JPWO2002029099A1 - 生理活性物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、種々の生理活性を有するＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する生理活性物質もしくは生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法、生体の恒常性維持に有効な、例えばストレスの緩和又は予防を目的とする遺伝子制御剤、並びに遺伝子の制御方法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、生理活性物質のスクリーニング方法、遺伝子制御剤並びに遺伝子の制御方法に関する。
背景技術
生物は、生活環境の変化等の外的要因、ウイルス、細菌感染等の内的要因により、様々なストレスを受ける。ストレスはそれ自身、生物の正常な生活を妨げる要因であるが、これがうまく回避されない場合や逆に過剰反応が起こった場合にはより重篤な障害、例えば疾病を引き起こすこととなる。
ストレスが負荷された状態、あるいはそこから疾病へと移行する状態においては生体内の種々の機能、要素が複合的に関与するが、そこには基本的には遺伝子の発現状態の変化が存在する。したがって、遺伝子レベルでの調節により、スムーズにストレスを回避することは可能なはずである。しかしながら、ストレスを受けている状態、並びにそれが回避される過程での遺伝子発現の調節の詳細は明らかではなく、上記のような遺伝子レベルの調節によるストレス回避手段は未だ確立されていない。
一方、アガロースから得ることのできるＬ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−１，５−ｅｐｏｘｙ−１αβ，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｓ−ｈｅｘａ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ、以下ＤＧＥと称す）は種々の生理活性を有しており、生体の恒常性維持に有用な化合物であることが知られている（国際公開第９９／６４４２４号パンフレット）。しかしながら、該化合物の遺伝子レベルでの作用機作は明らかにされていない。
本発明の目的は、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する生理活性物質もしくは生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法、生体の恒常性維持に有効な、例えばストレスの緩和又は予防を目的とする遺伝子制御剤、並びに遺伝子の制御方法を提供することにある。
発明の開示
本発明の第１の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）▲１▼被検物質、及び▲２▼下記（ｉ）に記載の化合物及び／又は下記（ｉｉ）に記載の化合物を、それぞれ生体に負荷する工程：
（ｉ）下記式（Ｉ）で表される化合物、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（式中、Ｘ及びＹは、Ｈ又はＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨの時、ＹはＨ、ＸがＨの時、ＹはＣＨ２ＯＨである）
（ｉｉ）下記式（ＩＩ）で表される３，６−アンヒドロガラクトース、そのアルデヒド体、その抱水体、並びにそれらの２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、及び／又は該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を▲１▼を負荷した場合と▲２▼を負荷した場合とで比較する工程、並びに
（３）少なくとも１つの遺伝子が、▲２▼を負荷した場合と実質的に同等の発現量の変化を示した被検物質を選択する工程、を包含する方法に関する。
本発明の第２の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）被検物質を生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量と当該負荷を行っていない場合の当該生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を両者で比較する工程、並びに
（３）下記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は下記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる被検物質を選択する工程：
Ａ群：
骨形成タンパク質−６〔ＢＭＰ−６（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１７１８）〕遺伝子、
ケモカインレセプター−１〔ＣＣＲ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１２９５）〕遺伝子、
肝細胞増殖因子〔ＨＧＦ（ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３２３）〕遺伝子、
Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１〔ＩＣＡＭ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００２０１）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ−１β（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２５３２）〕遺伝子、
インターロイキン−１６〔ＩＬ−１６（ジーンバンク登録番号：Ｍ９０３９１）〕遺伝子、
白血病阻害因子〔ＬＩＦ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２３０９）〕遺伝子、
オステオポンチン〔ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００５８２）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
ニューロピリン−１〔Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３８７３）〕遺伝子、
ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ６〔ＳＴＡＴ６（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０６７５７５）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡ：ＦＬＪ２２２９８ ｆｉｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＲＣ０４６３７（ジーンバンク登録番号：ＡＫ０２５９５１）を含む遺伝子、
Ｂ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔ＨＯ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２１３３）〕遺伝子、
チオレドキシンレダクターゼ−１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１０６６９７）遺伝子、
ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ〔ＳＵＩ１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０８３４４１）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＨＳＰＣ０１４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５９３２）〕遺伝子、
Ｃ群：
Ｎ−ｍｙｃ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ １〔ＮＤＲＧ１（ジーンバンク登録番号；ＮＭ ００６０９６）〕遺伝子、
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ〔ＡＤＡＲ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５８４１）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３ｂ，ｓｕｂｕｎｉｔ２〔ＳＦ３Ｂ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６８４２）〕遺伝子、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３〔ＩＬＦ３（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００４５１６）〕遺伝子、
ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ２〔ＶＡＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９５）〕遺伝子、及び
配列表の配列番号：１２に記載の塩基配列を含む遺伝子、
Ｄ群：
ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ １〔ＥＥＦ１Ａ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１４０２）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＩ７〔ＲＰＬ１７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８５）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２４〔ＲＰＬ２４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８６）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｒｇｉｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ２〔ＳＦＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３０１６）〕遺伝子、
ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ １〔ＴＰＴ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３２９５）〕遺伝子、
ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＵＱＣＲＢ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９４）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５ａ〔ＲＰＳ１５Ａ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１０１９）〕遺伝子、及び
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２７〔ＲＰＬ２７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８８）〕遺伝子、
Ｅ群：
インターロイキン−２レセプターα〔ＩＬ２ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０１０５７）〕遺伝子、
インターロイキン−６〔ＩＬ６（ジーンバンク登録番号：Ｘ０４４３０）〕遺伝子、
ＣＤ１６６（ジーンバンク登録番号：Ｙ１０１８３）遺伝子、
インターフェロン調節因子−１〔ＩＲＦ１（ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４５４）〕遺伝子、
インターロイキン−１５レセプターα〔ＩＬ１５ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｕ３１６２８）〕遺伝子、
Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−ｂ ｐ１０５サブユニット〔ＮＦＫＢ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ５８６０３）〕遺伝子、
カスパーゼ−１〔ＣＡＳＰ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ８７５０７）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ１Ｂ（ジーンバンク登録番号：Ｍ１５３３０）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
Ｇｒｏ１オンコジーン〔ＧＲ０１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４４８９）〕遺伝子、
インターロイキン−１α〔ＩＬ１Ａ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２８９８３）〕遺伝子、
インヒビンベータＡ〔ＩＮＨＢＡ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３６３４）〕遺伝子、
インターロイキン−７レセプター〔ＩＬ７Ｒ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２９６９６）〕遺伝子、
前駆Ｂ細胞コロニー増強因子〔ＰＢＥＦ（ジーンバンク登録番号：Ｕ０２０２０）〕遺伝子、
Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ〔ＬＡＲＣ（ジーンバンク登録番号：Ｕ６４１９７）〕遺伝子、及び
インターロイキン−８〔ＩＬ８（ジーンバンク登録番号：Ｍ２６３８３）〕遺伝子、
Ｆ群：
コロニー刺激因子−１レセプター〔ＣＳＦＩＲ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０３６６３）〕遺伝子、
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター−４〔ＣＸＣＲ４（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１４７２０４）〕遺伝子、及び
エンドグリン〔ＥＮＧ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００１１８）〕遺伝子、
Ｇ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔ＨＭＯＸ１（ジーンバンク登録番号：Ｚ８２２４４）〕遺伝子、
を包含する方法に関する。
本発明の第３の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）ストレスの生体への負荷、並びに被検物質とストレスの生体への負荷をそれぞれ行う工程、
（２）（１）の生体及びいずれの負荷も行っていない正常生体における遺伝子の発現量をそれぞれ測定する工程、並びに
（３）（２）により得られた遺伝子の発現量を（１）の生体と正常生体とで比較し、下記（ａ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現パターンを示す被検物質を選択する工程：
（ａ）前記のＡ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｂ）前記のＢ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに増加する、
（ｃ）前記のＣ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに減少する、
（ｄ）前記のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、
（ｅ）前記のＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｆ）前記のＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｇ）前記のＧ群の遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、を包含する方法に関する。
本発明の第３の発明において、生体に負荷するストレスがホルボールミリステートアセテート処理である場合、遺伝子の発現パターンは上記（ａ）〜（ｄ）が例示され、生体に負荷するストレスがリポポリサッカライド処理である場合、遺伝子の発現パターンは上記（ｅ）〜（ｇ）が例示される。
本発明の第１〜３の発明において、生体としては生物個体又は培養細胞が例示される。遺伝子の発現量としては、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量により測定される遺伝子の発現量が例示され、当該測定は、特にＤＮＡアレイを使用したハイブリダイゼーション法により行うのが好適である。また、本発明は、本発明の第１〜３の発明により得られうる物質も包含する。
本発明の第４の発明は、本発明の第１〜３の発明のスクリーニング方法に使用されるＤＮＡアレイに関し、上記Ａ〜Ｇ群記載の遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化されていることを特徴とするＤＮＡアレイに関する。
本発明の第５の発明は、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第６の発明は、ストレスの負荷された生体において、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第７の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した上記に示すＡ群及びＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第８の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した上記に示すＢ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第９の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した上記に示すＣ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第１０の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した上記に示すＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第５〜１０の発明において、含有される各々の化合物が本発明の第１〜３のいずれかの発明のスクリーニング方法によって得られた物質である遺伝子制御剤が例示される。また、本発明の第５〜１０の発明の遺伝子制御剤としては、ストレスの緩和、もしくは予防を目的とする遺伝子制御剤が例示される。
本発明の第１１の発明は、上記（ｉ）記載の化合物、上記（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有する組成物を生体に投与することにより、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法に関する。
本発明の第１２の発明は、上記（ｉ）記載の化合物、上記（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有する組成物を、ストレスが負荷された生体に投与することにより、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法に関する。
本発明の第１１及び１２の発明において、上記（ｉ）記載の化合物又は上記（ｉｉ）記載の化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、本発明の第１〜３の発明のいずれかのスクリーニング方法によって得られた物質が例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の一態様においては、上記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を使用する。当該化合物の一例としては、Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）が挙げられる。
該化合物は、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオース及び３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物を中性からアルカリの条件下で処理（維持）することにより得ることができる。また、当該化合物のｐＨ７未満での酸加水分解および／または酵素分解を行い、ついで得られた酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理（維持）することにより得ることができる。
なお、前記酵素分解としては、例えば、３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物、例えばアガロースのα−アガラーゼによる分解を挙げることができる。酵素分解反応を行うための条件は特に限定はなく、使用する酵素についての公知の条件に従えばよい。
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオース及び３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物のｐＨ７超のアルカリ処理において、当該化合物を溶解または懸濁するアルカリの種類に特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等の無機塩基、トリス、エチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基が使用可能である。アルカリの濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、処理温度も特に限定はないが、好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また処理時間も特に限定はないが、数秒〜数日に設定すればよい。アルカリの種類と濃度、処理時の温度及び時間は原料となる上記化合物の種類および目的とする式（Ｉ）で表される化合物の生成量により適宜選択すればよい。一般に、ｐＨ７超であれば良いが、低濃度のアルカリよりも高濃度のアルカリ、低温よりも高温を選択することにより式（Ｉ）で表される化合物の生成は速やかに進行する。
例えば、アガロビオース又はκ−カラビオースのｐＨ１１．５の水溶液を調製し、３７℃で５分間保持することにより、式（Ｉ）で表される化合物が生成する。
生成した式（Ｉ）で表される化合物を含有するアルカリ液は、目的に応じ中和して用いても良く、またｐＨ７未満の酸性溶液として使用しても良い。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物の精製手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、例えば、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等の精製方法を組合せて精製すればよい。
例えば、アガロビオースの中性からアルカリの条件下での処理物より式（Ｉ）で表される化合物のＸがＣＨ２ＯＨ、ＹがＨである化合物が精製され、κ−カラビオースの中性からアルカリでの条件下での処理物より、式（Ｉ）で表される化合物のＸがＨ、ＹがＣＨ２ＯＨである化合物が精製される。
また、式（Ｉ）で表される化合物の誘導体としては、生体において、当該化合物と実質的に同等の遺伝子発現パターンを示しうる限り特に限定はないが、例えば式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物（例えば、システイン、グルタチオン又はそれらの公知の誘導体）とを反応して得られる化合物を使用することができる。なお、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応して得られる化合物の製造方法としては国際公開第９９／６４４２４号パンフレットに記載の公知の方法を挙げることができる。
式（Ｉ）で表される化合物又はその誘導体の塩としては、医薬として許容される塩が好適であり、公知の方法にて変換することができる。
また、式（Ｉ）で表される化合物であるＤＧＥはアガロオリゴ糖が生体内に取り込まれた際に生成される化合物であることから、アガロオリゴ糖を生体に投与した場合、ＤＧＥと同様の生体反応を起こすことが予想されている〔Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．（Ｓｏｒｕｉ）４８：１３−１９，Ｍａｒｃｈ １０，２０００〕。よって、本発明においては式（Ｉ）で表される化合物の代わりに、生体に投与した場合に当該化合物が生成すると考えられる、上記式（ＩＩ）で表される３，６−アンヒドロガラクトース、そのアルデヒド体、その抱水体、並びにそれらの２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、及び／又は該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を使用することもできる（なお、３，６−アンヒドロガラクトースのアルデヒド体、抱水体、２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体については国際公開第００／４１５７９号パンフレット記載の化合物が例示される）。当該化合物の例としては、特に限定はないが、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖が例示される。
［１］本発明の生理活性物質のスクリーニング方法
