CN1304008C - 医药组合物 - Google Patents

Abstract

含有从选自通式(I)所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物，以及在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物作为有效成分的、糖尿病、风湿病、需要炎症抑制的疾病、需要α-糖苷酶抑制的疾病、需要前列腺素合成抑制的疾病、需要内毒素休克抑制的疾病、需要白细胞介素产生抑制的疾病、需要血红素加氧酶产生诱导的疾病、需要肿瘤坏死因子产生抑制或致癌抑制的疾病的治疗用或预防用医药组合物。

Description

医药组合物

技术领域

本发明涉及医药组合物，更详细地说，涉及以源于藻类的生理活性物质为有效成分的医药。此外，本发明还涉及含有该生理活性组合物的功能性饮食品。

背景技术

可以认为，炎症是生物体对外来侵袭的防御性作用，从而产生内因性活性物质以使身体状态能够适应的结果。然而，由此引起的反应变得有害，而且引起疾病状态者居多。此外，自免疫疾病中的炎症是免疫细胞视自身为异物、导致也对正常细胞采取有害行动而发生的。

自免疫疾病之一的慢性关节风湿病是关节部位的特异性炎症，作为该慢性关节风湿病的药物治疗法，是采用甾类、非甾类抗炎症剂和金、D-青霉胺等宽解导入药进行内科治疗的。

琼脂等源于藻类的寡糖可望开发成为食品原料(食品化学品，1988-2，40～44；增刊食品化学品-4，1990年12月，127-131；特开平6-38691号)，而关于它们的抗炎症作用、抗风湿病作用还不清楚。

发明目的

本发明的目的是开发有抗炎症作用、抗风湿病作用等生理功能、安全性高的物质，并提供以该物质为有效成分的抗炎症剂、抗风湿病剂等对该化合物显示敏感性的疾病用医药品、以该物质为构成成分的功能性饮食品等。

发明公开

若概要地说明本发明，则本发明的第一方面涉及含有从选自式I

所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物，以及在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物作为有效成分的、糖尿病、风湿病、需要炎症抑制的疾病、需要α-糖苷酶抑制的疾病、需要前列腺素合成抑制的疾病、需要内毒素休克抑制的疾病、需要白细胞介素产生抑制的疾病、需要血红素加氧酶产生诱导的疾病、需要肿瘤坏死因子产生抑制或致癌抑制的疾病的治疗或预防用医药组合物。

本发明的第二方面涉及含有、添加和/或稀释从选自式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物以及在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物而成的、糖尿病、风湿病、需要炎症抑制的疾病、需要α-糖苷酶抑制的疾病、需要前列腺素合成抑制的疾病、需要内毒素休克抑制的疾病、需要白细胞介素产生抑制的疾病、需要血红素加氧酶产生诱导的疾病、需要肿瘤坏死因子产生抑制或致癌抑制的疾病的症状改善用饮食品或该疾病的预防用饮食品。

本发明的第三方面涉及从选自式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物以及在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物在抗糖尿病剂、抗风湿病剂、抗炎症剂、α-糖苷酶抑制剂、前列腺素合成抑制剂、内毒素休克抑制剂、白细胞介素产生抑制剂、血红素加氧酶产生诱导剂、肿瘤坏死因子产生抑制剂或致癌抑制剂的制造中的用途。

附图简单说明

图1：是添加琼脂二糖、琼脂四糖或琼脂六糖、在各培养条件下培养时培养基中的NO₂ ^-浓度显示图。

图2：是添加琼脂二糖、琼脂四糖或琼脂六糖、在各培养条件下培养时培养基中的细胞内过氧化物量占正常范围内细胞的比例(％)显示图。

图3：是添加琼脂二糖、琼脂四糖或琼脂六糖、在各培养条件下培养时培养基中的前列腺素E₂浓度显示图。

图4：是在各培养条件下培养时培养基中的NO₂ ^-浓度显示图。

图5：是在各培养条件下培养时培养基中的前列腺素E₂浓度显示图。

图6：是本发明的寡糖对小鼠II型胶原关节炎模型的预防效果显示图。

图7：是本发明的寡糖对小鼠II型胶原关节炎模型的治疗效果显示图。

图8：是本发明的寡糖对Lewis大鼠糖负荷后的血糖值上升抑制作用显示图。

图9：是本发明的寡糖对自然发病糖尿病大鼠的血糖值下降作用显示图。

图10：是本发明的寡糖对自然发病糖尿病大鼠糖负荷后的血糖值上升抑制作用显示图。

图11：是本发明的寡糖对TPA诱发小鼠耳郭浮肿模型的浮肿抑制作用显示图。

图12：是本发明的寡糖对TPA诱发小鼠致癌模型的致癌抑制作用显示图。A表示对肿瘤数的作用，B表示对肿瘤发生率的作用。

图13：向各样品中添加花生四烯酸时的前列腺素E₂生成显示图。

图14：向各样品中添加前列腺素H₂时的前列腺素E₂生成显示图。

图15：添加各样品时的前列腺素E₂生成显示图。

图16：在各培养条件下培养时培养上清液中IL-6的浓度显示图。

图17：在各条件下培养上清液中IL-6的浓度显示图。

图18：在各培养条件下培养时培养上清液中IL-10的浓度显示图。

发明的详细说明

本发明中，式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖(以下简称3，6-脱水吡喃半乳糖)的醛衍生物是以下式II所示化合物。其水合物是以下式III所示化合物。而3，6-脱水吡喃半乳糖的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物是以下式IV和式V所示化合物。此外，这些的醛衍生物是以下式VI和式VII所示化合物。这些的水合物是以下式VIII和式IX所示化合物。

式III：

式IV：

式V：

式VI：

式VII：

式VIII：

式IX：

本说明书中，式I～IX的结构也可以用其它表现形式表达，但这些也包含在内，而且还包含其可能的互变异构体，即全都可以用式I～IX表示。此外，式I～IX中的立体配置，只要能得到所希望的活性就没有特别限定，可以是D-型、L-型或这些的混合物。

本发明的可溶性糖化合物没有特别限定，可以是含有从3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物选择的化合物(以下这些总称为“式I～IX化合物”)中至少一种的可溶性糖化合物，含有式I～IX化合物中至少一种的物质(以下简称原料物质)在不足pH7的酸性下进行酸分解和/或酶分解就能得到，而且也可以用化学合成法得到。本发明的可溶性糖化合物只要使用时是无固化或半固化(凝胶化)物的化合物就没有特别限定。因此，使用时含有从溶胶化的式I～IX化合物中选择的至少一种化合物的糖化合物，包含在本发明的可溶性糖化合物中。要说明的是，本发明中较好使用的该可溶性糖化合物包括诸如其非还原末端是L-半乳糖-6-硫酸以外的糖的糖化合物，例如，琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物。

用来得到该可溶性糖化合物的原料物质没有特别限定，可以列举诸如琼脂糖、琼脂胶、海萝聚糖、紫菜聚糖、角叉藻聚糖、帚叉藻聚糖、沙菜聚糖等红藻的粘质多糖〔共立出版公司发行，多糖生化学1-化学编-，第314页(1969)〕。而且，这些多糖的含有物也包含在原料物质中。例如，作为琼脂糖、琼脂胶的原料，可以使用石花菜科( Gelidiaceae)的 Gelidium amausii、 Gelidium japonicum、 Gelidium pacificum、 Gelidium subcostatum、 Pterocladia tenuis和 Acanthopeltis japonica等，红篱科( Gracilariaceae)的 Gracilaria varrucosa和 Gracilaria gigas等，仙菜科( Ceramiaceae)的 Ceramium kondoi和 Campylaephora hypnaeoides等及其它红藻类，通常把数种藻类配合作为原料。原料藻类通常使用在太阳下晒干的干品，但在本发明中可以使用新鲜藻类和干燥藻类。而且也可以使用干燥时边喷水边漂白的所谓漂白原藻。

原料藻类用热水提取后，通过冷却就能得到“凉粉”。这种“凉粉”通过冷冻脱水或压榨脱水除去水分、再通过干燥就能得到琼脂。琼脂不管构成其来源的藻类如何，均可以棒状、带状、板状、丝状、粉末状等各种形态使用。通常，琼脂含有约70％琼脂糖和约30％琼脂胶，但进行精制可以进一步制备高纯度琼脂糖。精制琼脂糖可以使用精制度从低到高的各种琼脂糖含量的制品。

原料物质包括上述琼脂的原料藻类、凉粉、琼脂、精制琼脂糖、精制琼脂胶、这些制造步骤得到的中间产物或副产物。

琼脂糖是以交替结合的D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖为主结构的多糖，D-半乳糖的1位和3，6-脱水-L-半乳糖的4位以β-苷键结合，而3，6-脱水-L-半乳糖的1位和D-半乳糖的3位以α-苷键结合。α-1，3-键可以用稀酸温和水解，或用琼脂酶〔碳水化合物研宄(Carbohydr.Res.)第66卷第207页(1978)〕水解，而β-1，4-键可以用β-琼脂酶选择性水解。

此外，角叉藻聚糖是杉藻科、红翎菜科、沙菜科等红藻类中所含的多糖，已知有κ-角叉藻聚糖、λ-角叉藻聚糖、η-角叉藻聚糖。

κ-角叉藻聚糖具有D-半乳糖-4-硫酸的1位与3，6-脱水-D-半乳糖的4位以β-苷键结合和3，6-脱水-D-半乳糖的1位与D-半乳糖-4-硫酸的3位以α-苷键结合交互重复的基本结构。λ-角叉藻聚糖具有D-半乳糖的1位与D-半乳糖-2，6-二硫酸的4位以β-苷键结合和D-半乳糖-2，6-二硫酸的1位与D-半乳糖的3位以α-苷键结合交互重复的基本结构。角叉藻聚糖可以用来作为食品的凝胶化剂。

上述原料物质用化学的、物理的和/或酶的方法进行部分分解的产物也包含在本发明的原料物质中。

作为化学分解方法的实例，可以列举从酸性到中性的水解；作为物理分解方法的实例，可以列举电磁波或超声波的照射；作为酶分解方法的实例，可以列举用水解酶例如琼脂酶、角叉藻聚糖酶等的水解。

原料物质从酸性到中性的分解条件，只要是能生成有抗糖尿病作用、抗风湿病作用、抗炎症作用、α-糖苷酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、白细胞介素产生抑制作用、血红素加氧酶产生诱导作用、肿瘤坏死因子产生抑制作用和/或致癌抑制作用等的式I～IX化合物、含有这些化合物中至少一种的可溶性糖化合物例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖(以下简称角叉藻二糖)和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物、以及其非还原末端是L-半乳糖-6-硫酸以外的糖而其还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物的条件，就没有特别限定。

例如，原料物质通过溶解或悬浮于酸中进行反应，就能生成本发明中使用的从式I～IX化合物中选择的化合物和含有这些化合物中至少一种的可溶性糖化合物。此外，通过反应时加热，从式I～IX化合物中选择的化合物和含有这些化合物中至少一种的可溶性糖化合物的生成所需要的反应时间可以缩短。

原料物质，例如琼脂糖或含有琼脂糖的物质，溶解或悬浮的酸的种类没有特别限定，但可以使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乳酸、抗坏血酸等有机酸、以及阳离子交换树脂、阳离子交换纤维、阳离子交换膜等固体酸。

酸的浓度没有特别限定，但可以以0.0001～5当量、较好0.001～1当量的浓度使用。而且反应温度也没有特别限定，但可以设定0～200℃、较好20～130℃。此外，反应时间也没有特别限定，但可以设定数秒～数日。酸的种类和浓度、反应温度和反应时间可根据成为原料的含有从式I～IX化合物中选择的至少一种化合物的物质例如琼脂糖、角叉藻聚糖等的种类和作为目标的从式I～IX化合物中选择的化合物、含有运些化合物的糖化合物的生成量、还原末端有作为目标的从式I～IX化合物中选择的化合物的可溶性糖化合物的聚合度进行适当选择。一般来说，通过选择从弱酸到强酸、从低浓度酸到高浓度酸、从低温到高温，酸分解反应就能迅速进行。

此外，在使用固体酸的情况下，一般地说，强阳离子交换树脂比弱阳离子交换树脂能达到更高的分解反应效率。而且，每一种原料物质的使用量越多、且作用温度越高，酸分解反应就进行得越快。

