KR20030040518A - 생리활성 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

생리활성 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20030040518A KR10-2003-7004796A KR20037004796A KR20030040518A KR 20030040518 A KR20030040518 A KR 20030040518A KR 20037004796 A KR20037004796 A KR 20037004796A KR 20030040518 A KR20030040518 A KR 20030040518A
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마사또모 로꾸시마
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 다양한 생리활성을 갖는 DGE 와 동일한 유전자 제어활성을 갖는 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 후보물질의 스크리닝 방법, 생체의 항상성 유지에 유효한, 예컨대 스트레스의 완화 또는 예방을 목적으로 하는 유전자 제어제, 및 유전자의 제어방법을 제공한다.

Description

생리활성 물질의 스크리닝 방법 {METHOD OF SCREENING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE}
생물은 생활환경의 변화 등과 같은 외적 요인, 바이러스, 세균감염 등과 같은 내적 요인에 의해 다양한 스트레스를 받는다. 스트레스는 그 자체가 생물의 정상적인 생활을 방해하는 요인인데, 이것을 잘 회피할 수 없는 경우나 반대로 과잉반응이 일어난 경우에는 보다 병세가 심한 장애, 예컨대 질병을 일으키게 된다.
스트레스가 부하된 상태나 이로부터 질병으로 이행되는 상태에서는 생체 내의 다양한 기능, 요소가 복합적으로 관여하는데, 거기에는 기본적으로는 유전자의 발현상태의 변화가 존재한다. 따라서, 유전자 레벨에서의 조절에 의해 원활하게 스트레스를 회피하는 것이 가능할 것이다. 그러나, 스트레스를 받고 있는 상태나 그것이 회피되는 과정에서의 유전자 발현의 조절에 대한 상세한 내용은 명확하지 않으며, 상기와 같은 유전자 레벨의 조절에 의한 스트레스 회피수단은 아직 확립되어 있지 않다.
한편, 아가로오스에서 얻을 수 있는 L-글리세로-1,5-에폭시-1αβ, 6-디히드록시-시스-헥사-3-엔-2-온 (L-glycero-1,5-epoxy-1αβ,6-dihydroxy-cis-hexa-3-en-2-one, 이하 DGE 라고 함) 은 다양한 생리활성을 갖고 있고, 생체의 항상성 유지에 유용한 화합물임이 알려져 있다 (국제공개 제99/64424호 팜플렛). 그러나, 이 화합물의 유전자 레벨에서의 작용기작은 밝혀지지 않았다.
본 발명의 목적은 DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 갖는 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 후보물질의 스크리닝 방법, 생체의 항상성 유지에 유효한, 예컨대 스트레스의 완화 또는 예방을 목적으로 하는 유전자 제어제, 및 유전자의 제어방법을 제공하는 것에 있다.
발명의 개요
본 발명의 제 1 발명은, 생리활성 물질의 스크리닝 방법으로서 하기 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다;
(1) ① 피검물질, 및 ② 하기 (i) 에 기재된 화합물 및/또는 하기 (ⅱ) 에 기재된 화합물을 각각 생체에 부하시키는 공정:
(i) 하기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물, 이의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물,
(식 중, X 및 Y 는 H 또는 CH2OH, 단 X 가 CH2OH 일 때 Y 는 H, X 가 H 일 때 Y 는 CH2OH 임)
(ⅱ) 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 3,6-안히드로갈락토오스, 이의 알데히드체, 이의 포수체, 및 이들의 2-O-메틸화체 및 2-O-황산화체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 및/또는 이 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성 당화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물,
(2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 ① 을 부하시킨 경우와 ② 를 부하시킨 경우로 비교하는 공정, 및
(3) 적어도 하나의 유전자가 ② 를 부하시킨 경우와 실질적으로 동등한 발현량의 변화를 나타낸 피검물질을 선택하는 공정.
본 발명의 제 2 발명은, 생리활성 물질의 스크리닝 방법으로서 하기 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다;
(1) 피검물질을 생체에 부하시키는 공정,
(2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량과 해당 부하를 실시하고 있지 않는 경우의 해당 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 양쪽으로 비교하는공정, 및
(3) 하기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 하기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 피검물질을 선택하는 공정:
A 군:
골형성 단백질-6 [BMP-6 (진뱅크 등록번호: NM_001718)] 유전자,
케모카인 리셉터-1 [CCR-1 (진뱅크 등록번호: NM_001295)] 유전자,
간세포 증식인자 [HGF (진뱅크 등록번호: X16323)] 유전자,
세포간 부착 분자-1 [Intercellular adhesion molecule-1: ICAM-1 (진뱅크 등록번호: NM_000201)] 유전자,
인터류킨-1β[IL-1β(진뱅크 등록번호: X02532)] 유전자,
인터류킨-16 [IL-16 (진뱅크 등록번호: M90391)] 유전자,
백혈병 저해인자 [LIF (진뱅크 등록번호: NM_002309)] 유전자,
오스테오폰틴 [osteopontin (진뱅크 등록번호: NM_000582)] 유전자,
종양 괴사인자-α[TNF-α(진뱅크 등록번호: X02910)] 유전자,
뉴로필린-1 [Neuropilin-1 (진뱅크 등록번호: NM_003873)] 유전자,
전사의 시그널 트랜스듀서 및 액티베이터 6 [signal transducer and activator of transcription 6: STAT6 (진뱅크 등록번호: AF067575)] 유전자, 및
호모 사피엔스 (Homo Sapiens) cDNA: FLJ22298 fis, 클론 HRC04637 (진뱅크 등록번호: AK025951) 을 포함하는 유전자,
B 군:
헴옥시게나아제-1 [HO-1 (진뱅크 등록번호: NM_002133) 유전자,
티오레독신 리덕타아제-1 (진뱅크 등록번호: AF106697) 유전자,
추정 번역 개시 인자 [putative translation initiation factor: SUIl (진뱅크 등록번호: AF083441)] 유전자, 및
호모 사피엔스 가설 단백질 [Homo sapiens hypothetical protein: HSPC014 (진뱅크 등록번호: NM_015932)] 유전자,
C 군:
N-myc 하류 조절 유전자 1 [N-myc downstream regulated gene 1: NDRG1 (진뱅크 등록번호: NM_006096)] 유전자,
RNA 특이적 아데노신 디아미나제 [adenosine deaminase, RNA specific: ADAR (진뱅크 등록번호: NM_015841)] 유전자,
스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 2 [splicing factor 3b, subunit 2: SF3B2 (진뱅크 등록번호: NM_006842)] 유전자,
인터류킨 인핸서 결합 인자 3 [interleukin enhancer binding factor 3: ILF3 (진뱅크 등록번호: NM_004516)] 유전자,
발릴-tRNA 합성효소 2 [valyl-tRNA synthetase 2: VARS2 (진뱅크 등록번호: NM_006295)] 유전자, 및
서열목록의 서열번호 12 에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자,
D 군:
진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1 [eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1: EEF1A1 (진뱅크 등록번호: NM_001402)] 유전자,
리보좀 단백질 L17 [ribosomal protein L17: RPL17 (진뱅크 등록번호: NM_000985)] 유전자, 및
리보좀 단백질 L24 [ribosomal protein L24: RPL24 (진뱅크 등록번호: NM_000986)] 유전자,
아르기닌/세린-풍부 스플라이싱 인자 2 [splicing factor, arginine/serine-rich 2: SFRS2 (진뱅크 등록번호: NM_003016)] 유전자,
번역적으로 조절된 종양 단백질 1 [tumor protein, translationally-controlled 1: TPT1 (진뱅크 등록번호: NM_003295)] 유전자,
유비퀴놀-사이토크롬 c 리덕타제 결합 단백질 [ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein: UQCRB (진뱅크 등록번호: NM_006294)] 유전자,
리보좀 단백질 S15a [ribosomal protein S15a: RPS15A (진뱅크 등록번호: NM_001019)] 유전자,
리보좀 단백질 L27 [ribosomal protein L27: RPL27 (진뱅크 등록번호: NM_000988)] 유전자,
E 군:
인터류킨-2 리셉터α[IL2RA (진뱅크 등록번호: X01057)] 유전자,
인터류킨-6 [IL6 (진뱅크 등록번호: X04430)] 유전자,
CD166 (진뱅크 등록번호: Y10183) 유전자,
인터페론 조절인자-1 [IRF1 (진뱅크 등록번호: X14454)] 유전자
인터류킨-15 리셉터α[IL15RA (진뱅크 등록번호: U31628)] 유전자,
핵 인자 카파-b p105 서브유닛 [Nuclear factor kappa-b p105 subunit: NFKB1 (진뱅크 등록번호: M58603)] 유전자,
카스파아제-1 [CASP1 (진뱅크 등록번호: M87507)] 유전자,
인터류킨-1β[IL1β(진뱅크 등록번호: M15330)] 유전자,
종양 괴사인자-α[TNF-α(진뱅크 등록번호: X02910)] 유전자,
Gro1 옹코진 [GRO1 (진뱅크 등록번호: X54489)] 유전자,
인터류킨-1α[IL1A (진뱅크 등록번호: M28983)] 유전자,
인히빈베타 A [INHBA (진뱅크 등록번호: J03634)] 유전자,
인터류킨-7 리셉터 [IL7R (진뱅크 등록번호: M29696)] 유전자,
전구 B 세포 콜로니 증강인자 [PBEF (진뱅크 등록번호: U02020)] 유전자,
간 및 활성화 조절 케모카인 [Liver and activation regulated chemokine: LARC (진뱅크 등록번호: U64197)] 유전자, 및
인터류킨-8 [IL8 (진뱅크 등록번호: M26383)] 유전자,
F 군:
콜로니 자극인자-1 리셉터 [CSF1R (진뱅크 등록번호: X03663)] 유전자,
케모카인 (C-X-C 모티브) 리셉터-4 [CXCR4 (진뱅크 등록번호: AF147204)] 유전자, 및
엔도글린 [ENG (진뱅크 등록번호: NM_000118)] 유전자,
G 군:
헴옥시게나아제-1 [HMOX1 (진뱅크 등록번호: Z82244)] 유전자.
본 발명의 제 3 방법은, 생리활성 물질의 스크리닝 방법으로서 하기 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다;
(1) 스트레스의 생체로의 부하, 및 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하를 각각 실시하는 공정,
(2) (1) 의 생체 및 어떤 부하도 실시하고 있지 않는 정상 생체에서의 유전자의 발현량을 각각 측정하는 공정, 및
(3) (2) 에 의해 얻어진 유전자의 발현량을 (1) 의 생체와 정상 생체로 비교하고, 하기 (a) ∼ (g) 에 기재된 유전자의 발현 패턴에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 패턴을 나타내는 피검물질을 선택하는 공정:
(a) 상기 A 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(b) 상기 B 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 증가하고,
(c) 상기 C 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 감소하고,
(d) 상기 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가하고,
(e) 상기 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(f) 상기 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(g) 상기 G 군의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가함.
본 발명의 제 3 발명에서, 생체에 부하되는 스트레스가 포르볼 미리스테이트 아세테이트 처리인 경우, 유전자의 발현 패턴은 상기 (a) ∼ (d) 가 예시되고, 생체에 부하되는 스트레스가 리포폴리사카라이드 처리인 경우, 유전자의 발현 패턴은 상기 (e) ∼ (g) 가 예시된다.