上記の式（Ｉ）で表される化合物の１つであるＤＧＥは、生体の受けたダメージを緩和し、生体の恒常性維持を促進する作用を有する。ＤＧＥは前記のようなストレスを受けた生体において発現量の変化が見られる遺伝子の当該発現量を調節する活性、すなわち、遺伝子発現制御活性（もしくは作用）を有しており、この活性は生体内の各種遺伝子の発現制御を介することが知られている。さらに、ＤＧＥは種々の生理活性を有することが知られており、例えばアポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、一酸化窒素産生抑制活性等の抗酸化活性、抗病原微生物活性、抗変異原活性、α−グリコシダーゼ阻害活性、免疫調節作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、サイトカイン産生調節作用、抗リウマチ作用、抗糖尿病作用、滑膜細胞増殖抑制活性、熱ショックタンパク質産生誘導作用等が挙げられる。そして、このような生理活性はＤＧＥの遺伝子制御作用による遺伝子発現量の調節により発現されるものと考えられる。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法は、前記のような種々の生理活性が知られるＤＧＥの遺伝子制御作用に基づく遺伝子の発現量の変化を指標として、同様な遺伝子発現量の変化を少なくとも示しうるＤＧＥ以外の物質のスクリーニング方法を提供するものである。すなわち、生体内において、ＤＧＥと同様な遺伝子の発現パターンを少なくとも示しうる物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明により得られた物質はＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を示しうることから、例えばＤＧＥと同様な生理活性を有するものと推定される。したがって、当該化合物を用いて、例えば当該生理活性の発現が有効に寄与する疾患及び／又は症状（例えば、がん、炎症、アレルギー、糖尿病等の上記のＤＧＥの生理活性を要する疾患）の治療又は予防に有効な医薬、食品、飲料等を提供することが可能となる。
また、ＤＧＥの生理活性とは異なる未知の生理活性を有する物質等を得ることも可能であり、かかる観点から、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法は、生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法と捉えることもできる。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法においては、具体的には、下記工程；
（１）▲１▼被検物質、及び▲２▼前記（ｉ）に記載の化合物及び／又は前記（ｉｉ）に記載の化合物を、それぞれ生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を▲１▼を負荷した場合と▲２▼を負荷した場合とで比較する工程、並びに
（３）少なくとも１つの遺伝子が、▲２▼を負荷した場合と実質的に同等の発現量の変化を示した被検物質を選択する工程、により、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する物質を得ることができる。
なお、「実質的に同等の発現量の変化」とは、必ずしも発現量の程度において同等であることを意図するものではなく、少なくとも発現量の変化のパターンが同等であることを意図する。
すなわち、▲１▼被検物質を負荷、すなわち、投与するかもしくは摂取させた（以下において同様）生体由来の試料における遺伝子発現量を測定する。一方、▲２▼の化合物、例えば前記式（Ｉ）で表わされる化合物、例えばＤＧＥを負荷した生体由来の試料における遺伝子発現量を測定する。次いで各々の遺伝子発現量及び／又はその変化を比較し、被検物質とＤＧＥそれぞれの遺伝子発現制御作用が類似しているかどうかを判定する。遺伝子発現制御作用が類似している物質はＤＧＥと同様の生理活性を有している可能性が高く、ＤＧＥと同じ目的で使用できることが期待される。
上記のＤＧＥの有する遺伝子発現制御作用は、特に限定するものではないが、例えば、ＤＧＥを負荷した生体と当該負荷を行わない場合の当該生体（対照）との間での遺伝子発現状態（発現パターン）を比較することにより確認することができる。その際、両者間で発現量に差異を有する遺伝子はＤＧＥによる制御対象の遺伝子であると考えられる。なお、ＤＧＥの有する遺伝子発現制御作用は、後述する実施例１に記載のように、生体へのストレス負荷を介して確認することもできる。
なお、本明細書において、生体としては特に限定するものではないが、好適には生物個体（ヒトを除く）又は培養細胞を挙げることができる。例えば生物個体を使用する場合、該個体より適当な試料、例えば組織の一部や体液等を採取し、遺伝子発現状態を調べることができる。
また、本発明のスクリーニング方法において使用される被検物質には何ら限定はなく、天然由来のもの、人為的に合成されたもの、天然由来の物質を人為的に改変したもの等を使用することができる。これらの物質は単離されたもの、複数の物質を含有するもののいずれも使用することができ、例えば、適切な分離操作と本発明のスクリーニング方法とを組み合わせて有用な物質を精製、もしくは単離することも可能である。
また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、例えば前記（ｉ）記載の化合物又は（ｉｉ）記載の化合物と実質的に同等の生理活性を有する組成物、例えば植物、動物、担子菌又は微生物等からの天然由来の組成物から、その活性成分を特定することもできる。例えば、このような組成物を構成する化合物を被検物質として、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法を実施することにより、その活性成分を特定することもできる。
また、上記の本発明のスクリーニング方法によって得られる物質、すなわち、前記（ｉ）記載の化合物又は前記（ｉｉ）記載の化合物と同様な遺伝子制御活性を有する物質も本発明の範囲に包含される。当該物質は、被検物質を本発明のスクリーニング方法に供し、当該方法において定められた遺伝子制御活性を有するか否かを判定することにより得ることができる。また、当該物質としては、例えば植物、担子菌類由来の物質やそれらの誘導体が例示され、ここで使用される植物としては、様々な生理活性が知られている薬用植物や海藻類等が例示される。
また、それらに由来する物質としては、特に限定はないが、構成成分として糖を含有する物質、例えば、多糖類、その分解物又はそれらの誘導体が挙げられ、中でも分子量１００〜２０００程度の物質等が好適である。さらに、これらの内から本発明のスクリーニング方法によって対照として使用された物質（例えば、ＤＧＥ）以外の遺伝子制御活性をも有する物質を選択することができる。前記の、構成成分として糖を含有する物質としては、３，６−アンヒドロガラクトースを分子内に有する物質が特に好適である。なお、分解物、誘導体は、その元となる物質と、生体内において、実質的に同様な遺伝子の発現パターンを示しうるものである限り特に限定されない。
遺伝子発現状態の比較は公知の方法、例えば当該遺伝子産物（ポリペプチド）量の測定や当該遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量の測定により実施することができる。上記の目的からはｍＲＮＡ量を測定する方法が効率的であり、好適である。
例えば、ポリペプチド量の測定は、当該ポリペプチド又はその断片に特異的に結合しうる抗体を使用して行うのが好適である。当該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、さらに公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばＦａｂフラグメント、単鎖抗体等であってもよい。これらの抗体及び誘導体等は公知の方法に従って製造することができる（例えば、１９９２年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ参照）。また、ポリペプチド量の測定方法としては、例えば公知の酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等を挙げることができる。さらに、前記抗体等を、前記ポリペプチド量の測定方法における検出の容易化のために各種標識を行ってもよい。
ｍＲＮＡ量の測定方法には特に限定はなく、公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザン・ハイブリダイゼーション法、ドットブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロビーズ法等を使用することができる。微量の試料で多数の遺伝子の発現状態を調べることが可能であることから、上記の目的には、ＤＮＡアレイを使用する方法が特に好適である。
本明細書において「ＤＮＡアレイ」とは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上のあらかじめ定められた領域（位置）に固定されているものを指し、例えばＤＮＡチップと呼称されているものを包含する。また、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上に高密度に固定されているものはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる。
ＤＮＡアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。支持体の表面は、共有結合または非共有結合により一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡを固定化できるものであればいずれでもよく、支持体の表面に親水性又は疎水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はないが、例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有しているものが好適に使用できる。これらの官能基は、支持体自体の表面特性として存在していてもよいが、表面処理によって導入してもよい。このような表面処理物としては、例えば、ガラスをアミノアルキルシラン等の市販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したもの等が挙げられる。また、これらの処理を施したスライドガラスの一部は市販されている。
支持体上に固定化される遺伝子又はそのＤＮＡ断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型とした公知の核酸増幅法、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（国際公開第００／５６８７７号パンフレット記載）等によって増幅されたＤＮＡが挙げられ、かかる核酸増幅における反応条件は特に限定されるものではない。また、ＲＮＡを鋳型とした転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法あるいはＱβレプリカーゼ法により増幅されたＲＮＡを逆転写することにより得られるＤＮＡを用いることもできる。
支持体への固定化の操作は市販のＤＮＡアレイ作製装置、例えばアフィメトリックス社製のＤＮＡチップ作製装置を使用して行なうことができる。該装置を使用することにより、遺伝子が高密度に整列、固定化されたＤＮＡアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ）を作製することができる。
本発明で使用されるＤＮＡアレイとしては任意の遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が固定されたものを使用することができ、好ましくは、生体の恒常性維持に関連した機能を有するタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が固定されたアレイが使用される。また、各種の遺伝子の断片を固定化したＤＮＡマイクロアレイが市販されており（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ等、宝酒造社製）、これを使用してもよい。また、該ＤＮＡアレイに固定化される遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片の選択は、後述の実施例３に記載のＤＮＡマイクロビーズ法や、サブトラクション法、ディファレンシャルディスプレイ法等により、生体へのストレスの負荷、例えば生体の恒常性維持に支障をきたす薬剤、例えばホルボールミリステートアセテートやリポポリサッカライド等を負荷した生体と未負荷の生体とで発現量に変化が見られる遺伝子を選択することにより行うことができる。
このようなＤＮＡアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。例えば、試料中のｍＲＮＡを標識するか、もしくはｍＲＮＡを鋳型として標識されたｃＤＮＡを調製し、これとＤＮＡアレイの間でハイブリダイゼーションを実施することにより、試料中で転写されている複数のｍＲＮＡを同時に検出し、さらにその発現量を測定することができる。
ＤＧＥを負荷した場合と負荷していない場合の生体における遺伝子発現量の差は、例えば両場合における遺伝子の発現パターンを以下のようにして比較することにより調べることができる。
すなわち、ＤＧＥを負荷した生体由来の試料（ＤＧＥ負荷試料）中の核酸とＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション及びＤＧＥを負荷していない生体由来の試料（対照試料）中の核酸とＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションのそれぞれの結果を比較することにより、両者で発現量の異なる遺伝子を検出することができる。例えば、前記試料中の核酸を任意の方法で標識し、当該核酸とハイブリダイゼーションを行ったアレイについて、使用された標識に応じて適切なシグナルの検出を行い、アレイ上の各遺伝子のＤＧＥ負荷試料及び対照試料中の発現量を比較する。好ましくは、ＤＧＥ負荷試料と対照試料中の各々の核酸とをあらかじめ異なる方法で標識しておくことで、複数の標識、例えば２種類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍光アナライザーを用いて、ＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量との差を同じＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションにて比較することができる。すなわち、両者を当量混合してＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションを行うことで両者の遺伝子発現量の差をシグナルの色及び強度の違いとして検出することができる。その結果、得られたシグナルの強度に両者間で優位な差のある遺伝子はＤＧＥによる発現制御対象の遺伝子であると特定される。
より具体的には以下の工程によりＤＧＥ負荷試料と対照試料間での遺伝子発現量の差を調べることができる。
互いに比較しようとする生体由来の試料、例えば異なる処理を施された細胞よりｍＲＮＡを調製し、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識する。標識に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、２種類以上の蛍光物質を用いて、好適には２種類の蛍光物質を用いて、ＤＧＥ負荷試料、対照試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが望ましい。また、標識は試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を化学的に標識する方法の他、例えばｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成時、もしくはｃＤＮＡからの転写、増幅反応時に標識ヌクレオチドを共存させることによっても実施することができる。
次に、上記の標識核酸と、適当な遺伝子に対応する核酸又はその断片を固定化されたＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、その条件は使用するＤＮＡアレイや標識ｃＤＮＡに適したものを適宜選択すればよい。例えばモレキュラー・クローニング ア・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の条件で行なうことができる。
上記のハイブリダイゼーションによって得られた標識由来のシグナルを比較し、試料間でシグナルの強度に有意な差のある遺伝子を検出することができる。具体的には、上記の方法で標識された核酸試料とハイブリダイゼーションを行ったアレイについて放射能、蛍光、発光等のシグナル強度を専用測定器、例えばクロマトスキャナーもしくはイメージアナライザー等を用いて検出することによって、そのシグナル強度の差から、その発現量が有意に変化する遺伝子を検出することができる。標識の検出法は、用いられる標識物質の種類に応じて適切なものを選択すればよい。
各試料由来の核酸（ｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸）を互いに区別しうる標識物質で標識することにより、一度のハイブリダイゼーションで両試料中の遺伝子発現量の差を比較することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより、両試料中の遺伝子発現量を１枚のＤＮＡアレイ上で測定することができる。
こうして、異なる試料の間での多種類の遺伝子発現量を、微量の試料で比較することができる。
なお、ＤＧＥ負荷試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定するためには、両者のｍＲＮＡ量及び使用した蛍光物質間の強度差を補正する必要があるが、当該補正は比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子（好適にはハウスキーピング遺伝子）を用いて公知の方法により行うことができる。
また、本明細書において、遺伝子発現量の差が優位であると判定する場合とは、例えば、対照試料における遺伝子発現量に対するＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量の比、すなわち、相対発現比率（ＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量）が１．７以上もしくは０．６以下の場合である。ここで、相対発現比率が１．７以上の場合が発現量が増加した遺伝子であり、０．６以下の場合が発現量が減少した遺伝子であると判定する。
さらに、ＤＧＥ負荷試料と対照試料間における遺伝子発現量の差は、公知のＤＮＡマイクロビーズアレイ法により行うこともできる。当該方法によれば、発現量や、既知・未知であるに関わらず発現しうる遺伝子を全て解析可能である。
上記の方法によりＤＧＥを投与、もしくは摂取させた生体とＤＧＥを与えない対照との間の遺伝子発現状態を比較し、ＤＧＥによってその発現が制御されうる遺伝子を確認することができる。以上のようにして確認された、ＤＧＥがその遺伝子発現制御作用を及ぼしうる遺伝子としては、例えば、後述の表１〜３に示すＡ〜Ｇ群に記載の遺伝子が挙げられる。
生物は、生活環境の変化等の外的要因、ウイルス、細菌感染等の内的要因により、様々なストレスを受ける。ストレスとしては、例えば高温、低温環境、飢餓状態、化学物質への暴露等が例示される。ここで化学物質としては、例えばホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、オカダ酸等が挙げられる。中でもＴＰＡやＬＰＳは、生体に投与することで炎症を惹起させ、かかる作用を利用して人工的に炎症モデルを作製する目的で使用されている。
このようなストレスを受けた結果、生体内では、様々な遺伝子の発現が変化する。その中には、ストレスの結果、発現が誘導もしくは増強され、生体に悪影響を及ぼす遺伝子群（例えば、Ａ群及びＥ群の遺伝子）もあれば、ストレスの悪影響を取り除くために発現が誘導もしくは増強されるか、或いはストレスを受けていない場合と発現が同等である遺伝子群（例えば、Ｂ群及びＧ群の遺伝子）もある。ストレスを受け、Ａ群及びＥ群の遺伝子の発現が高い状態が生じ、その発現が低下しない状態が続くと、様々な疾患の発病につながると考えられる。従って、ストレスを受けた際にＡ群及びＥ群の遺伝子の発現が増加し難くなる状態にすることは様々な疾患の予防につながる。また、ストレスを受けた際に、増加したＡ群及びＥ群の遺伝子の発現をいち早く低下させることも、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながる。一方、Ｂ群及びＧ群の遺伝子は、ストレス状態を回避するために発現が増加する遺伝子群であり、ストレスを受けた際に、このような遺伝子群をより高発現にすることで、いち早くストレス状態を回避することが可能となり、ストレスが引き金となる様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながると考えられる。
また、ストレスの結果、ストレスの悪影響を取り除くために、発現が減少されるか、或いはストレスを受けていない場合と発現が同等である遺伝子群（例えば、Ｃ群及びＦ群の遺伝子）もあれば、ストレスの結果、発現が減少され、生体に悪影響を及ぼす遺伝子群（例えば、Ｄ群の遺伝子）もある。Ｃ群の遺伝子は、ストレス状態を回避するために発現が減少する遺伝子群であり、ストレスを受けた際に、このような遺伝子群の発現量をさらに抑えることで、いち早くストレス状態を回避することが可能となり、ストレスが引き金となる様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながると考えられる。一方、ストレスを受け、Ｄ群の遺伝子の発現が低い状態が生じ、その発現が増加しない状態が続くと、様々な疾患の発病につながると考えられる。従って、ストレスを受けた際にＤ群の遺伝子の発現が増加することは様々な疾患の予防につながる。また、ストレスを受けた際に、減少したＤ群の遺伝子の発現をいち早く増加させることも、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながる。
本発明により明らかとなった、ＤＧＥがその発現を抑制する（減少させる）Ａ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の遺伝子、及びＤＧＥがその発現を促進する（増加させる）Ｂ群、Ｄ群及びＧ群の遺伝子を表１〜３に示す。
被検物質について、上記のＤＧＥと同様にして遺伝子発現制御作用を調べ、これをＤＧＥのものと比較することによってＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する物質を選択することができる。なお、被検物質を負荷した場合とＤＧＥを負荷した場合での、遺伝子発現量の変化の比較、すなわち、発現パターンの比較においては少なくとも１つの遺伝子について比較すればよいが、より有用な物質を見出す観点からは、複数の遺伝子の発現パターンを比較することが好ましい。本発明を特に限定するものではないが、例えば、好ましくは２種以上の遺伝子、より好ましくは４種以上の遺伝子、さらに好ましくは７種以上の遺伝子の発現パターンを比較して所望の遺伝子制御活性を有する物質が選択される。
好適な態様としては、前述の表１〜３に示すＡ群〜Ｇ群から選択される少なくとも１つの遺伝子について比較を行えばよい。より好ましくは、Ａ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子とＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子（計２つ以上の遺伝子）、さらに好ましくはＡ群〜Ｇ群の各群より選択される少なくとも１つの遺伝子（計７つ以上の遺伝子）について発現パターンが比較される。
また、以上の知見をもとに、本発明により、以下のような本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の別の態様が提供される。すなわち、本発明により、下記工程；
（１）被検物質を生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量と当該負荷を行っていない場合の当該生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を両者で比較する工程、並びに
（３）表１〜３中のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる被検物質を選択する工程、を包含する生理活性物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法により、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する物質を簡便に得ることができる。
また、より詳細には以下のような本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の別の態様が提供される。すなわち、本発明により、下記工程；
（１）ストレスの生体への負荷、並びに被検物質とストレスの生体への負荷をそれぞれ行う工程、
（２）（１）の生体及びいずれの負荷も行っていない正常生体における遺伝子の発現量をそれぞれ測定する工程、並びに
（３）（２）により得られた遺伝子の発現量を（１）の生体と正常生体とで比較し、下記（ａ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現パターンを示す被検物質を選択する工程：
（ａ）上記のＡ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｂ）上記のＢ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに増加する、
（ｃ）上記のＣ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに減少する、
（ｄ）上記のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、
（ｅ）上記のＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｆ）上記のＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｇ）上記のＧ群の遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、を包含する生理活性物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法により、ＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する物質を簡便に得ることができる。
なお、上記の２つの別の態様において、被検物質の遺伝子発現制御作用は、上記のＤＧＥと同様の方法により調べることができる。また、ストレスの生体への負荷は、前記するような各種のストレスを生体に対して負荷することにより行われるが、好ましくは化学物質を用いて行うのが好適であり、中でも、ＴＰＡ（ホルボールミリステートアセテート）処理又はＬＰＳ（リポポリサッカライド）処理がより好適である。ここで、処理とは、投与又は摂取させることをいう。