例如，琼脂以10％(重量)悬浮于0.1N盐酸中、在100℃加热溶解13分钟、除去不溶物得到的、本发明中使用的糖化合物溶液，即使冷却到其凝固点也不会再发生凝胶化。此溶液中所含的糖类，用凝胶过滤HPLC、顺相HPLC等方法分析时几乎没有发现高分子糖类，表明大部分分解成可溶性的10糖以下的糖化合物。同样，在固体酸的情况下，市售的强阳离子交换树脂的Na型1重量份用1N盐酸转化成H型后加入到79重量份的脱盐水中、进而加入、悬浮琼脂10重量份、在95℃加热180分钟得到的本发明的糖化合物溶液，即使冷却到其凝固点也不会再发生凝胶化。此溶液中所含的糖类，用凝胶过滤HPLC、顺相HPLC等方法分析时几乎没有发现高分子糖类，表明大部分分解成可溶性的10糖以下的糖化合物。

此外，本发明中使用的、在还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的可溶性糖化合物制造时，通过使用柠檬酸、乳酸、苹果酸等有机酸并在酸浓度数10mM～数M、加热温度70～95℃、加热时间数10分钟～24小时范围内适当选择，就能大量生成有生理活性的寡糖，例如抗氧化用寡糖。而且，水解后维持酸性并使之不处于碱性条件下，所生成的该生理活性寡糖就会显示长期的保存稳定性。

本发明中使用的从式I～IX化合物中选择的化合物和含有这些化合物中至少一种的可溶性糖化合物例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物，既可以以原料物质的分解物原样使用，也可以中和后使用，还可以进一步精制后使用。从式I～IX化合物中选择的化合物和在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等寡糖，可以以编程性细胞死亡诱发活性或致癌活性作为指标进行精制。作为精制手段，可以采用化学方法、物理方法等已知的精制手段，还可以组合凝胶过滤法、分子量分级膜分级法、溶剂萃取法、使用了离子交换树脂等的各种色谱法等先有技术上已知的精制方法，对酸分解物中生成的目标编程性细胞死亡诱发性物质即从式I～IX化合物中选择的化合物和含有该化合物中至少一种的可溶性糖化合物进行精制。

这样得到的化合物的结构可以用质谱法、核磁共振法、紫外吸收谱测定、红外吸收谱测定等已知方法剖析。

作为本发明的有效成分之一例的琼脂二糖，是D-半乳糖的1位与3，6-脱水-L-半乳糖的4位以β-苷键结合的二糖。3，6-脱水-L-半乳糖的1位是异头碳，因而有α-型和β-型存在，但无论哪一种都包含在本发明使用的琼脂二糖中。

在本发明中作为有效成分使用的、还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物，只要是在从该式I～IX化合物中选择的化合物的1位以外的羟基上有糖结合的，而且有抗糖尿病作用、抗风湿病作用、抗炎症作用、α-糖苷酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、白细胞介素产生抑制作用、血红素加氧酶产生诱导作用、肿瘤坏死因子产生抑制作用和/或致癌抑制作用等的化合物，就没有特别限定。例如，可以列举原料物质的分解物，如琼脂糖的酸分解物或α-琼脂酶分解物即琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、琼脂十糖、β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等。进而，有从葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖、木糖、阿拉伯糖、核糖等戊糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、gluronic acid等糖醛酸、葡糖胺、半乳糖等氨基糖、N-乙酰基神经氨糖酸等唾液酸、墨角藻糖等脱氧糖、这些的酯、酰胺和内酯中选择的糖在从式I～IX化合物中选择的化合物的1位以外的一个或多个羟基上结合的衍生物，也包含在本发明的、在还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物中。进而，这些在还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物例如琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物上结合了丙酮酸和/或硫酸基的、以及该糖的羟基进行了甲基化的衍生物，也包含在本发明的、在还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物中。要说明的是，如上所述，本发明中在还原末端有从式I～IX化合物中选择的化合物的糖化合物，较好的是其非还原末端是L-半乳糖-6-硫酸以外的糖。

还原末端有3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物的还原末端化合物的1位是异头碳，因而还原末端有该化合物的糖化合物存在着α-型和β-型，但无论哪一种都可以作为还原末端有3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物的糖化合物在本发明中使用。

此外，只要具有抗糖尿病作用、抗风湿病作用、抗炎症作用、α-糖苷酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、白细胞介素产生抑制作用、血红素加氧酶产生诱导作用、肿瘤坏死因子产生抑制作用和/或致癌抑制作用等的生理活性，分子量就没有特别限定。

作为本发明中使用的、从式I～IX化合物中选择的化合物和在还原末端有该化合物的糖化合物的还原末端化合物，当然也可以使用α-型、β-型、醛型、水合型的混合物以及D-型、L-型的混合物等。

这样一来，本发明中使用的、从式I～IX化合物中选择的化合物和在还原末端有该化合物的糖化合物具有抗糖尿病作用、抗风湿病作用、抗炎症作用、α-糖苷酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、白细胞介素产生抑制作用、血红素加氧酶产生诱导作用、肿瘤坏死因子产生抑制作用和/或致癌抑制作用等，而且按照本发明，首先提供含有从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物作为有效成分的、糖尿病、风湿病、需要炎症抑制的疾病、需要α-糖苷酶抑制的疾病、需要前列腺素合成抑制的疾病、需要内毒素休克抑制的疾病、需要白细胞介素产生抑制的疾病、需要血红素加氧酶产生诱导的疾病、需要肿瘤坏死因子产生抑制或致癌抑制的疾病的治疗剂或预防剂。

作为本发明的治疗用或预防用医药组合物，可以制成抗糖尿病剂、抗风湿病剂、抗炎症剂、α-糖苷酶抑制剂、血糖上升抑制剂、抗高脂血症剂、抗肥胖剂、前列腺素合成抑制剂、内毒素休克抑制剂、白细胞介素产生抑制剂、血红素加氧酶产生诱导剂、肿瘤坏死因子产生抑制剂、活性氧产生抑制剂、一氧化氮(NO)产生抑制剂、过氧化物质产生抑制剂、致癌抑制剂等。

风湿病是引起骨膜细胞或软骨细胞障碍的疾病，本发明中使用的化合物可通过滑膜细胞增殖抑制作用等而用来作为抗风湿病剂。

此外，本发明中使用的化合物，在慢性关节风湿病等脏器特异自免疫疾病或炎症性疾病中，能抑制被认为会直接引起炎症的肿瘤坏死因子的产生。因此，可以改善炎症、风湿病、尤其慢性关节风湿病的症状，使作为炎症标志(marker)的C反应蛋白质(CRP)值、类风湿因子(RF)值、红血球沉降速度(血沉)值激减，步行困难等合并症状也会显著改善。

肿瘤坏死因子是作为诱导肿瘤部位出血性坏死的因子发现的，但目前被认为是以炎症为根本的、广泛涉及生物体防御和免疫机理的细胞因子。这种肿瘤坏死因子的产生调节机理的破绽是给宿主带来各种各样的麻烦，而且肿瘤坏死因子的过度或未调节的产生涉及慢性关节性风湿病、风湿性脊髓炎、变形性关节症、痛风性关节炎、败血症、败血性休克、内毒素休克、革兰阴性菌败血症、毒性休克综合征、脑型疟、慢性肺炎、移植片对宿主反应、同种移植片排异反应、流行性感冒等感染症引起的发热和肌肉痛、感染或恶性肿瘤继发性恶病质、人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)继发性恶病质、AIDS、AIDS相关综合征、瘢痕瘤形成、渍疡性大肠炎、多发性硬化症、自免疫糖尿病和全身红斑狼疮等自免疫疾病，并与其中多数疾病有关〔分子医学(Molecular Medicine)，第33卷第1010～1020页、第1182～1189页(1996)〕。

本发明的肿瘤坏死因子产生抑制剂可用于治疗通过肿瘤坏死因子传递或恶化的症状。

本发明中使用的化合物可用于抑制氧化物质例如活性氧的产生，以该化合物为有效成分的活性氧产生抑制剂等抗氧化剂可用于治疗或预防起因于活性氧的产生和/或过剩的疾病。

本发明中，需要抑制NO产生的疾病没有特别限定，但包括诸如毒性休克或某些细胞因子治疗等引起的全身性血压低下、血压应答低下、自免疫疾病、炎症、关节炎、风湿性关节炎、糖尿病、炎症性肠疾病、血管机能不全、病因性血管扩张、组织损伤、心脏血管系缺血、痛感过敏症、脑缺血、伴随血管新生的疾病、癌症等疾病。

脑局部缺血期间和再灌流后NO产生量增大，伴随这种情况的是脑组织受损伤。脑局部缺血时，通过对患者给药本发明的NO产生抑制剂，能减轻脑组织的损伤和改善预后。

组织的炎症和疼痛的引起与花生四烯酸代谢有很大关系。源于细胞膜磷脂质的花生四烯酸是通过体内环状加氧酶的作用而代谢成前列腺素、前列环素(prostacyclin)、血栓烷这三者的。其中，前列腺素有血管扩张作用和伴随血管扩张而进入脏器的血流增加作用，但尤其在炎症部位前列腺素E₂和I₂会通过其血流增加作用增加浮肿和白血球浸润。即，通过给药本发明的前列腺素E₂合成抑制剂，能抑制前列腺素的生物合成，和表现出镇痛、抗炎症作用。进而，炎症部分浸润的白血球会生产活性氧、引起氧化紧张状态，因而，能抑制前列腺素生物合成的本发明前列腺素E₂合成抑制剂也可用于由氧化紧张状态引起的如上所述各种症状、疾病的预防、治疗或恶化防止。

此外，也如以上所述，NO会诱发能特征性确认炎症性病变的浮肿、即血管透过性亢进作用，并使炎症性传递质前列腺素类的生物合成亢进，因此，本发明的NO产生抑制效果和前列腺素E₂合成抑制效果起到协同作用，而且在镇痛、抗炎症作用和由氧化紧张状态引起的各种症状、疾病的预防、治疗和恶化防止方面也表现出协同效果。

通过在皮肤上涂布强致癌促进剂12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，以产生能促进涂布部位细胞的花生四烯酸代谢的前列腺素、白三烯、血栓烷等化学物质。这些炎症性物质会使血管透过性亢进、引起皮肤浮肿。作为与花生四烯酸代谢产物有关的皮肤疾病，已知有红斑、膨疹等急性荨麻疹，而且能抑制TPA引起的浮肿的物质可以认为对这些疾病是有效的。此外，TPA引起的皮肤疾病模型，从组织学类似点来看，可以用来作为牛皮癣的模型，而且能抑制TPA引起的浮肿的物质可用来作为牛皮癣治疗药。

致癌过程包括造成细胞DNA损伤的突然变异原性(引发)阶段，和进而使细胞增殖摆脱控制(促进)这样的阶段，而且可以认为细胞癌化必须经历这些过程的。

DMBA起到引发剂的作用，而TPA是作为促进剂促进致癌的。作为TPA的促进作用，已知除直接变异作用外还有生物体炎症诱导引起的致癌作用。即，TPA引起从巨噬细胞等炎症细胞中游离出NO、前列腺素E₂等炎症性传递质。前列腺素E₂会选择性地活化Th₂细胞，而Th₂的活化又与Th₁的抑制有关。另一方面，NO会选择性地抑制Th₁。NO、前列腺素E₂引起的Th₁的抑制会抑制生物体对癌的防御机制，并诱导致癌。迄今为止，已有人报告了能抑制前列腺素E₂的NSAID、甾类等引起的致癌抑制作用。

迄今为止，已经有若干篇论文报告了绿茶及其成分儿茶素类有致癌抑制作用(Okabe，S.等，Jpn.J.Cancer  Res.90：733-739，1999；Yamane，T.等，Molecular  Medicine(分子医学)33：394-399，1996；Wang，Z.等，Cancer Res，52：1162-1170，1992)。

