
燥重量ベース；HSV-１CPE IC50＝8μg/ml ）。

【００４５】製造法Ｃ：Gracilaria duraからの粗抽出
物 紅藻植物網Gigartinales目Gracilariceae科Gracilaria
属に属するGracilariaduraを北アドリア海で夏に収穫
し、空気乾燥する前に注意深く手で分類した。

【００４６】製造法Ａで記載したように加工した海草
（200g）は、粗抽出物35gとなった（E-GD;収率 17.5%
乾燥重量ベース；HSV-１CPE IC50＝６μg/ml）。

【００４７】製造法Ｄ：Gelidium corneumからの粗抽出
物 紅藻植物網Gelidiales目Gelidiaceae科に属するGelidiu
m corneumを北アドリア海で夏に収穫し、空気乾燥する
前に手で注意深く分類した。

【００４８】製造法Ａに記載したように加工した海草
（200g）は、粗抽出物39gとなった（E-GC；収率19.5%
乾燥重量ベース；HSV-１CPE IC50＝８μg/ml）。

【００４９】製造法Ｅ：寒天からの水性抽出物 寒天［Bacto-Agar（登録商標）:Difco Laboratories,Mi
chigan.（米国)］100gを0.05M NaCl水溶液900mlに懸濁
させて、30℃に温度調節したジャケット付きカラム（50
×5cm I.D.）に注いだ。蠕動性ポンプ及びさらに0.05M
NaCl溶液（500ml）を含む外部貯蔵所を通して、溶離液
を8ml/分で7時間再循環させた。再循環を解除したら、
溶離液1600mlを収集するまで新しい0.05M NaClを加え
た。溶離液を濃縮し、凍結乾燥すると、水性抽出物15.9
gが得られた（AE）（HSV-１CPE IC50＝8.6μg/ml）。

【００５０】実施例１：DEAEクロマトグラフィーによる
AEの精製 活性抗-ウイルス性硫酸化多糖類を、水性抽出物AE（製
造法Ｅ）からDEAEクロマトグラフィーにより精製した。
各々の実施について、AE３gを0.1M リン酸塩緩衝液（pH
7.4）300mlに溶解させ、0.1M リン酸塩緩衝液（pH 7.
4）で平衡させた5×50cm（1000ml）Fractogel TSK DEAE
-650Mカラムに充填した。緩衝液から0.1Mリン酸塩緩衝
液（pH 7.4）中の2M NaClまでの勾配溶離を室温で600ml
/hで実施した。溶離した画分を収集し、全炭水化物含量
（フェノール-硫酸法）及びHSV-１感染細胞に対するin
vitro活性の両方についてモニターした。通常１〜1.5M
NaCl濃度範囲で溶離した活性画分をプールし、透析また
は限外濾過し、次いで凍結乾燥した。AE（15.9g）を加
工すると、精製物（370mg）が得られた（lot 7987/44；
D.S＝0.84；HSV-１CPE IC50＝0.2μg/ml）。

【００５１】実施例２：「アガロイド型硫酸化物」の抽
出及び精製 CTAB沈澱（AP1）によるD.S.＞0.3を有する多糖類 Bacto-Agar（登録商標;Difco）を、2mM アジ化ナトリウ
ムを含む0.5M NaCl水溶液６リットルに懸濁させ、次い
で室温で２時間激しく撹拌した。ガラスウールで濾過し
て得られた水性抽出物（4400ml）を、5M NaCl 37ml、2M
硫酸ナトリウム24ml及びCTAB6%（w/v）水溶液330mlを
撹拌下添加し、30分間すこし暖め（40℃）、少なくとも
２時間室温で放置して集めた。0.5M NaClが存在する
と、ペクチン及び電荷密度の低い硫酸化多糖類（D.S.＜
0.3）が沈澱しなくなる。

【００５２】短時間遠心分離して沈澱を収集し、4M NaC
l 640mlに溶解し、40℃で一晩撹拌した。残りのアガロ
ース及び不溶性不純物を遠心分離して除去した。