ＴＰＡは発がんプロモーターとして知られており、その作用としては直接的な変異作用の他、生体の炎症誘導による発がん作用が知られている。すなわちＴＰＡはマクロファージ等の炎症細胞からＮＯ、プロスタグランジンＥ２等、炎症性メディエーターの遊離を惹起する。
ＬＰＳはサイトカイン誘導因子であり、生体に対し、発熱、致死効果、血圧低下等の様々な影響を及ぼすが、この作用はＬＰＳそれ自体の直接作用ではなく、ＬＰＳによりマクロファージを中心とする宿主細胞が産生する炎症性サイトカインなどの作用によるものである。
上記Ａ〜Ｄ群はストレスとしてＴＰＡを用いた際に遺伝子の変動が確認された遺伝子群であり、また上記Ｅ〜Ｇ群はＬＰＳを用いた際に遺伝子の変動が確認された遺伝子群である。ＤＧＥはＴＰＡやＬＰＳにより誘発される炎症を抑制することから、すなわち、上記工程においてのストレスとしてＴＰＡ処理を用いた場合に上記遺伝子の発現パターン（ａ）〜（ｄ）を示す化合物を選択すれば、ＴＰＡにより誘発される炎症と同様のメカニズムで誘発される炎症を治療又は予防する効果を有する化合物を得られることが期待でき、また、ストレスとしてＬＰＳ処理を用いた場合に上記遺伝子の発現パターン（ｅ）〜（ｇ）を示す化合物を選択することにより、ＬＰＳにより誘発される炎症と同様のメカニズムで誘発される炎症を治療又は予防する効果を有する化合物を得られることが期待できる。
なお、遺伝子発現制御作用が多少異なる物質であっても、当該物質はＤＧＥの有する生理活性のうちのいくつかを有している可能性がある。このような物質もＤＧＥの代替物質として目的に応じて使用することは可能である。
また、別の一態様として、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法に好適に使用されるキットも提供しうる。当該キットは、例えば表１〜３に示すＡ群〜Ｇ群から選択される少なくとも１つの遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブ、或いは当該遺伝子にコードされるポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を少なくとも含んでおればよい。
［２］本発明のＤＮＡアレイ
また本発明は、前記生理活性物質のスクリーニング方法に使用されるＤＮＡアレイであって、前記のＡ〜Ｇ群の遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化ＤＮＡアレイを提供する。本発明のＤＮＡアレイは、上記のＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化されたアレイである。すなわち、各々の遺伝子に対応するＤＮＡ又はその断片の位置が支持体上においてあらかじめ決定されており、このようなアレイを使用した場合、検出されたシグナルの位置からこのシグナルがどの遺伝子のＤＮＡ又はその断片に由来するのかを直ちに知ることができる。該アレイは上記［１］の生理活性物質のスクリーニング、ならびにＤＧＥの投与もしくは摂取が有効な疾病における遺伝子的な病態解析に有用である。
上記ＤＮＡアレイに固定される遺伝子又はそのＤＮＡ断片としては、生体へのストレスやＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子又はそのＤＮＡ断片であるか、或いはそれらを含有するものであれば特に限定はなく、例えば後述の実施例３に記載のＤＮＡマイクロビース法を用いて、固定化される遺伝子又はそのＤＮＡ断片を選択することができる。また、生体へのストレスやＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子以外の遺伝子、例えば陰性対照として使用される遺伝子等を含有してもよい。また、その製造は公知の方法にしたがって行えばよく、例えば、上記［１］に記載されたＤＮＡアレイ作製装置を使用することができる。
本発明のＤＮＡアレイにおいては、遺伝子又はそのＤＮＡ断片は一本鎖、二本鎖のどちらが固定されていてもよい。また、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。また、その製法にも特に限定はなく、化学的に合成したもの、天然由来のもの、酵素的に合成したもの、それらの組み合わせであってもよい。なお、遺伝子又はそのＤＮＡ断片の鎖長としては、特に限定されるものではないが、例えば、約２０塩基長〜約１キロ塩基長であることが望ましく、また、該鎖長より短い或いは長いものであっても、任意の被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションにおいて特異的にハイブリダイズするものであればよい。
アレイの支持体、ＤＮＡ固定化密度にも特に限定はなく、目的や固定化する遺伝子数に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、ＤＮＡアレイの支持体としては前記するようなものを挙げることができ、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常、スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。また、多数の遺伝子を固定化する場合や微量の試料に適したアレイを作製したい場合には、支持体に高密度で遺伝子を固定したマイクロアレイが好適に使用できる。当該マイクロアレイとしては、１００ドット／ｃｍ２以上の密度で核酸、特にＤＮＡが固定化されたものが好適である。また、その形状にも特に限定はなく、平板状、円盤状、テープ状等、適宜選択することができる。
［３］本発明の遺伝子制御剤、遺伝子制御方法
また本発明は、生体における遺伝子発現の制御方法に関し、特に限定するものではないが、ストレスを受けた生体において発現量が変化した遺伝子について、当該遺伝子の発現を制御（調節）し、生体の恒常性を保つ方法、ならびに該方法のための遺伝子制御剤を提供する。
例えば前記のようなストレスを受けた生体における影響は、該生体中の遺伝子の発現を適切に制御することによって解消することが可能であると考えられる。そのためには、当該遺伝子、例えば表１〜３に挙げられた遺伝子を制御しうる化合物もしくは当該化合物を有効成分として含有する組成物、すなわち、本発明により提供される遺伝子制御剤の使用が有効である。従って、当該遺伝子制御剤は、特にストレスの緩和又は予防用として好適である。
上記の遺伝子制御剤に有効成分として含有させることのできる化合物としては、例えば、ＤＧＥ、ＤＧＥの誘導体及び／又はそれらの塩を使用することができ、さらにＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する化合物、その誘導体及び／又はそれらの塩を使用することもできる。なお、当該化合物の誘導体等は、前記式（Ｉ）で表される化合物の誘導体等と同様にして製造することができる。ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、上記［１］に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を好適に使用することができる。
当該遺伝子制御剤は公知の医薬の製造方法に従って調製することができる。例えば、前記有効成分を薬学的に許容されうる公知の液状又は固体状の担体と混合し、さらに所望により、公知の溶剤、分散剤、乳化剤、安定化剤、滑沢剤等を加えて、液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、又は錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤等の固形剤とすることができる。
前記担体は、本発明の遺伝子制御剤の投与形態及び剤型に応じて選択することができる。経口剤とする場合は、例えばデンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース等の利用が好適である。一方、非経口剤とする場合は、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、ダイズ油、プロピレングリコール等の利用が好適である。
本発明の遺伝子制御剤における前記有効成分の含有量は、遺伝子制御剤の投与形態、投与方法などにより変化し一概には決定できないが、本発明の所望の効果が得られうる量で前記有効成分を投与しうるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の遺伝子制御剤は、剤型に応じた適当な投与経路により、経口的にも非経口的にも投与できる。非経口的に投与する場合、例えば注射剤として、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。その投与量も特に限定されるものではなく、例えば剤型、投与方法、使用目的、投与対象である患者の年齢、体重、症状に応じて、本発明の所望の効果が得られうる範囲で適宜決定すればよい。
本発明の遺伝子制御剤としては具体的には以下のようなものが例示される。
（１）表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（２）ストレスの負荷された生体において、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（３）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、表１〜３に記載のＡ群及びＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（４）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、表１〜３に記載のＢ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（５）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、表１〜３に記載のＣ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、並びに
（６）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、表１〜３に記載のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤。
さらに、本発明により、
前記（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を生体に投与することにより、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる遺伝子の制御方法、並びに
前記記載の（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を、ストレスの負荷された生体に投与することにより、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる遺伝子の制御方法、が提供される。
ここで、生体とは、哺乳動物、中でもヒトである。また、少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、上記［１］に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を好適に使用することができる。
かかる遺伝子の制御方法によれば、表１〜３に示した遺伝子の発現を好適に制御することができ、生体の受けたストレスの緩和および／または回避が可能となる。
なお、有効成分として投与する化合物もしくは当該化合物を含む組成物の投与方法、投与量等は、例えば前記遺伝子制御剤と同様でよい。
本発明の遺伝子の制御方法により、ストレスに起因する生体に悪影響を及ぼす遺伝子群の発現を抑制するとともに、ストレス状態の回避に関与する遺伝子群の発現を増強し、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止を行うことができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）ＲＮＡの調製
ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製、１２−７０２Ｆ）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、好中球様に分化誘導した。
上記により得られた細胞を遠心により回収し、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し１０ｃｍシャーレに１０ｍＬずつ加えた。各シャーレに１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１０μＬの１００μｇ／ｍＬホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製、１３１３９−０１９）ジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して６時間培養後さらに１０μＬの１００μｇ／ｍＬ ＴＰＡジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１００μＬの水を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。なお、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの説明書に従い調製した。
（２）ｃＤＮＡの合成
上記により得られた各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５μｇと１００ｐｇのλ ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ−Ａ（宝酒造社製、ＴＸ８０２）を、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（宝酒造社製、ＴＸ８０７）と、１ｍＭ ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＵＴＰあるいはＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア製、ＰＡ５３０２２（Ｃｙ３）、ＰＡ５５０２２（Ｃｙ５））を用い、キットの説明書に従って蛍光標識されたｃＤＮＡの合成反応と精製を行った。蛍光標識したＤＮＡ溶液を表４の組み合わせで混合し，クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行い、２μＬの５×Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ Ｉ（Ｈｕｍａｎ）（宝酒造社製、ＴＸ８０８）を添加してエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡは１０μＬのハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ溶液を０．２２μｍのフィルターに通したもの）に溶解し、ハイブリダイゼーションに供した。
（３）ハイブリダイゼーション
カバーガラス（２２×２２ｍｍ）の上に１０μＬのプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、１ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ溶液を０．２２μｍのフィルターに通したもの）を滴下し、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ（ｖｅｒ．１．０）（宝酒造社製、Ｘ１０４）のアレイＤＮＡ面が下になるようにしてカバーガラスの上に、気泡が入らないようにかぶせた。チップのアレイＤＮＡ面が上になるようにひっくり返し、ペーパーボンド（コクヨ社製、タ−１００）をカバーガラスの周辺に滴下して溶液を密閉し室温で２時間放置することでプレハイブリダイゼーションを行った。チップを２×ＳＳＣ中に移しペーパーボンドおよびカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ続いて０．２×ＳＳＣ中で洗浄後、遠心により水分を飛ばして乾燥した。
上記のハイブリダイゼーション溶液に溶解した蛍光標識ＤＮＡ溶液を９５℃で２分間加熱して変性させた後、遠心して上清をカバーガラス（２２×２２ｍｍ）の上に滴下し、上記のように処理をしたチップのアレイＤＮＡ面が下になるようにしてカバーガラスの上に、気泡が入らないようにかぶせた。チップのアレイＤＮＡ面が上になるようにひっくり返し、ペーパーボンドをカバーガラスの周辺に滴下して溶液を密閉した。このチップを湿箱に入れた後、６５℃の恒温槽で１６時間保温した。チップを２×ＳＳＣ中に移しペーパーボンドおよびカバーガラスを外し、５５℃の２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で３０分間で２回洗浄、続いて６５℃の２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳで５分間洗浄し、室温の０．０５×ＳＳＣで５分間洗浄後、遠心により水分を飛ばして乾燥した。
（４）解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造社製、ＧＭ２０５）により上記チップの各スポットの蛍光シグナルを読み取った。この画像データをもとにＩｍａＧｅｎｅ（宝酒造社製、ＢＤ００１）により各スポットの蛍光シグナルを定量した。この結果、ＴＰＡ添加区分でいくつかの遺伝子発現の変動が確認でき、これに対してＤＧＥ＋ＴＰＡ添加区分で、この変動をさらに上下させていることが確認できた。すなわち、ＤＧＥはいくつかの遺伝子についてＴＰＡによる遺伝子の変動を修飾する作用を有することが確認できた。その結果をまとめたものを表５に示す。表５はＴＰＡによって変動のあった遺伝子のうち、ＤＧＥによってその変動が修飾されたものをまとめたものであり、Ａ−１群はＤＧＥによってその発現が抑制された遺伝子、Ｂ−１群はＤＧＥによってその発現が促進された遺伝子である。
実施例２
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ヒト健常人ドナーより４００ｍＬ採血を実施した。採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層後５００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製）を用いて洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）／１０％ジメチルスルホキシドからなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。実験時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出し各実験に供した。
（２）プラスチック接着性単球の分離
５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン（以上バイオウイタカー社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩ培地と略す）に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＭＣを懸濁後、１００ｍｍシャーレ（旭テクノグラス社製）に１５ｍＬずつまき、３７℃で、５％のＣＯ２湿式インキュベーター内にて１．５時間インキュベートした。その後、非接着性の細胞を吸引除去し、各ウエルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄し、１０ｍＬの５ＨＲＰＭＩ培地を加えてプラスチック接着性の単球を得た。
（３）ＲＮＡの調製
実施例２−（２）により得られた各シャーレに１０μＬの１μｇ／ｍＬリポポリサッカイライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１０μＬの２０ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間培養後さらに１０μＬの１μｇ／ｍＬＬＰＳ水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１０μＬの水を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。なお、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの取扱説明書に従い調製した。
（４）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は実施例１−（２）記載の方法に準じて行った。ただし、蛍光標識したＤＮＡ溶液の組み合わせは表６にしたがって行った。
（５）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは実施例１−（３）記載の方法に準じて行った。ただし、チップはＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ（ｖｅｒ．２．０）（宝酒造社製、Ｘ１０４）を用いた。
（６）解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造社製）により上記チップの各スポットの蛍光シグナルを読み取った。この画像データをもとにＩｍａＧｅｎｅ（宝酒造社製、ＢＤ００１）により各スポットの蛍光シグナルを定量した。この結果、いくつかの遺伝子についてＬＰＳ添加区分で発現の増加が確認でき、これに対してＤＧＥを添加することでこの増加を抑制していることが確認できた。また、いくつかの遺伝子についてＬＰＳ添加区分で発現の変動が認められないものの、ＤＧＥ＋ＬＰＳ添加区分で発現の増加および下降が確認できた。その結果をまとめたものを表７に示す。表７はＬＰＳによって発現が増加した遺伝子のうちＤＧＥによってその増加が抑制されたもの（Ｅ群）、ＬＰＳによって発現が変動しないもののＤＧＥ＋ＬＰＳで発現が下降したもの（Ｆ群）および増加したもの（Ｇ群）をまとめたものである。
実施例３ ＤＮＡマイクロビーズの作製と遺伝子の選択
プロシーディングズ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズオブ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９７巻、第１６６５〜１６７０頁、（２０００年）（以下、文献１と呼ぶ。）記載の方法に準じて、以下に示すようにＤＮＡマイクロビーズの作製を行った。
（１）ｃＤＮＡの合成
ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシドをそれぞれ含有するＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、上記細胞を好中球様に分化誘導した。得られた細胞を遠心により回収し、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁したうえ、この懸濁液を１０ｃｍシャーレ２枚に１０ｍｌずつ加えた。一方のシャーレに１００μｌの水（Ａ）、もう一方のシャーレに１０μｌの１００μｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製）ジメチルスルホキシド溶液（Ｂ）を添加してそれぞれ４時間培養した。それぞれのシャーレより回収した（Ａ）、（Ｂ）の細胞のそれぞれよりトリゾール試薬（ギブコ社製）を用いて全ＲＮＡを調製し、次いでオリゴテックスＴＭ−ｄＴ３０（宝酒造社製）を用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡ ２．５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。その際、逆転写に用いるプライマーとして、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の５’ビオチン標識プライマーを使用した。
こうして得られたｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理し、セファロースＣＬ４Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いてゲルろ過精製した後、エタノール沈殿を行った。沈殿として回収されたｃＤＮＡを２００μｌのＤｐｎＩＩ緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）に溶解し、制限酵素ＤｐｎＩＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。この消化物よりストレプトアビジンマグネットビーズ（ダイナール社製）を用いてｃＤＮＡの３’側部分を回収した後、２０μｌの１０×ＮＥＢ＃２緩衝液（ニューイングランド バイオラブズ社製）を加えて全量を２００μｌに調整し、制限酵素ＢｓｍＢＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。反応液についてフェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、沈殿を滅菌水１０．５μｌに溶解し、これを３’側ｃＤＮＡ溶液として以下の実験に用いた。
（２）３’側ｃＤＮＡとアンチタグ付きマイクロビーズのハイブリダイゼーション
実施例３−（１）で合成した（Ａ）および（Ｂ）由来の３’側ｃＤＮＡ溶液１μｌを文献１記載のタグベクターｐＬＣＶ２ ２００ｎｇにそれぞれ挿入して１４万〜１８万クローンからなるプラスミドプール６個を調製した。配列表の配列番号：２に記載の塩基配列の５’ビオチン標識プライマー、および配列表の配列番号：３に記載の塩基配列の５’ＦＡＭ標識プライマーを１００μｌの反応液１本あたりそれぞれ１００ｐｍｏｌ使用し、反応液１本あたり上記の各プラスミドプール１２５ｎｇを鋳型としたＰＣＲを、各プラスミドプールあたり４８本行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。
９４℃−３分保持
９４℃−３０秒、６７℃−３分を１サイクルとした８サイクル
９４℃−３０秒、６４℃−３分を１サイクルとした２２サイクル
６７℃−３分保持