作为其它报告的致癌抑制物质，有维生素类、、非甾系抗炎症药、钙或硒等矿物质类，N-乙酰基半胱氨酸这样的抗氧化物质等。作为有关寡糖的报告，有人报告了乳果糖的致癌抑制作用(Ponz de Leon等，Scand，J，Gastroeuterol.Suppl.222：72-75，1997；Challa，A.等，Carcinogenesis 18：517-521，1997)或半乳糖寡糖对大肠癌的致癌抑制作用(Wijnands，M.V.等，Carcinogenesis  20：651-656，1999)或果糖寡糖(或寡果糖)对大肠癌的致癌抑制作用或对乳腺癌的致癌抑制作用等(Pierre，F.等，Cancer Res.57：225-228，1997；Taper，H.S.等，J.Nutr.129：1488-1491，1999)。然而，源于琼脂的寡糖有这样的致癌抑制作用尚未见有人报告。

从式I～IX化合物中选择的化合物和从在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物中选择的化合物，能抑制TPA引起的炎症，和抑制炎症因子引起的致癌。以从这些化合物中选择的化合物作为有效成分，可以制造、提供致癌抑制剂、致癌抑制用饮食品。

白细胞介素是淋巴细胞、单细胞等产生的蛋白质性生物活性物质的总称。现在已知有白细胞介素1～18存在。作为本发明中的白细胞介素，可以列举诸如IL-6、IL-10。

IL-6，作为诱导B细胞最终分化的分化因子，能克隆其cDNA。IL-6不仅有免疫反应，而且与造血系统、神经系统的细胞分化或急性反应有关，进而还与各种免疫异常或炎症性疾病、淋巴系统肿瘤的发病有密切关系。此外，IL-6会对B细胞诱导抗体产生，从而产生IgM、IgG、IgA等各类免疫球蛋白，但与IL-4不同的是不涉及类别切换。而且，IL-6也作为B细胞或浆细胞的增殖因子起作用。另一方面，也涉及T细胞系，能使T细胞增殖或分化。IL-6也涉及造血系统，它与IL-3协调，通过缩短GO期来使造血干细胞增殖。此外，促进巨核细胞成熟来诱导血小板增加。IL-6也涉及细菌或病毒感染、恶性肿瘤等生物体即刻反应的急性期反应有关。IL-6也涉及神经系统，是从成胶质细胞瘤或星形细胞瘤等神经系细胞分泌的，也在神经系的分化诱导方面起作用。慢性关节风湿病或全身性红斑狼疮中，可以看到B细胞的活性，而且患者的关节液中有高浓度IL-6存在。以全身性淋巴节肿胀为特征的Castleman综合征中，血中IL-6浓度非常高。显示出自免疫疾病样症状的心房粘液肿患者中，肿瘤细胞产生出大量的IL-6。而且，来自多发性骨髓肿患者的骨髓瘤细胞的增殖可以用抗IL-6抗体抑制，由此可见，IL-6是骨髓瘤细胞的自增殖因子的可能性高。进而，原发性肾小球性肾炎患者的尿中也含有IL-6，而且IL-6也作为肾小球膜细胞的增殖因子起作用〔宫园浩平和管村和夫编，“生物科学用语词库：Cytokine·增殖因子”第28～29页，羊土社(1995)〕。在认为这样的IL-6异常产生是病体原因的疾病中，给药本发明中使用的化合物，就可以抑制IL-6的产生、治疗或预防症状。

此外，作为需要抑制IL-10产生的疾病，可以列举诸如伴随免疫低下的疾病。

血红素加氧酶(HO)中，有33kDa的HO-1和36kDa的HO-2两种同功酶存在。HO-2具有在HO-1的N末端侧加上由20个氨基酸残基组成的氨基序列的结构。残余部分的相同性为40～50％，高次结构彼此非常类似。两者在C末端部均有疏水性区域，这部分结合在微粒体膜上。微粒体若进胰蛋白酶处理，就可以得到具有血红素分解活性的可溶性级分，由此可以认为，含活性中心的大区域在细胞质侧是突出的。

HO-1是一种诱导酶，在各种细胞中会由于基质血红素、重金属离子、某种有机化合物、过氧化氢、或者热振荡、紫外线照射、局部缺血这样的化学、物理要因而受到显著诱导。HO-2是构成酶，在各组织中都有表达，但在脑和精巢中活性尤其高。HO会把血红素分解成胆绿素、CO、铁、而胆绿素又通过还原酶进一步变成胆红素。这种胆红素有脂肪酸的抗氧化作用、脂质自由基的清除剂作用、中性白细胞的吞噬作用等伴随大量发生的氧自由基引起的磷脂质、中性脂肪、胆固醇的氢过氧化物产生抑制作用、与动脉硬化症发病密切相关的LDL(低密度脂蛋白)的产生抑制作用、单线态氧的清除剂作用等作为抗氧化物质的活性，作为内因性抗氧化物质在生物体内扮演着重要角色。各种自由基，不仅作用于脂质，而且也作用于蛋白质、核酸等各种各样生物体物质，成为引起慢性疾病、癌症的要因，但胆红素能减少这样的各种自由基〔卟啉研究会编《卟啉·血红素的生命科学：向遗传病·癌·工学应用等的展开》，东京化学同人(1995)〕。总而言之，通过诱导HO，就能诱导有抗氧化活性的胆红素的产生，从而能治疗或预防各种自由基引起的疾病。本发明中使用的化合物能诱导HO的产生，从而对如上所述需要诱导HO产生的疾病的治疗或预防是有用的。

上述的本发明治疗用或预防用医药组合物，例如抗糖尿病剂，可以通过以从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物为有效成分、将其与已知的医药用载体组合、制剂化来制造。

一般来说，这些化合物可以与药学上可接受的液状或固体状载体配合，必要时添加溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固形剂，和通常液剂、悬浮剂、乳剂等液剂。此外，还可以制成在使用前添加适当载体而使其变成液状的干燥品。

本发明的医药组合物可以以经口剂或注射剂、点滴用剂等非经口剂中任何一种给药。

医药用载体可以根据上述给药形态和剂型进行选择，在经口剂的情况下，可以利用诸如淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。而且，当经口剂调制时，也可以进一步配合粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂、着色剂、香料等。

另一方面，在非经口剂的情况下，可按照常法，把本发明的有效成分即有编程性细胞死亡诱发性的糖化合物溶解乃至悬浮于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理食盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，必要时添加杀菌剂、稳定剂、等渗剂、无痛化剂等来制备。

本发明的医药组合物可以采用与制剂形态对应的适当给药途径给药。给药方法也没有特别限定，可以通过内用、外用和注射进行。注射剂可以经诸如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用剂也包括栓剂等。

本发明的医药组合物例如抗糖尿病剂的给药量可根据其制剂形态、给药方法、使用目的和要施用的患者的年龄、体重、症状适当设定，没有一定，但一般来说，制剂中含有的有效成分数量是成人每1日10μg～200mg/kg。当然，给药量是因种种条件而异的，因而用比上述给药量少的剂量有时也能令人满意，或者说有时也必须超出范围。本发明的药剂除原样经口给药外，也可以添加到任意食品中供日常摄取。

同样，本发明的抗风湿病剂、抗炎症剂、α-糖苷酶抑制剂、血糖上升抑制剂、抗高脂血症剂、抗肥胖剂、前列腺素合成抑制剂、内毒素休克抑制剂、白细胞介素产生抑制剂、血红素加氧酶产生诱导剂、肿瘤坏死因子产生抑制剂、或致癌抑制剂，只要以从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物为有效成分、将其与已知的医药用载体组合、制剂化就可以制造。这些制剂的制造可以按照上述医药组合物的制造方法进行。

作为这些抗风湿病剂、抗炎症剂、α-糖苷酶抑制剂、血糖上升抑制剂、抗高脂血症剂、抗肥胖剂、前列腺素合成抑制剂、内毒素休克抑制剂、白细胞介素产生抑制剂、血红素加氧酶产生诱导剂、肿瘤坏死因子产生抑制剂、或致癌抑制剂，可以采用与制剂形态对应的适当给药途径给药。给药方法也没有特别限定，可以通过内用、外用和注射进行。注射剂可以经诸如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，外用剂也包括栓剂等。

此外，作为这些抗风湿病剂、抗炎症剂、α-糖苷酶抑制剂、血糖上升抑制剂、抗高脂血症剂、抗肥胖剂、前列腺素合成抑制剂、内毒素休克抑制剂、白细胞介素产生抑制剂、血红素加氧酶产生诱导剂、肿瘤坏死因子产生抑制剂、致癌抑制剂的给药量，可根据其制剂形态、给药方法、使用目的和要施用的患者的年龄、体重、症状适当设定，没有一定，但一般来说，制剂中含有的有效成分数量是成人每1日10μg～200mg/kg。当然，给药量是因种种条件而异的，因而用比上述给药量少的剂量有时也能令人满意，或者说有时也必须超出范围。本发明的药剂除原样经口给药外，也可以添加到任意食品中供日常摄取。

其次，本发明的饮食品是含有、添加和/或稀释从选自式I～IX化合物的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物中选择的至少一种化合物，例如，从原料物质在不足pH 7的酸性下的酸分解物和/或酶分解物生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物而成的食品或饮料，而且因其抗糖尿病作用、抗风湿病作用、抗炎症作用、α-糖苷酶抑制作用、血糖上升抑制作用、抗高脂血症作用、抗肥胖作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、白细胞介素产生抑制作用、血红素加氧酶产生诱导作用、肿瘤坏死因子产生抑制作用和/或致癌抑制作用，对于对从式I～IX化合物中选择的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物中至少一种显示感受性的糖尿病、风湿病、需要炎症抑制的疾病、需要α-糖苷酶抑制的疾病、需要前列腺素合成抑制的疾病、需要内毒素休克抑制的疾病、需要白细胞介素产生抑制的疾病、需要血红素加氧酶产生诱导的疾病、或需要肿瘤坏死因子产生抑制的疾病的症状改善、预防是极其有用的，而且对于致癌抑制也有用。

本发明的食品或饮料的制造方法没有特别限定，但可以采用调理、加工和一般使用的食品或饮料的制造方法，所制造的食品或饮料中只要含有从式I～IX化合物中选择的化合物和从在还原末端含有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物，例如，从原料物质在不足pH7的酸性下的酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等中选择的至少一种化合物作为有效成分即可。

本发明的饮食品没有特别限定，但可以列举诸如谷物加工品(例如小麦粉加工品、淀粉类加工品、预混物加工品、面条类、通心粉类、面包类、豆酱类、荞麦面条类、面筋制品、米粉制品、粉条、包装饼等)、油脂加工品(例如可塑性油脂、炸虾(鱼)油、色拉油、生菜油、白色调味油等)、大豆加工品(例如豆腐类、豆酱、纳豆(一种蒸后发酵的大豆)等)、食肉加工品(例如火腿、腊肉、压制火腿、香肠等)、水产制品(例如冷冻磨碎鱼肉、鱼糕、竹签炸鱼肉卷(竹轮)、鱼肉山芋丸子(半平)、炸鱼糕小馅饼(萨摩扬)、鱼丸、筋、鱼肉火腿、鱼肉香肠、干松鱼、鱼卵加工品、水产品罐头、酱煮鱼虾等)、乳制品(例如原乳、乳脂(酪)、酸乳酪、黄油、奶酪、炼乳、奶粉、冰淇淋等)、野菜·果实加工品(例如膏类、酱类、渍物类、果实饮料、野菜饮料、混合饮料等)、甜味食品类(例如巧克力、饼干、甜点心类、糕饼类、米饼甜点、米花糖类等)、酒类(例如日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌、烧酒、伏特加、白兰地、杜松子酒、甜酒、啤酒、清凉酒饮料、果酒、白酒等)、嗜好饮料(例如绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)、调味料(例如酱油、沙司、醋、料酒等)、罐装·瓶装·袋装食品(例如牛肉盖浇米饭、小锅肉菜米饭、红豆饭、咖厘饭、及其它各种调理好的食品等)、半干燥或浓缩食品(例如肝膏、其它涂抹食品、养麦面条或切面的浇汁、浓缩汤类等)、干燥食品(例如方便面类、方便咖喱饭、速溶咖啡、果汁粉、汤料粉、方便豆酱汁、调理好的食品、调理好的饮料、调理好的汤等)、冷冻食品(例如鸡素烧、蒸鸡蛋羹、烧烤鳗鱼、汉堡牛排、烧卖、饺子、各种棒形食品、水果鸡尾等)、固形食品、液体食品(例如汤等)、香辣调味料类等农产、林产加工品、畜产加工品、水产加工品等。