【００５３】硫酸ナトリウム（28ml，2M）、CTAB（93m
l、６%）及び水4780mlを順にゆっくりと、透明な上清
（4M NaClに再溶解させたもの:700ml）によく撹拌しな
がら添加し、塩化ナトリウム濃度を0.5Mに下げて、均一
な沈澱形成を促した。撹拌しながら暖め（40℃,30分
間）、室温に放置して（＞２時間）、沈澱を遠心分離に
より収集し、4M NaCl 430mlに再溶解させた（40℃,一晩
撹拌）。

【００５４】十分に撹拌しながらメタノール（2530ml）
をゆっくり透明溶液（470ml）に添加して、そのナトリ
ウム塩として硫酸化多糖類を沈澱させて、上清中に総て
のCTA及び殆どのNaClを残した（3000ml，84% MeOH）。
イオン交換が完了するまで少なくとも２時間撹拌した。

【００５５】沈澱を濾過して収集し、水220mlに溶解し
（全容量260ml）、濾過（0.45μm）して完全に透明に
し、NaClを総て除去するために84%MeOH中で再び沈澱さ
せた（1500ml MeOHを添加）。95% MeOH（500ml,２回）
及び100% MeOH（400ml,２回）で最終洗浄し、乾燥する
と、硫酸化多糖類の精製ナトリウム塩が得られた（D.S.
＞0.3：収率1.3%）（６g,lot 8682/36，即ち“AP1”；
D.S.＝0.75；HSV-１CPE IC50＝0.2μg/ml）。

【００５６】実施例３：“APS”の製造 “寒天型Ａ”（cat.n.A4550，Sigma Chemical Company,
USA）500gを実施例２の記載通りに加工すると、硫酸化
多糖類4.6gが得られた（lot "APS";D.S.＝0.68;HSV-１C
PE IC50＝0.4μg/ml）。

【００５７】実施例４:“APA”の製造 “Agar-Agar”（cat.n.412361，Carlo Erba，Italy）20
0gを細かく砕き、出発物質と反応体の量比を同一に保持
し全容量を縮小して実施例２の記載通りに加工すると、
硫酸化多糖類2.8gが得られた（lot“APA”；D.S.＝0.7
0；HSV-１CPE IC50＝0.2μg/ml）。

【００５８】実施例５：ASP lot 7987/52Bの製造及び特
徴付け lot AP1（実施例２）100mgをDEAEクロマトグラフィーに
かけた。実施例１に記載の方法を1.6×19cm（40ml）カ
ラムを使用するために縮小した。溶離液プロフィール
（図１の実線）は、はっきりとした且つ異なる電荷密度
を有する、AP１中の２種類の異なる硫酸化多糖類の存在
を強調している：“ピークＡ”（lot 7987/52A;D.S.＝
0.38;HSV-1 CPE IC50＞20μg/ml）及びピークＢ（lot 7
987/52B;D.S.＝0.91; HSV-1 CPE IC50＝0.2μg/ml）。

【００５９】以下のように特徴付けられる。

【００６０】−NaClの一定勾配液のもとでベースライン
と完全に分離したピークとして溶出されるため、“ピー
クＡ”及び“ピークＢ”は異なる種類の化合物として見
なされるべきであり、電荷密度が連続的に異なる単一範
囲の単糖類の一部としてはみなされるべきではない。

【００６１】−“ピークＢ”（D.S.＝0.91）はHSV-１に
対して高活性であるが、“ピークＡ”（D.S.＝0.38）は
不活性である。

【００６２】−両方のピークは、同様のガラクトースモ
ル含量（PC、HPLC及びGCにより）、少量の3,6-アンヒド
ロガラクトース（Yaphe,W.及びArsenault,G.P.［1965］
Anal.Biochem.13:143-148により測定）、β（1→4）Ｄ-
ガラクトースとα（1→3）Ｌ-ガラクトースの交互繰り
返しユニットから主になる共通の主鎖（13C-NMR）及び
同様のHPSECプロフィール（Mp約190kDa）を有する。