反応終了後、ＰＣＲ反応液を各プールごとに１本に集め、フェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、得られた沈殿を滅菌水１２００μｌに溶解した。ここに１０×ＮＥＢ＃４緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）１８０μｌを加え、全量を１８００μｌにした後、制限酵素ＰａｃＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。反応液よりウルトラリンクＳＡレジン（ピアス社製）に吸着する画分を除いて得られるｃＤＮＡ溶液についてフェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、沈殿を滅菌水１２００μｌに溶解した。ここに１０×ＮＥＢ＃２緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）１８０μｌを加え、全量を１８００μｌに調整してＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）処理を行った。この際基質としてｄＧＴＰのみを加えることによりタグ部分の１本鎖化を行った。
この１本鎖タグを持つｃＤＮＡの各プールごと３００μｇを文献１記載の１億４４００万個のアンチタグ付きマイクロビーズと混合し、４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１．２％ デキストラン硫酸）中、７２℃で振盪しながら３日間ハイブリダイゼーションを行った。遠心分離によってマイクロビーズを集め、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁して振盪しながら６４〜７０℃で３０分間洗浄を行った。この洗浄操作を数回繰り返した後に６プール分の洗浄済みｃＤＮＡ付きマイクロビーズを集め、ＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション社製）を用いてマイクロビーズのＦＡＭの蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）を測定し、蛍光強度の大きい方から１％のマイクロビーズを分取した。以上の操作によって、ｃＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合した約６００万個のマイクロビーズを得た。
（３）ＤＮＡマイクロビーズ懸濁液の調製
実施例３−（２）で得られた、ｃＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合したマイクロビーズのうち約２００万個を１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．４ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰに懸濁し、２０ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して１２℃で２時間反応させた。反応はプロナーゼ処理によって停止し、次いで反応液よりマイクロビーズを遠心分離によって集め、１００μｌのＤｐｎＩＩ緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）に懸濁してＤｐｎＩＩ（ニューイングランド バイオラブズ社製）で消化した。遠心分離によってマイクロビーズを集め、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０３３ｍＭ ｄＧＴＰ、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、１０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ ラージフラグメント（宝酒造社製）を加えて２５℃で１５分間反応させた。遠心分離によってマイクロビーズを集めて１００μｌのライゲーション緩衝液（宝酒造社製）に懸濁後、予め配列表の配列番号：４、配列番号：５に示される塩基配列のＤＮＡをアニールさせて作製したアダプター０．１ｎｍｏｌを加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いてライゲーション反応を行った。マイクロビーズを遠心分離によって集め、ビーズストリッピング溶液（１５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に懸濁して室温で１０分間反応させた。反応液より遠心分離により上清を除いた後、マイクロビーズを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁して、サンプル１およびサンプル２由来のＤＮＡマイクロビーズ懸濁液を得た。
（４）プローブの作製
実施例３−（１）で調製した（Ａ）および（Ｂ）由来の３’側ｃＤＮＡ １μｌを文献１記載のプローブベクターｐＬＣＶ ２００ｎｇにそれぞれ挿入して８００万〜１０００万クローンからなるプラスミドを調製した。このプラスミドのそれぞれ１０μｇにユニバーサル緩衝液Ｈ（宝酒造社製）２０μｌを加えて全量を２００μｌにした後、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）にて消化した。（Ａ）由来のＳａｕ３ＡＩ消化済プラスミド１．２μｇを鋳型に配列表の配列番号：６に示される塩基配列の５’ＦＡＭ標識プライマー２ｎｍｏｌを用いて、また、（Ｂ）由来のＳａｕ３ＡＩ消化済プラスミド２．４μｇを鋳型に配列表の配列番号：７に示される塩基配列の５’Ｃｙ５標識プライマー４ｎｍｏｌを用いて、それぞれリニアＰＣＲを行った。リニアＰＣＲは、以下の条件で行った。
９５℃−５分保持
９５℃−３０秒、６４℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとした２５サイクル
７２℃−１０分保持
リニアＰＣＲ後の反応液のそれぞれより、キアクイックＰＣＲピュリフィケーションキット（キアゲン社製）を用いて増幅ＤＮＡを精製し、エタノール沈殿を行った後、滅菌水２１μｌに溶解し、サンプル１由来ＦＡＭ蛍光標識プローブおよびサンプル２由来Ｃｙ５蛍光標識プローブを得た。
（５）ＤＮＡマイクロビーズとのハイブリダイゼーション
実施例３−（３）で調製したサンプル１由来のＤＮＡマイクロビーズとサンプル２由来のＤＮＡマイクロビーズを、それぞれ約３６万個ずつ混合し、このビーズに（４）で作製したサンプル１由来ＦＡＭ蛍光標識プローブおよびサンプル２由来Ｃｙ５蛍光標識プローブを各５μｇを加え、５０μｌの緩衝液（４×ＳＳＣ、２５％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ）中で振盪しながら６５℃で終夜ハイブリダイゼーションを行った。遠心分離によって集めたマイクロビーズを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃で３０分間洗浄後、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間洗浄し、遠心分離にてＤＮＡマイクロビーズを集め、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、ハイブリダイゼーション済ＤＮＡマイクロビーズを得た。
（６）ソーティング
実施例３−（５）で得たハイブリダイゼーション済ＤＮＡマイクロビーズを、ＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション社製）を用いたソーティングに供した。ＤＮＡマイクロビーズについてＦＡＭの蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）およびＣｙ５の蛍光強度（励起波長：６４７ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ）を測定し、ＦＡＭの蛍光強度の強いＤＮＡマイクロビーズを３６９２個（ビーズ懸濁液Ａ）、Ｃｙ５の蛍光強度の強いＤＮＡマイクロビーズを３３４９個（ビーズ懸濁液Ｂ）分取した。
（７）ＰＣＲおよびＤＮＡ塩基配列決定
実施例３−（６）で分取したビーズ懸濁液ＡおよびＢを鋳型に、配列表の配列番号：８および配列番号：９にそれぞれ塩基配列を示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。１００μｌの反応液中に、鋳型ビーズを２００個とプライマーを４０ｐｍｏｌずつ加え、ビーズ懸濁液Ａ，Ｂそれぞれについて５本ずつの反応を行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。
９５℃−５分保持
９５℃−３０秒、６４℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとした２５サイクル
７２℃−１０分保持
ＰＣＲ反応液を懸濁液Ａ，Ｂごとに１本にまとめ、それぞれの１μｌをクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）と混合してライゲーションを行い、クローニングした。ビーズ懸濁液Ａ由来のコロニー９６０個と、ビーズ懸濁液Ｂ由来のコロニー９６０個の合計１９２０個のコロニーからプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った。得られた塩基配列の中で、以下に示すどちらかの条件を満たすものを選択した。
条件１：インサート配列の長さが、４０ベース以上のもの。
条件２：インサート配列の長さが、３０ベース以上、４０ベース以下で、ｐｏｌｙＡ配列を持たないもの。
複数のプラスミドにおいて同じインサート配列が出現した場合は、どれか１個のプラスミドを選択し、ＤＮＡマイクロアレイ用の鋳型プラスミドとして７４０個のプラスミドを得た。
実施例４ ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現解析
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例３において取得した７４０個のクローンのプラスミドを鋳型として、配列表の配列番号：１０と１１に記載の配列を有するプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行った。ついで、当該増幅産物をエタノール沈殿により精製後、０．３μｇ／μｌになるように１×ＳｏｌｕｔｉｏｎＴ（宝酒造社製）に溶解し、これをスポッティング溶液とした。当該スポッティング溶液をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤー（アフィメトリックス社製）を用いて、アミノ化スライドガラスであるＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子社製）にスポットした。スポット後のスライドを３７℃、湿度９０％にて１時間保持した後、６０ｍＪ／ｃｍ２のエネルギーでＵＶクロスリンクした。さらに、０．２％ ＳＤＳで１回、次いで蒸留水で２回洗浄した後、２．７５ｇの無水コハク酸と１６２．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドン、１５ｍｌの１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるブロッキング溶液に２０分間浸し、遊離のアミノ基をブロックした。次いで、蒸留水で２回洗浄した後、沸騰水中にて２分間熱変性し、氷温の１００％エタノールで急冷した。その後、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離によりスライドガラスを乾燥させ、以下の実験に用いた。
（２）細胞の調製
ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ バイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製、１２−７０２Ｆ）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、好中球様に分化誘導した。得られた細胞を遠心により回収し、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し１０ｃｍシャーレに１０ｍＬずつ加えた。各シャーレに１００μｌの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分、１０μＬの１００μｇ／ｍＬホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製、１３１３９−０１９）ジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分、１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して６時間培養後さらに１０μＬの１００μｇ／ｍＬ ＴＰＡジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１００μＬの水を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分を設定した。
（３）検出用標識ｃＤＮＡの調製とハイブリダイゼーション
実施例４−（２）で調製したＨＬ−６０細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）を用い、それぞれのキットのプロトコールに従いＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを調製した。次いで、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ）（宝酒造社製）を用いてキットのプロトコールに従い、それぞれＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ１．０μｇを鋳型として、表８に示したサンプルＲＮＡの組み合わせでＣｙ３とＣｙ５で標識されたｃＤＮＡを調製し、混合した。
次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（宝酒造社製）の取扱説明書に従い、実施例４−（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイと，上記のＣｙ３標識ｃＤＮＡとＣｙ５標識ｃＤＮＡの混合物（４種類）とのハイブリダイゼーションを行い、洗浄・乾燥の操作を行った。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍ）とＣｙ５（励起波長：６３５ｎｍ、検出波長：６６０ｎｍ）の蛍光画像を取得した。その後、各スポットのスポット領域のシグナル強度の平均値と、スポットの周辺領域（以下、バックグラウンド領域と称す。）のシグナル強度の平均値と標準偏差を、画像定量解析ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．１（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて定量・算出した。
（４）各クローンのグループ化
発現比率から統計解析により各クローンのグループ化を行うには、信頼性の低いデータと有意な変動を示さないクローンのデータを除去する必要がある。よって、以下の手順によりグループ化に供するクローンの絞り込みを行った。すなわち、実施例４−（３）で得られたバックグラウンド領域のシグナル強度の平均値と標準偏差から、以下の数式によりシグナル強度の閾値を求めた。
シグナル強度の閾値＝バックグラウンド領域のシグナル強度の平均値＋２×（バ
ックグラウンド領域のシグナル強度の標準偏差）
各スポット領域のシグナル強度の平均値が上記の閾値より大きいか否かで、当該スポットシグナルの各チャンネルにおける有意性を判断した。次いで、４つのサンプル全てで、Ｃｙ３とＣｙ５の両方のチャンネルで有効シグナルを持たないスポットのクローンを除外した。さらに、Ｃｙ３のシグナルに対するＣｙ５のシグナル強度の比率（以下、発現比率と称す。）を算出し、すべてのサンプルにおいて当該比率が２分の１より大きくかつ２より小さいクローンについて、変動を示さなかったクローンとして以後の解析から除外した。以上の絞り込みの結果、７４０個のクローンの中から２２７個のクローンが選択された。
次に、上記で選択された２２７クローンについて、ＴＰＡおよびＤＧＥの処理により発現が変動した、すなわちサンプル番号３あるいは４の発現比率が０．５５以下もしくは１．８以上の値を有するクローンについて、ＤＧＥ処理による変動の関係から以下の４つのグループに分けることができた。
Ａ−３群 ＴＰＡ処理により発現が増加し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が低下するクローン。
Ｂ−３群 ＴＰＡ処理により発現が増加し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が増加するクローン。
Ｃ−３群 ＴＰＡ処理により発現が低下し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が低下するクローン。
Ｄ−３群 ＴＰＡ処理により発現が低下し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が増加するクローン。
これらのクローンについて相同性検索を行った。これらの結果から、４つのグループに分けられたクローンに対して相同性の得られた塩基配列名とそのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を表９及び１０に示す。なお、表９及び１０において相同性が認められたクローンについてはＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列名を、相同性が認められなかったクローンについては、配列表の配列番号を示した。
これらの結果から、それぞれＡ−３群、Ｂ−３群、Ｃ−３群、Ｄ−３群に分類されたクローンは表１１に示す遺伝子の部分配列であることが推定された。なお、表１１中のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．において、遺伝子の全塩基配列が明らかにされていないものについては、表９及び１０記載の塩基配列のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示した。
配列表フリーテキスト
配列番号：１の配列は、全ｍＲＮＡについての逆転写用プライマーの配列である。
配列番号：２の配列は、タグベクターｐＬＣＶ２の一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：３の配列は、タグベクターｐＬＣＶ２の一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：４の配列は、オリゴヌクレオチドアダプターの配列である。
配列番号：５の配列は、オリゴヌクレオチドアダプターの配列である。
配列番号：６の配列は、プローブベクターｐＬＣＶの一部を増幅するためのリニアＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：７の配列は、プローブベクターｐＬＣＶの一部を増幅するためのリニアＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：８の配列は、ＤＮＡマイクロビーズ上のｃＤＮＡについてのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：９の配列は、ＤＮＡマイクロビーズ上のｃＤＮＡについてのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：１０の配列は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：１１の配列は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
産業上の利用可能性
本発明は、種々の生理活性を有するＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する生理活性物質もしくは生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法、生体の恒常性維持に有効な、例えばストレスの緩和又は予防を目的とする遺伝子制御剤、並びに遺伝子の制御方法を提供する。本発明により、例えば、ＤＧＥの有する各種生理活性の発現が有効に働く疾患又は症状の治療又は予防効果が期待できる。
【配列表】
本発明は、生理活性物質のスクリーニング方法、遺伝子制御剤並びに遺伝子の制御方法に関する。
背景技術
生物は、生活環境の変化等の外的要因、ウイルス、細菌感染等の内的要因により、様々なストレスを受ける。ストレスはそれ自身、生物の正常な生活を妨げる要因であるが、これがうまく回避されない場合や逆に過剰反応が起こった場合にはより重篤な障害、例えば疾病を引き起こすこととなる。
ストレスが負荷された状態、あるいはそこから疾病へと移行する状態においては生体内の種々の機能、要素が複合的に関与するが、そこには基本的には遺伝子の発現状態の変化が存在する。したがって、遺伝子レベルでの調節により、スムーズにストレスを回避することは可能なはずである。しかしながら、ストレスを受けている状態、並びにそれが回避される過程での遺伝子発現の調節の詳細は明らかではなく、上記のような遺伝子レベルの調節によるストレス回避手段は未だ確立されていない。
一方、アガロースから得ることのできるＬ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（Ｌ−ｇｌｙｃｅｒｏ−１，５−ｅｐｏｘｙ−１αβ，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｓ−ｈｅｘａ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ、以下ＤＧＥと称す）は種々の生理活性を有しており、生体の恒常性維持に有用な化合物であることが知られている（国際公開第９９／６４４２４号パンフレット）。しかしながら、該化合物の遺伝子レベルでの作用機作は明らかにされていない。
本発明の目的は、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する生理活性物質もしくは生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法、生体の恒常性維持に有効な、例えばストレスの緩和又は予防を目的とする遺伝子制御剤、並びに遺伝子の制御方法を提供することにある。
発明の開示
本発明の第１の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）▲１▼被検物質、及び▲２▼下記（ｉ）に記載の化合物及び／又は下記（ｉｉ）に記載の化合物を、それぞれ生体に負荷する工程：
（ｉ）下記式（Ｉ）で表される化合物、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（ｉｉ）下記式（ＩＩ）で表される３，６−アンヒドロガラクトース、そのアルデヒド体、その抱水体、並びにそれらの２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、及び／又は該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（３）少なくとも１つの遺伝子が、▲２▼を負荷した場合と実質的に同等の発現量の変化を示した被検物質を選択する工程、を包含する方法に関する。
本発明の第２の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）被検物質を生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量と当該負荷を行っていない場合の当該生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を両者で比較する工程、並びに
（３）下記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は下記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる被検物質を選択する工程：
Ａ群：
骨形成タンパク質−６〔ＢＭＰ−６（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１７１８）〕遺伝子、
ケモカインレセプター−１〔ＣＣＲ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１２９５）〕遺伝子、
肝細胞増殖因子〔ＨＧＦ（ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３２３）〕遺伝子、
Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１〔ＩＣＡＭ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００２０１）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ−１β（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２５３２）〕遺伝子、
インターロイキン−１６〔ＩＬ−１６（ジーンバンク登録番号：Ｍ９０３９１）〕遺伝子、
白血病阻害因子〔ＬＩＦ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２３０９）〕遺伝子、
オステオポンチン〔ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００５８２）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
ニューロピリン−１〔Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３８７３）〕遺伝子、
ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ６〔ＳＴＡＴ６（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０６７５７５）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡ：ＦＬＪ２２２９８ ｆｉｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＲＣ０４６３７（ジーンバンク登録番号：ＡＫ０２５９５１）を含む遺伝子、
Ｂ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔ＨＯ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２１３３）〕遺伝子、
チオレドキシンレダクターゼ−１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１０６６９７）遺伝子、
ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ〔ＳＵＩ１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０８３４４１）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＨＳＰＣ０１４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５９３２）〕遺伝子、
Ｃ群：
Ｎ−ｍｙｃ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ １〔ＮＤＲＧ１（ジーンバンク登録番号；ＮＭ ００６０９６）〕遺伝子、
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ〔ＡＤＡＲ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５８４１）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３ｂ，ｓｕｂｕｎｉｔ２〔ＳＦ３Ｂ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６８４２）〕遺伝子、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３〔ＩＬＦ３（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００４５１６）〕遺伝子、
ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ２〔ＶＡＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９５）〕遺伝子、及び
配列表の配列番号：１２に記載の塩基配列を含む遺伝子、
Ｄ群：
ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ １〔ＥＥＦ１Ａ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１４０２）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＩ７〔ＲＰＬ１７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８５）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２４〔ＲＰＬ２４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８６）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｒｇｉｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ２〔ＳＦＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３０１６）〕遺伝子、
ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ １〔ＴＰＴ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３２９５）〕遺伝子、
ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＵＱＣＲＢ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９４）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５ａ〔ＲＰＳ１５Ａ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１０１９）〕遺伝子、及び
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２７〔ＲＰＬ２７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８８）〕遺伝子、
Ｅ群：
インターロイキン−２レセプターα〔ＩＬ２ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０１０５７）〕遺伝子、
インターロイキン−６〔ＩＬ６（ジーンバンク登録番号：Ｘ０４４３０）〕遺伝子、
ＣＤ１６６（ジーンバンク登録番号：Ｙ１０１８３）遺伝子、
インターフェロン調節因子−１〔ＩＲＦ１（ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４５４）〕遺伝子、
インターロイキン−１５レセプターα〔ＩＬ１５ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｕ３１６２８）〕遺伝子、
Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−ｂ ｐ１０５サブユニット〔ＮＦＫＢ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ５８６０３）〕遺伝子、
カスパーゼ−１〔ＣＡＳＰ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ８７５０７）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ１Ｂ（ジーンバンク登録番号：Ｍ１５３３０）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
Ｇｒｏ１オンコジーン〔ＧＲ０１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４４８９）〕遺伝子、
インターロイキン−１α〔ＩＬ１Ａ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２８９８３）〕遺伝子、
インヒビンベータＡ〔ＩＮＨＢＡ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３６３４）〕遺伝子、
インターロイキン−７レセプター〔ＩＬ７Ｒ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２９６９６）〕遺伝子、
前駆Ｂ細胞コロニー増強因子〔ＰＢＥＦ（ジーンバンク登録番号：Ｕ０２０２０）〕遺伝子、
Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ〔ＬＡＲＣ（ジーンバンク登録番号：Ｕ６４１９７）〕遺伝子、及び
インターロイキン−８〔ＩＬ８（ジーンバンク登録番号：Ｍ２６３８３）〕遺伝子、
Ｆ群：
コロニー刺激因子−１レセプター〔ＣＳＦＩＲ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０３６６３）〕遺伝子、
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター−４〔ＣＸＣＲ４（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１４７２０４）〕遺伝子、及び
エンドグリン〔ＥＮＧ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００１１８）〕遺伝子、
Ｇ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔ＨＭＯＸ１（ジーンバンク登録番号：Ｚ８２２４４）〕遺伝子、
を包含する方法に関する。
本発明の第３の発明は、生理活性物質のスクリーニング方法であって、下記工程；
（１）ストレスの生体への負荷、並びに被検物質とストレスの生体への負荷をそれぞれ行う工程、
（２）（１）の生体及びいずれの負荷も行っていない正常生体における遺伝子の発現量をそれぞれ測定する工程、並びに
（３）（２）により得られた遺伝子の発現量を（１）の生体と正常生体とで比較し、下記（ａ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現パターンを示す被検物質を選択する工程：
（ａ）前記のＡ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｂ）前記のＢ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに増加する、
（ｃ）前記のＣ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに減少する、
（ｄ）前記のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、
（ｅ）前記のＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｆ）前記のＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｇ）前記のＧ群の遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、を包含する方法に関する。
本発明の第３の発明において、生体に負荷するストレスがホルボールミリステートアセテート処理である場合、遺伝子の発現パターンは上記（ａ）〜（ｄ）が例示され、生体に負荷するストレスがリポポリサッカライド処理である場合、遺伝子の発現パターンは上記（ｅ）〜（ｇ）が例示される。
本発明の第１〜３の発明において、生体としては生物個体又は培養細胞が例示される。遺伝子の発現量としては、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量により測定される遺伝子の発現量が例示され、当該測定は、特にＤＮＡアレイを使用したハイブリダイゼーション法により行うのが好適である。また、本発明は、本発明の第１〜３の発明により得られうる物質も包含する。
本発明の第４の発明は、本発明の第１〜３の発明のスクリーニング方法に使用されるＤＮＡアレイに関し、上記Ａ〜Ｇ群記載の遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化されていることを特徴とするＤＮＡアレイに関する。
本発明の第５の発明は、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第６の発明は、ストレスの負荷された生体において、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第７の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した上記に示すＡ群及びＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第８の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した上記に示すＢ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第９の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した上記に示すＣ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第１０の発明は、ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した上記に示すＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有することを特徴とする遺伝子制御剤に関する。
本発明の第５〜１０の発明において、含有される各々の化合物が本発明の第１〜３のいずれかの発明のスクリーニング方法によって得られた物質である遺伝子制御剤が例示される。また、本発明の第５〜１０の発明の遺伝子制御剤としては、ストレスの緩和、もしくは予防を目的とする遺伝子制御剤が例示される。
本発明の第１１の発明は、上記（ｉ）記載の化合物、上記（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有する組成物を生体に投与することにより、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法に関する。
本発明の第１２の発明は、上記（ｉ）記載の化合物、上記（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有する組成物を、ストレスが負荷された生体に投与することにより、上記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は上記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法に関する。
本発明の第１１及び１２の発明において、上記（ｉ）記載の化合物又は上記（ｉｉ）記載の化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、本発明の第１〜３の発明のいずれかのスクリーニング方法によって得られた物質が例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の一態様においては、上記式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を使用する。当該化合物の一例としては、Ｌ−グリセロ−１，５−エポキシ−１αβ，６−ジヒドロキシ−シス−ヘキサ−３−エン−２−オン（ＤＧＥ）が挙げられる。
該化合物は、還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオース及び３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物を中性からアルカリの条件下で処理（維持）することにより得ることができる。また、当該化合物のｐＨ７未満での酸加水分解および／または酵素分解を行い、ついで得られた酸分解物および／または酵素分解物を中性からアルカリの条件下で処理（維持）することにより得ることができる。
なお、前記酵素分解としては、例えば、３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物、例えばアガロースのα−アガラーゼによる分解を挙げることができる。酵素分解反応を行うための条件は特に限定はなく、使用する酵素についての公知の条件に従えばよい。
還元末端に３，６−アンヒドロガラクトースを有する化合物、例えば、アガロビオース、κ−カラビオース及び３，６−アンヒドロガラクトースを還元末端に有する化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物のｐＨ７超のアルカリ処理において、当該化合物を溶解または懸濁するアルカリの種類に特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等の無機塩基、トリス、エチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基が使用可能である。アルカリの濃度も特に限定はないが、好ましくは０．０００１〜５規定、より好ましくは０．００１〜１規定の濃度で使用可能である。また、処理温度も特に限定はないが、好ましくは０〜２００℃、より好ましくは２０〜１３０℃に設定すればよい。また処理時間も特に限定はないが、数秒〜数日に設定すればよい。アルカリの種類と濃度、処理時の温度及び時間は原料となる上記化合物の種類および目的とする式（Ｉ）で表される化合物の生成量により適宜選択すればよい。一般に、ｐＨ７超であれば良いが、低濃度のアルカリよりも高濃度のアルカリ、低温よりも高温を選択することにより式（Ｉ）で表される化合物の生成は速やかに進行する。
例えば、アガロビオース又はκ−カラビオースのｐＨ１１．５の水溶液を調製し、３７℃で５分間保持することにより、式（Ｉ）で表される化合物が生成する。
生成した式（Ｉ）で表される化合物を含有するアルカリ液は、目的に応じ中和して用いても良く、またｐＨ７未満の酸性溶液として使用しても良い。
本発明の式（Ｉ）で表される化合物の精製手段としては、化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、例えば、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等の精製方法を組合せて精製すればよい。
例えば、アガロビオースの中性からアルカリの条件下での処理物より式（Ｉ）で表される化合物のＸがＣＨ２ＯＨ、ＹがＨである化合物が精製され、κ−カラビオースの中性からアルカリでの条件下での処理物より、式（Ｉ）で表される化合物のＸがＨ、ＹがＣＨ２ＯＨである化合物が精製される。
また、式（Ｉ）で表される化合物の誘導体としては、生体において、当該化合物と実質的に同等の遺伝子発現パターンを示しうる限り特に限定はないが、例えば式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物（例えば、システイン、グルタチオン又はそれらの公知の誘導体）とを反応して得られる化合物を使用することができる。なお、式（Ｉ）で表される化合物とＳＨ基含有化合物とを反応して得られる化合物の製造方法としては国際公開第９９／６４４２４号パンフレットに記載の公知の方法を挙げることができる。
式（Ｉ）で表される化合物又はその誘導体の塩としては、医薬として許容される塩が好適であり、公知の方法にて変換することができる。
また、式（Ｉ）で表される化合物であるＤＧＥはアガロオリゴ糖が生体内に取り込まれた際に生成される化合物であることから、アガロオリゴ糖を生体に投与した場合、ＤＧＥと同様の生体反応を起こすことが予想されている〔Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．（Ｓｏｒｕｉ）４８：１３−１９，Ｍａｒｃｈ １０，２０００〕。よって、本発明においては式（Ｉ）で表される化合物の代わりに、生体に投与した場合に当該化合物が生成すると考えられる、上記式（ＩＩ）で表される３，６−アンヒドロガラクトース、そのアルデヒド体、その抱水体、並びにそれらの２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、及び／又は該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を使用することもできる（なお、３，６−アンヒドロガラクトースのアルデヒド体、抱水体、２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体については国際公開第００／４１５７９号パンフレット記載の化合物が例示される）。当該化合物の例としては、特に限定はないが、例えば、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース等のアガロオリゴ糖が例示される。
［１］本発明の生理活性物質のスクリーニング方法
上記の式（Ｉ）で表される化合物の１つであるＤＧＥは、生体の受けたダメージを緩和し、生体の恒常性維持を促進する作用を有する。ＤＧＥは前記のようなストレスを受けた生体において発現量の変化が見られる遺伝子の当該発現量を調節する活性、すなわち、遺伝子発現制御活性（もしくは作用）を有しており、この活性は生体内の各種遺伝子の発現制御を介することが知られている。さらに、ＤＧＥは種々の生理活性を有することが知られており、例えばアポトーシス誘発活性、制がん活性、活性酸素産生抑制活性、過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、一酸化窒素産生抑制活性等の抗酸化活性、抗病原微生物活性、抗変異原活性、α−グリコシダーゼ阻害活性、免疫調節作用、プロスタグランジン合成抑制作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、サイトカイン産生調節作用、抗リウマチ作用、抗糖尿病作用、滑膜細胞増殖抑制活性、熱ショックタンパク質産生誘導作用等が挙げられる。そして、このような生理活性はＤＧＥの遺伝子制御作用による遺伝子発現量の調節により発現されるものと考えられる。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法は、前記のような種々の生理活性が知られるＤＧＥの遺伝子制御作用に基づく遺伝子の発現量の変化を指標として、同様な遺伝子発現量の変化を少なくとも示しうるＤＧＥ以外の物質のスクリーニング方法を提供するものである。すなわち、生体内において、ＤＧＥと同様な遺伝子の発現パターンを少なくとも示しうる物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明により得られた物質はＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を示しうることから、例えばＤＧＥと同様な生理活性を有するものと推定される。したがって、当該化合物を用いて、例えば当該生理活性の発現が有効に寄与する疾患及び／又は症状（例えば、がん、炎症、アレルギー、糖尿病等の上記のＤＧＥの生理活性を要する疾患）の治療又は予防に有効な医薬、食品、飲料等を提供することが可能となる。
また、ＤＧＥの生理活性とは異なる未知の生理活性を有する物質等を得ることも可能であり、かかる観点から、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法は、生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法と捉えることもできる。
本発明の生理活性物質のスクリーニング方法においては、具体的には、下記工程；
（１）▲１▼被検物質、及び▲２▼前記（ｉ）に記載の化合物及び／又は前記（ｉｉ）に記載の化合物を、それぞれ生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を▲１▼を負荷した場合と▲２▼を負荷した場合とで比較する工程、並びに
（３）少なくとも１つの遺伝子が、▲２▼を負荷した場合と実質的に同等の発現量の変化を示した被検物質を選択する工程、により、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する物質を得ることができる。
なお、「実質的に同等の発現量の変化」とは、必ずしも発現量の程度において同等であることを意図するものではなく、少なくとも発現量の変化のパターンが同等であることを意図する。
すなわち、▲１▼被検物質を負荷、すなわち、投与するかもしくは摂取させた（以下において同様）生体由来の試料における遺伝子発現量を測定する。一方、▲２▼の化合物、例えば前記式（Ｉ）で表わされる化合物、例えばＤＧＥを負荷した生体由来の試料における遺伝子発現量を測定する。次いで各々の遺伝子発現量及び／又はその変化を比較し、被検物質とＤＧＥそれぞれの遺伝子発現制御作用が類似しているかどうかを判定する。遺伝子発現制御作用が類似している物質はＤＧＥと同様の生理活性を有している可能性が高く、ＤＧＥと同じ目的で使用できることが期待される。
上記のＤＧＥの有する遺伝子発現制御作用は、特に限定するものではないが、例えば、ＤＧＥを負荷した生体と当該負荷を行わない場合の当該生体（対照）との間での遺伝子発現状態（発現パターン）を比較することにより確認することができる。その際、両者間で発現量に差異を有する遺伝子はＤＧＥによる制御対象の遺伝子であると考えられる。なお、ＤＧＥの有する遺伝子発現制御作用は、後述する実施例１に記載のように、生体へのストレス負荷を介して確認することもできる。
なお、本明細書において、生体としては特に限定するものではないが、好適には生物個体（ヒトを除く）又は培養細胞を挙げることができる。例えば生物個体を使用する場合、該個体より適当な試料、例えば組織の一部や体液等を採取し、遺伝子発現状態を調べることができる。
また、本発明のスクリーニング方法において使用される被検物質には何ら限定はなく、天然由来のもの、人為的に合成されたもの、天然由来の物質を人為的に改変したもの等を使用することができる。これらの物質は単離されたもの、複数の物質を含有するもののいずれも使用することができ、例えば、適切な分離操作と本発明のスクリーニング方法とを組み合わせて有用な物質を精製、もしくは単離することも可能である。
また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、例えば前記（ｉ）記載の化合物又は（ｉｉ）記載の化合物と実質的に同等の生理活性を有する組成物、例えば植物、動物、担子菌又は微生物等からの天然由来の組成物から、その活性成分を特定することもできる。例えば、このような組成物を構成する化合物を被検物質として、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法を実施することにより、その活性成分を特定することもできる。
また、上記の本発明のスクリーニング方法によって得られる物質、すなわち、前記（ｉ）記載の化合物又は前記（ｉｉ）記載の化合物と同様な遺伝子制御活性を有する物質も本発明の範囲に包含される。当該物質は、被検物質を本発明のスクリーニング方法に供し、当該方法において定められた遺伝子制御活性を有するか否かを判定することにより得ることができる。また、当該物質としては、例えば植物、担子菌類由来の物質やそれらの誘導体が例示され、ここで使用される植物としては、様々な生理活性が知られている薬用植物や海藻類等が例示される。
また、それらに由来する物質としては、特に限定はないが、構成成分として糖を含有する物質、例えば、多糖類、その分解物又はそれらの誘導体が挙げられ、中でも分子量１００〜２０００程度の物質等が好適である。さらに、これらの内から本発明のスクリーニング方法によって対照として使用された物質（例えば、ＤＧＥ）以外の遺伝子制御活性をも有する物質を選択することができる。前記の、構成成分として糖を含有する物質としては、３，６−アンヒドロガラクトースを分子内に有する物質が特に好適である。なお、分解物、誘導体は、その元となる物質と、生体内において、実質的に同様な遺伝子の発現パターンを示しうるものである限り特に限定されない。
遺伝子発現状態の比較は公知の方法、例えば当該遺伝子産物（ポリペプチド）量の測定や当該遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量の測定により実施することができる。上記の目的からはｍＲＮＡ量を測定する方法が効率的であり、好適である。
例えば、ポリペプチド量の測定は、当該ポリペプチド又はその断片に特異的に結合しうる抗体を使用して行うのが好適である。当該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、さらに公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばＦａｂフラグメント、単鎖抗体等であってもよい。これらの抗体及び誘導体等は公知の方法に従って製造することができる（例えば、１９９２年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ参照）。また、ポリペプチド量の測定方法としては、例えば公知の酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等を挙げることができる。さらに、前記抗体等を、前記ポリペプチド量の測定方法における検出の容易化のために各種標識を行ってもよい。