本发明的饮食品中，只要含有、添加和/或稀释从式I～IX化合物中选择的化合物和从在还原末端含有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物，例如，从原料物质在不足pH 7的酸性下的酸分解和/或酶分解生成的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖等中选择的至少一种化合物并含有显示其生理机能的必要量，就对其形状无特别限定，也包含片状、颗粒状、胶囊状等形状的可经口摄取的形状物。

3，6-脱水吡喃半乳糖或其2-O-甲基化衍生物或其2-O-硫酸化衍生物和在还原末端具有该化合物的糖化合物，是半缩醛环容易开环且末端容易变成醛的。这种醛和3，6-脱水吡喃半乳糖的醛衍生物的醛，容易与对醛有反应性的化合物例如氨基酸等这样的亲核性物质反应，反应的式I～IX化合物或糖化合物例如寡糖就变成还原末端没有从式I～IX化合物中选择的化合物的状态。因此，就会丧失从式I～IX化合物中选择的化合物和还原末端具有这些化合物的寡糖所具有的各种生理活性。即，为了使饮料或食品中从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有这些化合物的糖化合物组成的一组中选择的化合物充分保持稳定，必须使对这些醛显示出反应性的化合物的摩尔浓度保持比这些醛的摩尔浓度低的状态。

因此，在本发明的食品或饮料的制造中，通过对先有技术上未加以控制的、对这些醛显示出反应性的化合物量进行控制，就有可能提供从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有这些化合物的糖化合物组成的一组中选择的化合物实质上不减少、这些化合物的含有量高的食品或饮料。

此外，从式I～IX化合物中选择的化合物和在还原末端有该化合物的糖化合物的还原末端上该从式I～IX化合物中选择的化合物，已被发现在酸性下是稳定的，因此，在本发明的食品或饮料的制造方法中使其工艺全过程在酸性下进行并使所得到的食品或饮料成为酸性食品或酸性饮料，就有可能提供从选自式I～IX化合物的化合物和在还原末端有这些化合物的糖化合物组成的一组中选择的化合物含有量高的酸性食品或酸性饮料。

而且，从式I～IX化合物中选择的化合物和还原末端有该化合物的可溶性糖化合物例如源于琼脂的琼脂寡糖，能抑制脂多糖(LPS)或TPA等诱导的炎症传递质例如NO、前列腺素E₂(PGE₂)等的产生，而且也可以用来作为致癌预防用食品添加剂。

本发明中使用的从选自式I～IX化合物的化合物和含有该化合物的可溶性糖化合物组成的一组中选择的化合物，即使以1g/kg的给药量对小鼠经口或经腹腔内给药，也都没有观察到急性毒性。

实施例

以下列举参考例、实施例更具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。

参考例1

琼脂(Agar Noble)悬浮于0.1N HCl中使之达到10％浓度，在100℃加热19分钟。把上述试样加到用水平衡的Toyopearl HW40C(东索公司制)柱(4.4cm×85cm)上，以每分钟1.4ml的流速、以水作为移动相进行凝胶过滤色谱分离。洗脱的物质用差示折射率计检测，收集的级分每个7ml。

确认了洗脱时间406分、435分、471分和524分的峰，与各峰对应的级分在硅胶60板F₂₅₄(Merck公司制)上点样，以1-丁醇∶乙醇∶水＝5∶5∶1展开，用苔黑酚-硫酸法分析时，清楚地表明这些依次是琼脂八糖、琼脂六糖、琼脂四糖和琼脂二糖。把这些级分冷冻干燥，得到30mg琼脂八糖、100mg琼脂六糖、150mg琼脂四糖和140mg琼脂二糖。

参考例2

(1)市售琼脂(伊那琼脂S-7型，伊那食品工业公司制)150g、食品添加剂用柠檬酸(无水)(三荣源F.F.I.公司制)15g用去离子水配成1.5升，升温至92℃之后，在92～95℃在搅拌下保持130分钟。然后冷却至室温，用Celite 545(Celite公司制)的0.5％主体加料过滤，制备滤液(琼脂分解寡糖溶液)，用以下的顺相HPLC分析。柱：PALPAK S型(4.6×250mm，宝酒造公司制，CA8300)

溶剂A：90％乙腈水溶液

溶剂B：50％乙腈水溶液

流速：1ml/分钟

洗脱：溶剂A(10分钟)→从溶剂A到溶剂B的直线浓度梯度(40分钟)→溶剂B(10分钟)

检测：195nm的吸光度

柱温度：40℃

结果确认了作为糖化合物是以琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖为主成分生成的。

而且，在以下条件下进行顺相HPLC、凝胶过滤HPLC，得到了同样的结果。

(a)

柱：TOSOH TSK-gel Amide-80(4.6×250mm，东索公司制)

溶剂：60％CH₃CN

流速：0.7ml/分钟

检测：RI检测器

柱温度：80℃

(b)

柱：TOSOH TSK-gel ALPHA-2500×2(7.8×300mm，东索公司制)

溶剂：H₂O

流速：0.3ml/分钟

检测：RI检测器

柱温度：60℃

滤液的pH是约2.6、酸度0.92、白利糖度9.2％，用以下参考例2-(2)记载的方法测定的琼脂二糖生成量是43.1mM。

(2)用F-试剂盒乳糖/半乳糖(Boehringer Mannheim公司制，Code 176303)，让β-半乳糖苷酶作用于琼脂二糖，用测定所生成半乳糖的浓度的方法进行琼脂二糖的定量。

按照试剂盒的使用方法进行定量，但β-半乳糖苷酶的反应改用37℃、1小时。校正曲线用乳糖制作，算出以乳糖计的摩尔浓度(mM)之后，再换算成琼脂二糖浓度(mg/ml)。

用上述参考例1制备的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖，尝试按上述方法定量。其结果，琼脂二糖的计算值与实测值一致。另一方面，琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖实质上无法用上述方法检测。即，显而易见的是，琼脂二糖以外的琼脂寡糖实质上无法用上述检测方法检测，通过用上述方法，可以进行琼脂寡糖中琼脂二糖的浓度测定。

参考例3

市售琼脂(伊那琼脂S-7型，伊那食品工业公司制)溶解在脱盐水中使之达到10％(重量/体积)，进一步添加强阳离子交换树脂活性型(H⁺)(Diaion SK-104，三菱化学公司制)使之达到1％(重量/体积)，在95℃水解3小时，反应后降低到常温，进行固液分离(从溶液中除去树脂)。所得到的液体用活性炭处理(活性炭浓度4％(重量/体积))除去着色物质等，过滤(孔径0.1μm的过滤器)后减压浓缩、再过滤(孔径0.2μm的过滤器)、按常法冷冻干燥，以含有琼脂二糖的组合物形式制备了琼脂二糖。

这种琼脂二糖的组成是水分1.3％、半乳糖3.4％，琼脂二糖30.7％、琼脂四糖、琼脂六糖等琼脂寡糖62.4％，pH 4.1。

实施例1

在含有10％胎牛血清、不含苯酚红、含有2mM L-谷氨酰胺(LifeTech Oriental公司制，Code 25030-149)的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，Code 12-917F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCC TIB 71)，使之达到3×10⁵个/ml，向48孔微滴板的孔中每孔各加500μl，在5％碳酸气存在下于37℃培养6小时。参考例1制备的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖溶解在水中使之达到5mM并过滤灭菌的各寡糖水溶液分别向各孔中每孔添加10μl，进一步培养0.5小时或5小时。然后，向各孔中添加10μl 5μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，Code L-2012)、2000U/ml干扰素γ(IFNγ，Cosmobio公司销售，Code GZM-MG-IFN)水溶液，培养12小时后，进行NO在培养基中氧化生成的NO₂ ^-浓度测定。

要说明的是，作为对照，设定了LPS、IFNγ不添加组和琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖不添加组。

上述培养后，向100μl的培养上清液中添加100μl的4％Griess试剂(Sigma公司制，Code G4410)，在室温放置15分钟后，测定490nm的吸光度。以在上述培养基中溶解的已知浓度NaNO₂制作校正曲线，用来计算培养基中的NO₂ ^-浓度。测定全部重复进行三次。

结果表明，琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖全都抑制了LPS、IFNγ诱导的NO产生。而且发现，在LPS、IFNγ添加前，在琼脂寡糖存在下，与0.5小时培养组相比，5小时培养组能更强地抑制NO产生。进而还发现，糖链越长，即与琼脂二糖相比，琼脂四糖、琼脂六糖添加组能更强地抑制NO产生。其结果显示在图1中。即，图1是在各培养条件下培养时培养基中NO₂ ^-浓度显示图。图1中，横座标表示培养条件，纵座标表示NO₂ ^-浓度(μM)。

实施例2

在含有10％胎牛血清、含有1.3％二甲基亚砜(同仁化学公司制，Code 346-03615)的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker公司制，Code12-702F)中添加HL-60细胞，在5％碳酸气存在下，在37℃培养1周，制备分化成中性白细胞样的细胞(以下称HL-60Nu)。

参考例1得到的琼脂二糖，琼脂四糖、琼脂六糖溶解于水中使之达到5mM，过滤灭菌。把HL-60Nu细胞以能达到2.5×10⁵个/2.4ml的方式悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，添加上述寡糖水溶液50μl，在5％碳酸气存在下，在37℃培养2小时。然后，向各孔中添加5mg/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA，Gibco公司制，Code 13139-019)水溶液50μl，进一步培养5小时后，进行细胞内过氧化物测定。要说明的是，作为对照，设定了TPA不添加组和琼脂二糖，琼脂四糖、琼脂六糖不添加组。

上述培养后，向各孔中添加5mM 2′，7′-二氯荧光素二乙酸盐(Sigma公司，Code D6833)二甲基亚砜溶液10μl，进一步培养30分钟。然后，通过离心分离回收细胞，用磷酸缓冲食盐水洗涤2次，按照细胞工学别册实验方案素列活性氧实验方案(1994年秀润公司出版)第51～54页记载的方法，用FACScan，测定与细胞内过氧化物量成比例生成的2′，7′-二氯荧光素。

其结果，对琼脂六糖观察到TPA诱导细胞内过氧化物生成的抑制，对琼脂二糖，琼脂四糖也观察到若干抑制。其结果显示于图2中。即，图2是在各培养条件下培养时细胞内过氧化物量处于正常范围内的细胞比例显示图，横座标表示培养条件，纵座标表示细胞内过氧化物量处于正常范围内的细胞比例(％)。

实施例3

在含有10％胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(BioWhittaker公司制，Code 12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCC TIB71)使之达到3×10⁵个/ml，向48孔微滴板的孔中每孔加500μl，在5％碳酸气存在下于37℃培养6小时。把参考例1制备的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖溶解于水中使之达到5mM并过滤灭菌的各寡糖水溶液向各孔中每孔分别添加10μl，进一步培养0.5小时或5小时。然后，向各孔中添加50μg/ml LPS水溶液10μl，培养12小时后测定前列腺素E₂的量。要说明的是，作为对照，设定了LPS不添加组和琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖不添加组。

上述培养后，用前列腺素E₂ ELISA试剂盒(Neogen公司制，Code404110)测定培养上清液中的前列腺素E₂量。测定全部重复进行三次。

结果表明，琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖均抑制了LPS诱导的前列腺素E₂产生。而且观察到，在LPS添加前，在琼脂寡糖存在下，与0.5小时培养组相比，5小时培养组能更强地抑制前列腺素E₂产生。其结果显示在图3中。即，图3是在各培养条件下培养时培养基中前列腺素E₂浓度显示图。图3中，横座标表示培养条件，纵座标表示前列腺素E₂浓度(ng/ml)。

实施例4

(1)对参考例2制备的琼脂分解寡糖溶液1升加碳酸钙(和光纯药公司制，Code 034-00425)8.5g，在5℃搅拌过夜。将其过滤，得到滤液。结果表明，通过这种处理，使柠檬酸浓度从处理前的11.40mg/ml变成1.37mg/ml。此外，也使钙浓度从处理前的0.25mg/ml变成处理后的0.62mg/ml。