【００６３】−２種類の物質のフェニルカルバモイル化
またはメチル化誘導体のIRスペクトルは、800〜850cm^-1
の範囲で十分な解像度を示し、“ピークＡ”で全ての置
換がサルフェートヘミエステル基によるものではないと
してもガラクトース-6-サルフェートにほとんど起因す
ることを示しているが、これに対してガラクトース-6-
サルフェート（820cm^-1）及びガラクトース-2-サルフェ
ート（840cm^-1）並びにおそらくガラクトース-4-サルフ
ェート（850cm^-1、ショルダー）が“ピークＢ”中に検
出される。その13C-NMRスペクトルは、これらの知見と
一致している。

【００６４】−アルカリ性で不安定なサルフェート基
（即ち、6-サルフェート）を除去するためにアルカリ処
理を実施すると、“ピークＢ”は、幾らか抗-HSV-１活
性（CPEIC50＝0.8μg/ml）及びアルカリ性で安定な基
（2-及びおそらく4-サルフェート；D.S.＝0.47）を有す
る生成物を与えるが、“ピークＡ”は、総てのサルフェ
ート基を失った。

【００６５】実施例６：ASP lot 8682/54の製造 実施例２に記載の方法を少し変形した。硫酸化多糖類の
セチルトリメチル臭化アンモニウム（CTAB）との第２の
沈澱形成を、（0.5M NaClの代わりに）1M MaClの存在下
に実施し、“ピークＢ”のASPのみを収集するために、
D.S.＜0.6の硫酸化多糖類が沈澱しないようにした。

【００６６】Bacto-Agar（登録商標：Difco）454gから
出発して、寒天からの水性抽出、0.5M NaCl中でのCTAB
との第１の沈澱形成及び4M NaCl中での再溶解を実施例
２の記載通りに実施した。

【００６７】硫酸ナトリウム（14ml,2M）、CTAB（46ml,
６%）及び水2040mlを順に且つゆっくりと、透明な上清
（700ml,4M NaCl中に再溶解させたもの）によく撹拌し
ながら添加し、塩化ナトリウム濃度を１Mに下げて均一
な沈澱形成を促した。撹拌しながら暖めた後（40℃,30
分）、室温に放置し（＞２時間）、遠心分離した沈澱を
収集し、4M NaCl 300mlに再溶解させた（40℃,一晩撹
拌）。

【００６８】メタノール（1685ml）を十分に撹拌しなが
らゆっくりと透明な溶液（315ml）に添加して、そのナ
トリウム塩として硫酸化多糖類を沈澱させて、CTA全部
とNaClを殆ど上清中に残した（2000ml,84% MeOH）。少
なくとも２時間撹拌して、イオン交換を完了させた。

【００６９】沈澱を遠心分離によって収集し、水150ml
に溶解させ（全容量180ml）、濾過して（0.45μｍ）完
全に透明にして、（1000ml MeOHを添加することによ
り）再び84% MeOH中で沈澱させてNaClを総て除去した。
95% MeOH（350ml,２回）及び100%MeOH（300ml）で最終
洗浄し、乾燥すると、硫酸化多糖類の精製ナトリウム塩
が得られた（収率1.0%，D.S.＞0.6）（4.4g,lot 8682/5
4;D.S.＝0.85；HSV-１CPEIC50＝0.2μg/ml）。

【００７０】ASP lot 8682/54の特徴例 注意:記載しない限り、置換基または単糖類残基量は以
後モル百分率で表す。

【００７１】ASP lot 8682/54（実施例６）は、D.S.＝
0.85、3,6-アンヒドロガラクトース含量10.4%、水8.1%
（重量）であった（表１）。これはナトリウム塩（Na：
7.5重量%）として得られ、製造の最終段階では過剰の塩
化ナトリウム（Cl：＜0.1重量%）はなかった。