ｍＲＮＡ量の測定方法には特に限定はなく、公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザン・ハイブリダイゼーション法、ドットブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロビーズ法等を使用することができる。微量の試料で多数の遺伝子の発現状態を調べることが可能であることから、上記の目的には、ＤＮＡアレイを使用する方法が特に好適である。
本明細書において「ＤＮＡアレイ」とは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上のあらかじめ定められた領域（位置）に固定されているものを指し、例えばＤＮＡチップと呼称されているものを包含する。また、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上に高密度に固定されているものはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる。
ＤＮＡアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。支持体の表面は、共有結合または非共有結合により一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡを固定化できるものであればいずれでもよく、支持体の表面に親水性又は疎水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はないが、例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有しているものが好適に使用できる。これらの官能基は、支持体自体の表面特性として存在していてもよいが、表面処理によって導入してもよい。このような表面処理物としては、例えば、ガラスをアミノアルキルシラン等の市販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したもの等が挙げられる。また、これらの処理を施したスライドガラスの一部は市販されている。
支持体上に固定化される遺伝子又はそのＤＮＡ断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型とした公知の核酸増幅法、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法（国際公開第００／５６８７７号パンフレット記載）等によって増幅されたＤＮＡが挙げられ、かかる核酸増幅における反応条件は特に限定されるものではない。また、ＲＮＡを鋳型とした転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法あるいはＱβレプリカーゼ法により増幅されたＲＮＡを逆転写することにより得られるＤＮＡを用いることもできる。
支持体への固定化の操作は市販のＤＮＡアレイ作製装置、例えばアフィメトリックス社製のＤＮＡチップ作製装置を使用して行なうことができる。該装置を使用することにより、遺伝子が高密度に整列、固定化されたＤＮＡアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ）を作製することができる。
本発明で使用されるＤＮＡアレイとしては任意の遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が固定されたものを使用することができ、好ましくは、生体の恒常性維持に関連した機能を有するタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が固定されたアレイが使用される。また、各種の遺伝子の断片を固定化したＤＮＡマイクロアレイが市販されており（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ等、宝酒造社製）、これを使用してもよい。また、該ＤＮＡアレイに固定化される遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片の選択は、後述の実施例３に記載のＤＮＡマイクロビーズ法や、サブトラクション法、ディファレンシャルディスプレイ法等により、生体へのストレスの負荷、例えば生体の恒常性維持に支障をきたす薬剤、例えばホルボールミリステートアセテートやリポポリサッカライド等を負荷した生体と未負荷の生体とで発現量に変化が見られる遺伝子を選択することにより行うことができる。
このようなＤＮＡアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。例えば、試料中のｍＲＮＡを標識するか、もしくはｍＲＮＡを鋳型として標識されたｃＤＮＡを調製し、これとＤＮＡアレイの間でハイブリダイゼーションを実施することにより、試料中で転写されている複数のｍＲＮＡを同時に検出し、さらにその発現量を測定することができる。
ＤＧＥを負荷した場合と負荷していない場合の生体における遺伝子発現量の差は、例えば両場合における遺伝子の発現パターンを以下のようにして比較することにより調べることができる。
すなわち、ＤＧＥを負荷した生体由来の試料（ＤＧＥ負荷試料）中の核酸とＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション及びＤＧＥを負荷していない生体由来の試料（対照試料）中の核酸とＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションのそれぞれの結果を比較することにより、両者で発現量の異なる遺伝子を検出することができる。例えば、前記試料中の核酸を任意の方法で標識し、当該核酸とハイブリダイゼーションを行ったアレイについて、使用された標識に応じて適切なシグナルの検出を行い、アレイ上の各遺伝子のＤＧＥ負荷試料及び対照試料中の発現量を比較する。好ましくは、ＤＧＥ負荷試料と対照試料中の各々の核酸とをあらかじめ異なる方法で標識しておくことで、複数の標識、例えば２種類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍光アナライザーを用いて、ＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量との差を同じＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションにて比較することができる。すなわち、両者を当量混合してＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションを行うことで両者の遺伝子発現量の差をシグナルの色及び強度の違いとして検出することができる。その結果、得られたシグナルの強度に両者間で優位な差のある遺伝子はＤＧＥによる発現制御対象の遺伝子であると特定される。
より具体的には以下の工程によりＤＧＥ負荷試料と対照試料間での遺伝子発現量の差を調べることができる。
互いに比較しようとする生体由来の試料、例えば異なる処理を施された細胞よりｍＲＮＡを調製し、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識する。標識に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、２種類以上の蛍光物質を用いて、好適には２種類の蛍光物質を用いて、ＤＧＥ負荷試料、対照試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが望ましい。また、標識は試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を化学的に標識する方法の他、例えばｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成時、もしくはｃＤＮＡからの転写、増幅反応時に標識ヌクレオチドを共存させることによっても実施することができる。
次に、上記の標識核酸と、適当な遺伝子に対応する核酸又はその断片を固定化されたＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、その条件は使用するＤＮＡアレイや標識ｃＤＮＡに適したものを適宜選択すればよい。例えばモレキュラー・クローニング ア・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の条件で行なうことができる。
上記のハイブリダイゼーションによって得られた標識由来のシグナルを比較し、試料間でシグナルの強度に有意な差のある遺伝子を検出することができる。具体的には、上記の方法で標識された核酸試料とハイブリダイゼーションを行ったアレイについて放射能、蛍光、発光等のシグナル強度を専用測定器、例えばクロマトスキャナーもしくはイメージアナライザー等を用いて検出することによって、そのシグナル強度の差から、その発現量が有意に変化する遺伝子を検出することができる。標識の検出法は、用いられる標識物質の種類に応じて適切なものを選択すればよい。
各試料由来の核酸（ｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸）を互いに区別しうる標識物質で標識することにより、一度のハイブリダイゼーションで両試料中の遺伝子発現量の差を比較することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより、両試料中の遺伝子発現量を１枚のＤＮＡアレイ上で測定することができる。
こうして、異なる試料の間での多種類の遺伝子発現量を、微量の試料で比較することができる。
なお、ＤＧＥ負荷試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定するためには、両者のｍＲＮＡ量及び使用した蛍光物質間の強度差を補正する必要があるが、当該補正は比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子（好適にはハウスキーピング遺伝子）を用いて公知の方法により行うことができる。
また、本明細書において、遺伝子発現量の差が優位であると判定する場合とは、例えば、対照試料における遺伝子発現量に対するＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量の比、すなわち、相対発現比率（ＤＧＥ負荷試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量）が１．７以上もしくは０．６以下の場合である。ここで、相対発現比率が１．７以上の場合が発現量が増加した遺伝子であり、０．６以下の場合が発現量が減少した遺伝子であると判定する。
さらに、ＤＧＥ負荷試料と対照試料間における遺伝子発現量の差は、公知のＤＮＡマイクロビーズアレイ法により行うこともできる。当該方法によれば、発現量や、既知・未知であるに関わらず発現しうる遺伝子を全て解析可能である。
上記の方法によりＤＧＥを投与、もしくは摂取させた生体とＤＧＥを与えない対照との間の遺伝子発現状態を比較し、ＤＧＥによってその発現が制御されうる遺伝子を確認することができる。以上のようにして確認された、ＤＧＥがその遺伝子発現制御作用を及ぼしうる遺伝子としては、例えば、後述の表１〜３に示すＡ〜Ｇ群に記載の遺伝子が挙げられる。
生物は、生活環境の変化等の外的要因、ウイルス、細菌感染等の内的要因により、様々なストレスを受ける。ストレスとしては、例えば高温、低温環境、飢餓状態、化学物質への暴露等が例示される。ここで化学物質としては、例えばホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、オカダ酸等が挙げられる。中でもＴＰＡやＬＰＳは、生体に投与することで炎症を惹起させ、かかる作用を利用して人工的に炎症モデルを作製する目的で使用されている。
このようなストレスを受けた結果、生体内では、様々な遺伝子の発現が変化する。その中には、ストレスの結果、発現が誘導もしくは増強され、生体に悪影響を及ぼす遺伝子群（例えば、Ａ群及びＥ群の遺伝子）もあれば、ストレスの悪影響を取り除くために発現が誘導もしくは増強されるか、或いはストレスを受けていない場合と発現が同等である遺伝子群（例えば、Ｂ群及びＧ群の遺伝子）もある。ストレスを受け、Ａ群及びＥ群の遺伝子の発現が高い状態が生じ、その発現が低下しない状態が続くと、様々な疾患の発病につながると考えられる。従って、ストレスを受けた際にＡ群及びＥ群の遺伝子の発現が増加し難くなる状態にすることは様々な疾患の予防につながる。また、ストレスを受けた際に、増加したＡ群及びＥ群の遺伝子の発現をいち早く低下させることも、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながる。一方、Ｂ群及びＧ群の遺伝子は、ストレス状態を回避するために発現が増加する遺伝子群であり、ストレスを受けた際に、このような遺伝子群をより高発現にすることで、いち早くストレス状態を回避することが可能となり、ストレスが引き金となる様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながると考えられる。
また、ストレスの結果、ストレスの悪影響を取り除くために、発現が減少されるか、或いはストレスを受けていない場合と発現が同等である遺伝子群（例えば、Ｃ群及びＦ群の遺伝子）もあれば、ストレスの結果、発現が減少され、生体に悪影響を及ぼす遺伝子群（例えば、Ｄ群の遺伝子）もある。Ｃ群の遺伝子は、ストレス状態を回避するために発現が減少する遺伝子群であり、ストレスを受けた際に、このような遺伝子群の発現量をさらに抑えることで、いち早くストレス状態を回避することが可能となり、ストレスが引き金となる様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながると考えられる。一方、ストレスを受け、Ｄ群の遺伝子の発現が低い状態が生じ、その発現が増加しない状態が続くと、様々な疾患の発病につながると考えられる。従って、ストレスを受けた際にＤ群の遺伝子の発現が増加することは様々な疾患の予防につながる。また、ストレスを受けた際に、減少したＤ群の遺伝子の発現をいち早く増加させることも、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止につながる。
本発明により明らかとなった、ＤＧＥがその発現を抑制する（減少させる）Ａ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の遺伝子、及びＤＧＥがその発現を促進する（増加させる）Ｂ群、Ｄ群及びＧ群の遺伝子を表１〜３に示す。
好適な態様としては、前述の表１〜３に示すＡ群〜Ｇ群から選択される少なくとも１つの遺伝子について比較を行えばよい。より好ましくは、Ａ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子とＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子（計２つ以上の遺伝子）、さらに好ましくはＡ群〜Ｇ群の各群より選択される少なくとも１つの遺伝子（計７つ以上の遺伝子）について発現パターンが比較される。
また、以上の知見をもとに、本発明により、以下のような本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の別の態様が提供される。すなわち、本発明により、下記工程；
（１）被検物質を生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量と当該負荷を行っていない場合の当該生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を両者で比較する工程、並びに
（３）表１〜３中のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる被検物質を選択する工程、を包含する生理活性物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法により、ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する物質を簡便に得ることができる。
また、より詳細には以下のような本発明の生理活性物質のスクリーニング方法の別の態様が提供される。すなわち、本発明により、下記工程；
（１）ストレスの生体への負荷、並びに被検物質とストレスの生体への負荷をそれぞれ行う工程、
（２）（１）の生体及びいずれの負荷も行っていない正常生体における遺伝子の発現量をそれぞれ測定する工程、並びに
（３）（２）により得られた遺伝子の発現量を（１）の生体と正常生体とで比較し、下記（ａ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現パターンを示す被検物質を選択する工程：
（ａ）上記のＡ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｂ）上記のＢ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに増加する、
（ｃ）上記のＣ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに減少する、
（ｄ）上記のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、
（ｅ）上記のＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｆ）上記のＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｇ）上記のＧ群の遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、を包含する生理活性物質のスクリーニング方法が提供される。当該方法により、ＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する物質を簡便に得ることができる。
なお、上記の２つの別の態様において、被検物質の遺伝子発現制御作用は、上記のＤＧＥと同様の方法により調べることができる。また、ストレスの生体への負荷は、前記するような各種のストレスを生体に対して負荷することにより行われるが、好ましくは化学物質を用いて行うのが好適であり、中でも、ＴＰＡ（ホルボールミリステートアセテート）処理又はＬＰＳ（リポポリサッカライド）処理がより好適である。ここで、処理とは、投与又は摂取させることをいう。
ＴＰＡは発がんプロモーターとして知られており、その作用としては直接的な変異作用の他、生体の炎症誘導による発がん作用が知られている。すなわちＴＰＡはマクロファージ等の炎症細胞からＮＯ、プロスタグランジンＥ２等、炎症性メディエーターの遊離を惹起する。
ＬＰＳはサイトカイン誘導因子であり、生体に対し、発熱、致死効果、血圧低下等の様々な影響を及ぼすが、この作用はＬＰＳそれ自体の直接作用ではなく、ＬＰＳによりマクロファージを中心とする宿主細胞が産生する炎症性サイトカインなどの作用によるものである。
上記Ａ〜Ｄ群はストレスとしてＴＰＡを用いた際に遺伝子の変動が確認された遺伝子群であり、また上記Ｅ〜Ｇ群はＬＰＳを用いた際に遺伝子の変動が確認された遺伝子群である。ＤＧＥはＴＰＡやＬＰＳにより誘発される炎症を抑制することから、すなわち、上記工程においてのストレスとしてＴＰＡ処理を用いた場合に上記遺伝子の発現パターン（ａ）〜（ｄ）を示す化合物を選択すれば、ＴＰＡにより誘発される炎症と同様のメカニズムで誘発される炎症を治療又は予防する効果を有する化合物を得られることが期待でき、また、ストレスとしてＬＰＳ処理を用いた場合に上記遺伝子の発現パターン（ｅ）〜（ｇ）を示す化合物を選択することにより、ＬＰＳにより誘発される炎症と同様のメカニズムで誘発される炎症を治療又は予防する効果を有する化合物を得られることが期待できる。
なお、遺伝子発現制御作用が多少異なる物質であっても、当該物質はＤＧＥの有する生理活性のうちのいくつかを有している可能性がある。このような物質もＤＧＥの代替物質として目的に応じて使用することは可能である。
また、別の一態様として、本発明の生理活性物質のスクリーニング方法に好適に使用されるキットも提供しうる。当該キットは、例えば表１〜３に示すＡ群〜Ｇ群から選択される少なくとも１つの遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブ、或いは当該遺伝子にコードされるポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を少なくとも含んでおればよい。
［２］本発明のＤＮＡアレイ
また本発明は、前記生理活性物質のスクリーニング方法に使用されるＤＮＡアレイであって、前記のＡ〜Ｇ群の遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化ＤＮＡアレイを提供する。本発明のＤＮＡアレイは、上記のＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子または該遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化されたアレイである。すなわち、各々の遺伝子に対応するＤＮＡ又はその断片の位置が支持体上においてあらかじめ決定されており、このようなアレイを使用した場合、検出されたシグナルの位置からこのシグナルがどの遺伝子のＤＮＡ又はその断片に由来するのかを直ちに知ることができる。該アレイは上記［１］の生理活性物質のスクリーニング、ならびにＤＧＥの投与もしくは摂取が有効な疾病における遺伝子的な病態解析に有用である。
上記ＤＮＡアレイに固定される遺伝子又はそのＤＮＡ断片としては、生体へのストレスやＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子又はそのＤＮＡ断片であるか、或いはそれらを含有するものであれば特に限定はなく、例えば後述の実施例３に記載のＤＮＡマイクロビース法を用いて、固定化される遺伝子又はそのＤＮＡ断片を選択することができる。また、生体へのストレスやＤＧＥによって発現制御を受ける遺伝子以外の遺伝子、例えば陰性対照として使用される遺伝子等を含有してもよい。また、その製造は公知の方法にしたがって行えばよく、例えば、上記［１］に記載されたＤＮＡアレイ作製装置を使用することができる。
本発明のＤＮＡアレイにおいては、遺伝子又はそのＤＮＡ断片は一本鎖、二本鎖のどちらが固定されていてもよい。また、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。また、その製法にも特に限定はなく、化学的に合成したもの、天然由来のもの、酵素的に合成したもの、それらの組み合わせであってもよい。なお、遺伝子又はそのＤＮＡ断片の鎖長としては、特に限定されるものではないが、例えば、約２０塩基長〜約１キロ塩基長であることが望ましく、また、該鎖長より短い或いは長いものであっても、任意の被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションにおいて特異的にハイブリダイズするものであればよい。
アレイの支持体、ＤＮＡ固定化密度にも特に限定はなく、目的や固定化する遺伝子数に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、ＤＮＡアレイの支持体としては前記するようなものを挙げることができ、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常、スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。また、多数の遺伝子を固定化する場合や微量の試料に適したアレイを作製したい場合には、支持体に高密度で遺伝子を固定したマイクロアレイが好適に使用できる。当該マイクロアレイとしては、１００ドット／ｃｍ２以上の密度で核酸、特にＤＮＡが固定化されたものが好適である。また、その形状にも特に限定はなく、平板状、円盤状、テープ状等、適宜選択することができる。
［３］本発明の遺伝子制御剤、遺伝子制御方法
また本発明は、生体における遺伝子発現の制御方法に関し、特に限定するものではないが、ストレスを受けた生体において発現量が変化した遺伝子について、当該遺伝子の発現を制御（調節）し、生体の恒常性を保つ方法、ならびに該方法のための遺伝子制御剤を提供する。
例えば前記のようなストレスを受けた生体における影響は、該生体中の遺伝子の発現を適切に制御することによって解消することが可能であると考えられる。そのためには、当該遺伝子、例えば表１〜３に挙げられた遺伝子を制御しうる化合物もしくは当該化合物を有効成分として含有する組成物、すなわち、本発明により提供される遺伝子制御剤の使用が有効である。従って、当該遺伝子制御剤は、特にストレスの緩和又は予防用として好適である。
上記の遺伝子制御剤に有効成分として含有させることのできる化合物としては、例えば、ＤＧＥ、ＤＧＥの誘導体及び／又はそれらの塩を使用することができ、さらにＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する化合物、その誘導体及び／又はそれらの塩を使用することもできる。なお、当該化合物の誘導体等は、前記式（Ｉ）で表される化合物の誘導体等と同様にして製造することができる。ＤＧＥと同様な遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、上記［１］に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を好適に使用することができる。
当該遺伝子制御剤は公知の医薬の製造方法に従って調製することができる。例えば、前記有効成分を薬学的に許容されうる公知の液状又は固体状の担体と混合し、さらに所望により、公知の溶剤、分散剤、乳化剤、安定化剤、滑沢剤等を加えて、液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、又は錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤等の固形剤とすることができる。
前記担体は、本発明の遺伝子制御剤の投与形態及び剤型に応じて選択することができる。経口剤とする場合は、例えばデンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース等の利用が好適である。一方、非経口剤とする場合は、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、ダイズ油、プロピレングリコール等の利用が好適である。
本発明の遺伝子制御剤における前記有効成分の含有量は、遺伝子制御剤の投与形態、投与方法などにより変化し一概には決定できないが、本発明の所望の効果が得られうる量で前記有効成分を投与しうるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の遺伝子制御剤は、剤型に応じた適当な投与経路により、経口的にも非経口的にも投与できる。非経口的に投与する場合、例えば注射剤として、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。その投与量も特に限定されるものではなく、例えば剤型、投与方法、使用目的、投与対象である患者の年齢、体重、症状に応じて、本発明の所望の効果が得られうる範囲で適宜決定すればよい。