(2)实施例4-(1)记载的脱柠檬酸琼脂分解寡糖溶液进行冷冻干燥制成粉末，以能达到10％浓度的方式溶解于自来水中，制成10％琼脂寡糖溶液。

让ddy小鼠(日本SLC，雌性，7周龄)在21日期间以自由饮水方式摄取上述制备的10％琼脂寡糖溶液。要说明的是，作为对照，令其自由饮用自来水。此外，各组均以每组2只进行。此后，向腹腔内注射含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker公司制，Code 12-702F)4ml，充分按摩后从2只小鼠中采集培养基样品、合并，得到腹腔细胞。把腹腔细胞悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中使之达到10⁶个/ml，向48孔微滴板的孔中每孔加注500μl，在5％碳酸气存在下于37℃培养2小时，然后除去培养上清液得到粘着性细胞，作为腹腔巨噬细胞使用。向各孔中每孔加注新的含有10％胎牛血清、不含苯酚红、含有2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，Code 12-917F)500μl，添加10μl的5μg/ml LPS、2000U/ml IFNγ水溶液，进一步培养12小时后，按照实施例1记载的方法进行NO在培养基中氧化生成的NO₂ ^-浓度的测定。要说明的是，作为对照，设定了LPS、IFNγ水溶液不添加组。而且，测定全部重复进行3次。

其结果，观察到在从以自由饮水方式摄取10％琼脂寡糖溶液的小鼠制备的腹腔巨噬细胞中显著的NO产生抑制，琼脂寡糖在自由饮水中显示了强烈的NO产生抑制作用。

其结果显示在图4中。即，图4是在各培养条件下培养时培养基中NO₂ ^-浓度显示图，横座标表示培养条件，纵座标表示NO₂ ^-浓度(μM)。

实施例5

实施例4-(1)记载的脱柠檬酸琼脂分解寡糖冷冻干燥制成粉末，并溶解于自来水中使之达到10％的浓度，制成10％琼脂寡糖溶液。

在21日期间以自由饮水方式给ddy小鼠(日本SLC，雌性，7周龄)喂上述制备的10％琼脂寡糖溶液。要说明的是，作为对照，以自由饮水方式摄取自来水。而且，以每组各2只进行。此后，向腹腔内注入含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker公司制，Code 12-702F)4ml，充分按摩后采样，合并每组2日的样，得到腹腔细胞。在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中悬浮腹腔细胞使之达到10⁶个/ml，向48孔微滴板上每孔各加500μl，在5％碳酸气存在下于37℃培养2小时，然后除去培养上清液得到粘着性细胞，作为腹腔巨噬细胞使用。向各孔中每孔加注新的含有10％胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，Code 12-604F)500μl、添加10μl的50μg/ml LPS水溶液进一步培养12小时后，测定前列腺素E₂的量。要说明的是，作为对照，设定一个LPS不添加组。

上述培养后，用前列腺素E₂ ELISA试剂盒测定培养上清液中的前列腺素E₂量。而且，测定全部以重复3次进行。

结果表明，在从以自由饮水方式摄取10％琼脂寡糖溶液的小鼠制备的腹腔巨噬细胞中显著抑制了前列腺素E₂产生，琼脂寡糖在自由饮水中显示出对前列腺素E₂产生的强烈抑制作用。

其结果显示在图5中。即，图5是在各培养条件下培养时培养基中的前列腺素E₂浓度显示图，横座标表示培养条件，纵座标表示前列腺素E₂浓度(ng/ml)。

实施例6

(1)用发色基质对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷与α-葡萄糖苷酶相互作用，用比色法定量水解游离的4-硝基苯酚，测定α-葡糖苷酶活性。

10μl的α-葡糖苷酶溶液〔40mU/ml，源于S.cerevisiae，Sigma公司制，溶解于10mM磷酸缓冲液pH 7.2(37℃)中〕中混合10μl含试样的溶液〔溶解于10mM磷酸缓冲液pH 7.2(37℃)中〕之后，添加1.5mg/ml的基质溶液〔Sigma公司制，溶解于10mM磷酸缓冲液pH 7.2(37℃)中〕80μl，使反应开始。在37℃反应40分钟后，测定410nm(岛津uv 2200)的吸光度。其结果列于表1中。要说明的是，这种情况下的残存活性是以不添加试样者为100％算出的。

                    表1α-葡糖苷酶抑制活性(残存活性％)

	0μM	5μM	50μM	500μM	1000μM	5000μM
							脱水半乳糖	100	100	100	100	100	100
琼脂二糖	100	100	100	100	100	100
							琼脂四糖	100	100	97	75	32	20
琼脂六糖	100	91	91	47	35	7
							琼脂八糖	100	91	90	32	26	11
新琼脂二糖	100	100	100	100	100	100
							新琼脂四糖	100	100	93	89	76	42
新琼脂六糖	100	100	100	93	71	8

从上述结果可以看出，四糖以上的琼脂寡糖和四糖以上的新琼脂寡糖有α-葡糖苷酶抑制活性。进而，还可以看出，琼脂寡糖的α-葡糖苷酶抑制活性比新琼脂寡糖强。

要说明的是，作为试样使用的琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖采用参考例1制备的产品，而脱水半乳糖(船越公司制)、新琼脂二糖(Sigma公司制)、新琼脂四糖(船越公司制)、新琼脂六糖(船越公司制)则采用市售品。

(2)使用从大鼠小肠粘膜得到的粗酶标品〔用Arne Dahlqvist，Anal.Biochem.，7，18-25(1964)的方法制备〕的参考例1制备的琼脂四糖或琼脂六糖在试管内的α-葡糖苷酶抑制活性测定按以下方法进行。

酶反应是向用10mM磷酸缓冲液pH7.0适当稀释的试样物质溶液10μl中加入80μl作为基质的蔗糖、麦芽糖、海藻糖和可溶性淀粉的同缓冲液溶液使其达到最终浓度100mM(可溶性淀粉为0.5％)，添加10μl从大鼠小肠制备的粗酶液，在37℃反应20分钟。酶活性是通过添加葡萄糖测定用试剂(和光纯药公司制)3ml、在37℃反应5分钟后测定505nm的吸光度而作为上述反应液中生成的葡萄糖量求出的。对各基质分解的抑制活性，是用上述方法对4种不同浓度测定的活性作为相对于对照组而言的残存活性(％)表示、计算的。在琼脂四糖存在下对各基质的残存活性(％)列于表2中，而在琼脂六糖存在下对各基质的残存活性(％)列于表3中。

        表2在琼脂四糖存在下对各基质的残存活性(％)

基质(mM)	0	0.2	0.5	1.0	2.0
						蔗糖	100	92	85	83	72
麦芽糖	100	97	95	100	98
						海藻糖	100	100	100	100	93
可溶性淀粉	100	100	96	97	91

          表3在琼脂六糖存在下对各基质的残存活性(％)

基质(mM)	0	0.2	0.5	1.0	2.0
						蔗糖	100	92	85	81	70
麦芽糖	100	98	100	91	92
						海藻糖	100	100	100	100	93
可溶性淀粉	100	100	97	96	97

这些物质对蔗糖的抑制物质常数(Ki)当从狄克松图(Dixon plot)求出时，琼脂四糖是7.4mM、琼脂六糖是7.9mM。进而，琼脂寡糖当以蔗糖为基质时显示出比当以麦芽糖等为基质时更强的α-葡糖苷酶抑制作用。

实施例7

用6周龄的雄性DBA/1J系小鼠，将源于牛关节的II型胶原(K41：胶原技术研修会)3mg/ml与等量弗洛因德完全佐剂(FCA)混合并制成乳液剂，经小鼠尾根部皮下给药(150μg/0.1ml/只小鼠)。3周后再次以同样方式追加给药，诱发II型胶原关节炎。

参考例2-(1)记载的琼脂分解寡糖溶液用自来水稀释3.3倍或33.3倍，从胶原初次敏化时起(考察预防效果时)或从追加免疫时起(考察治疗效果时)，以自由饮水方式摄取。对照组以自由饮水方式摄取自来水。各组均由10只组成，关节炎发病评价按以下方式算出，以〔发病小鼠总分的合计点数/1组小鼠的数目〕表示(最高16点)。即，0点：无变化；1点：一指或多指肿胀；2点：全面观察到发红和肿胀；3点：全面观察到强度肿胀；4点：伴随关节的强直性变化。

结果表示在图6和7中。纵座标表示关节炎分值，横座标表示经过日数(日)。各值都表示平均值±标准误差。白圆点表示对照组，白四角表示3.3倍稀释溶液摄取组，白三角表示33.3倍稀释溶液摄取组。图中的*、**分别表示用Mann-Whitney U检验时，相对于对照组而言，在p＜0.05、0.01时是有意义的。

预防效果：实验期间的平均饮水量，对3.3倍稀释溶液摄取组是约130ml/kg，对33.3倍稀释溶液摄取组是约200ml/kg。在对照组中，观察到第62日以后关节炎分值显著上升，而在3.3倍稀释溶液摄取组中显示出显著抑制。

治疗效果：实验期间的平均饮水量，对于3.3倍稀释溶液摄取组是约150ml/kg，对于33.3倍稀释溶液摄取组是230ml/kg。3.3倍稀释溶液摄取组第62日以后显示出显著抑制。

从以上结果可以发现，琼脂寡糖对小鼠II型胶原关节炎有预防和治疗效果。因此，可期待对慢性关节风湿病的效果。

实施例8

对六周龄雌性CDF1系小鼠，预先将实施例4-(1)记载的脱柠檬酸琼脂分解寡糖溶液冷冻干燥制成粉末，再溶解于自来水中使之达到10％、5％、1％的浓度，配制10％、5％、1％琼脂寡糖溶液。以自由饮水方式摄取这种10％、5％、1％琼脂寡糖溶液。稀释时用自来水，给予对照组的同样是自来水。饮水摄取开始起第19日经腹腔内给药高剂量LPS(300μg/只小鼠)，制作内毒素休克死模型，探讨直至72小时后的致死抑制作用〔实验(1)〕。同样饮水摄取了19日的小鼠经腹腔内给药低剂量LPS(20μg/只小鼠)，用市售ELISA试剂盒(R & D公司)测定1小时后血清中TNF-α浓度[实验(2)]。另一方面，当制作内毒素肝障碍模型时，对小鼠同时经腹腔内给药半乳糖胺(Sigma公司)(20mg/只小鼠)和LPS(0.01μg/只小鼠)，制作了剧症肝炎致死模型，探讨了延命效果〔实验(3)〕。

结果列于表4中，实验期间的琼脂摄取量，对于10％、5％、1％琼脂寡糖溶液摄取组分别是约20、9、2g/kg/日。在实验(1)、(3)中，对于10％琼脂寡糖溶液摄取组观察到显著的致死抑制作用。在实验(2)中，对于10％琼脂寡糖溶液摄取组观察到血清中TNF-α浓度的抑制。

表4

组	(1)致死率死亡数/总数(％)	2TNF(μg/ml)(n)	(3)致死率死亡数/总数(％)
				对照	7/8(88)	10.4±1.6(4)	8/8(100)
10％琼脂寡糖溶液	2/8*(25)	7.4±0.8(4)	4/7*(57)
				5％琼脂寡糖溶液	6/8(75)	12.8±1.6(4)	7/8(88)
1％琼脂寡糖溶液	8/8(100)	11.3±1.0(4)	8/8(100)

表中的数值表示平均值±标准误差，*表示Mann-Whitney U检验时，相对于对照组而言，在p＜0.05时是有意义的。

癌症的化学疗法，虽说是有效治疗法，但容易陷入有损于患者生物防御体系的感染。在这样的状况下，细菌感染引起的败血症会成为致死性疾病。已经证实，琼脂寡糖不仅有不具有此类副作用的抗癌作用，而且也能抑制败血症引起的致死。另一方面，在实验上，大鼠、小鼠对内毒素的耐性远比人高，因此，当制作病态模型时，往往采用预先提高敏感性这样的手段。其中一种是与半乳糖胺并用的模型，但这种模型同时也被摆在作为剧症肝炎模型的位置上。即使在临床上，不仅肝炎剧症化，就连作为慢性肝炎的增恶因子之一，也显示出内毒素卷入的重要性。从本结果可以期待，通过使慢性肝炎患者服用，就能预防病态的增恶化。