【００７２】酸-不安定性3,6-アンヒドロガラクトース
の分解生成物の他に、ガラクトースのみが加水分解生成
物中の糖構成成分として検出された（計算値：59重量
%，実測値：58重量%）。ガラクトースを加水分解生成物
から単離する際、特定の旋光の低い正の値を示し、Ｄ-
異性体が過剰であることを示した。Ｌ-異性体の存在
は、Ｄ-ガラクトースオキシダーゼでガラクトースの単
離サンプルを処理後、測定した［α］^Dの負の値により
確認した。

【００７３】ASP lot 8682/54は、HPSECプロフィール
（図２）に示されているようにMp範囲150〜240kDaの多
分散系である。

【００７４】生成物の赤外スペクトル（図３）は、サル
フェートエステル［1420（w)，1370（w）及び1250cm^-1
並びに未分解の800〜850cm^-1バンド］及び3,6-アンヒド
ロガラクトース（930cm^-1）の典型的な吸収を示した。
硫酸化サイトに関する幾つかの情報が、２つの主なバン
ド［840cm^-1（2-サルフェート）及び820cm^-1（6-サルフ
ェート）−後者は810cm^-1のショルダー（3,6-アンヒド
ロガラクトース-2-サルフェート）により強くなってい
る］及び弱いバンド［850cm^-1（4-サルフェート）］を
有するが860cm^-1（3-サルフェート）に吸収がない、フ
ェニルカルバモイル化ASP lot 8682/54のIRスペクトル
から得られた（図４）。

【００７５】ASP lot 8682/54の特定の旋光の負の値
（［α］^D25：−15°;ｃ＝1.0，水；２０〜６０℃で一
定）は、アガロイド骨格（即ち、3-O-結合β-Ｄ-ガラク
トピラノシル残基と4-O-結合α-Ｌ-ガラクトピラノシル
残基が交互になっている）からなっているので、正の旋
光を示すカラゲナンとは異なる。ASPの特定の旋光の負
の値が低いのは、3,6-アンヒドロガラクトピラノース残
基の割合が低いことを考慮するともっともである。さら
に、［α］Ｄ/温度プロフィール中のヒステリシスまた
は変化の兆候の欠失は、室温に於けるASP lot 8682/54
の水溶液中の二重らせんの集合物の発生とは反対の結論
を示す。

【００７６】アガロイド骨格は、特に13C-NMRスペクト
ルのアノマー炭素領域でカラゲナンとはっきり区別でき
た。このスペクトルから、幾つかの化学的特徴が推論さ
れ得る。

【００７７】−メトキシル置換（59.1ppm）は、存在し
ないか、またはASPのこのロットでは少なくともはっき
りしない。これは、1H-NMRによっても確認できた。

【００７８】−幾つかのβ-Ｄ-ガラクトピラノースユニ
ットのO-4及びO-6（1-カルボキシエチリデン基）位のピ
ルビン酸置換は25.7及び176.4ppmのシグナルから推論で
き、約５%と推定した。

【００７９】−十分な分解能ではないが、アノマー炭素
シグナルは、β（1→4）Ｄ-ガラクトピラノースとα（1
→3）Ｌ-ガラクトピラノースの交互繰り返しユニットか
ら構成されている構造からなる。特に、帰属は以下の通
りである。

【００８０】α-L：GAL，2-S-GAL，6-S-GALまたは2,6-D
S-GALであるとき、C-1（β-D）（30〜40%）104.4ppm . α-L：3,6-ANであるとき、C-1（β-D）（10〜20%）102.
7ppm. α-L：GALまたは6-S-GALであるとき、C-1（α-L）（15
〜25%)101.6ppm. α-L：2-S-GAL，2,6-DS-GAL，3,6-ANまたは3,6-AN-2-S-
GALであるとき、C-1（α-L）（25〜35%）９９．２ｐｐ
ｍ． 但し、ＧＡＬ＝非置換ガラクトピラノース； 2-S-GAL＝ガラクトピラノース-2-サルフェート； 6-S-GAL＝ガラクトピラノース-6-サルフェート； 2,6-DS-GAL＝ガラクトピラノース-2,6-ジサルフェー
ト； 3,6-AN＝3,6-アンヒドロガラクトピラノース； 3,6-AN-2-S-GAL＝3,6-アンヒドロガラクトピラノース-2
-サルフェート （３位での硫酸化は、IRスペクトルをベースとして無視
した）である。