본 발명의 제 1 내지 제 3 발명에서, 생체로는 생물개체 또는 배양세포가 예시된다. 유전자의 발현량으로는 이 유전자로부터 전사되는 mRNA 양에 의해 측정되는 유전자의 발현량이 예시되고, 해당 측정은 특히 DNA 어레이를 사용한 하이브리다이제이션법에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명은 본 발명의 제 1 내지 제 3 발명에 의해 얻어질 수 있는 물질도 포함한다.
본 발명의 제 4 발명은, 본 발명의 제 1 내지 제 3 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 DNA 어레이에 관한 것으로, 상기 A ∼ G 군에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 2 개의 유전자 또는 이의 단편이 지지체 상의 미리 정해진 위치에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 어레이에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 발명은, 상기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 상기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 발명은, 스트레스가 부하된 생체에서 상기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 상기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 발명은, 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 증가한 상기에 나타내는 A 군 및 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 8 발명은, 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 증가한 상기에 나타내는 B 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 9 발명은, 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 감소된 상기에 나타내는 C 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 10 발명은, 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 감소된 상기에 나타내는 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 내지 제 10 발명에서, 함유되는 각각의 화합물이 본 발명의 제 1 내지 제 3 발명 중 어느 한 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질인 유전자 제어제가 예시된다. 또, 본 발명의 제 5 내지 제 10 발명의 유전자 제어제로는 스트레스의 완화 또는 예방을 목적으로 하는 유전자 제어제가 예시된다.
본 발명의 제 11 발명은, 상기 (i) 에 기재된 화합물, 상기 (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하는 조성물을 생체에 투여함으로써, 상기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 상기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 유전자의 제어방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 12 발명은, 상기 (i) 에 기재된 화합물, 상기 (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하는 조성물을 스트레스가 부하된 생체에 투여함으로써, 상기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 상기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 유전자의 제어방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 11 및 제 12 발명에서, 상기 (i) 에 기재된 화합물 또는 상기 (ⅱ) 에 기재된 화합물과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로는, 본 발명의 제 1 내지 제 3 발명 중 어느 한 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질이 예시된다.
본 발명은 생리활성 물질의 스크리닝 방법, 유전자 제어제 및 유전자의 제어방법에 관한 것이다.
본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법의 한 양태에서는 상기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 구조를 갖는 화합물을 사용한다. 해당 화합물의 일례로는 L-글리세로-1,5-에폭시-1αβ, 6-디히드록시-시스-헥사-3-엔-2-온 (DGE) 을 들 수 있다.
이 화합물은 환원 말단에 3,6-안히드로갈락토오스를 갖는 화합물, 예컨대 아가로비오스, κ-카라비오스 및 3,6-안히드로갈락토오스를 환원 말단에 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 중성에서 알칼리의 조건하에 처리 (유지) 함으로써 얻을 수 있다. 또, 해당 화합물의 pH 7 미만에서의 산가수분해 및/또는 효소분해를 실시하고, 이어서 얻어진 산분해물 및/또는 효소분해물을 중성에서 알칼리의 조건하에 처리 (유지) 함으로써 얻을 수 있다.
또한, 상기 효소분해로는 예컨대 3,6-안히드로갈락토오스를 환원 말단에 갖는 화합물, 예컨대 아가로오스의 α-아가라아제에 의한 분해를 들 수 있다. 효소분해반응을 실시하기 위한 조건은 특별히 한정되지 않고, 사용하는 효소에 대한 공지된 조건에 따르면 된다.
환원 말단에 3,6-안히드로갈락토오스를 갖는 화합물, 예컨대 아가로비오스, κ-카라비오스 및 3,6-안히드로갈락토오스를 환원 말단에 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물의 pH 7 이상의 알칼리 처리에서, 해당 화합물을 용해 또는 현탁시키는 알칼리의 종류에 특별히 한정은 없지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 암모니아 등의 무기염기, 트리스, 에틸아민, 트리에틸아민 등의 유기염기를 사용할 수 있다. 알칼리의 농도도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.0001 ∼ 5 N, 보다 바람직하게는 0.001 ∼ 1 N의 농도로 사용할 수 있다. 또한, 처리온도도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0 ∼ 200℃, 보다 바람직하게는 20 ∼ 130℃ 로 설정하면 된다. 또한 처리시간도 특별히 한정되지 않지만, 수초 ∼ 수일로 설정하면 된다. 알칼리의 종류와 농도, 처리시의 온도 및 시간은 원료가 되는 상기 화합물의 종류 및 목적으로 하는 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 생성량에 따라 적절히 선택하면 된다. 일반적으로 pH 7 이상이면 되는데, 저농도의 알칼리보다 고농도의 알칼리, 저온보다 고온을 선택함으로써 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 생성이 신속히 진행된다.
예컨대, 아가로비오스 또는 κ-카라비오스의 pH 11.5 인 수용액을 제조하고, 37℃ 에서 5 분간 유지함으로써 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물이 생성된다.
생성된 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물을 함유하는 알칼리액은 목적에 따라 중화시켜 사용해도 되고, 또 pH 7 미만의 산성 용액으로 하여 사용해도 된다.
본 발명의 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 정제수단으로는 화학적 방법, 물리적 방법 등의 공지의 정제수단을 사용하면 되고, 예컨대 겔여과법, 분자량 분획막에 의한 분획법, 용매추출법, 이온교환수지 등을 사용한 각종 크로마토그래피 등의 정제방법을 조합하여 정제하면 된다.
예컨대, 아가로비오스의 중성에서 알칼리의 조건하에서의 처리물로부터 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 X 가 CH2OH, Y 가 H 인 화합물이 정제되고, κ-카라비오스의 중성에서 알칼리에서의 조건하에서의 처리물로부터 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 X 가 H, Y 가 CH2OH 인 화합물이 정제된다.
또, 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 유도체로는 생체에서 해당 화합물과 실질적으로 동등한 유전자 발현 패턴을 나타낼 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물과 SH 기 함유 화합물 (예컨대, 시스테인, 글루타티온 또는 이들의 공지된 유도체) 를 반응시켜 얻어지는 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물과 SH 기 함유 화합물을 반응시켜 얻어지는 화합물의 제조방법으로는 국제공개 제99/64424호 팜플렛에 기재된 공지된방법을 들 수 있다.
화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물 또는 이의 유도체의 염으로는 의약으로 허용되는 염이 바람직하며 공지된 방법으로 변환할 수 있다.
또, 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물인 DGE 는 아가로올리고당이 생체내에 흡수되었을 때 생성되는 화합물인 점에서, 아가로올리고당을 생체에 투여했을 경우에 DGE 와 동일한 생체반응을 일으킬 것으로 예상되고 있다 [Jpn. J. Phycol. (Sorui) 48:13-19, March 10, 2000]. 따라서, 본 발명에서는 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물 대신에 생체에 투여한 경우에 해당 화합물이 생성되는 것으로 생각된다. 상기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 3,6-안히드로갈락토오스, 이의 알데히드체, 이의 포수체, 및 이들의 2-O-메틸화체 및 2-O-황산화체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 및/또는 이 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성 당화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 사용할 수도 있다 (또한, 3,6-안히드로갈락토오스의 알데히드체, 포수체, 2-O-메틸화체 및 2-O-황산화체에 대해서는 국제공개 제00/41579호 팜플렛에 기재된 화합물이 예시됨). 해당 화합물의 예로는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스, 아가로옥타오스 등의 아가로올리고당이 예시된다.
[1] 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법
상기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 하나인 DGE 는 생체가 받은 손상을 완화시키고 생체의 항상성 유지를 촉진시키는 작용을 갖는다. DGE 는 상기와 같은 스트레스를 받은 생체에서 발현량의 변화가 관찰되는 유전자의 해당 발현량을조절하는 활성, 즉 유전자 발현 제어활성 (또는 작용) 을 갖고 있고, 이 활성은 생체내의 각종 유전자의 발현 제어를 개재시키는 것으로 알려져 있다. 또한, DGE 는 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 예컨대 세포자멸사(apoptosis) 유발 활성, 제암 활성, 활성산소 생산억제 활성, 과산화지질 래디컬 생산억제 활성, 일산화질소 생산억제 활성 등의 항산화 활성, 항병원 미생물 활성, 항변이원 활성, α-글리코시다아제저해 활성, 면역조절 작용, 프로스타글란딘 합성억제 작용, 항염증 작용, 항알레르기 작용, 사이토카인 생산조절 작용, 항류머티즘 작용, 항당뇨병 작용, 활막 세포증식억제 활성, 열쇼크 단백질 생산유도 작용 등을 들 수 있다. 그리고, 이와 같은 생리활성은 DGE 의 유전자 제어작용에 의한 유전자 발현량의 조절에 의해 발현되는 것으로 생각된다.
본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법은 상기와 같은 다양한 생리활성이 알려진 DGE 의 유전자 제어작용에 기초하는 유전자의 발현량의 변화를 지표로 하여, 동일한 유전자 발현량의 변화를 적어도 나타낼 수 있는 DGE 이외의 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 즉, 생체내에서 DGE 와 동일한 유전자의 발현 패턴을 적어도 나타낼 수 있는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 얻어진 물질은 DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 나타낼 수 있기 때문에, 예컨대 DGE 와 동일한 생리활성을 갖는 것으로 추정된다. 따라서, 해당 화합물을 사용하여 예컨대 해당 생리활성의 발현이 유효하게 기여되는 질환 및/또는 증상 (예컨대, 암, 염증, 알레르기, 당뇨병 등의 상기 DGE 의 생리활성을 필요로 하는 질환) 의 치료 또는 예방에 유효한 의약, 식품, 음료 등을제공하는 것이 가능해진다.
또, DGE 의 생리활성과는 다른 아직 알려지지 않은 생리활성을 갖는 물질 등을 얻는 것이 가능하며, 이러한 관점에서 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법은 생리활성 물질의 후보물질의 스크리닝 방법으로 취할 수도 있다.
본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법에서는 구체적으로는 하기 공정에 의해 DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 갖는 물질을 얻을 수 있다;
(1) ① 피검물질, 및 ② 상기 (i) 에 기재된 화합물 및/또는 상기 (ⅱ) 에 기재된 화합물을 각각 생체에 부하시키는 공정,
(2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 ① 을 부하시킨 경우와 ② 를 부하시킨 경우로 비교하는 공정, 및
(3) 적어도 하나의 유전자가 ② 를 부하시킨 경우와 실질적으로 동등한 발현량의 변화를 나타낸 피검물질을 선택하는 공정.
또한,「실질적으로 동등한 발현량의 변화」란, 반드시 발현량의 정도에 있어서 동등한 것을 의도하는 것이 아니라, 적어도 발현량의 변화 패턴이 동등한 것을 의도한다.
즉, ① 피검물질을 부하, 즉 투여하거나 또는 섭취시킨 (하기에 있어서 동일) 생체 유래의 시료에서의 유전자 발현량을 측정한다. 한편, ② 의 화합물, 예컨대 상기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물, 예컨대 DGE 를 부하시킨 생체 유래의 시료에서의 유전자 발현량을 측정한다. 이어서 각각의 유전자 발현량 및/또는 그 변화를 비교하여 피검물질과 DGE 각각의 유전자 발현 제어작용이 유사한지의 여부를 판정한다. 유전자 발현 제어작용이 유사한 물질은 DGE 와 동일한 생리활성을 갖고 있을 가능성이 높아, DGE 와 동일한 목적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
상기 DGE 가 갖는 유전자 발현 제어작용은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 DGE 를 부하시킨 생체와 해당 부하를 실시하지 않는 경우의 해당 생체 (대조) 사이에서의 유전자 발현상태 (발현 패턴) 를 비교함으로써 확인할 수 있다. 그 때, 양쪽 사이에서 발현량에 차이를 갖는 유전자는 DGE 에 의한 제어대상 유전자인 것으로 생각된다. 또한, DGE 가 갖는 유전자 발현 제어작용은 후술하는 실시예 1 에 기재된 바와 같이 생체로의 스트레스 부하를 통하여 확인할 수도 있다.