实施例9

(1)用13周龄雄性路易斯(Lewis)大鼠，进行由蔗糖负荷引起的糖负荷试验。

对禁食18小时的大鼠，经口给药蔗糖2g/kg。临给药前、给药15、30、60、120分钟后经尾静脉进行采血，用测定试剂盒(GLU Neo Shino-Test；Shino-Test公司)测定血浆中的葡萄糖浓度。从糖负荷试验4周前起以饮水方式摄取(N＝5)参考例2-(1)制备的琼脂分解寡糖溶液的3.3倍稀释液、10倍稀释液。

给对照组提供自来水(N＝2)。4周间的平均饮水量，对于3.3倍稀释溶液摄取组是80ml/kg/日，同样对于10倍稀释溶液摄取组是100ml/kg/日。

结果表示在图8中。图的横座标表示蔗糖给药后的时间经过，纵座标表示血糖值(mg/dl)。对照组血糖值随时间的变化用圆点表示，3.3倍稀释溶液摄取组用四角符号表示，10倍稀释溶液摄取组用菱形符号表示。

对照组的血糖值在直至糖负荷60分钟后的上升之后减少了。通过琼脂寡糖的饮水摄取，糖负荷前即禁食时的血糖值下降，而且发现，糖负荷后血糖值的上升也有受抑制的倾向。

通常，空腹时血糖值减少，吃饭后会暂时性上升，但经过一段时间还会回到原来的水平。这种生物体机能是受到因糖的刺激而从胰脏分泌的激素(荷尔蒙)控制的。在临床上，作为诊断这种机能是否正常的方法，要在空腹时给予糖负荷，再进行血糖随时间变化的测定试验。

从本实施例用大鼠借助于蔗糖负荷进行的糖负荷试验的结果，确认了用琼脂寡糖的饮水摄取的有效性。由此表明，琼脂寡糖在与血糖控制有关的功能上是有效果的。

(2)用59周龄雄性WBN/Kob大鼠，将参考例2-(1)制备的琼脂分解寡糖溶液的3.3倍稀释溶液以饮水方式摄取。对照组给予自来水(N＝3)。

从琼脂寡糖摄取开始，随日期推移，从尾静脉进行采血，用测定试剂盒(GLU Neo Shino-Test；Shino-Test公司)测定血浆中的葡萄糖浓度。

实验期间琼脂寡糖给药组的平均饮水量是300ml/kg/日。

结果显示于图9中。图的横座标表示从给药开始起的日数，纵座标表示血糖值(mg/dl)。对照样的血糖值随时间变化用白圆点表示，琼脂寡糖给药组用黑圆点表示。已经观察到，在实验期间，对照组维持一定的高血糖值，而琼脂寡糖给药组有血糖值慢慢降低的倾向。

自然发病糖尿病大鼠WBN/Kob大鼠从出生后3月龄时胰脏引起炎症性变性，然后血糖值徐徐上升，从而作为糖尿病模型用于实验。

这次使用的动物显示出非常高的血糖值，发病后经历了好几个月，可以认为处于重症化状态。通过琼脂寡糖的饮用摄取，有使血糖徐徐降低的效果，这在糖尿病治疗上是有意义的，即使对于重症病例，其改善效果也是可以期待的。

(3)用63周龄雄性WBN/Kob大鼠，借助于葡萄糖负荷，进行糖负荷试验。对禁食18小时的大鼠。经口给药葡萄糖2g/kg。临给药前、给药15、30、60、120、240分钟后从尾静脉进行采血，用测定试剂盒(GLU Neo Shino-Test；Shino-Test公司)测定血浆中的葡萄糖浓度。从糖负荷试验4周前开始以饮水方式摄取(N＝3)参考例2-(1)制备的琼脂分解寡糖溶液的3.3倍稀释溶液。给对照组饮用自来水(N＝3)。琼脂寡糖给药组的平均饮水量是300ml/kg/日。

结果显示在图10中。图的横座标表示葡萄糖给药后的时间经过，纵座标表示血糖值(mg/dl)。对照样的血糖值随时间变化用白圆点表示，琼脂寡糖给药组用黑圆点表示。

对照组血糖值在直至糖负荷60分钟后的上升之后慢慢降低。通过琼脂寡糖的饮水摄取，糖负荷前即禁食时的血糖值降低了，而且还观察到糖负荷后的血糖值上升也有受抑制的倾向。在负荷60分钟后，与对照组相比，以5％以下的危险率显示出有意义的血糖降低作用。这种倾向持续直至糖负荷120分钟后。

通常，空腹时血糖值降低，吃饭后暂时性上升，经过一段时间又会回到原来水平。然而，在糖尿病的病态下，即使空腹时血糖也不下降，而且吃饭后血糖还会进一步上升。受糖的刺激而从胰脏分泌的激素会使血糖受到控制，但在病态下观察到这种机能也是异常的。在临床上，作为这些机能的诊断方法，是在空腹时给予糖负荷，再随着时间推移进行血糖测定试验。这一次，用自然发病糖尿病大鼠WBN/Kob大鼠借助于葡萄糖负荷进行糖负荷试验，确认了通过琼脂寡糖的饮水给药的有效性。因此，即使在血糖的控制机能上有异常的病态下，也可以期待借助于琼脂寡糖的效果的机能改善。

(4)用5周龄的雄性ddY小鼠，以120mg/kg的剂量经腹腔内给药链脲霉素(Nacalai Tesque公司)，制作糖尿病模型。从链脲霉素给药1周后起，开始以饮水方式摄取参考例2-(1)制备的琼脂分解寡糖溶液的3.3倍、33.3倍、333倍稀释溶液。让对照组摄取自来水(N＝5～6)。从琼脂寡糖的摄取开始起，2、4、9、14日后从眼底静脉进行采血，用测定试剂盒(GLU Neo Shino-Test；Shino-Test公司)测定血浆中的葡萄糖浓度。

结果列于表5中。表中的数字表示平均值±标准误差。此外，表中的*、**分别意味着与对照组比较，该组在5％和1％以下的危险率时有显著差值。

表5

血糖值(mg/dl)	第0日	第2日	第4日	第9日	第14日
						对照组(N＝6)3.3倍稀释溶液	286.0±34.1	376.4±60.3	374.0±53.7	500.1±46.5	546.8±26.7
给药组(N＝5)33.3倍稀释溶液	272.5±57.0	326.5±79.6	364.3±83.4	297.8±81.4	373.5±65.0*
						给药组(N＝6)333倍稀释溶液	255.0±51.1	290.9±62.0	271.4±59.6	298.0±74.3*	361.9±75.7*
给药组(N＝6)	264.4±33.3	246.0±29.5	238.1±31.3	271.1±55.2*	324.1±55.3**

对照组随日期推移的血糖值徐徐上升，到实验结束时变成重症高血糖状态。3.3倍稀释溶液给药组和33.3倍稀释溶液给药组从给药第9日起，333倍稀释溶液给药组从给药第14日起，与对照组比较时，可以确认显著的血糖值下降，在对照组中观察到的高血糖症状得到改善。

链脲霉素糖尿病模型是通过胰脏胰岛的不可逆细胞障碍而以实验方式造成高血糖病态得到的模型，是人们经常使用的。在血糖控制方面，从胰脏胰岛分泌的激素是必不可少的，因而，其障碍而引起的胰岛素分泌不足成为引起高血糖的重要原因。

在链脲霉素糖尿病模型中，通过琼脂寡糖给药改善了高血糖症状，因而可期待有抗糖尿病作用。

实施例10

在ICR系小鼠(雄性，7周龄，体重约30g；日本SLC)的右耳廓外侧整个表面上涂布TPA(Gibco公司)丙酮溶液5nmol/20μl，每组3只，TPA涂布2小时后测定PGE₂量，TPA涂布6小时后测定耳廓浮肿程度。

PGE₂的测定是从放血死亡的小鼠上切取整个耳廓，加500μl提取液(100mmol/升Tris盐酸缓冲液、1mmol/升EDTA、2mmol/升还原谷胱甘肽、2μmol/升血红蛋白)进行匀浆，以10,000G离心10分钟，回收上清液。向上清液中加500μl 80％乙醇和10μl冰乙酸，静置5分钟后以2,500G离心5分钟，回收上清液。回收的上清液进一步加到C18柱上，用2ml水和2ml己烷洗脱，向洗脱液中添加4ml含1％甲醇的乙基丙酮，然后回收乙基丙酮层，用氮气蒸发至干。用ELISA试剂盒(Neogen公司)测定提取物中的PGE₂量。

耳廓浮肿的测定是从放血致死的小鼠上切取有TPA涂布的那一侧的整个耳廓，测定其重量。

实施例4-(1)制备的脱柠檬酸琼脂分解寡糖冷冻干燥制成的粉末的给药，是以局部涂布或添加到饮水中进行的。即，在局部涂布中，在TPA涂布30分钟前把该粉末的3％或10％溶液在右耳廓两侧的整个表面上涂布、风干。在饮水摄取中，是从TPA涂布14日前起至宰杀时，把该粉末的3％或10％溶液加入给水瓶中自由摄取。

耳廓PGE₂量测定结果列于表6中。

表6

	耳廓提取液中PGE2量(ng/ml)平均±标准偏差
		正常小鼠组(TPA非涂布)	1.1±0.3
对照小鼠组(TPA涂布)	3.1±0.4
		冷冻干燥粉末10％溶液涂布组	1.9±0.3(相对于对照小鼠组而言、p＜0.05)
冷冻干燥粉末10％溶液摄取组	1.3±0.3(相对于对照小鼠组而言、p＜0.01)

如表6中所示，可以确认，由于TPA的涂布，与正常小鼠组相比，对照组的PGE₂量增加约3倍。另一方面，在冷冻干燥粉末的10％溶液给药组中，可以确认，与对照组相比，涂布组或饮水摄取组的炎症局部PGE₂产生量均有显著减少(显著差检验用学生t-试验进行，当p＜0.05时统计学上有意义)。

耳廓重量测定结果是计算出相对于不涂布TPA的耳廓重量的增加率来表示的。其结果显示在图11中。图的纵座标表示TPA涂布小鼠相对于无TPA涂布小鼠的耳廓重量的增加率，各柱和误差线表示一组3只小鼠的平均值和标准误差。对照组与脱柠檬酸琼脂分解寡糖溶液给药组的显著差检验用学生t-试验进行，以p＜0.05为统计学上有意义。

已确认，通过TPA涂布，对照组有2倍以上的重量增加。另一方面，在冷冻干燥粉末的10％溶液给药组中，可以确认，与对照组相比，涂布组与饮水摄取组的耳廓重量增加均有显著减少，表明琼脂寡糖对浮肿的抑制作用。

实施例11

用ICR小鼠(雌性，9周龄，体重约30g；日本SLC)，各实验组以每组10只进行。小鼠背部体毛剃毛、涂布溶解于100μl丙酮中的100μg  7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA，Sigma公司)、进行引发(initiation)。从1周后起，每周2次、持续20周在同一部位涂布溶解于100μl丙酮中的1μg TPA(Nacalai Tesque公司)，进行促进(promotion)。

琼脂分解寡糖溶液的给药以局部涂布或添加在饮水中进行。要说明的是，作为琼脂分解寡糖溶液，采用参考例2-(1)记载的琼脂分解寡糖溶液(以下称10％琼脂寡糖溶液)、10％琼脂寡糖溶液的3.3倍水稀释物(以下称3％琼脂寡糖溶液)、10％琼脂寡糖溶液的10倍水稀释物(以下称1％琼脂寡糖溶液)。

在琼脂寡糖溶液的局部涂布中，是在DMBA涂布的30分钟前、和各TPA涂布的30分钟前将10％琼脂寡糖溶液涂布在背部、风干的。在饮水摄取中，是从DMBA涂布7日前起把1％或3％琼脂寡糖溶液加入给水瓶中自由摄取的。另一方面，给对照组摄取自来水。

各组中，从TPA涂布开始起20周期间每周一次监测每只小鼠背部发生的肿瘤数，和有肿瘤发生的小鼠只数。

实验结果显示在图12中。图12中A和B的纵座标分别表示肿瘤发生率和每只小鼠发生的肿瘤数，横座标表示TPA涂布开始起的日数(周)。

在对照组中观察到TPA涂布开始第7周有部分肿瘤发生，第11周全部小鼠都有肿瘤发生，第20周的肿瘤平均数是19.3个。另一方面，琼脂寡糖饮水摄取组第20周的肿瘤数，1％组为8.8个、3％组为2.8个，可以认为有显著抑制作用。进而，以10％琼脂寡糖溶液涂布方式给药，完全没有观察到肿瘤发生。