本発明の遺伝子制御剤としては具体的には以下のようなものが例示される。
（１）表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（２）ストレスの負荷された生体において、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（３）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、表１〜３に記載のＡ群及びＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（４）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、表１〜３に記載のＢ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、
（５）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、表１〜３に記載のＣ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤、並びに
（６）ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、表１〜３に記載のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなる遺伝子制御剤。
さらに、本発明により、
前記（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を生体に投与することにより、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる遺伝子の制御方法、並びに
前記記載の（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を、ストレスの負荷された生体に投与することにより、表１〜３に記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる遺伝子の制御方法、が提供される。
ここで、生体とは、哺乳動物、中でもヒトである。また、少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物としては、上記［１］に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を好適に使用することができる。
かかる遺伝子の制御方法によれば、表１〜３に示した遺伝子の発現を好適に制御することができ、生体の受けたストレスの緩和および／または回避が可能となる。
なお、有効成分として投与する化合物もしくは当該化合物を含む組成物の投与方法、投与量等は、例えば前記遺伝子制御剤と同様でよい。
本発明の遺伝子の制御方法により、ストレスに起因する生体に悪影響を及ぼす遺伝子群の発現を抑制するとともに、ストレス状態の回避に関与する遺伝子群の発現を増強し、様々な疾患の予防、治療、増悪の阻止を行うことができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）ＲＮＡの調製
ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製、１２−７０２Ｆ）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、好中球様に分化誘導した。
上記により得られた細胞を遠心により回収し、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し１０ｃｍシャーレに１０ｍＬずつ加えた。各シャーレに１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１０μＬの１００μｇ／ｍＬホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製、１３１３９−０１９）ジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して６時間培養後さらに１０μＬの１００μｇ／ｍＬ ＴＰＡジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１００μＬの水を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。なお、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの説明書に従い調製した。
（２）ｃＤＮＡの合成
上記により得られた各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５μｇと１００ｐｇのλ ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ−Ａ（宝酒造社製、ＴＸ８０２）を、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（宝酒造社製、ＴＸ８０７）と、１ｍＭ ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３−ｄＵＴＰあるいはＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア製、ＰＡ５３０２２（Ｃｙ３）、ＰＡ５５０２２（Ｃｙ５））を用い、キットの説明書に従って蛍光標識されたｃＤＮＡの合成反応と精製を行った。蛍光標識したＤＮＡ溶液を表４の組み合わせで混合し，クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行い、２μＬの５×Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ Ｉ（Ｈｕｍａｎ）（宝酒造社製、ＴＸ８０８）を添加してエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡは１０μＬのハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ溶液を０．２２μｍのフィルターに通したもの）に溶解し、ハイブリダイゼーションに供した。
カバーガラス（２２×２２ｍｍ）の上に１０μＬのプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、１ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ溶液を０．２２μｍのフィルターに通したもの）を滴下し、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ（ｖｅｒ．１．０）（宝酒造社製、Ｘ１０４）のアレイＤＮＡ面が下になるようにしてカバーガラスの上に、気泡が入らないようにかぶせた。チップのアレイＤＮＡ面が上になるようにひっくり返し、ペーパーボンド（コクヨ社製、タ−１００）をカバーガラスの周辺に滴下して溶液を密閉し室温で２時間放置することでプレハイブリダイゼーションを行った。チップを２×ＳＳＣ中に移しペーパーボンドおよびカバーガラスを外し、２×ＳＳＣ続いて０．２×ＳＳＣ中で洗浄後、遠心により水分を飛ばして乾燥した。
上記のハイブリダイゼーション溶液に溶解した蛍光標識ＤＮＡ溶液を９５℃で２分間加熱して変性させた後、遠心して上清をカバーガラス（２２×２２ｍｍ）の上に滴下し、上記のように処理をしたチップのアレイＤＮＡ面が下になるようにしてカバーガラスの上に、気泡が入らないようにかぶせた。チップのアレイＤＮＡ面が上になるようにひっくり返し、ペーパーボンドをカバーガラスの周辺に滴下して溶液を密閉した。このチップを湿箱に入れた後、６５℃の恒温槽で１６時間保温した。チップを２×ＳＳＣ中に移しペーパーボンドおよびカバーガラスを外し、５５℃の２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で３０分間で２回洗浄、続いて６５℃の２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳで５分間洗浄し、室温の０．０５×ＳＳＣで５分間洗浄後、遠心により水分を飛ばして乾燥した。
（４）解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造社製、ＧＭ２０５）により上記チップの各スポットの蛍光シグナルを読み取った。この画像データをもとにＩｍａＧｅｎｅ（宝酒造社製、ＢＤ００１）により各スポットの蛍光シグナルを定量した。この結果、ＴＰＡ添加区分でいくつかの遺伝子発現の変動が確認でき、これに対してＤＧＥ＋ＴＰＡ添加区分で、この変動をさらに上下させていることが確認できた。すなわち、ＤＧＥはいくつかの遺伝子についてＴＰＡによる遺伝子の変動を修飾する作用を有することが確認できた。その結果をまとめたものを表５に示す。表５はＴＰＡによって変動のあった遺伝子のうち、ＤＧＥによってその変動が修飾されたものをまとめたものであり、Ａ−１群はＤＧＥによってその発現が抑制された遺伝子、Ｂ−１群はＤＧＥによってその発現が促進された遺伝子である。
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ヒト健常人ドナーより４００ｍＬ採血を実施した。採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層後５００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製）を用いて洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）／１０％ジメチルスルホキシドからなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。実験時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出し各実験に供した。
（２）プラスチック接着性単球の分離
５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン（以上バイオウイタカー社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩ培地と略す）に１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＭＣを懸濁後、１００ｍｍシャーレ（旭テクノグラス社製）に１５ｍＬずつまき、３７℃で、５％のＣＯ２湿式インキュベーター内にて１．５時間インキュベートした。その後、非接着性の細胞を吸引除去し、各ウエルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄し、１０ｍＬの５ＨＲＰＭＩ培地を加えてプラスチック接着性の単球を得た。
（３）ＲＮＡの調製
実施例２−（２）により得られた各シャーレに１０μＬの１μｇ／ｍＬリポポリサッカイライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分、１０μＬの２０ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間培養後さらに１０μＬの１μｇ／ｍＬＬＰＳ水溶液を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１０μＬの水を添加して４時間後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した区分を設定した。なお、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの取扱説明書に従い調製した。
（４）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は実施例１−（２）記載の方法に準じて行った。ただし、蛍光標識したＤＮＡ溶液の組み合わせは表６にしたがって行った。
ハイブリダイゼーションは実施例１−（３）記載の方法に準じて行った。ただし、チップはＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＣＨＩＰ（ｖｅｒ．２．０）（宝酒造社製、Ｘ１０４）を用いた。
（６）解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（宝酒造社製）により上記チップの各スポットの蛍光シグナルを読み取った。この画像データをもとにＩｍａＧｅｎｅ（宝酒造社製、ＢＤ００１）により各スポットの蛍光シグナルを定量した。この結果、いくつかの遺伝子についてＬＰＳ添加区分で発現の増加が確認でき、これに対してＤＧＥを添加することでこの増加を抑制していることが確認できた。また、いくつかの遺伝子についてＬＰＳ添加区分で発現の変動が認められないものの、ＤＧＥ＋ＬＰＳ添加区分で発現の増加および下降が確認できた。その結果をまとめたものを表７に示す。表７はＬＰＳによって発現が増加した遺伝子のうちＤＧＥによってその増加が抑制されたもの（Ｅ群）、ＬＰＳによって発現が変動しないもののＤＧＥ＋ＬＰＳで発現が下降したもの（Ｆ群）および増加したもの（Ｇ群）をまとめたものである。
プロシーディングズ オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズオブ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９７巻、第１６６５〜１６７０頁、（２０００年）（以下、文献１と呼ぶ。）記載の方法に準じて、以下に示すようにＤＮＡマイクロビーズの作製を行った。
（１）ｃＤＮＡの合成
ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシドをそれぞれ含有するＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、上記細胞を好中球様に分化誘導した。得られた細胞を遠心により回収し、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁したうえ、この懸濁液を１０ｃｍシャーレ２枚に１０ｍｌずつ加えた。一方のシャーレに１００μｌの水（Ａ）、もう一方のシャーレに１０μｌの１００μｇ／ｍｌホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製）ジメチルスルホキシド溶液（Ｂ）を添加してそれぞれ４時間培養した。それぞれのシャーレより回収した（Ａ）、（Ｂ）の細胞のそれぞれよりトリゾール試薬（ギブコ社製）を用いて全ＲＮＡを調製し、次いでオリゴテックスＴＭ−ｄＴ３０（宝酒造社製）を用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡ ２．５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。その際、逆転写に用いるプライマーとして、配列表の配列番号：１に示される塩基配列の５’ビオチン標識プライマーを使用した。
こうして得られたｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理し、セファロースＣＬ４Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）を用いてゲルろ過精製した後、エタノール沈殿を行った。沈殿として回収されたｃＤＮＡを２００μｌのＤｐｎＩＩ緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）に溶解し、制限酵素ＤｐｎＩＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。この消化物よりストレプトアビジンマグネットビーズ（ダイナール社製）を用いてｃＤＮＡの３’側部分を回収した後、２０μｌの１０×ＮＥＢ＃２緩衝液（ニューイングランド バイオラブズ社製）を加えて全量を２００μｌに調整し、制限酵素ＢｓｍＢＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。反応液についてフェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、沈殿を滅菌水１０．５μｌに溶解し、これを３’側ｃＤＮＡ溶液として以下の実験に用いた。
（２）３’側ｃＤＮＡとアンチタグ付きマイクロビーズのハイブリダイゼーション
実施例３−（１）で合成した（Ａ）および（Ｂ）由来の３’側ｃＤＮＡ溶液１μｌを文献１記載のタグベクターｐＬＣＶ２ ２００ｎｇにそれぞれ挿入して１４万〜１８万クローンからなるプラスミドプール６個を調製した。配列表の配列番号：２に記載の塩基配列の５’ビオチン標識プライマー、および配列表の配列番号：３に記載の塩基配列の５’ＦＡＭ標識プライマーを１００μｌの反応液１本あたりそれぞれ１００ｐｍｏｌ使用し、反応液１本あたり上記の各プラスミドプール１２５ｎｇを鋳型としたＰＣＲを、各プラスミドプールあたり４８本行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。
９４℃−３分保持
９４℃−３０秒、６７℃−３分を１サイクルとした８サイクル
９４℃−３０秒、６４℃−３分を１サイクルとした２２サイクル
６７℃−３分保持
反応終了後、ＰＣＲ反応液を各プールごとに１本に集め、フェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、得られた沈殿を滅菌水１２００μｌに溶解した。ここに１０×ＮＥＢ＃４緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）１８０μｌを加え、全量を１８００μｌにした後、制限酵素ＰａｃＩ（ニュー イングランド バイオラブズ社製）による消化を行った。反応液よりウルトラリンクＳＡレジン（ピアス社製）に吸着する画分を除いて得られるｃＤＮＡ溶液についてフェノール・クロロホルム処理およびエタノール沈殿を行った後、沈殿を滅菌水１２００μｌに溶解した。ここに１０×ＮＥＢ＃２緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）１８０μｌを加え、全量を１８００μｌに調整してＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）処理を行った。この際基質としてｄＧＴＰのみを加えることによりタグ部分の１本鎖化を行った。
この１本鎖タグを持つｃＤＮＡの各プールごと３００μｇを文献１記載の１億４４００万個のアンチタグ付きマイクロビーズと混合し、４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１．２％ デキストラン硫酸）中、７２℃で振盪しながら３日間ハイブリダイゼーションを行った。遠心分離によってマイクロビーズを集め、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁して振盪しながら６４〜７０℃で３０分間洗浄を行った。この洗浄操作を数回繰り返した後に６プール分の洗浄済みｃＤＮＡ付きマイクロビーズを集め、ＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション社製）を用いてマイクロビーズのＦＡＭの蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）を測定し、蛍光強度の大きい方から１％のマイクロビーズを分取した。以上の操作によって、ｃＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合した約６００万個のマイクロビーズを得た。
（３）ＤＮＡマイクロビーズ懸濁液の調製
実施例３−（２）で得られた、ｃＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合したマイクロビーズのうち約２００万個を１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．４ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、各０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５−メチルｄＣＴＰ、１ｍＭ ＡＴＰに懸濁し、２０ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加して１２℃で２時間反応させた。反応はプロナーゼ処理によって停止し、次いで反応液よりマイクロビーズを遠心分離によって集め、１００μｌのＤｐｎＩＩ緩衝液（ニュー イングランド バイオラブズ社製）に懸濁してＤｐｎＩＩ（ニューイングランド バイオラブズ社製）で消化した。遠心分離によってマイクロビーズを集め、１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０３３ｍＭ ｄＧＴＰ、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、１０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ ラージフラグメント（宝酒造社製）を加えて２５℃で１５分間反応させた。遠心分離によってマイクロビーズを集めて１００μｌのライゲーション緩衝液（宝酒造社製）に懸濁後、予め配列表の配列番号：４、配列番号：５に示される塩基配列のＤＮＡをアニールさせて作製したアダプター０．１ｎｍｏｌを加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いてライゲーション反応を行った。マイクロビーズを遠心分離によって集め、ビーズストリッピング溶液（１５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に懸濁して室温で１０分間反応させた。反応液より遠心分離により上清を除いた後、マイクロビーズを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁して、サンプル１およびサンプル２由来のＤＮＡマイクロビーズ懸濁液を得た。
（４）プローブの作製
実施例３−（１）で調製した（Ａ）および（Ｂ）由来の３’側ｃＤＮＡ １μｌを文献１記載のプローブベクターｐＬＣＶ ２００ｎｇにそれぞれ挿入して８００万〜１０００万クローンからなるプラスミドを調製した。このプラスミドのそれぞれ１０μｇにユニバーサル緩衝液Ｈ（宝酒造社製）２０μｌを加えて全量を２００μｌにした後、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）にて消化した。（Ａ）由来のＳａｕ３ＡＩ消化済プラスミド１．２μｇを鋳型に配列表の配列番号：６に示される塩基配列の５’ＦＡＭ標識プライマー２ｎｍｏｌを用いて、また、（Ｂ）由来のＳａｕ３ＡＩ消化済プラスミド２．４μｇを鋳型に配列表の配列番号：７に示される塩基配列の５’Ｃｙ５標識プライマー４ｎｍｏｌを用いて、それぞれリニアＰＣＲを行った。リニアＰＣＲは、以下の条件で行った。
９５℃−５分保持
９５℃−３０秒、６４℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとした２５サイクル
７２℃−１０分保持
リニアＰＣＲ後の反応液のそれぞれより、キアクイックＰＣＲピュリフィケーションキット（キアゲン社製）を用いて増幅ＤＮＡを精製し、エタノール沈殿を行った後、滅菌水２１μｌに溶解し、サンプル１由来ＦＡＭ蛍光標識プローブおよびサンプル２由来Ｃｙ５蛍光標識プローブを得た。
（５）ＤＮＡマイクロビーズとのハイブリダイゼーション
実施例３−（３）で調製したサンプル１由来のＤＮＡマイクロビーズとサンプル２由来のＤＮＡマイクロビーズを、それぞれ約３６万個ずつ混合し、このビーズに（４）で作製したサンプル１由来ＦＡＭ蛍光標識プローブおよびサンプル２由来Ｃｙ５蛍光標識プローブを各５μｇを加え、５０μｌの緩衝液（４×ＳＳＣ、２５％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ）中で振盪しながら６５℃で終夜ハイブリダイゼーションを行った。遠心分離によって集めたマイクロビーズを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃で３０分間洗浄後、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間洗浄し、遠心分離にてＤＮＡマイクロビーズを集め、これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０に懸濁し、ハイブリダイゼーション済ＤＮＡマイクロビーズを得た。
（６）ソーティング
実施例３−（５）で得たハイブリダイゼーション済ＤＮＡマイクロビーズを、ＭｏＦｌｏサイトメーター（サイトメーション社製）を用いたソーティングに供した。ＤＮＡマイクロビーズについてＦＡＭの蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、検出波長：５３０ｎｍ）およびＣｙ５の蛍光強度（励起波長：６４７ｎｍ、検出波長：６７０ｎｍ）を測定し、ＦＡＭの蛍光強度の強いＤＮＡマイクロビーズを３６９２個（ビーズ懸濁液Ａ）、Ｃｙ５の蛍光強度の強いＤＮＡマイクロビーズを３３４９個（ビーズ懸濁液Ｂ）分取した。
（７）ＰＣＲおよびＤＮＡ塩基配列決定
実施例３−（６）で分取したビーズ懸濁液ＡおよびＢを鋳型に、配列表の配列番号：８および配列番号：９にそれぞれ塩基配列を示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。１００μｌの反応液中に、鋳型ビーズを２００個とプライマーを４０ｐｍｏｌずつ加え、ビーズ懸濁液Ａ，Ｂそれぞれについて５本ずつの反応を行った。ＰＣＲは以下の条件で行った。
９５℃−５分保持
９５℃−３０秒、６４℃−３０秒、７２℃−３０秒を１サイクルとした２５サイクル
７２℃−１０分保持
ＰＣＲ反応液を懸濁液Ａ，Ｂごとに１本にまとめ、それぞれの１μｌをクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）と混合してライゲーションを行い、クローニングした。ビーズ懸濁液Ａ由来のコロニー９６０個と、ビーズ懸濁液Ｂ由来のコロニー９６０個の合計１９２０個のコロニーからプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った。得られた塩基配列の中で、以下に示すどちらかの条件を満たすものを選択した。
条件１：インサート配列の長さが、４０ベース以上のもの。
条件２：インサート配列の長さが、３０ベース以上、４０ベース以下で、ｐｏｌｙＡ配列を持たないもの。
複数のプラスミドにおいて同じインサート配列が出現した場合は、どれか１個のプラスミドを選択し、ＤＮＡマイクロアレイ用の鋳型プラスミドとして７４０個のプラスミドを得た。