또한, 본 명세서에서 생체로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 생물개체 (인간을 제외함) 또는 배양세포를 들 수 있다. 예컨대 생물개체를 사용하는 경우, 이 개체로부터 적당한 시료, 예컨대 조직의 일부나 체액 등을 채취하여 유전자 발현상태를 조사할 수 있다.
또, 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용되는 피검물질은 전혀 한정되지 않고, 천연 유래인 것, 인위적으로 합성된 것, 천연 유래의 물질을 인위적으로 개변한 것 등을 사용할 수 있다. 이들 물질은 단리된 것, 복수 물질을 함유하는 것 모두 사용할 수 있고, 예컨대 적절한 분리조작과 본 발명의 스크리닝 방법을 조합하여 유용한 물질을 정제 또는 단리시킬 수도 있다.
또, 본 발명의 스크리닝 방법을 사용함으로써, 예컨대 상기 (i) 에 기재된 화합물 또는 (ⅱ) 에 기재된 화합물과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 조성물,예컨대 식물, 동물, 담자균 또는 미생물 등으로부터의 천연 유래의 조성물로부터 그 활성 성분을 특정할 수도 있다. 예컨대, 이와 같은 조성물을 구성하는 화합물을 피검물질로 하여, 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법을 실시함으로써 그 활성 성분을 특정할 수도 있다.
또, 상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 물질, 즉 상기 (i) 에 기재된 화합물 또는 상기 (ⅱ) 에 기재된 화합물과 실질적으로 동등한 유전자 제어활성을 갖는 물질도 본 발명의 범위에 포함된다. 해당 물질은 피검물질을 본 발명의 스크리닝 방법에 제공하고, 해당 방법에서 정해진 유전자 제어활성을 갖는지의 여부를 판정함으로써 얻을 수 있다. 또, 해당 물질로는, 예컨대 식물, 담자균류 유래의 물질이나 이들의 유도체가 예시되고, 여기에서 사용되는 식물로는 다양한 생리활성이 알려져 있는 약용 식물이나 해조류 등이 예시된다.
또, 이들에 유래하는 물질로는 특별히 한정되지 않지만, 구성 성분으로서 당을 함유하는 물질, 예컨대 다당류, 이의 분해물 또는 이들의 유도체를 들 수 있고, 그 중에서도 분자량 100 ∼ 2000 정도의 물질 등이 바람직하다. 또한, 이들 중에서 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 대조로 사용된 물질 (예컨대, DGE) 이외의 유전자 제어활성도 갖는 물질을 선택할 수 있다. 상기의 구성 성분으로 당을 함유하는 물질로는 3,6-안히드로갈락토오스를 분자내에 갖는 물질이 특히 바람직하다. 또한, 분해물, 유도체는 이의 근원이 되는 물질과, 생체내에서 실질적으로 동등한 유전자의 발현 패턴을 나타낼 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
유전자 발현상태의 비교는 공지된 방법, 예컨대 해당 유전자 산물 (폴리펩티드) 양의 측정이나 해당 유전자로부터 전사되는 mRNA 양의 측정에 의해 실시할 수 있다. 상기 목적에서는 mRNA 양을 측정하는 방법이 효율적이며 바람직하다.
예컨대, 폴리펩티드 양의 측정은 해당 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합될 수 있는 항체를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 해당 항체로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어떤 것이어도 되고, 또한 공지 기술에 의해 수식된 항체나 항체의 유도체, 예컨대 Fab 프래그먼트, 단일 사슬 항체 등이어도 된다. 이들 항체 및 유도체 등은 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다 (예컨대, 1992 년, John Wiely & Sons, Inc. 발행, John E. Coligan 편저, Current Protocols in Immunology 참조). 또, 폴리펩티드 양의 측정방법으로는 예컨대 공지된 효소 면역측정법, 형광 면역측정법, 발광 면역측정법 등을 들 수 있다. 또한, 상기 항체 등을 상기 폴리펩티드 양의 측정방법에서의 검출의 용이화를 위해 각종 표지를 실시해도 된다.
mRNA 양의 측정방법에 특별히 한정은 없고, 공지된 방법 예컨대 RT-PCR 법, 노던ㆍ하이브리다이제이션법, 도트블롯ㆍ하이브리다이제이션법, DNA 어레이를 사용하는 하이브리다이제이션법, DNA 마이크로비즈법 등을 사용할 수 있다. 미량의 시료로 다수의 유전자 발현상태를 조사할 수 있기 때문에, 상기 목적에는 DNA 어레이를 사용하는 방법이 특히 바람직하다.
본 명세서에서 「DNA 어레이」란, 유전자 또는 유전자 유래의 DNA 단편이 지지체 상의 미리 정해진 영역 (위치) 에 고정되어 있는 것을 가리키며, 예컨대 DNA 칩이라고 호칭되고 있는 것을 포함한다. 또, 유전자 또는 유전자 유래의 DNA단편이 지지체 상에 고밀도로 고정되어 있는 것은 DNA 마이크로어레이라고도 불리운다.
DNA 어레이의 지지체는 하이브리다이제이션에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 통상 슬라이드유리, 실리콘칩, 니트로셀룰로오스나 나일론의 막 등이 사용된다. 지지체 표면은 공유결합 또는 비공유결합에 의해 1 개 사슬 DNA 또는 2 개 사슬 DNA 를 고정화시킬 수 있는 것이면 어떤 것이어도 되고, 지지체 표면에 친수성 또는 소수성의 관능기를 갖고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 수산기, 아미노기, 티올기, 알데히드기, 카르복실기, 아실기 등을 갖고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 관능기는 지지체 자체의 표면 특성으로 존재하고 있어도 되지만, 표면 처리에 의해 도입해도 된다. 이와 같은 표면 처리물로는, 예컨대 유리를 아미노알킬실란 등의 시판되고 있는 실란 커플링제로 처리한 것이나, 폴리리신이나 폴리에틸렌이민 등의 폴리 양이온으로 처리한 것 등을 들 수 있다. 또, 이들 처리를 실시한 슬라이드유리의 일부는 시판되고 있다.
지지체 상에 고정화되는 유전자 또는 이의 DNA 단편으로는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리, 이들을 주형으로 한 공지된 핵산 증폭법, 예컨대 PCR (polymerase chain reaction) 법, LCR (ligase chain reaction) 법, SDA (strand displacement amplification) 법이나 ICAN (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids) 법 (국제공개 제00/56877호 팜플렛에 기재) 등에 의해 증폭된 DNA 를 들 수 있고, 이러한 핵산증폭에서의 반응조건은 특별히 한정되는 것은 아니다. 또, RNA 를 주형으로 한 전사 증폭 시스템 (TAS; transcription-based amplification system) 법, 자립복제 (3SR; self-sustained sequence replication) 법, NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) 법, TMA (transcription-mediated amplification) 법 또는 Qβ레플리카아제법에 의해 증폭된 RNA 를 역전사시킴으로써 얻어지는 DNA 를 사용할 수도 있다.
지지체로의 고정화 조작은 시판되고 있는 DNA 어레이 제작장치, 예컨대 어피메트릭스사 제조의 DNA 칩 제작장치를 사용하여 실시할 수 있다. 이 장치를 사용함으로써 유전자가 고정밀도로 정렬, 고정화된 DNA 어레이 (DNA 마이크로어레이) 를 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA 어레이로는 임의의 유전자 또는 이 유전자 유래의 DNA 단편이 고정된 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 생체의 항상성 유지에 관련된 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자 또는 이 유전자 유래의 DNA 단편이 고정된 어레이가 사용된다. 또, 각종 유전자의 단편을 고정화시킨 DNA 마이크로어레이가 시판되고 있어 (IntelliGene Human Cytokine CHIP 등, 다카라슈조사 제조), 이것을 사용해도 된다. 또, 이 DNA 어레이에 고정화되는 유전자 또는 이 유전자 유래의 DNA 단편의 선택은 후술하는 실시예 3 에 기재된 DNA 마이크로비즈법이나, 서브트랙션법, 디퍼렌셜 디스플레이법 등에 의해 생체로의 스트레스의 부하, 예컨대 생체의 항상성 유지에 지장을 초래하는 약제, 예컨대 포르볼 미리스테이트 아세테이트나 리포폴리사카라이드 등을 부하시킨 생체와 미부하의 생체에서 발현량에 변화가 관찰되는 유전자를 선택함으로써 실행할 수 있다.
이와 같은 DNA 어레이를 사용함으로써 핵산시료 중에 함유되는 다종류의 핵산분자의 양을 동시에 측정할 수 있다. 또, 소량의 핵산시료로도 측정할 수 있다는 이점이 있다. 예컨대, 시료 중의 mRNA 를 표지하거나, 또는 mRNA 를 주형으로서 표지된 cDNA 를 제조하여, 이것과 DNA 어레이 사이에서 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 시료 중에서 전사되어 있는 복수의 mRNA 를 동시에 검출하고 또한 이의 발현량을 측정할 수 있다.
DGE 를 부하시킨 경우와 부하시키고 있지 않는 경우의 생체에서의 유전자 발현량의 차이는, 예컨대 두 경우에서의 유전자의 발현 패턴을 하기와 같이 하여 비교함으로써 조사할 수 있다.
즉, DGE 를 부하시킨 생체 유래의 시료 (DGE 부하 시료) 중의 핵산과 DNA 어레이와의 하이브리다이제이션 및 DGE 를 부하시키고 있지 않는 생체 유래의 시료 (대조 시료) 중의 핵산과 DNA 어레이의 하이브리다이제이션의 각각의 결과를 비교함으로써 양쪽에서 발현량이 다른 유전자를 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 시료 중의 핵산을 임의의 방법으로 표지하고, 해당 핵산과 하이브리다이제이션을 실시한 어레이에 대해, 사용된 표지에 따라 적절한 시그널을 검출하여 어레이 상의 각 유전자의 DGE 부하 시료 및 대조 시료 중의 발현량을 비교한다. 바람직하게는 DGE 부하 시료와 대조 시료 중의 각각의 핵산을 미리 다른 방법으로 표지해 둠으로써, 복수 표지, 예컨대 2 종류의 형광을 검출할 수 있는 다파장 검출 형광 애널라이저를 사용하여, DGE 부하 시료에서의 유전자 발현량과 대조 시료에서의 유전자발현량의 차이를 동일한 DNA 어레이 상에서 경합 하이브리다이제이션으로 비교할 수 있다. 즉, 양쪽을 당량 혼합하여 DNA 어레이와 하이브리다이제이션을 실시함으로써 양쪽 유전자 발현량의 차이를 시그널의 색 및 강도의 차이로서 검출할 수 있다. 그 결과, 얻어진 시그널의 강도에 양쪽 사이에서 우위인 차이가 있는 유전자는 DGE 에 의한 발현 제어대상의 유전자인 것으로 특정된다.
보다 구체적으로는 하기의 공정에 의해 DGE 부하 시료와 대조 시료 사이에서의 유전자 발현량의 차이를 조사할 수 있다.