【００８１】−β-及びα-結合アノマー炭素原子の個々
の積分の比は、大体１:１である。

【００８２】−α-Ｌ及びβ-Ｄユニット中の全C-6の約6
0%は、遊離ヒドロキシル基を有する（61.5ppmのシグナ
ル）。

【００８３】以下の主生成物： −非置換3-O-結合β-D-ガラクトピラノースに起因する
2,4,6-トリ-O-メチルガラクトース； −3-O-結合β-D-ガラクトピラノース-2-サルフェートに
起因する4,6-ジ-O-メチルガラクトース； −3-O-結合β-D-ガラクトピラノース-6-サルフェートに
起因する2,4-ジ-O-メチルガラクトース； −非置換4-O-結合α-L-ガラクトピラノースに起因する
2,3,6-トリ-O-メチルガラクトース； −4-O-結合α-L-ガラクトピラノース-2-サルフェートに
起因する3,6-ジ-O-メチルガラクトピラノース； −4-O-結合α-L-ガラクトピラノース-2,6-ジサルフェー
トに起因する3-O-メチルガラクトピラノース；並びに極
少量の −3-O-結合β-D-ガラクトピラノース-4-サルフェートに
起因する2,6-ジ-O-メチルガラクトース； −3-O-結合β-D-ガラクトピラノース-2,6-ジサルフェー
トに起因する4-O-メチルガラクトース； −幾つかの分枝場所の存在を示唆している2,3,4,6-テト
ラ-O-メチルガラクトース が識別されるとき、メチル化分析からASP構造について
の情報がさらに出てくる。

【００８４】実際、3,6-アンヒドロ-α-L-ガラクトース
（10%）をベースとする総ての残渣は、過メチル化ASPの
酸加水分解時に劣化した。全α-L-対β-D-メチル化残渣
の比は約４:５と予測したので、3,6-アンヒドロ-α-L-
残基10%を考慮に入れて、本発明者らは、元の未メチル
化多糖類中の3-O-結合β-D-対4-O-結合α-L-ガラクトピ
ラノシル残基の比は約１:１であるとした。

【００８５】構造分析から得られた総ての情報を考慮に
入れると、本発明者らはASP lot 8682/54が、平均し
て、 1：2：4：3のピルビン酸化：6-サルフェート：2-サルフ
ェート：非置換 として現れる3-O-結合β-D-ガラクトピラノシル残基
と、 3：2：2：3の2,6-ジサルフェート：2-サルフェート：3,
6-アンヒドロ-2-サルフェート：未置換 として現れる4-O-結合α-L-ガラクトピラノシル残基が
交互になっていると見なし得る。

【００８６】この状況は、比及び幾つかの少数の構造詳
細の概略である；例えば、IRスペクトルから推定される
ように4-サルフェート置換もある程度存在するだろう。

【００８７】ASP（lot 8682/54）のDEAEクロマトグラフ
ィー lot 8682/54（実施例６）100mgを、DEAEクロマトグラフ
ィーにかけた。1.6×19cm（40ml）カラムを使用するた
めに実施例１に記載の方法を縮小した。溶離プロフィー
ル（図１の点線）から、“ピークＢ”のASPだけの存在
が明らかになり、ASPの選択的抽出及び精製にぴったり
の好適な方法として実施例３の方法が確認できた。

【００８８】実施例７：藻の粗抽出物からのASPの精製 加工する多糖類の量を少なくするために実施例６に記載
の方法を縮小して、CTAB沈澱形成により藻類の粗抽出物
からASPを精製した。E-GVF（25g，精製法Ａ）、E-GVS
（38g，精製法Ｂ）、E-GD（35g，精製法Ｃ）及びE-GC
（39g，精製法Ｄ）を別個に各0.5M NaCl水溶液500mlに
溶解させ、2M 硫酸ナトリウム（３ml）及びCTAB６%（w/
v）水溶液55mlを添加して沈澱させ、撹拌下、30分間少
し暖めて（40℃）、室温で少なくとも２時間放置して集
合させた。沈澱を短時間遠心分離して収集し、4M NaCl
180mlに溶解させて、一晩40℃で撹拌した。不溶性不純
物を遠心分離して除去した。