以上结果表明，琼脂寡糖显示出极高的致癌抑制作用。

实施例12

从人体慢性风湿病患者的滑膜建立的纤维芽细胞株DSEK细胞(作为离体风湿病模型，保存在埼玉医科大学综合医疗中心第二内科)用含10％FBS(Bio Whittaker公司制)的Iscov-MEM培养基(IMDM：Gibco-BRL公司制)，在5％CO₂存在下于37℃在培养器中把细胞培养直至达到饱和，以胰蛋白酶-EDTA溶液(Bio Whittaker公司制)把细胞悬浮在培养基上使之达到3×10⁴个/ml，向96孔微滴板(FALCON公司制)的各孔中每孔分注200μl。培养5～7日后，到细胞差不多达到80％饱和时交换培养基，添加含有25、50、75、100、200、或400μM琼脂二糖的200μl上述培养基。

取72小时的时间进程，随时间推移每24小时加10μl PremixWST-1(宝酒造公司制，MK400)、在37℃反应3.5小时，以450nm吸光度(A₄₅₀)减650nm吸光度(A₆₅₀)得列的值作为细胞增殖度。

其结果列于表7中。

表7

琼脂二糖浓度(μM)	24小时	培养时间48小时细胞增殖度(A450-650)	72小时
				0	1.04	1.27	1.46
50	1.00	1.49	1.27
				100	0.88	1.87	1.26
200	0.89	1.50	0.93
				400	0.87	0.52	0.47
800	0.54	0.45	0.56

此外，用A_450-650数据求出的半数细胞增殖抑制浓度-IC₅₀是24小时为225.3μM、72小时为169.1μM。

以上，在离体风湿病模型-DSEK细胞中，在添加琼脂二糖的情况下，与PBS添加对照组相比，各化合物添加组均抑制了风湿病细胞的增殖。而且，在随时间推移的观察中，发现这些化合物不仅继续有增殖抑制活性，而且有活性随时间推移而增强的倾向。

以上结果表明，琼脂二糖是有抗风湿病活性的，而且可以期待开发成为对慢性风湿病有用的治疗药和健康食品。

此外，在DSEK细胞培养中，随时间的推移每24小时回收150μl/孔的培养上清液，用对各细胞因子特异的ELISA试剂盒(人体FGF-β和人体IL-10，INTERGEN公司制；人体TGF-β，Promega公司制)，测定琼脂二糖对源于此细胞的细胞因子(人体TGF-β、人体FGF-β、和人体IL-10)产生(表达)的影响。

结果表明，琼脂二糖对人体IL-10、人体FGF-β和人体TGF-β的产生抑制作用。

实施例13

在含100μM羟基脲的含有10％胎牛血清(Gibco公司制)RPMI1640培养基(Bio Whittaker公司制，12-720F)中悬浮HL-60细胞(ATCCCCL-240)使之达到5×10⁵个/ml，向10cm陪替氏培养皿中加入20ml，在5％CO₂存在下于37℃培养过夜，使细胞停止于G1期。此细胞用离心分离法回收，再次在含100μM羟基脲的含有10％胎牛血清(Gibco公司制)RPMI 1640培养基中使之达到5×10⁵个/ml，向6孔微滴板的各孔中每孔加5ml。另一方面，作为羟基脲未处理细胞，把HL-60细胞悬浮在含有10％胎牛血清(Gibco公司制)RPMI 1640培养基中使之达到1×10⁵个/ml，向6个微滴板的各孔中每孔加5ml。向羟基脲处理细胞组各自的孔中添加50μl的琼脂二糖(80mM、60mM、40mM、20mM)、琼脂六糖(80mM、60mM、40mM、20mM)水溶液，另外，向羟基脲未处理细胞组各自的孔中添加50μl的琼脂二糖(40mM、30mM、20mM、10mM)、琼脂六糖(40mM、30mM、20mM、10mM)水溶液，进一步培养48小时。然后，回收培养液、通过离心分离收集细胞，悬浮于5ml新的含有10％胎牛血清(Gibco公司制)RPMI 1640培养基中，用其中100μl借助于Premix WST-1细胞增殖试验系统(宝酒造公司制，MK400)测定活细胞数。

其结果，对羟基脲处理的细胞的50％增殖抑制浓度(IC₅₀)无论在哪一个样品中都比未处理的细胞高。其结果列于表8中。即，表8是汇总了各样品及其IC₅₀(μM)的表。从这个表可以看出，琼脂寡糖对停滞于G1期的细胞是毒性低的。即，考虑到在生物体中几乎所有细胞都呈滞留于G1期的状态，因而可以认为琼脂寡糖是对生物体毒性小的药剂。

表8

	羟基脲处理细胞(μM)	羟基脲未处理细胞(μM)
			琼脂二糖	401	210.6
琼脂六糖	383	205.3

实施例14

(1)含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCC TIB 71)使之达到3×10⁵个/ml，向6孔微滴板的孔中每孔加5ml，在5％CO₂存在下于37℃培养过夜。向各孔中添加50μl 10mM琼脂二糖和琼脂六糖水溶液，进一步培养0.6小时之后，向各孔中添加50μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，L-2012)水溶液，培养12小时。用刮器从平皿上剥离、回收细胞、悬浮在含有1μg/ml胃酶抑制剂A(Sigma公司制，P5318)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽(Sigma公司制，L2884)、1mM苯甲基磺酰氟(Nacalai Tesque公司制，273-27)、10mM乙二胺四乙酸二氢二钠、0.1％Triton X-100的磷酸缓冲食盐水中，一次冷冻融解之后进行离心分离，以上清液作为蛋白质级分。蛋白质级分中的蛋白质含量用微量BCA蛋白质试验试剂(宝酒造公司销售Pierce公司制，P7411)测定。这样制备的各蛋白质级分样品与等量的含有4％硫酸月桂酯钠(SDS)、2％2-巯基乙醇、0.001％溴苯酚蓝、20％甘油的0.125M  Tris-盐酸缓冲液(pH 6.8)混合在100℃处理5分钟之后，负荷于7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上、以20mA的恒电流进行电泳。电泳后的凝胶，借助于含有48mM Tris、39mM甘氨酸、20％甲醇、0.0375％SDS的吸墨缓冲液，用Trans Blot SDCell Semi-Dry吸墨装置(Bio-Rad公司制)，按照所附实验方案，以15V的恒电压。在PVDF膜(Milipore公司制，IPVHOOO 10)上转录25分钟。转录后的PVDF膜在Block Ace(大日本制药公司制，UK-B25)溶液中于4℃阻断过夜。阻断后的膜用含有0.1％吐温20的磷酸缓冲食盐水，在缓缓振荡下洗涤3次15分钟。然后，在含有50ng/ml抗环状加氧酶2抗体(Transduction Laboratories公司制，C22420)、10％Block Ace、0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水中，在缓缓振荡下于室温反应1小时，再用含有0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水在缓缓振荡下洗涤3次15分钟。然后，在含有0.1％过氧化物酶标记免抗小鼠IgG(H+L)抗体(Zymed公司制，61-6520)、10％Block Ace、0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水中，在缓缓振荡下于室温反应1小时，再用含有0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水在缓缓振荡下洗涤5次15分钟。随后，PVDF膜用Western Blot Chemiluminescence ReagentPlus(第一化学公司经销NEN生命科学产品公司制，NEL 103)按照所附实验方案染色、在X-射线胶片(柯达公司制，CAT1651454)上感光。感光后的胶片用FPM800(富士胶片公司制)显影。

其结果，在LPS添加组中检出了环状加氧酶2蛋白质，但琼脂二糖、琼脂六糖在0或6小时前添加组中均不能抑制LPS诱导环状加氧酶2蛋白质表达的亢进。

(2)在含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的Dulbecco改性Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCC TIB 71)使之达到3×10⁵个/ml，向6孔微滴板的孔中各加5ml，在5％CO₂存在下于37℃培养过夜。向各孔中添加50μl 10mM琼脂二糖或琼脂六糖水溶液，进一步培养0或6小时之后，向各孔中添加50μl100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，L-2012)水溶液，培养5小时。除去培养上清液，向各孔中添加1ml Catrimox-14(宝酒造公司经销衣阿华生物技术公司制，WA002)溶液，移液之后回收溶液，按照以下附属的实验方案制备RNA。制备的RNA用RNA-PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1(宝酒造公司制，R019A)进行RT-PCR。逆转录反应用随机引物(N6)(宝酒造公司制，3801)在30℃进行10分钟、42℃进行30分钟、99℃进行5分钟，用合成cDNA作为模板、用环状加氧酶2的引子(GGCACTTGCATTGATGGTGGCT：1号序列和CAAGCAGTGGCAAGGCCTCCA：2号序列)按如下进行PCR：94℃2分钟，(94℃30秒钟、55℃1分钟、72℃1分钟)30个循环，72℃5分钟。反应后，向2％琼脂糖凝胶中加入样品，以100V进行电泳。电泳后的凝胶用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色，在紫外线照射下观察凝胶。

结果，在LPS添加组中检出了源于环状加氧酶2mRNA的带，但琼脂二糖、琼脂六糖在0或6小时添加组中均不能抑制LPS诱导环状加氧酶2mRNA合成的亢进。

从实施例14或以下实施例15的结果，可以认为，琼脂寡糖对前列腺素E₂产生的抑制并不能抑制环状加氧酶2的表达。

实施例15

(1)在含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCC TIB 71)使之达到1×10⁶个/ml，向10cm陪替氏培养皿中每个加20ml，在5％CO₂存在下于37℃培养过夜。向各培养皿中添加200μl10mM琼脂六糖或以下实施例15-(2)得到的DGE的水溶液，进一步培养5小时之后，向各孔中添加200μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，L-2012)水溶液，培养12小时。要说明的是，作为对照，加200μl水代替样品。用刮器从平皿上剥离、回收细胞、悬浮在含有1μg/ml胃酶抑制剂A(Sigma公司制，P5318)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽(Sigma公司制，L2884)、1mM苯甲基磺酰氟(Nacalai Tesque公司制，273-27)的0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)中，用超声波破碎机使细胞膜破碎之后，用离心分离回收上清液，作为粗酵母级分。粗酵母级分中的蛋白质含量用微量BCA蛋白质试验试剂(宝酒造公司经销Pierce公司制，P7411)测定。这样制备的各粗酵母级分样品100μl中加2.5μl 200mM谷胱甘肽(Nacalai Tesque公司制，170-50)水溶液、2.5μl 200mM L-肾上腺素水悬浮液(Nacalai Tesque公司制，010-04)，再添加1μl 3mM花生四烯酸(Cayman公司制，90010.1)溶液或1μl 100μg/ml前列腺素H₂溶液(Cayman公司制，17020)，在37℃反应30分钟。通过在100℃加热2分钟，使反应停止。反应液中的前列腺素E₂含量用前列腺素E₂ ELISA试剂盒(NEOGEN公司制，404110)测定。

其结果，与对照组比较，在琼脂己糖或DGE添加组中，添加花生四烯酸时和添加前列腺素H₂时，前列腺素E₂的生成都受到了抑制。这可以认为，琼脂己糖或DGE有在前列腺素H₂生成过程的下游抑制前列腺素E₂的作用机理。即，图13是向各样品中添加花生四烯酸时的前列腺素E₂生成显示图。横座标表示各样品，纵座标表示每1mg蛋白质的前列腺素E₂生成量(ng/ml)。图14是向各样品中添加前列腺素H₂时的前列腺素E₂生成显示图，横座标表示各样品，纵座标表示每1mg蛋白质的前列腺素E₂生成量(ng/ml)。

(2)进行DGE，即式X

所示L-甘油基-1，5-环氧-1αβ，6-二羟基-顺式-己-3-烯-2-酮的制备

市售琼脂(Agar Noble)2.5g悬浮在50ml 0.1N HCl中，在100℃加热13分钟、溶解。冷却到室温，用NaOH调整到pH 12，然后进行中和处理。

中和处理物用以下顺相HPLC分离，大量切取保留时间4.05分～4.16分的级分，得到DGE。

柱：PALPAK S型(4.6×250mm，宝酒造公司制)