서로 비교하고자 하는 생체 유래의 시료, 예컨대 다른 처리가 실시된 세포에서 mRNA 를 제조하고, 시료 중의 mRNA, 이 mRNA 유래의 cDNA 또는 이 cDNA 로부터 전사 또는 증폭된 핵산을 표지한다. 표지에 사용되는 표지물질로는, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광물질, 발광단을 갖는 물질 등의 물질을 사용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로는 Cy2, FluorX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 이소티오시안산플루오레세인 (FITC), 텍사스레드, 로다민 등을 들 수 있다. 또, 동시에 검출할 수 있는 관점에서 2 종류 이상의 형광물질을 사용하고, 바람직하게는 2 종류의 형광물질을 사용하고, DGE 부하 시료, 대조 시료를 각각 다른 형광물질로 표지하는 것이 바람직하다. 또, 표지는 시료 중의 mRNA, 이 mRNA 유래의 cDNA 또는 이 cDNA 로부터 전사 또는 증폭된 핵산을 화학적으로 표지하는 방법 이외에, 예컨대 mRNA 로부터의 cDNA 합성시, 또는 cDNA 로부터의 전사, 증폭반응시에 표지 뉴클레오티드를 공존시킴으로써 실시할 수도 있다.
이어서, 상기 표지 핵산과, 적당한 유전자에 대응하는 핵산 또는 이의 단편을 고정화된 DNA 어레이와의 사이에서 하이브리다이제이션을 실시한다. 하이브리다이제이션은 공지된 방법으로 실시하면 되고, 그 조건은 사용하는 DNA 어레이나 표지 cDNA 에 적합한 것을 적절하게 선택하면 된다. 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2 판, 제 9.52 내지 9.55 페이지 (1989)] 에 기재된 조건으로 실시할 수 있다.
상기 하이브리다이제이션에 의해 얻어진 표지 유래의 시그널을 비교하여, 시료 사이에서 시그널의 강도에 유의한 차이가 있는 유전자를 검출할 수 있다. 구체적으로는 상기 방법으로 표지된 핵산시료와 하이브리다이제이션을 실시한 어레이 대해 방사능, 형광, 발광 등의 시그널 강도를 전용 측정기, 예컨대 크로마토 스캐너 또는 이미지 애널라이저 등을 사용하여 검출함으로써, 그 시그널 강도의 차이로부터 그 발현량이 유의하게 변화하는 유전자를 검출할 수 있다. 표지의 검출법은 사용되는 표지물질의 종류에 따라 적절한 것을 선택하면 된다.
각 시료 유래의 핵산 (mRNA, 이 mRNA 유래의 cDNA 또는 이 cDNA 로부터 전사 또는 증폭된 핵산) 을 서로 구별할 수 있는 표지물질로 표지함으로써, 1 회의 하이브리다이제이션으로 두 시료 중의 유전자 발현량의 차이를 비교할 수 있다. 예컨대, 상기 Cy3 및 Cy5 를 표지물질로 사용하는 경우, Cy3 은 532㎚, Cy5 는 635㎚ 의 파장으로 스캔함으로써 두 시료 중의 유전자 발현량을 1 매의 DNA 어레이 상에서 측정할 수 있다.
이렇게, 상이한 시료 사이에서의 다종류의 유전자 발현량을 미량의 시료로 비교할 수 있다.
또한, DGE 부하 시료와 대조 시료의 유전자 발현의 차이를 측정하기 위해서는 양쪽 mRNA 양 및 사용한 형광물질간의 강도차를 보정할 필요가 있는데, 해당 보정은 비교적 발현변동이 적은 표준적인 유전자 (바람직하게는 하우스키핑 유전자) 를 사용하여 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
또, 본 명세서에서 유전자 발현량의 차이가 우위인 것으로 판정하는 경우란, 예컨대 대조 시료에서의 유전자 발현량에 대한 DGE 부하 시료에서의 유전자 발현량의 비, 즉 상대발현비율 (DGE 부하 시료에서의 유전자 발현량/대조 시료에서의 유전자 발현량) 이 1.7 이상 또는 0.6 이하인 경우이다. 여기에서, 상대발현비율이 1.7 이상인 경우가 발현량이 증가한 유전자이며, 0.6 이하인 경우가 발현량이 감소한 유전자인 것으로 판정한다.
또한, DGE 부하 시료와 대조 시료 사이에서의 유전자 발현량의 차이는 공지된 DNA 마이크로비즈 어레이법에 의해 실시할 수도 있다. 해당 방법에 의하면, 발현량이나, 이미 알려져 있거나 아직 알려져 있지 않는 것에 관계없이 발현될 수 있는 유전자를 모두 해석할 수 있다.
상기 방법에 의해 DGE 를 투여 또는 섭취시킨 생체와 DGE 를 부여하지 않는 대조 사이의 유전자 발현상태를 비교하고, DGE 에 의해 발현이 제어될 수 있는 유전자를 확인할 수 있다. 상기와 같이 하여 확인된 DGE 가 유전자 발현 제어작용을 미칠 수 있는 유전자로는, 예컨대 후술하는 표 1 ∼ 3 에 나타내는 A ∼ G 군에 기재된 유전자를 들 수 있다.
생물은 생활환경의 변화 등과 같은 외적 요인, 바이러스, 세균감염 등과 같은 내적 요인에 의해 다양한 스트레스를 받는다. 스트레스로는 예컨대 고온, 저온환경, 기아상태, 화학물질로의 폭로 등이 예시된다. 여기에서, 화학물질로는 예컨대 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (TPA), 리포폴리사카라이드 (LPS), 피토헤마글루티닌 (PHA), 오카다산 등을 들 수 있다. 그 중에서도 TPA 나 LPS 는 생체에 투여됨으로써 염증을 야기시켜, 이러한 작용을 이용하여 인공적으로 염증모델을 제작할 목적으로 사용되고 있다.
이와 같은 스트레스를 받은 결과, 생체내에서는 다양한 유전자의 발현이 변화된다. 그 중에는 스트레스의 결과, 발현이 유도 또는 증강되어 생체에 악영향을 미치는 유전자군 (예컨대, A 군 및 E 군의 유전자) 도 있고, 스트레스의 악영향을 없애기 위해 발현이 유도 또는 증강되거나, 또는 스트레스를 받고 있지 않는 경우와 발현이 동등한 유전자군 (예컨대, B 군 및 G 군의 유전자) 도 있다. 스트레스를 받아 A 군 및 E 군의 유전자의 발현이 높은 상태가 발생하고, 그 발현이 저하되지 않는 상태가 계속되면 다양한 질환의 발병으로 이어질 것으로 생각된다. 따라서, 스트레스를 받았을 때에 A 군 및 E 군의 유전자의 발현이 잘 증가되지 않는 상태로 하는 것은 다양한 질환의 예방으로 이어진다. 또, 스트레스를 받았을 때에 증가된 A 군 및 E 군의 유전자의 발현을 신속하게 저하시키는 것도 다양한 질환의 예방, 치료, 증악의 저지로 이어진다. 한편, B 군 및 G 군의 유전자는 스트레스 상태를 회피하기 위해 발현이 증가하는 유전자군으로, 스트레스를 받았을 때에 이러한 유전자군을 보다 고발현으로 함으로써 신속하게 스트레스 상태를 회피하는 것이 가능해져, 스트레스가 원인이 되는 다양한 질환의 예방, 치료, 증악의저지로 이어질 것으로 생각된다.
또, 스트레스의 결과, 스트레스의 악영향을 없애기 위해 발현이 감소되거나, 또는 스트레스를 받고 있지 않는 경우와 발현이 동등한 유전자군 (예컨대, C 군 및 F 군의 유전자) 도 있고, 스트레스의 결과, 발현이 감소되어 생체에 악영향을 미치는 유전자군 (예컨대, D 군의 유전자) 도 있다. C 군의 유전자는 스트레스 상태를 회피하기 위해 발현이 감소되는 유전자군으로, 스트레스를 받았을 때에 이러한 유전자군의 발현량을 더욱 억제함으로써 신속하게 스트레스 상태를 회피하는 것이 가능해져, 스트레스가 원인이 되는 다양한 질환의 예방, 치료, 증악의 저지로 이어질 것으로 생각된다. 한편, 스트레스를 받아 D 군의 유전자 발현이 낮은 상태가 발생하고 그 발현이 증가하지 않는 상태가 계속되면, 다양한 질환의 발병으로 이어질 것으로 생각된다. 따라서, 스트레스를 받았을 때에 D 군의 유전자 발현이 증가하는 것은 다양한 질환의 예방으로 이어진다. 또, 스트레스를 받았을 때에 감소한 D 군의 유전자 발현을 신속하게 증가시키는 것도 다양한 질환의 예방, 치료, 증악의 저지로 이어진다.
본 발명에 의해 명확해진, DGE 가 발현을 억제시키는 (감소시키는) A 군, C군, E 군 및 F 군의 유전자, 및 DGE 가 발현을 촉진시키는 (증가시키는) B 군, D 군 및 G 군의 유전자를 표 1 ∼ 3 에 나타낸다.
유전자명 GenBankAccession No.
A 군골형성 단백질-6 (BMP-6)케모카인 리셉터-1 (CCR-1)간세포 증식인자 (HGF)세포간 부착 분자-1 (ICAM-1)인터류킨-1β(IL-1β)인터류킨-16 (IL-16)백혈병 저해인자 (LIF)오스테오폰틴 (osteopontin)종양 괴사인자-α(TNF-α)뉴로필린-1 (Neuropilin-1)전사의 시그널 트랜스듀서 및 액티베이터 6 (STAT6)호모 사피엔스 cDNA: FLJ22298 fis, 클론 HRC04637 을 포함하는 유전자 NM_001718NM_001295X16323NM_000201X02532M90391NM_002309NM_000582X02910NM_003873AF067575AK025951
B 군:헴옥시게나아제-1 (HO-1)티오레독신 리덕타아제-1추정 번역 개시 인자 (SUIl)호모 사피엔스 가설 단백질 (HSPC014) NM_002133AF106697AF083441NM_015932
유전자명 GenBankAccession No.
C 군N-myc 하류 조절 유전자 1 (NDRG1)RNA 특이적 아데노신 디아미나제 (ADAR)스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 2 (SF3B2)인터류킨 인핸서 결합 인자 3 (ILF3)발릴-tRNA 합성효소 2 (VARS2)서열목록의 서열번호 12 에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 NM_006096NM_015841NM_006842NM_004516NM_006295없음
D 군진핵생물 전자 신장 인자 1 알파 1 (EEF1A1)리보좀 단백질 L17 (RPL17)리보좀 단백질 L24 (RPL24)아르기닌/세린-풍부 스플라이싱 인자 2 (SFRS2)번역적으로 조절된 종양 단백질 1 (TPT1)유비퀴놀-사이토크롬 c 리덕타제 결합 단백질 (UQCRB)리보좀 단백질 S15a (RPS15A)리보좀 단백질 L27 (RPL27) NM_001402NM_000985NM_000986NM_003016NM_003295NM_006294NM_001019NM_000988
유전자명 GenBankAccession No.