【００８９】硫酸ナトリウム（４ml,2M）、CTAB（13ml,
６%）及び水583mlを順に且つゆっくりと、よく撹拌しな
がら透明な上清（200ml，4M NaCl中に再溶解させたもの
から）に添加し、塩化ナトリウム濃度を１Mに下げ、均
一な沈澱形成を促進させた。撹拌しながら暖めた後（40
℃，30分）、室温に放置し（＞２時間）、沈澱を収集し
て4M NaCl 95mlに再溶解させた（40℃，一晩撹拌）。

【００９０】メタノール（525ml）を十分に撹拌しなが
ら、透明な溶液（100ml）にゆっくり添加し、そのナト
リウム塩として硫酸化多糖類を沈澱させ、総てのCTA及
びNaClを殆ど上清中に残した（625ml，84% MeOH）。少
なくとも２時間撹拌すると、イオン交換が完了した。

【００９１】沈澱を濾過して収集し、水50mmに溶解し
（全容量60ml）、濾過（0.45μｍ）して完全に透明にし
て、（315ml MeOHを添加することにより）再び84% MeOH
中で沈澱させてNaClを全部除去した。95% MeOH（100m
l，２回）及び100% MeOH（100ml）で最終洗浄後、乾燥
させると、各々D.S.＞0.6の硫酸化多糖類の精製ナトリ
ウム塩が得られた。

【００９２】“GVF”（1.24g；E-GVFからの収率5.0%ま
たは乾燥藻類からの収率0.62%；D.S.＝0.92；HSV-１CPE
IC50＝0.2μg/ml） “GVS”（1.04g；E-GVSからの収率2.7%または乾燥藻類
からの収率0.52%：D.S.＝0.82；HSV-１CPE IC50＝0.2μ
g/ml） “GD”（0.92g；E-GDからの収率2.6%または乾燥藻類か
らの収率0.46%；D.S.＝0.85；HSV-１CPE IC50＝0.14μg
/ml） “GC”（0.97g；E-GCからの収率2.5%または乾燥藻類か
らの収率0.49%；D.S.＝0.87；HSV-１CPE IC50＝0.2μg/
ml）抗-ウイルス活性及び細胞毒性の“in vitro”分析 トリプシン処理による許容細胞の単層を再懸濁させ、次
いで24または96個のウエルの平底培地プレートに懸濁液
（４〜10×10⁴細胞/ml，5% ウシ胎児血清を補ったイー
グルの基礎培地）を接種することにより試験を実施し
た。本発明の生成物の水溶液のアリコートを、（細胞毒
性試験用に）未感染細胞または抗-ウイルス活性試験用
に30〜100 I.C.50ウイルス/ウエルに感染させた細胞と
一緒に、ウエル中、正副二重にして２倍の血清希釈液中
に分散させた。生成物を細胞とインキュベーションして
15分後、ウイルスを添加した。

【００９３】細胞毒性を、細胞成長を50%減少させるの
に必要な濃度（TC IC50）として評価した。

【００９４】抗-ウイルス活性は、細胞変性（CPE）の減
少として、モロニー肉腫ウイルス感染中で病巣の形質転
換として知見され、（Elisaにより）HIV核蛋白質p24量
及び（核酸を用いる分子ハイブリダイゼーション法によ
り）HIV合成RNAの全量を測定することにより観察した。
抗-ウイルス活性を、ウイルスが誘発した細胞病原性を5
0%減少させるのに必要な濃度（CPE IC50）、MSVが誘発
した病原形質転換を50%阻害するのに必要な濃度（F IC5
0）及びHIV p24及びHIV RNAの両方を50%減少させるのに
必要な濃度として測定した。時折、感染性ウイルス産生
の50%減少（IVIC50）も試験した。これは、感染処理及
び未処理培地のクリオリセート（cryolystates）中のウ
イルス含量を滴定することにより決定した。