移动相A：90％乙腈水溶液

移动相B：50％乙腈水溶液

流速：1ml/分钟

洗脱：移动相A(10分钟)→移动相A到移动相B的直线浓度梯度(40分钟)→移动相B(10分钟)

检测：195nm吸光度

柱温度：40℃

实施例16

对于实施例15制备的粗酶级分对照样品100μl，添加2.5μl 200mM谷胱甘肽水溶液、2.5μl 200mM L-肾上腺素水悬浮液之后，作为样品，添加1μl 100mM琼脂二糖水溶液或100mM琼脂己糖水溶液或10mM DGE水溶液。而且，作为阴性对照添加1μl水，作为阳性对照添加1μl 13mM尼美舒利(Cayman公司制，70640)溶液。然后，添加1μl 3mM花生四烯酸溶液，在37℃反应5分钟。在100℃加热2分钟使反应停止。反应液中的前列腺素E₂含量用前列腺素E₂ ELISA试剂盒测定。

结果表明，可以确认对尼美舒利添加组抑制了前列腺素E₂生成，但对添加了琼脂二糖、琼脂己糖、DGE的任何一组都不能确认对前列腺素E₂生成的抑制。即，可以认为，琼脂二糖、琼脂六糖、DGE对于能从花生四烯酸合成前列腺素E₂的任何-组酶都无法抑制。这个结果显示在图15中。即，图15是各样品添加时前列腺素E₂生成量显示图，横座标表示各样品，纵座标表示每1mg蛋白质的前列腺素E₂生成量(ng/ml)。

实施例17

向ddy小鼠(日本SLC；雌性，7周龄)的腹腔内注射含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker公司制，12-702F)4ml，充分按摩后取出，得到腹腔细胞。在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中悬浮该腹腔细胞使之达到10⁶个/ml，向48孔微滴板上每孔加注500μl，在5％CO₂存在下于37℃培养2小时，然后，除去培养上清液，得到粘着性细胞作为腹腔巨噬细胞使用。向各孔中每孔添加新的含有10％胎牛血清、不含苯酚红、含有2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-917F)500μl。再向各孔中添加参考例1得到的5μl 20mM、10mM、5mM琼脂二糖水溶液，并添加5μl 10μg/ml 13-乙酸-12-O-十四酰基佛波醇酯(TPA；Gibco公司制，13139-019)水溶液，进一步培养14小时后，回收培养上清液。培养上清液中的白细胞介素6(IL-6)的含量用酶免疫夹层试验(ELISA；匹配抗体对样品Pak-小鼠IL-6，Endogen公司制)测定。要说明的是，作为对照，设定了琼脂二糖、TPA水溶液不添加组。而且，测定全部以重复2次进行。

结果表明，在琼脂二糖添加组中可以确认依赖于琼脂二糖浓度的、对TPA诱导IL-6产生的抑制。该结果显示于图16中。即，图16是在各培养条件下培养时培养上清液中IL-6的浓度显示图，横座标表示培养条件，纵座标表示IL-6浓度(ng/ml)。

实施例18

参考例3记载的琼脂二糖溶解在自来水中使之达到1％、3％的浓度，分别配制成1％、3％琼脂二糖溶液。

让ddy小鼠(日本SLC；雌性，7周龄)在14日期间以自由饮水方式摄取以上配制的1％、3％琼脂二糖溶液。要说明的是，作为对照，自由饮用自来水。而且，各组均以每组2只进行。然后，向腹腔内注射含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Bio Whittaker公司制，12-702F)4ml，充分按摩后取出，将2只的取出物合并，得到腹腔细胞。把腹腔细胞悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中使之达到10⁶个/ml，向48孔微滴板中每孔加注500μl，在5％CO₂存在下于37℃培养2小时，然后，除去培养上清液，得到粘着性细胞，作为腹腔巨噬细胞使用。向各孔中每孔添加新的含有10％胎牛血清、不含苯酚红、含有2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改性Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-917F)500μl，并添加5μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，L-2012)水溶液，进一步培养5小时后，回收培养上清液。培养上清液中的白细胞介素6(IL-6)含量用酶免疫夹层试验测定。要说明的是，作为对照，设定了LPS不添加组。而且，测定全部以重复2次进行。

结果，在从以自由饮水方式摄取琼脂二糖溶液的小鼠制备的腹腔巨噬细胞中，可以确认依赖于琼脂二糖浓度的、对LPS诱导IL-6产生的抑制。其结果显示在图17中。即，图17是在各条件下的培养上清液中的IL-6浓度显示图，横座标表示条件，纵座标表示IL-6浓度(ng/ml)。

在含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCCTIB 71)使之达到3×10⁵个/ml，向48孔微滴板的孔中每孔加注0.5ml，在5％CO₂存在下于37℃培养过夜。向各孔中添加5μl参考例1记载的10mM琼脂二糖或琼脂六糖水溶液，进一步培养5小时之后，向各孔中添加5μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma公司制，L-2012)水溶液，培养18小时，回收培养上清液。培养上清液中的白细胞介素10(IL-10)的含量用酶免疫夹层试验测定。要说明的是，作为对照，设定了试样、LPS水溶液不添加组。而且，测定全部以重复2次进行。

结果，在琼脂二糖、琼脂六糖添加组中，可以确认对LPS诱导IL-10产生的抑制。该结果显示在图18中。即，图18是在各培养条件下培养时培养上清液中IL-10浓度显示图，横座标表示培养条件，纵座标表示IL-10浓度(pg/ml)。

实施例19

在含有10％胎牛血清(Gibco公司制)的Dulbecco改进Eagle培养基(Bio Whittaker公司制，12-604F)中悬浮RAW 264.7细胞(ATCCTIB 71)使之达到3×10⁵个/ml，向6孔微滴板的孔中每孔加5ml，5％CO₂存在下于37℃培养过夜。向各孔中添加50μl参考例1记载的20mM、10mM或5mM琼脂二糖或琼脂六糖水溶液，培养15小时。要说明的是，作为血红素加氧酶1诱导的阳性对照，设定了5μl 3mM 15-脱氧-Δ12，14-前列腺素J2(Cayman化学公司制，18570)二甲基亚砜溶液添加组，而作为阴性对照则设定了水添加组。细胞用刮器从滴板上剥离、回收，悬浮在含有0.05mM胃酶抑制剂A(Sigma公司制，P5318)、0.2mM亮抑蛋白酶肽(Sigma公司制，L2884)、1mM苯甲基磺酰氟(Nacalai Tesque公司制，273-27)、10mM乙二胺四乙酸二氢二钠、0.1％Triton X-100的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，一次冷冻-融解之后通过离心分离，以上清液作为蛋白质级分。蛋白质级分中的蛋白质含量用微量BCA蛋白质试验试剂(宝酒造公司经销Pierce公司制，P7411)测定。这样制备的各蛋白质级分样品与等量的含有4％硫酸月桂酯钠(SDS)、2％2-巯基乙醇、0.001％溴苯酚蓝、20％甘油的0.125M Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)混合并在100℃处理5分钟后，将以蛋白质量计10μg负荷到12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，以20mA恒电流进行电泳。电泳后的凝胶，借助于含有48mMTris、39mM甘氨酸、20％甲醇、0.0375％SDS的吸墨(Blotting)缓冲液，用Trans-Blot SD Cell Semi-Dry吸墨装置(Bio-Rad公司制)，按照附属实验方案，在PVDF膜(Millipore公司制，IPVHOOO 10)上以15V的恒电压转录25分钟。转录后的PVDF膜在Block Ace(大日本制药公司制，UK-B25)溶液中于4℃阻断过夜。阻断后的膜用含有0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水在缓缓振荡下洗涤3次15分钟。然后，在含有200ng/ml抗血红素加氧酶1抗体(N-19；Santa Cruz公司制，sc-7696)、10％Block Ace、0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水中，在缓缓振荡下于室温反应1小时，再用含有0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水在缓缓振荡下洗涤3次15分钟。然后，在含有0.1％过氧化物酶标记兔抗山羊IgG(H+L)抗体(Zymad公司制，61-1620)、10％Block Ace、0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水中，在室温在缓缓振荡下反应1小时，再用含有0.1％吐温-20的磷酸缓冲食盐水在缓缓振荡下洗涤5次15分钟。随后，PVDF膜用Western BlotChemiluminescence Reagent Plus(第一化学公司经销NEN生命科学产品公司制。NEL 103)按照所附实验方案染色，在X-射线胶片(柯达公司制，CAT 1651454)上感光。感光后的胶片用FPM800(富士胶片公司制)显影。

结果，在琼脂二糖、琼脂六糖中任何一种的添加组中，都可以确认源于血红素加氧酶1蛋白质的带。而且，带的强度取决于琼脂二糖、琼脂六糖的浓度。此结果列于表9中。表中根据血红素加氧酶1蛋白质的带强度用+号表示。即，完全观察不到带者是-，而+-、+、++依次表示带的强度越来越强。

表9

试样	血红素加氧酶1蛋白质带的强度
		水(阴性对照)	-
最终浓度200μM琼脂二糖	++
		最终浓度100μM琼脂二糖	+
最终浓度50μM琼脂二糖	+-
		最终浓度200μM琼脂六糖	++
最终浓度100μM琼脂六糖	+
		最终浓度50μM琼脂六糖	+-
15-脱氧-Δ12，14-前列腺素J2(阳性对照)	+

产业上利用的可能性

本发明提供了可用于维持生物体体内平衡和治疗或预防糖尿病、风湿病、生活习惯病等疾病的医药组合物、功能性食品和功能性饮料。此外，本发明中使用的化合物显示出显著的致癌抑制作用，因而，也可用来作为致癌抑制用食品添加剂。

序列表自由文本

1号序列

为扩增环状加氧酶2mRNA而设计的低聚核苷酸引物。

2号序列

为扩增环状加氧酶2mRNA而设计的低聚核苷酸引物。

               序列表

<110>Takara Shuzo Co.，Ltd.

<120>医药组合物

<130>661697

<150>JP 11-11646

<151>1999-01-20

<150>JP 11-191808

<151>1999-07-06

<150>JP 11-270285

<151>1999-09-24

<160>2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<214>人工序列

<220>

<223>为扩增环状加氧酶2mRNA而设计的低聚核苷酸引物。

<400>1

GGCACTTGCA TTGATGGTGG CT                                               22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<214>人工序列

<220>

<223>为扩增环状加氧酶2mRNA而设计的低聚核苷酸引物。

<400>2

CAAGCAGTGG CAAGGCCTCC A                                                21

Claims (8)

1.从选自式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、

其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物，以及在还原末端含有该化合物并且其非还原末端为L-乳糖-6-硫酸以外的糖的可溶性糖化合物组成的一组中选择的至少一种化合物，在抗糖尿病组合物的制造中的用途。

2.权利要求1记载的用途，其中，糖化合物是含有从式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物中选择的至少一种化合物的物质在pH 7以下的酸性下的酸分解物和/或酶分解物。

3.权利要求2记载的用途，其中，含有从式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物中选择的至少一种化合物的物质是从琼脂、琼脂糖和角叉藻聚糖组成的一组中选择的至少一种物质。

4.权利要求1～3中任何一项记载的用途，其中，糖化合物是从琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖组成的一组中选择的至少一种糖化合物。

5.由以下化合物组成的一组中选择的至少一种化合物在制备改善糖尿病的症状或预防该疾病用的饮食品中的用途，所述的组由式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物的化合物，以及在还原末端含该化合物并且其非还原末端为L-乳糖-6-硫酸以外的糖的可溶性糖化合物组成。

6.权利要求5记载的用途，其中，糖化合物是含有从式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物中选择的至少一种化合物的物质在pH 7以下的酸性下的酸分解物和/或酶分解物。

7.权利要求6记载的用途，其中，含有从式I所示3，6-脱水吡喃半乳糖、其醛衍生物、其水合物、以及这些的2-O-甲基化衍生物和2-O-硫酸化衍生物中选择的至少一种化合物的物质是从琼脂、琼脂糖和角叉藻聚糖组成的一组中选择的至少一种物质。

8.权利要求5～7中任何一项记载的用途，其中，糖化合物是从琼脂二糖、琼脂四糖、琼脂六糖、琼脂八糖、κ-角叉藻二糖和β-D-吡喃半乳糖基-3，6-脱水-2-O-甲基-L-半乳糖组成的一组中选择的至少一种糖化合物。

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