E 군인터류킨-2 리셉터α(IL2RA)인터류킨-6 (IL6)CD166인터페론 조절인자-1 (IRF1)인터류킨-15 리셉터α(IL15RA)핵 인자 카파-b p105 서브유닛 (NFKB1)카스파아제-1 (CASP1)인터류킨-1β(IL1β)종양 괴사인자-α(TNF-α)Gro1 옹코진 (GRO1)인터류킨-1α(IL1A)인히빈베타 A (INHBA)인터류킨-7 리셉터 (IL7R)전구 B 세포 콜로니 증강인자 (PBEF)간 및 활성화 조절 케모카인 (LARC)인터류킨-8 (IL8) X01057X04430Y10183X14454U31628M58603M87507M15330X02910X54489M28983J03634M29696U02020U64197M26383
F 군콜로니 자극인자-1 리셉터 (CSF1R)케모카인 (C-X-C 모티브) 리셉터-4 (CXCR4)엔도글린 (ENG) X03663AF147204NM_000118
G 군헴옥시게나아제-1 (HMOX1) Z82244
피검물질에 대해, 상기 DGE 와 동일하게 하여 유전자 발현 제어작용을 조사하고, 이것을 DGE 의 것과 비교함으로써 DGE 와 동일한 유전자 제어활성을 갖는 물질을 선택할 수 있다. 또한, 피검물질을 부하시킨 경우와 DGE 를 부하시킨 경우에서의 유전자 발현량의 변화의 비교, 즉 발현 패턴의 비교에서는 적어도 하나의 유전자에 대해 비교하면 되지만, 보다 유용한 물질을 찾아내는 관점에서는 복수 유전자의 발현 패턴을 비교하는 것이 바람직하다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예컨대 바람직하게는 2 종 이상의 유전자, 보다 바람직하게는 4 종 이상의 유전자, 더욱 바람직하게는 7 종 이상의 유전자의 발현 패턴을 비교하여 원하는 유전자 제어활성을 갖는 물질이 선택된다.
바람직한 양태로는, 전술한 표 1 ∼ 3 에 나타내는 A 군 ∼ G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에 대해 비교하면 된다. 보다 바람직하게는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자와 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 (합계 2 개 이상의 유전자), 더욱 바람직하게는 A 군 ∼ G 군의 각 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 (합계 7 개 이상의 유전자) 에 대해 발현 패턴이 비교된다.
또, 상기의 지견을 기초로, 본 발명에 의해 하기와 같은 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법의 다른 양태가 제공된다. 즉, 본 발명에 의해 하기 공정을 포함하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법이 제공된다;
(1) 피검물질을 생체에 부하시키는 공정,
(2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량과 해당 부하를 실시하고 있지 않는 경우의 해당 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 양쪽으로 비교하는 공정, 및
(3) 표 1 ∼ 3 중의 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 피검물질을 선택하는 공정. 해당 방법에 의해 DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 갖는 물질을 간편하게 얻을 수 있다.
또, 보다 상세하게는 하기와 같은 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법의 다른 양태가 제공된다. 즉, 본 발명에 의해 하기 공정을 포함하는 생리활성물질의 스크리닝 방법이 제공된다;
(1) 스트레스의 생체로의 부하, 및 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하를 각각 실시하는 공정,
(2) (1) 의 생체 및 어떤 부하도 실시하고 있지 않는 정상 생체에서의 유전자의 발현량을 각각 측정하는 공정, 및
(3) (2) 에 의해 얻어진 유전자의 발현량을 (1) 의 생체와 정상 생체로 비교하고, 하기 (a) ∼ (g) 에 기재된 유전자의 발현 패턴에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 패턴을 나타내는 피검물질을 선택하는 공정:
(a) 상기 A 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(b) 상기 B 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 증가하고,
(c) 상기 C 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 감소하고,
(d) 상기 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가하고,
(e) 상기 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(f) 상기 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
(g) 상기 G 군의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가함. 해당 방법에 의해 DGE 와 동일한 유전자 제어활성을 갖는 물질을 간편하게 얻을 수 있다.
또한, 상기 2 개의 다른 양태에서, 피검물질의 유전자 발현 제어작용은 상기 DGE 와 동일한 방법에 의해 조사할 수 있다. 또, 스트레스의 생체로의 부하는 상기한 바와 같은 각종 스트레스를 생체에 대해 부하시킴으로써 실시되는데, 바람직하게는 화학물질을 사용하여 실시하는 것이 바람직하며, 그 중에서도 TPA (포르볼 미리스테이트 아세테이트) 처리 또는 LPS (리포폴리사카라이드) 처리가 보다 바람직하다. 여기에서, 처리란 투여 또는 섭취시키는 것을 말한다.
TPA 는 발암 프로모터로 알려져 있고, 이의 작용으로는 직접적인 변이작용 이외에 생체의 염증유도에 의한 발암작용이 알려져 있다. 즉 TPA 는 마크로파지 등의 염증세포로부터 NO, 프로스타글란딘 E2등, 염증성 메디에이터의 유리를 야기시킨다.
LPS 는 사이토카인 유도인자로 생체에 대해 발열, 치사효과, 혈압저하 등의 다양한 영향을 미치는데, 이 작용은 LPS 그 자체의 직접 작용이 아니라, LPS 에 의해 마크로파지를 중심으로 하는 숙주세포가 생산하는 염증성 사이토카인 등의 작용에 의한 것이다.
상기 A ∼ D 군은 스트레스로서 TPA 를 사용했을 때에 유전자의 변동이 확인된 유전자군이며, 또 상기 E ∼ G 군은 LPS 를 사용했을 때에 유전자의 변동이 확인된 유전자군이다. DGE 는 TPA 나 LPS 에 의해 유발되는 염증을 억제하기 때문에, 즉 상기 공정에서의 스트레스로서 TPA 처리를 이용한 경우에 상기 유전자의 발현 패턴 (a) ∼ (d) 를 나타내는 화합물을 선택하면, TPA 에 의해 유발되는 염증과 동일한 메커니즘으로 유발되는 염증을 치료 또는 예방하는 효과를 갖는 화합물을 얻을 수 있는 것을 기대할 수 있고, 또 스트레스로서 LPS 처리를 이용한 경우에 상기 유전자의 발현 패턴 (e) ∼ (g) 를 나타내는 화합물을 선택함으로써, LPS 에 의해 유발되는 염증과 동일한 메커니즘으로 유발되는 염증을 치료 또는 예방하는 효과를 갖는 화합물을 얻을 수 있는 것을 기대할 수 있다.
또한, 유전자 발현 제어작용이 다소 다른 물질이라도 해당 물질은 DGE 가 갖는 생리활성 중 몇가지를 갖고 있을 가능성이 있다. 이와 같은 물질도 DGE 의 대체물질로서 목적에 따라 사용하는 것은 가능하다.
또, 다른 한 양태로서, 본 발명의 생리활성 물질의 스크리닝 방법에 바람직하게 사용되는 키트도 제공할 수 있다. 해당 키트는 예컨대 표 1 ∼ 3 에 나타내는 A 군 ∼ G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 발현되는 mRNA 또는 이의 단편을 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브, 또는 해당 유전자에 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 항체 또는 이의 단편을 적어도 함유하고 있으면 된다.
[2] 본 발명의 DNA 어레이
또 본 발명은 상기 생리활성 물질의 스크리닝 방법에 사용되는 DNA 어레이로서, 상기 A ∼ G 군의 유전자에서 선택되는 적어도 2 개의 유전자 또는 이의 단편이 지지체 상의 미리 정해진 위치에 고정화된 DNA 어레이를 제공한다. 본 발명의 DNA 어레이는 상기 DGE 에 의해 발현 제어되는 유전자 또는 이 유전자 유래의 DNA 단편이 지지체 상의 미리 정해진 위치에 고정화된 어레이이다. 즉, 각각의 유전자에 대응하는 DNA 또는 이의 단편의 위치가 지지체 상에서 미리 결정되어 있고, 이와 같은 어레이를 사용한 경우, 검출된 시그널의 위치로부터 이 시그널이 어느 유전자의 DNA 또는 이의 단편에 유래하는 것인지를 즉시 알 수 있다. 이 어레이는 상기 [1] 의 생리활성 물질의 스크리닝, 및 DGE 의 투여 또는 섭취가 유효한 질병에서의 유전자적인 병태 해석에 유용하다.
상기 DNA 어레이에 고정되는 유전자 또는 이의 DNA 단편으로는, 생체로의 스트레스나 DGE 에 의해 발현 제어되는 유전자 또는 이의 DNA 단편이거나, 또는 이들을 함유하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 후술하는 실시예 3 에 기재된 DNA 마이크로비즈법을 사용하여 고정화되는 유전자 또는 이의 DNA 단편을 선택할 수 있다. 또, 생체로의 스트레스나 DGE 에 의해 발현 제어되는 유전자 이외의 유전자, 예컨대 음성 대조로서 사용되는 유전자 등을 함유해도 된다. 또, 이의제조는 공지된 방법에 따라 실시하면 되고, 예컨대 상기 [1] 에 기재된 DNA 어레이 제작장치를 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 어레이에서는 유전자 또는 이의 DNA 단편은 1 개 사슬, 2 개 사슬 중 어떤 것이 고정되어 있어도 된다. 또, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중 어떤 것이어도 된다. 또, 이의 제법에도 특별히 한정은 없고, 화학적으로 합성된 것, 천연 유래인 것, 효소적으로 합성된 것, 이들의 조합이어도 된다. 또한, 유전자 또는 이의 DNA 단편의 사슬길이로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 약 20 염기길이 ∼ 약 1 킬로 염기길이인 것이 바람직하고, 또 이 사슬길이보다 짧거나 또는 긴 것이라도 임의의 피검 시료 중의 핵산과 하이브리다이제이션에서 특이적으로 하이브리다이즈하는 것이면 된다.
어레이의 지지체, DNA 고정화 밀도에도 특별히 한정은 없고, 목적이나 고정화되는 유전자수에 따라 적절한 것을 선택하면 된다. 예컨대, DNA 어레이의 지지체로는 상기한 바와 같은 것을 들 수 있고, 하이브리다이제이션에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 통상 슬라이드유리, 실리콘칩, 니트로셀룰로오스나 나일론의 막 등이 사용된다. 또, 다수 유전자를 고정화시키는 경우나 미량의 시료에 적합한 어레이를 제작하고자 하는 경우에는, 지지체에 고밀도로 유전자를 고정시킨 마이크로어레이를 바람직하게 사용할 수 있다. 해당 마이크로어레이로는 100 도트/㎠ 이상의 밀도로 핵산, 특히 DNA 가 고정화된 것이 바람직하다. 또, 이의 형상에도 특별히 한정은 없고, 평판 형상, 원반 형상, 테이프 형상 등 적절하게 선택할 수 있다.
[3] 본 발명의 유전자 제어제, 유전자 제어방법
또 본 발명은 생체에서의 유전자 발현의 제어방법에 관한 것으로, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 스트레스를 받은 생체에서 발현량이 변화된 유전자에 대해 해당 유전자의 발현을 제어 (조절) 하여 생체의 항상성을 유지하는 방법, 및 이 방법을 위한 유전자 제어제를 제공한다.
예컨대 상기와 같은 스트레스를 받은 생체에서의 영향은, 이러한 생체 중의 유전자 발현을 적절하게 제어함으로써 해소할 수 있는 것으로 생각된다. 그로 인해, 해당 유전자, 예컨대 표 1 ∼ 3 에 예시된 유전자를 제어할 수 있는 화합물 또는 해당 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물, 즉 본 발명에 의해 제공되는 유전자 제어제의 사용이 유효하다. 따라서, 해당 유전자 제어제는 특히 스트레스의 완화 또는 예방용으로 바람직하다.
상기 유전자 제어제에 유효성분으로 함유시킬 수 있는 화합물로는, 예컨대 DGE, DGE 의 유도체 및/또는 이들의 염을 사용할 수 있고, 또한 DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물, 이의 유도체 및/또는 이들의 염을 사용할 수도 있다. 또한, 해당 화합물의 유도체 등은 상기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물의 유도체 등과 동일하게 하여 제조할 수 있다. DGE 와 동일한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로는, 상기 [1] 에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질을 바람직하게 사용할 수 있다.