【００９５】 表１ 表中のASPの範囲に共通の他の物理化学特性 Ｎａ：6.7〜7.6 重量% Ｃｌ：＜ 0.1 重量% Ｐ：＜ 100 ppm ガラクトース：55〜59 重量% （GLC-MS） ［α］D25：−５°〜−20°（c 1.0，水） M.W.：１〜＞5000 kDa （Mp：170〜260kDa）（HPSEC） メチルエーテル基：0〜0.15mol/単糖類ユニット（13C-NMR） ピルビン酸基：0〜0.05mol/単糖類ユニット（13C-NMR） 赤外吸収（KBr）: 3200〜3700 cm^-1 （OH基） 2880〜2950 cm^-1 （CH₂及びCH基） 1600〜1680 cm^-1 （OH基） 1420(弱い),1370(弱い)及び1250cm^-1 （サルフェートエステル） 930 cm^-1 （3,6-アンヒドロガラクトース） 800〜850cm^-1 （サルフェートエステル） 溶解性： 水中50mg/ml以上 有機溶媒（例えば、ベンゼン、クロロホルム、エチルエーテル、アセトン、 メタノール及びエタノール)に不溶

【００９６】

【表１】

【００９７】

【表２】

【００９８】

【表３】

【００９９】

【表４】

【０１００】

【表５】

【０１０１】

【表６】

【０１０２】

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】AP１ lot 8682/36（─）及びASP lot 8682/54
（- - -）のDEAEクロマトグラフィーの結果を示す図で
ある。0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH 7.4）及び塩化ナトリ
ウム勾配液（……）を使用して70ml/時間で溶離した。
ｘ-軸は容積（ml）を表す。左側のｙ-軸は、485nmに於
ける吸収を示す。右側のｙ-軸は、塩化ナトリウム濃度
（M）を表す。画分をフェノール-硫酸法により分析し
た。

【図２】ASP lot 8682/54の高性能サイズ排除クロマト
グラフィーの結果を示す図である。ｘ-軸は、分子量（k
Da）を表す。ｙ-軸は、全体に対する濃度（重量%）で表
している。画分をレゾルシノール−硫酸法により分析し
た。

【図３】ASP lot 8682/54の赤外スペクトルを示す図で
ある。ｘ-は波長（cm^-1）を示す。

【図４】ASP lot 8682/54のフェニルカルバモイル誘導
体の赤外スペクトルを示す図である。ｘ-は、波長（cm
^-1）を示す。

フロントページの続き (72)発明者 ジヨバンニ・リボラ イタリー国、20141・ミラン、ビア・ベル ナルデイーノ・ベロ・ヌメロ・78 (72)発明者 ドメニコ・ウンゲーリ イタリー国、20015・ミラン、パラビアー ゴ、ビア・サン・セバスチアーノ、ヌメ ロ・106 (72)発明者 ジヤンバツテイスタ・ベントレツラ イタリー国、20149・ミラン、ビア・モル ベツリ・ヌメロ・18