実施例４ ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現解析
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例３において取得した７４０個のクローンのプラスミドを鋳型として、配列表の配列番号：１０と１１に記載の配列を有するプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行った。ついで、当該増幅産物をエタノール沈殿により精製後、０．３μｇ／μｌになるように１×ＳｏｌｕｔｉｏｎＴ（宝酒造社製）に溶解し、これをスポッティング溶液とした。当該スポッティング溶液をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤー（アフィメトリックス社製）を用いて、アミノ化スライドガラスであるＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子社製）にスポットした。スポット後のスライドを３７℃、湿度９０％にて１時間保持した後、６０ｍＪ／ｃｍ２のエネルギーでＵＶクロスリンクした。さらに、０．２％ ＳＤＳで１回、次いで蒸留水で２回洗浄した後、２．７５ｇの無水コハク酸と１６２．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドン、１５ｍｌの１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるブロッキング溶液に２０分間浸し、遊離のアミノ基をブロックした。次いで、蒸留水で２回洗浄した後、沸騰水中にて２分間熱変性し、氷温の１００％エタノールで急冷した。その後、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離によりスライドガラスを乾燥させ、以下の実験に用いた。
（２）細胞の調製
ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ バイオサイエンシズ社製）、１．３％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウイタカー社製、１２−７０２Ｆ）に懸濁し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で１週間培養し、好中球様に分化誘導した。得られた細胞を遠心により回収し、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し１０ｃｍシャーレに１０ｍＬずつ加えた。各シャーレに１００μｌの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分、１０μＬの１００μｇ／ｍＬホルボールミリステートアセテート（ＴＰＡ、ギブコ社製、１３１３９−０１９）ジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分、１００μＬの４ｍＭ ＤＧＥ水溶液を添加して６時間培養後さらに１０μＬの１００μｇ／ｍＬ ＴＰＡジメチルスルホキシド溶液を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分を設定した。また、陰性対照として１００μＬの水を添加して４時間後にＲＮＡを回収した区分を設定した。
（３）検出用標識ｃＤＮＡの調製とハイブリダイゼーション
実施例４−（２）で調製したＨＬ−６０細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）を用い、それぞれのキットのプロトコールに従いＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを調製した。次いで、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ）（宝酒造社製）を用いてキットのプロトコールに従い、それぞれＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ１．０μｇを鋳型として、表８に示したサンプルＲＮＡの組み合わせでＣｙ３とＣｙ５で標識されたｃＤＮＡを調製し、混合した。
（４）各クローンのグループ化
発現比率から統計解析により各クローンのグループ化を行うには、信頼性の低いデータと有意な変動を示さないクローンのデータを除去する必要がある。よって、以下の手順によりグループ化に供するクローンの絞り込みを行った。すなわち、実施例４−（３）で得られたバックグラウンド領域のシグナル強度の平均値と標準偏差から、以下の数式によりシグナル強度の閾値を求めた。
シグナル強度の閾値＝バックグラウンド領域のシグナル強度の平均値＋２×（バ
ックグラウンド領域のシグナル強度の標準偏差）
各スポット領域のシグナル強度の平均値が上記の閾値より大きいか否かで、当該スポットシグナルの各チャンネルにおける有意性を判断した。次いで、４つのサンプル全てで、Ｃｙ３とＣｙ５の両方のチャンネルで有効シグナルを持たないスポットのクローンを除外した。さらに、Ｃｙ３のシグナルに対するＣｙ５のシグナル強度の比率（以下、発現比率と称す。）を算出し、すべてのサンプルにおいて当該比率が２分の１より大きくかつ２より小さいクローンについて、変動を示さなかったクローンとして以後の解析から除外した。以上の絞り込みの結果、７４０個のクローンの中から２２７個のクローンが選択された。
次に、上記で選択された２２７クローンについて、ＴＰＡおよびＤＧＥの処理により発現が変動した、すなわちサンプル番号３あるいは４の発現比率が０．５５以下もしくは１．８以上の値を有するクローンについて、ＤＧＥ処理による変動の関係から以下の４つのグループに分けることができた。
Ａ−３群 ＴＰＡ処理により発現が増加し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が低下するクローン。
Ｂ−３群 ＴＰＡ処理により発現が増加し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が増加するクローン。
Ｃ−３群 ＴＰＡ処理により発現が低下し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が低下するクローン。
Ｄ−３群 ＴＰＡ処理により発現が低下し、さらにＤＧＥ処理によりその発現が増加するクローン。
これらのクローンについて相同性検索を行った。これらの結果から、４つのグループに分けられたクローンに対して相同性の得られた塩基配列名とそのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を表９及び１０に示す。なお、表９及び１０において相同性が認められたクローンについてはＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列名を、相同性が認められなかったクローンについては、配列表の配列番号を示した。
配列番号：１の配列は、全ｍＲＮＡについての逆転写用プライマーの配列である。
配列番号：２の配列は、タグベクターｐＬＣＶ２の一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：３の配列は、タグベクターｐＬＣＶ２の一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：４の配列は、オリゴヌクレオチドアダプターの配列である。
配列番号：５の配列は、オリゴヌクレオチドアダプターの配列である。
配列番号：６の配列は、プローブベクターｐＬＣＶの一部を増幅するためのリニアＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：７の配列は、プローブベクターｐＬＣＶの一部を増幅するためのリニアＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：８の配列は、ＤＮＡマイクロビーズ上のｃＤＮＡについてのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：９の配列は、ＤＮＡマイクロビーズ上のｃＤＮＡについてのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：１０の配列は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
配列番号：１１の配列は、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターの一部を増幅するためのＰＣＲ用プライマーの配列である。
産業上の利用可能性
本発明は、種々の生理活性を有するＤＧＥと同様な遺伝子制御活性を有する生理活性物質もしくは生理活性物質の候補物質のスクリーニング方法、生体の恒常性維持に有効な、例えばストレスの緩和又は予防を目的とする遺伝子制御剤、並びに遺伝子の制御方法を提供する。本発明により、例えば、ＤＧＥの有する各種生理活性の発現が有効に働く疾患又は症状の治療又は予防効果が期待できる。
【配列表】
Claims (23)
- 下記工程を包含することを特徴とする生理活性物質のスクリーニング方法；
（１）▲１▼被検物質、及び▲２▼下記（ｉ）に記載の化合物及び／又は下記（ｉｉ）に記載の化合物を、それぞれ生体に負荷する工程：
（ｉ）下記式（Ｉ）で表される化合物、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（式中、Ｘ及びＹは、Ｈ又はＣＨ２ＯＨ、ただし、ＸがＣＨ２ＯＨの時、ＹはＨ、ＸがＨの時、ＹはＣＨ２ＯＨである）
（ｉｉ）下記式（ＩＩ）で表される３，６−アンヒドロガラクトース、そのアルデヒド体、その抱水体、並びにそれらの２−Ｏ−メチル化体及び２−Ｏ−硫酸化体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、及び／又は該化合物を還元末端に有する可溶性の糖化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を▲１▼を負荷した場合と▲２▼を負荷した場合とで比較する工程、並びに
（３）少なくとも１つの遺伝子が、▲２▼を負荷した場合と実質的に同等の発現量の変化を示した被検物質を選択する工程。 - 下記工程を包含することを特徴とする生理活性物質のスクリーニング方法；
（１）被検物質を生体に負荷する工程、
（２）（１）の生体における遺伝子の発現量と当該負荷を行っていない場合の当該生体における遺伝子の発現量を測定し、その値を両者で比較する工程、並びに
（３）下記に示すＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又は下記に示すＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる被検物質を選択する工程：
Ａ群：
骨形成タンパク質−６〔ＢＭＰ−６（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１７１８）〕遺伝子、
ケモカインレセプター−１〔ＣＣＲ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１２９５）〕遺伝子、
肝細胞増殖因子〔ＨＧＦ（ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３２３）〕遺伝子、
Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１〔ＩＣＡＭ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００２０１）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ−１β（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２５３２）〕遺伝子、
インターロイキン−１６〔ＩＬ−１６（ジーンバンク登録番号：Ｍ９０３９１）〕遺伝子、
白血病阻害因子〔ＬＩＦ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２３０９）〕遺伝子、
オステオポンチン〔ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００５８２）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
ニューロピリン−１〔Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３８７３）〕遺伝子、
ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ６〔ＳＴＡＴ６（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０６７５７５）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡ：ＦＬＪ２２２９８ ｆｉｓ，ｃｌｏｎｅ ＨＲＣ０４６３７（ジーンバンク登録番号：ＡＫ０２５９５１）を含む遺伝子、
Ｂ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔Ｈ０−１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００２１３３）〕遺伝子、
チオレドキシンレダクターゼ−１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１０６６９７）遺伝子、
ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ〔ＳＵＩ１（ジーンバンク登録番号：ＡＦ０８３４４１）〕遺伝子、及び
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＨＳＰＣ０１４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５９３２）〕遺伝子、
Ｃ群：
Ｎ−ｍｙｃ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ １〔ＮＤＲＧ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６０９６）〕遺伝子、
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ〔ＡＤＡＲ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０１５８４１）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３ｂ，ｓｕｂｕｎｉｔ２〔ＳＦ３Ｂ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６８４２）〕遺伝子、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ３〔ＩＬＦ３（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００４５１６）〕遺伝子、
ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ２〔ＶＡＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９５）〕遺伝子、及び
配列表の配列番号：１２に記載の塩基配列を含む遺伝子、
Ｄ群：
ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ １〔ＥＥＦＩＡ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１４０２）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１７〔ＲＰＬ１７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８５）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２４〔ＲＰＬ２４（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８６）〕遺伝子、
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｒｇｉｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ−ｒｉｃｈ ２〔ＳＦＲＳ２（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３０１６）〕遺伝子、
ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ １〔ＴＰＴ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００３２９５）〕遺伝子、
ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ〔ＵＱＣＲＢ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００６２９４）〕遺伝子、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１５ａ〔ＲＰＳ１５Ａ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ００１０１９）〕遺伝子、及び
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２７〔ＲＰＬ２７（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００９８８）〕遺伝子、
Ｅ群：
インターロイキン−２レセプターα〔ＩＬ２ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０１０５７）〕遺伝子、
インターロイキン−６〔ＩＬ６（ジーンバンク登録番号：Ｘ０４４３０）〕遺伝子、
ＣＤ１６６（ジーンバンク登録番号：Ｙ１０１８３）遺伝子、
インターフェロン調節因子−１〔ＩＲＦ１（ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４５４）〕遺伝子、
インターロイキン−１５レセプターα〔ＩＬ１５ＲＡ（ジーンバンク登録番号：Ｕ３１６２８）〕遺伝子、
Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ−ｂ ｐ１０５サブユニット〔ＮＦＫＢ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ５８６０３）〕遺伝子、
カスパーゼ−１〔ＣＡＳＰ１（ジーンバンク登録番号：Ｍ８７５０７）〕遺伝子、
インターロイキン−１β〔ＩＬ１Ｂ（ジーンバンク登録番号：Ｍ１５３３０）〕遺伝子、
腫瘍壊死因子−α〔ＴＮＦ−α（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２９１０）〕遺伝子、
Ｇｒｏ１オンコジーン〔ＧＲ０１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４４８９）〕遺伝子、
インターロイキン−１α〔ＩＬ１Ａ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２８９８３）〕遺伝子、
インヒビンベータＡ〔ＩＮＨＢＡ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３６３４）〕遺伝子、
インターロイキン−７レセプター〔ＩＬ７Ｒ（ジーンバンク登録番号：Ｍ２９６９６）〕遺伝子、
前駆Ｂ細胞コロニー増強因子〔ＰＢＥＦ（ジーンバンク登録番号：Ｕ０２０２０）〕遺伝子、
Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ〔ＬＡＲＣ（ジーンバンク登録番号：Ｕ６４１９７）〕遺伝子、及び
インターロイキン−８〔ＩＬ８（ジーンバンク登録番号：Ｍ２６３８３）〕遺伝子、
Ｆ群：
コロニー刺激因子−１レセプター〔ＣＳＦ１Ｒ（ジーンバンク登録番号：Ｘ０３６６３）〕遺伝子、
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター−４〔ＣＸＣＲ４（ジーンバンク登録番号：ＡＦ１４７２０４）〕遺伝子、及び
エンドグリン〔ＥＮＧ（ジーンバンク登録番号：ＮＭ ０００１１８）〕遺伝子、
Ｇ群：
ヘムオキシゲナーゼ−１〔ＨＭＯＸ１（ジーンバンク登録番号：Ｚ８２２４４）〕遺伝子。 - 下記工程を包含することを特徴とする生理活性物質のスクリーニング方法；
（１）ストレスの生体への負荷、並びに被検物質とストレスの生体への負荷をそれぞれ行う工程、
（２）（１）の生体及びいずれの負荷も行っていない正常生体における遺伝子の発現量をそれぞれ測定する工程、並びに
（３）（２）により得られた遺伝子の発現量を（１）の生体と正常生体とで比較し、下記（ａ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現パターンを示す被検物質を選択する工程：
（ａ）請求項２において記載のＡ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｂ）請求項２において記載のＢ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに増加する、
（ｃ）請求項２において記載のＣ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時にさらに減少する、
（ｄ）請求項２において記載のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より減少し、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する、
（ｅ）請求項２において記載のＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時に正常生体より増加し、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｆ）請求項２において記載のＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に減少する、
（ｇ）請求項２において記載のＧ群の遺伝子の発現量が、ストレスの生体への負荷時は正常生体と同等であり、被検物質とストレスの生体への負荷時に増加する。 - ストレスがホルボールミリステートアセテート処理であり、遺伝子の発現パターンが（ａ）〜（ｄ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される請求項３記載の生理活性物質のスクリーニング方法。
- ストレスがリポポリサッカライド処理であり、遺伝子の発現パターンが（ｅ）〜（ｇ）記載の遺伝子の発現パターンから選択される請求項３記載の生理活性物質のスクリーニング方法。
- 生体が生物個体又は培養細胞である請求項１〜５いずれか１項に記載の生理活性物質のスクリーニング方法。
- 遺伝子の発現量を該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ量により測定する請求項１〜６いずれか１項に記載の生理活性物質のスクリーニング方法。
- 遺伝子の発現量をＤＮＡアレイを使用したハイブリダイゼーション法により測定する請求項７記載の生理活性物質のスクリーニング方法。
- 請求項８記載の生理活性物質のスクリーニング方法に使用されるＤＮＡアレイであって、請求項２において記載のＡ〜Ｇ群の遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子もしくはその断片が支持体上のあらかじめ定められた位置に固定化されていることを特徴とするＤＮＡアレイ。
- 請求項２において記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- ストレスの負荷された生体において、請求項２において記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、請求項２において記載のＡ群及びＥ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の増加した、請求項２において記載のＢ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、請求項２において記載のＣ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- ストレスが負荷された生体において、ストレスにより発現量の減少した、請求項２において記載のＤ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させる作用を有する化合物を含有してなることを特徴とする遺伝子制御剤。
- 化合物が請求項１〜８いずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた物質である請求項１０〜１５いずれか１項に記載の遺伝子制御剤。
- ストレスの緩和もしくは予防を目的とする請求項１０〜１６いずれか１項に記載の遺伝子制御剤。
- 請求項１において記載の（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を生体に投与することにより、請求項２において記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法。
- 請求項１において記載の（ｉ）記載の化合物、（ｉｉ）記載の化合物及びそれらの化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、もしくは該化合物を含有してなる組成物を、ストレスの負荷された生体に投与することにより、請求項２において記載のＡ群、Ｃ群、Ｅ群及びＦ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を減少させ、及び／又はＢ群、Ｄ群及びＧ群の少なくとも１つの遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする遺伝子の制御方法。
- 請求項１において記載の（ｉ）記載の化合物又は（ｉｉ）記載の化合物と少なくとも１つの遺伝子に対し実質的に同等の遺伝子発現制御活性を有する化合物が、請求項１〜８いずれか１項に記載のスクリーニング方法によって得られた物質である請求項１８又は１９記載の遺伝子の制御方法。
- 請求項１〜８いずれかにおいて記載のスクリーニング方法により得られうる物質。
- 植物由来の物質、担子菌由来の物質又はそれらの誘導体である請求項２１記載の物質。
- 多糖類、その分解物又はそれらの誘導体である請求項２１又は２２記載の物質。
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