해당 유전자 제어제는 공지된 의약의 제조방법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분을 약학적으로 허용될 수 있는 공지된 액상 또는 고체상의담체와 혼합하고, 또한 원하는 바에 따라 공지된 용제, 분산제, 유화제, 안정화제, 활택제 등을 첨가하여 액제, 현탁제, 유제 등과 같은 액제, 또는 정제, 과립제, 산제, 분말제 등과 같은 고형제로 할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 유전자 제어제의 투여형태 및 제제형태에 따라 선택할 수 있다. 경구제로 하는 경우는 예컨대 전분, 유당, 만니트, 카르복시메틸셀룰로스 등의 이용이 바람직하다. 한편, 비경구제로 하는 경우는 예컨대 주사용 증류수, 생리식염수, 대두유, 프로필렌글리콜 등의 이용이 바람직하다.
본 발명의 유전자 제어제에서의 상기 유효성분의 함유량은 유전자 제어제의 투여형태, 투여방법 등에 따라 변화되어 일괄적으로 결정할 수 없지만, 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 양으로 상기 유효성분을 투여할 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 유전자 제어제는 제제형태에 따른 적당한 투여경로에 의해 경구적으로 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적으로 투여하는 경우, 예컨대 주사제로서, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다. 이의 투여량도 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 제제형태, 투여방법, 사용목적, 투여대상인 환자의 연령, 체중, 증상에 따라, 본 발명의 원하는 효과를 얻을 수 있는 범위에서 적절하게 결정하면 된다.
본 발명의 유전자 제어제로는 구체적으로 하기와 같은 것이 예시된다.
(1) 표 1 ∼ 3 에 기재된 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제,
(2) 스트레스가 부하된 생체에서 표 1 ∼ 3 에 기재된 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제,
(3) 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 증가한 표 1 ∼ 3 에 기재된 A 군 및 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제,
(4) 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 증가한 표 1 ∼ 3 에 기재된 B 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제,
(5) 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 감소된 표 1 ∼ 3 에 기재된 C 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제, 및
(6) 스트레스가 부하된 생체에서 스트레스에 의해 발현량이 감소된 표 1 ∼ 3 에 기재된 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 유전자 제어제.
또한, 본 발명에 의해,
상기 (i) 에 기재된 화합물, (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하여 이루어지는 조성물을 생체에 투여함으로써, 표 1 ∼ 3 에 기재된 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 유전자의 제어방법, 및
상기 (i) 에 기재된 화합물, (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하여 이루어지는 조성물을 스트레스가 부하된 생체에 투여함으로써, 표 1 ∼ 3 에 기재된 A 군, C 군, E 군 및 F 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 유전자의 제어방법이 제공된다.
여기에서, 생체란 포유동물, 그 중에서도 인간이다. 또, 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 제어활성을 갖는 화합물로는, 상기 [1] 에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질을 바람직하게 사용할 수 있다.
이러한 유전자의 제어방법에 의하면, 표 1 ∼ 3 에 나타낸 유전자의 발현을 바람직하게 제어할 수 있고, 생체가 받은 스트레스의 완화 및/또는 회피가 가능해진다.
또한, 유효성분으로 투여하는 화합물 또는 해당 화합물을 함유하는 조성물의투여방법, 투여량 등은 예컨대 상기 유전자 제어제와 동일해도 된다.
본 발명의 유전자의 제어방법에 의해, 스트레스에 기인하는 생체에 악영향을 미치는 유전자군의 발현을 억제시키는 동시에, 스트레스 상태의 회피에 관여하는 유전자군의 발현을 증강시켜 다양한 질환의 예방, 치료, 증악을 저지할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) RNA 의 제조
HL-60 세포 (ATCC CCL-240) 를 10% 소태아 혈청 (JRH 바이오사이언시즈사 제조), 1.3% 디메틸술폭시드 함유 RPMI1640 배지 (바이오휘타커사 제조, 12-702F) 에 현탁시키고, 5% 탄산가스 존재하, 37℃ 에서 1 주일 동안 배양하여 호중구양으로 분화유도하였다.
상기에 의해 얻어진 세포를 원심에 의해 회수하고, 106세포/mL 가 되도록 10% 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켜 10㎝ 샬레에 10mL 씩 첨가하였다. 각 샬레에 100㎕ 의 4mM DGE 수용액을 첨가하여 4 시간후에 토탈 RNA 를 회수한 구분, 10㎕ 의 100㎍/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (TPA, 기브코사 제조, 13139-019) 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 4 시간후에 토탈 RNA 를 회수한 구분, 100㎕ 의 4mM DGE 수용액을 첨가하여 6 시간 동안 배양후, 다시 10㎕ 의 100㎍/mLTPA 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 4 시간후에 total RNA 를 회수한 구분을 설정하였다. 또, 음성 대조로서 100㎕ 의 물을 첨가하여 4 시간후에 total RNA 를 회수한 구분을 설정하였다. 또한, RNA 는 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조, 74104) 를 사용하여 키트의 설명서에 따라 제조하였다.
(2) cDNA 의 합성
상기에 의해 얻어진 각 total RNA 25㎍ 과 100pg 의 λpoly A+ RNA-A (다카라슈조사 제조, TX802) 를 RNA Fluorescence Labeling Core Kit (다카라슈조사 제조, TX807) 와, 1mM FluoroLink Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP (아마샴 파마시아사 제조, PA53022(Cy3), PA55022(Cy5)) 를 사용하고, 키트의 설명서에 따라 형광 표지된 cDNA 의 합성반응과 정제를 실시하였다. 형광 표지된 DNA 용액을 표 4 의 조합으로 혼합하여 클로로포름ㆍ이소아밀알콜 (24:1) 추출을 실시하고, 2㎕ 의 5 ×Competitor I (Human) (다카라슈조사 제조, TX808) 을 첨가하여 에탄올침전에 의해 DNA 를 회수하였다. 얻어진 DNA 는 10㎕ 의 하이브리다이제이션 용액 (6 ×SSC, 0.2% SDS, 5 ×덴하르트 용액, 0.1㎎/mL 변성 연어정자 DNA 용액을 0.22㎛ 의 필터에 통과시킨 것) 에 용해시켜 하이브리다이제이션에 제공하였다.
조합 1 음성 대조 (Cy3 표지) 와 DGE 첨가 구분 (Cy5 표지)
조합 2 음성 대조 (Cy3 표지) 와 TPA 첨가 구분 (Cy5 표지)
조합 3 음성 대조 (Cy3 표지) 와 DGE 및 TPA 첨가 구분 (Cy5 표지)
조합 4 TPA 첨가 구분 (Cy3 표지) 과 DGE 및 TPA 첨가 구분 (Cy5 표지)
(3) 하이브리다이제이션
커버유리 (22 ×22㎜) 위에 10㎕ 의 프리하이브리다이제이션 용액 (6 ×SSC, 0.2% SDS, 5 ×덴하르트 용액, 1㎎/mL 변성 연어정자 DNA 용액을 0.22㎛ 의 필터에 통과시킨 것) 을 적가하고, Human Cytokine CHIP(ver.1.0) (다카라슈조사 제조, X104) 의 어레이 DNA 면이 아래가 되도록 하여 커버유리 위에 기포가 들어가지 않도록 씌웠다. 칩의 어레이 DNA 면이 위가 되도록 뒤집고, 페이퍼본드 (고쿠요사 제조, 터-100) 를 커버유리의 주변에 적가하여 용액을 밀폐하고 실온에서 2 시간 동안 방치함으로써 프리하이브리다이제이션을 실시하였다. 칩을 2 ×SSC 중에 옮겨 페이퍼본드 및 커버유리를 떼내고, 2 ×SSC, 계속해서 0.2 ×SSC 중에서 세정후, 원심에 의해 수분을 날려 건조시켰다.
상기 하이브리다이제이션 용액에 용해시킨 형광 표지 DNA 용액을 95℃ 에서 2 분 동안 가열하여 변성시킨 후, 원심하여 상층액을 커버유리 (22 ×22㎜) 위에 적가하고, 상기와 같이 처리한 칩의 어레이 DNA 면이 아래가 되도록 하여 커버유리 위에 기포가 들어가지 않도록 씌웠다. 칩의 어레이 DNA 면이 위가 되도록 뒤집고, 페이퍼본드를 커버유리의 주변에 적가하여 용액을 밀폐하였다. 이 칩을 습식 박스에 넣은 후, 65℃ 의 항온조에서 16 시간 보온하였다. 칩을 2 ×SSC 중에 옮겨 페이퍼본드 및 커버유리를 떼내고, 55℃ 의 2 ×SSC, 0.2% SDS 중에서 30 분 동안 2 회 세정하고, 계속해서 65℃ 의 2 ×SSC, 0.2%, SDS 에서 5 분 동안 세정하고, 실온의 0.05 ×SSC 에서 5 분 동안 세정후, 원심에 의해 수분을 날려 건조시켰다.
(4) 해석
Affymetrix418 Array Scanner (다카라슈조사 제조, GM205) 에 의해 상기 칩의 각 스폿의 형광시그널을 판독하였다. 이 화상데이터를 기초로 ImaGene (다카라슈조사 제조, BD001) 에 의해 각 스폿의 형광시그널을 정량하였다. 이 결과, TPA 첨가 구분에서 몇가지의 유전자 발현의 변동을 확인할 수 있고, 이것에 대해 DGE + TPA 첨가 구분에서 이 변동을 더욱 상하시키고 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, DGE 는 몇가지의 유전자에 대해 TPA 에 의한 유전자의 변동을 수식하는 작용을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 정리한 것을 표 5 에 나타낸다. 표 5 는 TPA 에 의해 변동이 있었던 유전자 중, DGE 에 의해 그 변동이 수식된 것을 정리한 것으로, A-1 군은 DGE 에 의해 발현이 억제된 유전자, B-1 군은 DGE 에 의해 발현이 촉진된 유전자이다.
유전자명 GenBankAccession No.
A-1 군골형성 단백질-6 (BMP-6)케모카인 리셉터-1 (CCR-1)간세포 증식인자 (HGF)세포간 부착 분자-1 (ICAM-1)인터류킨-1β(IL-1β)인터류킨-16 (IL-16)백혈병 저해인자 (LIF)오스테오폰틴 (osteopontin)종양 괴사인자-α(TNF-α)뉴로필린-1 (Neuropilin-1) NM_001718NM_001295X16323NM_000201X02532M90391NM_002309NM_000582X02910NM_003873
B-1 군:헴옥시게나아제-1 (HO-1)티오레독신 리덕타아제-1 NM_002133AF106697
실시예 2
(1) PBMC 의 분리 및 보존
건강한 인간 제공자로부터 400mL 채혈을 실시하였다. 채혈액을 PBS(-) 로 2 배 희석하고, Ficoll-paque (파마시아사 제조) 위에 중층 후, 500 ×g 으로 20분 동안 원심하였다. 중간층의 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 피펫으로 회수하여, RPMI1640 배지 (바이오휘타커사 제조) 를 이용하여 세정하였다. 채취한 PBMC 는 90% FCS (JRH 바이오사이언시즈사 제조)/10% 디메틸술폭시드로 이루어지는 보존액에 현탁시켜 액체 질소 중에 보존하였다. 실험시에는 이러한 보존 PBMC 를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해시켜, 10㎍/㎖ DNase (칼비오켐사 제조) 를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 세정후, 트리판블루 염색법으로 생세포수를 산출하여 각 실험에 제공하였다.