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β（1→4）Ｄ-ガラクトースとα（1→
   3）Ｌ-ガラクトースの交互繰り返しユニットからなり、
   塩化ナトリウム増加勾配液を適用することによりアニオ
   ン交換クロマトグラフィーで均一精製し、蒸留水で完全
   に透析し、次いで凍結乾燥後、以下の特性： （ａ）元素分析：炭素20〜35重量%、水素3.2〜5.5重量
   %、窒素１重量%未満及び硫黄８重量%以上である（無水
   化合物として計算）； （ｂ）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより測定
   される分子量が10000kDa以下である； （ｃ）水、水性リン酸塩緩衝液（pH１〜13）及び水溶性
   アルコール20容量%以下を含む水性溶媒に溶解性である
   が、ベンゼン、クロロホルム、エチルエーテル並びに、
   メチルまたはエチルアルコール80容量%以上及び塩化ナ
   トリウム１g/lを含む水性アルコール性溶液に不溶であ
   る； （ｄ）塩化バリウムの存在下に水に可溶であるが、水性
   ２M塩酸中120℃で３時間加水分解後、塩化バリウムを添
   加すると硫酸バリウムの沈澱が生じる； （ｅ）全単糖類ユニットの90モル%以上が、非置換また
   は置換されたガラクトース及び3,6-アンヒドロガラクト
   ース残基である； （ｆ）全単糖類ユニットの30モル%以上が、２、３及び/
   または６-位に置換基を保持し得る4-O-結合α-Ｌ-ガラ
   クトピラノシド残基からなる； （ｇ）全単糖類ユニットの40モル%以上が、２、４及び/
   または６-位に置換基を保持し得る3-O-結合β-Ｄ-ガラ
   クトピラノシド残基からなる； （ｈ）全単糖類ユニットの40モル%以上が、２、３及び
   ６-位に置換基を保持し得る4-O-結合α-Ｌ-ガラクトピ
   ラノシド残基並びに２-位に置換基を保持し得る3,6-ア
   ンヒドロ-α-Ｌ-ガラクトピラノシド残基からなる； （ｉ）β-Ｄ-ガラクトピラノシド残基のO-4及びO-6を橋
   かけする環状ケタールとして結合したピルビン酸（１-
   カルボキシエチリデン）基が、全単糖類ユニットの10モ
   ル%未満の置換基として存在する； （ｊ）単糖類ユニット当たりのメチルエーテル置換基の
   モル比が0.3：１を超えない； （ｋ）サルフェートヘミエステル基が、β-Ｄ-ガラクト
   ピラノシド残基の２、４及び６-位、α-Ｌ-ガラクトピ
   ラノシド残基の２、３及び６-位並びに3,6-アンヒドロ-
   α-Ｌ-ガラクトピラノシド残基の２-位の置換基として
   存在し、全硫酸化度が常に0.6以上である；及び （ｌ）２及び４-位のサルフェートヘミエステル基の全
   硫酸化度への寄与が常に0.3以上であるを有する、アガ
   ロイド型の共通の主鎖を有する硫酸化多糖類及び医薬的
   に許容可能なその塩。
2. 【請求項２】 硫酸化度が0.9±0.1である請求項１に記
   載の硫酸化多糖類及び医薬的に許容可能なその塩。
3. 【請求項３】 MW：MN比が２:１以上で、MPが100〜300k
   Daである請求項１または２に記載の硫酸化多糖類及び医
   薬的に許容可能なその塩。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の硫
   酸化多糖類または医薬的に許容可能なその塩の単離方法
   であって、 （１）紅藻、寒天または未精製寒天の製造残渣を水性溶
   媒で抽出し； （２）前記多糖類を得るために、抽出物を精製処理及び
   カラムでの溶離処理または、分画沈澱にかけ、次いで （３）所望により、このようにして得られた多糖類を医
   薬的に許容可能なその塩に転化させるこをからなる該方
   法。
5. 【請求項５】 水性溶媒はリン酸塩緩衝液またはNaClの
   水溶液であり、精製処理は、遠心分離、濾過、有機溶媒
   との沈澱形成、透析、凍結乾燥及び限外濾過から選択さ
   れる少なくとも１種の処理であることを特徴とする請求
   項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 医薬的に許容可能なキャリヤまたは希釈
   剤及び、活性成分として請求項１〜３のいずれか１項に
   記載の硫酸化多糖類または医薬的に許容可能なその塩か
   らなる医薬組成物。
7. 【請求項７】 抗-ウイルス剤として使用するための請
   求項１〜３のいずれか１項に記載の硫酸化多糖類または
   医薬的に許容可能なその塩。
8. 【請求項８】 AIDS治療で使用するための請求項７に記
   載の硫酸化多糖類または医薬的に許容可能なその塩。