(2) 플라스틱 접착성 단구의 분리
5% 인간 AB 형 혈청, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민 (이상, 바이오휘타커사 제조), 10mM HEPES (나카라이테스크사 제조), 1% 스트렙토마이신-페니실린 (기브코 BRL 사 제조) 을 포함하는 RPMI1640 배지 (이하, 5HRPMI 배지라고 약칭함) 에 1 ×107세포/mL 가 되도록 PBMC 를 현탁시킨 후, 100㎜ 샬레 (아사히 테크노글라스사 제조) 에 15mL 씩 접종하여, 37℃ 에서, 5% 의 CO2로 습식 인큐베이터 내에서 1.5 시간 동안 인큐베이트하였다. 그 후, 비접착성 세포를 흡인제거하고, 각 웰을 RPMI1640 배지를 이용하여 세정하고, 10mL 의 5HRPMI배지를 첨가하여 플라스틱 접착성 단구를 얻었다.
(3) RNA 의 제조
실시예 2-(2) 에 의해 얻어진 각 샬레에 10㎕ 의 1㎍/mL 리포폴리사카라이드 (LPS, 시그마사 제조, L-2012) 수용액을 첨가하여 4 시간후에 total RNA 를 회수한 구분, 10㎕ 의 20mM DGE 수용액을 첨가하여 4 시간 동안 배양후 다시 10㎕ 의 1㎍/mL LPS 수용액을 첨가하여 4 시간후에 total RNA 를 회수한 구분을 설정하였다. 또, 음성 대조로서 10㎕ 의 물을 첨가하여 4 시간후에 total RNA 를 회수한 구분을 설정하였다. 또한, RNA 는 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조, 74104) 를 사용하여 키트의 취급설명서에 따라 제조하였다.
(4) cDNA 의 합성
cDNA 의 합성은 실시예 1-(2) 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 단, 형광 표지한 DNA 용액의 조합은 표 6 에 따라 실시하였다.
조합 1 음성 대조 (Cy3 표지) 와 LPS 첨가 구분 (Cy5 표지)
조합 2 음성 대조 (Cy3 표지) 와 DGE 및 LPS 첨가 구분 (Cy5 표지)
(5) 하이브리다이제이션
하이브리다이제이션은 실시예 1-(3) 에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 단, 칩은 Human Cytokine CHIP (ver.2.0) (다카라슈조사 제조, X104) 을 사용하였다.
(6) 해석
Affymetrix428 Array Scanner (다카라슈조사 제조) 에 의해 상기 칩의 각 스폿의 형광시그널을 판독하였다. 이 화상데이터를 기초로 ImaGene (다카라슈조사 제조, BD001) 에 의해 각 스폿의 형광시그널을 정량하였다. 이 결과, 몇가지의 유전자에 대해 LPS 첨가 구분에서 발현의 증가를 확인할 수 있고, 이것에 대해 DGE 를 첨가함으로써 이 증가를 억제하고 있음을 확인할 수 있었다. 또, 몇가지의 유전자에 대해 LPS 첨가 구분에서 발현의 변동이 관찰되지 않지만, DGE + LPS 첨가 구분에서 발현의 증가 및 하강을 확인할 수 있었다. 그 결과를 정리한 것을 표 7 에 나타낸다. 표 7 은 LPS 에 의해 발현이 증가한 유전자 중, DGE 에 의해 그 증가가 억제된 것 (E 군), LPS 에 의해 발현이 변동하지 않지만 DGE + LPS 에서 발현이 하강한 것 (F 군) 및 증가한 것 (G 군) 을 정리한 것이다.
유전자명 GenBankAccession No.
E 군인터류킨-2 리셉터α(IL2RA)인터류킨-6 (IL6)CD166인터페론 조절인자-1 (IRF1)인터류킨-15 리셉터α(IL15RA)핵 인자 카파-b p105 서브유닛 (NFKB1)카스파아제-1 (CASP1)인터류킨-1β(IL1β)종양 괴사인자-α(TNF-α)Grol 옹코진 (GRO1)인터류킨-1α(IL1A)인히빈베타 A (INHBA)인터류킨-7 리셉터 (IL7R)전구 B 세포 콜로니 증강인자 (PBEF)간 및 활성화 조절 케모카인 (LARC)인터류킨-8 (IL8) X01057X04430Y10183X14454U31628M58603M87507M15330X02910X54489M28983J03634M29696U02020U64197M26383
F 군콜로니 자극인자-1 리셉터 (CSF1R)케모카인 (C-X-C 모티브) 리셉터-4 (CXCR4)엔도글린 (ENG) X03663AF147204NM_000118
G 군헴옥시게나아제-1 (HMOX1) Z82244
실시예 3 DNA 마이크로비즈의 제작과 유전자의 선택
[Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 제 97 권, 제 1665 ∼ 1670 페이지, (2000 년) (이하, 문헌 1 이라고 함)] 에 기재된 방법에 따라 이하에 나타내는 바와 같이 DNA 마이크로비즈의 제작을 실시하였다.
(1) cDNA 의 합성
인간 전골수성 백혈병 세포 HL-60 세포 (ATCC CCL-240) 를 10% 소태아 혈청 (JRH 바이오사이언시즈사 제조), 1.3% 디메틸술폭시드를 각각 함유하는 RPMI1640 배지 (바이오휘타커사 제조) 에 현탁시키고, 5% 탄산가스 존재하, 37℃ 에서 1 주일 동안 배양하고, 상기 세포를 호중구양으로 분화유도하였다. 얻어진 세포를 원심에 의해 회수하여 10% 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 1 ×106세포/㎖ 가 되도록 현탁시킨 후, 이 현탁액을 10㎝ 샬레 2 장에 10㎖ 씩 첨가하였다. 한쪽의 샬레에 100㎕ 의 물 (A), 또 다른 한쪽의 샬레에 10㎕ 의 100㎍/㎖ 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (TPA, 기브코사 제조) 디메틸술폭시드 용액 (B) 을 첨가하여 각각 4 시간 동안 배양하였다. 각각의 샬레에서 회수한 (A), (B) 세포 각각에서 트리졸시약 (기브코사 제조) 을 사용하여 전체 RNA 를 제조하고, 이어서 올리고텍스TM-dT30 (다카라슈조사 제조) 을 사용하여 전체 RNA 에서 mRNA 를 정제하였다. 이 mRNA 2.5㎍ 을 주형으로 하고, cDNA 합성 키트 (스트라다진사 제조) 를 사용하여 cDNA 의 합성을 실시하였다. 그 때, 역전사에 사용하는 프라이머로서 서열목록의 서열번호 1 에 나타내는 염기서열의 5' 비오틴 표지 프라이머를 사용하였다.
이렇게 하여 얻어진 cDNA 를 페놀ㆍ클로로포름 처리하고 세파로오스 CL4B (아마샴 파마시아사 제조) 를 사용하여 겔여과 정제한 후, 에탄올침전을 실시하였다. 침전으로 회수된 cDNA 를 200㎕ 의 DpnII 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 에 용해시켜 제한효소 DpnII (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 에 의한 소화를 실시하였다. 이 소화물로부터 스트렙토아비딘 마그네틱 비즈 (다이널사 제조) 를 사용하여 cDNA 의 3' 측 부분을 회수한 후, 20㎕ 의 10 ×NEB#2 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 을 첨가하여 전체 양을 200㎕ 로 조정하고, 제한효소 BsmBI (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 에 의한 소화를 실시하였다. 반응액에 대해 페놀ㆍ클로로포름 처리 및 에탄올침전을 실시한 후, 침전물을 멸균수 10.5㎕ 에 용해시켜 이것을 3' 측 cDNA 용액으로 하기의 실험에 사용하였다.
(2) 3' 측 cDNA와 안티 택이 부착된 마이크로비즈의 하이브리다이제이션
실시예 3-(1) 에서 합성한 (A) 및 (B) 유래의 3' 측 cDNA 용액 1㎕ 를 문헌 1 에 기재된 택 벡터 pLCV2 200ng 에 각각 삽입하여 14 만 ∼ 18 만 클론으로 이루어지는 플라스미드 풀 6 개를 제조하였다. 서열목록의 서열번호 2 에 기재된 염기서열의 5' 비오틴 표지 프라이머, 및 서열목록의 서열번호 3 에 기재된 염기서열의 5' FAM 표지 프라이머를 100㎕ 의 반응액 1 개 당 각각 100p㏖ 사용하고, 반응액 1 개 당 상기 각 플라스미드 풀 125ng 를 주형으로 한 PCR 을 각 플라스미드 풀 당 48 개 실시하였다. PCR 은 하기의 조건에서 실시하였다.
94℃-3 분 유지
94℃-30 초, 67℃-3 분을 1 사이클로 한 8 사이클
94℃-30 초, 64℃-3 분을 1 사이클로 한 22 사이클
67℃-3 분 유지
반응종료후, PCR 반응액을 각 풀마다 1 개로 모아 페놀ㆍ클로로포름 처리 및 에탄올침전을 실시한 후, 얻어진 침전을 멸균수 1200㎕ 에 용해시켰다. 여기에 10 ×NEB#4 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 180㎕ 를 첨가하여 전체 양을 1800㎕ 로 한 후, 제한효소 PacI (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 에 의한소화를 실시하였다. 반응액으로부터 울트라링크 SA 레진 (피어스사 제조) 에 흡착하는 분획을 제외하고 얻어지는 cDNA 용액에 대해 페놀ㆍ클로로포름 처리 및 에탄올침전을 실시한 후, 침전을 멸균수 1200㎕ 에 용해시켰다. 여기에 10 ×NEB#2 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 180㎕ 를 첨가하여 전체 양을 1800㎕ 로 조정하고, T4 DNA 폴리머라아제 (다카라슈조사 제조) 처리를 실시하였다. 이 때 기질로서 dGTP 만을 첨가함으로써 택 부분의 1 개 사슬화를 실시하였다.
이 1 개 사슬 택을 갖는 cDNA 의 각 풀마다 300㎍ 을 문헌 1 에 기재된 1 억 4400 만개의 안티 택이 부착된 마이크로비즈와 혼합하여, 400㎕ 의 하이브리다이제이션 완충액 (10mM 인산 완충액 (pH 7.2), 0.5M NaCl, 0.01% Tween 20, 1.2% 덱스트란황산) 중, 72℃ 에서 진탕하면서 3 일 동안 하이브리다이제이션을 실시하였다. 원심분리에 의해 마이크로비즈를 모아 500㎕ 의 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM 디티오쓰레이톨, 0.01% Tween 20 에 현탁시켜 진탕하면서 64 ∼ 70℃ 에서 30 분 동안 세정하였다. 이 세정조각을 수차례 반복한 후에 6 풀 분량의 세정을 마친 cDNA 가 부착된 마이크로비즈를 모아, MoFlo 사이토미터 (사이토메이션사 제조) 를 사용하여 마이크로비즈의 FAM 의 형광강도 (여기파장: 488㎚, 검출파장: 530㎚) 를 측정하고, 형광강도가 큰 쪽에서 1% 의 마이크로비즈를 분취하였다. 상기의 조작에 의해 cDNA 가 하이브리다이제이션에 의해 결합된 약 600 만개의 마이크로비즈를 얻었다.
(3) DNA 마이크로비즈 현탁액의 제조
실시예 3-(2) 에서 얻어진 cDNA 가 하이브리다이제이션에 의해 결합된 마이크로비즈 중 약 200 만개를 100㎕ 의 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1.4mM 디티오쓰레이톨, 0.01% Tween 20, 각 0.1mM 의 dATP, dGTP, dTTP, 5-메틸 dCTP, 1mM ATP 에 현탁시키고, 20U 의 T4 DNA 폴리머라아제와 400U 의 T4 DNA 리가아제를 첨가하여 12℃ 에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응은 프로나아제 처리에 의해 정지되고, 이어서 반응액으로부터 마이크로비즈를 원심분리에 의해 모아 100㎕ 의 DpnII 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 에 현탁시켜 DpnII (뉴 잉글랜드 바이오러브즈사 제조) 로 소화를 실시하였다. 원심분리에 의해 마이크로비즈를 모아 100㎕ 의 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 5mM MgCl2, 0.033mM dGTP, 7.5mM 디티오쓰레이톨, 0.01% Tween 20 에 현탁시키고, 10U 의 DNA 폴리머라아제I 라지프래그먼트 (다카라슈조사 제조) 를 첨가하여 25℃ 에서 15 분 동안 반응시켰다. 원심분리에 의해 마이크로비즈를 모아 100㎕ 의 라이게이션 완충액 (다카라슈조사 제조) 에 현탁후, 미리 서열목록의 서열번호 4, 서열번호 5 에 나타내는 염기서열의 DNA 를 어닐시켜 제작한 어댑터 0.1n㏖ 을 첨가하고, T4 DNA 리가아제 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 라이게이션반응을 실시하였다. 마이크로비즈를 원심분리에 의해 모아 비즈 스트립핑 용액 (150mM NaOH 0.01%, Tween 20) 에 현탁시켜 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 반응액에서 원심분리에 의해 상층액을 제거한 후, 마이크로비즈를 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA, 0.01% Tween 20으로 세정하고, 1㎖ 의 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA, 0.01% Tween 20 에 현탁시켜 샘플 1 및 샘플 2 유래의 DNA 마이크로비즈 현탁액을 얻었다.
(4) 프로브의 제작
실시예 3-(1) 에서 제조한 (A) 및 (B) 유래의 3' 측 cDNA 1㎕ 를 문헌 1 에 기재된 프로브벡터 pLCV 200ng 에 각각 삽입하여 800 만 ∼ 1000 만 클론으로 이루어지는 플라스미드를 제조하였다. 이 플라스미드의 각각 10㎍ 에 유니버설 완충액 H (다카라슈조사 제조) 20㎕ 를 첨가하여 전체 양을 200㎕ 로 한 후, 제한효소 Sau3AI (다카라슈조사 제조) 로 소화를 실시하였다. (A) 유래의 Sau3AI 소화를 마친 플라스미드 1.2㎍ 을 주형으로 서열목록의 서열번호 6 에 나타내는 염기서열의 5' FAM 표지 프라이머 2n㏖ 을 사용하고, 또 (B) 유래의 Sau3AI 소화를 마친 플라스미드 2.4㎍ 을 주형으로 서열목록의 서열번호 7 에 나타내는 염기서열의 5' Cy5 표지 프라이머 4n㏖ 을 사용하여 각각 리니어 PCR 을 실시하였다. 리니어 PCR 은 하기의 조건에서 실시하였다.
95℃-5 분 유지
95℃-30 초, 64℃-30 초, 72℃-30 초를 1 사이클로 한 25 사이클
72℃-10 분 유지
리니어 PCR 후의 반응액의 각각에서 키아퀵 PCR 퓨리피케이션 키트 (키아겐사 제조) 를 사용하여 증폭 DNA 를 정제하고 에탄올침전을 실시한 후, 멸균수 21㎕ 에 용해시켜 샘플 1 유래 FAM 형광 표지 프로브 및 샘플 2 유래 Cy5 형광 표지 프로브를 얻었다.
(5) DNA 마이크로비즈와의 하이브리다이제이션
실시예 3-(3) 에서 제조한 샘플 1 유래의 DNA 마이크로비즈와 샘플 2 유래의 DNA 마이크로비즈를 각각 약 36 만개 씩 혼합하고, 이 비즈에 (4) 에서 제작한 샘플 1 유래 FAM 형광 표지 프로브 및 샘플 2 유래 Cy5 형광 표지 프로브를 각 5㎍ 을 첨가하고, 50㎕ 의 완충액 (4 ×SSC, 25% 포름아미드, 0.1% SDS) 중에서 진탕하면서 65℃ 에서 종액 하이브리다이제이션을 실시하였다. 원심분리에 의해 모은 마이크로비즈를 1 ×SSC, 0.1% SDS 용액으로 65℃ 에서 30 분간 세정후, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS 로 65℃ 에서 30 분간 세정하고, 원심분리에 의해 DNA 마이크로비즈를 모아, 이것을 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA, 0.01% Tween 20 에 현탁시켜 하이브리다이제이션을 마친 DNA 마이크로비즈를 얻었다.
(6) 분류 (sorting)
실시예 3-(5) 에서 얻은 하이브리다이제이션을 마친 DNA 마이크로비즈를 MoFlo 사이토미터 (사이토메이션사 제조) 를 사용한 분류에 제공하였다. DNA 마이크로비즈에 대해 FAM 의 형광강도 (여기파장: 488㎚, 검출파장: 530㎚) 및 Cy5 의 형광강도 (여기파장: 647㎚, 검출파장: 670㎚) 를 측정하고, FAM 의 형광강도가 강한 DNA 마이크로비즈를 3692 개 (비즈 현탁액 A), Cy5 의 형광강도가 강한 DNA 마이크로비즈를 3349 개 (비즈 현탁액 B) 분취하였다.
(7) PCR 및 DNA 염기서열 결정
실시예 3-(6) 에서 분취한 비즈 현탁액 A 및 B 를 주형으로 서열목록의 서열번호 8 및 서열번호 9 에 각각 염기서열을 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 100㎕ 의 반응액중에 주형 비즈를 200 개와 프라이머를 40p㏖ 씩 첨가하여 비즈 현탁액 A, B 각각에 대해 5 개 씩 반응을 실시하였다. PCR 은 하기의 조건에서 실시하였다.
95℃-5 분 유지
95℃-30 초, 64℃-30 초, 72℃-30 초를 1 사이클로 한 25 사이클
72℃-10 분 유지
PCR 반응액을 현탁액 A, B 마다 1 개로 모아 각각의 1㎕ 를 클로닝 벡터 pT7Blue (노바젠사 제조) 와 혼합하고 라이게이션을 실시하여 클로닝하였다. 비즈 현탁액 A 유래의 콜로니 960 개와, 비즈 현탁액 B 유래의 콜로니 960 개 합계 1920 개의 콜로니로부터 플라스미드를 정제하여 삽입 DNA 단편의 염기서열 해석을 실시하였다. 얻어진 염기서열 중에서 하기에 나타내는 어떤 한 조건을 만족시키는 것을 선택하였다.
조건 1: 인서트 서열의 길이가 40 베이스 이상인 것.
조건 2: 인서트 서열의 길이가 30 베이스 이상, 40 베이스 이하이며, polyA 서열을 갖지 않는 것.
복수 플라스미드에서 동일 인서트 서열이 출현한 경우는, 어떤 1 개의 플라스미드를 선택하여 DNA 마이크로어레이용 주형 플라스미드로서 740 개의 플라스미드를 얻었다.
실시예 4 DNA 마이크로어레이를 사용한 발현해석
(1) DNA 마이크로어레이의 제작
실시예 3 에서 취득한 740 개 클론의 플라스미드를 주형으로 하고, 서열목록의 서열번호 10 과 11 에 기재된 서열을 갖는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 이어서, 해당 증폭산물을 에탄올침전에 의해 정제후, 0.3㎍/㎕ 가 되도록 1 ×SolutionT (다카라슈조사 제조) 에 용해시켜, 이것을 스포팅 용액으로 하였다. 해당 스포팅 용액을 Affymetrix 417 어레이어 (어피메트릭스사 제조) 를 사용하여 아미노화 슬라이드유리인 MAS 코트슬라이드유리 (마츠나미유리사 제조) 에 스폿하였다. 스폿후의 슬라이드를 37℃, 습도 90% 에서 1 시간 동안 유지한 후, 60mJ/㎠ 의 에너지로 UV 크로스링크하였다. 또한, 0.2% SDS 로 1 회, 이어서 증류수로 2 회 세정한 후, 2.75g 의 무수 숙신산과 162.5㎖ 의 N-메틸-2-피롤리돈, 15㎖ 의 1M 붕산 완충액 (pH 8.0) 으로 이루어지는 블로킹 용액에 20 분 동안 침지시켜 유리된 아미노기를 블록하였다. 이어서, 증류수로 2 회 세정한 후, 비등수 중에서 2 분 동안 열변성시키고, 빙온의 100% 에탄올로 급랭시켰다. 그 후, 1,000rpm 정도의 저속 원심분리에 의해 슬라이드유리를 건조시켜 하기의 실험에 사용하였다.
(2) 세포의 제조
HL-60 세포 (ATCC CCL-240) 를 10% 소태아 혈청 (JRH 바이오사이언시즈사 제조), 1.3% 디메틸술폭시드 함유 RPMI1640 배지 (바이오휘타커사 제조, 12-702F) 에 현탁시키고, 5% 탄산가스 존재하, 37℃ 에서 1 주일 동안 배양하여 호중구양으로 분화유도하였다. 얻어진 세포를 원심에 의해 회수하고, 106세포/mL 가 되도록10% 소태아 혈청 함유 RPMI1640 배지에 현탁시켜 10㎝ 샬레에 10mL 씩 첨가하였다. 각 샬레에 100㎕ 의 4mM DGE 수용액을 첨가하여 4 시간후에 RNA 를 회수한 구분, 10㎕ 의 100㎍/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (TPA, 기브코사 제조, 13139-019) 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 4 시간후에 RNA 를 회수한 구분, 100㎕ 의 4mM DGE 수용액을 첨가하여 6 시간 동안 배양후, 다시 10㎕ 의 100㎍/mL TPA 디메틸술폭시드 용액을 첨가하여 4 시간후에 RNA 를 회수한 구분을 설정하였다. 또, 음성 대조로서 100㎕ 의 물을 첨가하여 4 시간후에 RNA 를 회수한 구분을 설정하였다.
(3) 검출용 표지 cDNA 의 제조와 하이브리다이제이션
실시예 4-(2) 에서 제조한 HL-60 세포로부터 Trizol Reagent (기브코 BRL 사 제조) 와 Oligotex-dT30 <Super> (다카라슈조사 제조) 을 사용하여, 각각의 키트의 프로토콜에 따라 PolyA(+)RNA 를 제조하였다. 이어서, RNA Fluorescence Labeling Core Kit (M-MLV Version) (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 키트의 프로토콜에 따라 각각 PolyA(+)RNA 1.0㎍ 을 주형으로서, 표 8 에 나타낸 샘플 RNA 의 조합으로 Cy3 과 Cy5 로 표지된 cDNA 를 제조하여 혼합하였다.
샘플번호 Cy3 Cy5
1 미처리 DGE 처리
2 미처리 TPA 처리
3 TPA 처리 DGE 처리 + TPA 처리
4 미처리 DGE 처리 + TPA 처리
이어서, IntelliGene (다카라슈조사 제조) 의 취급설명서에 따라, 실시예 4-(1) 에서 제작한 DNA 마이크로어레이와, 상기 Cy3 표지 cDNA 와 Cy5 표지 cDNA 의 혼합물 (4 종류) 과의 하이브리다이제이션을 실시하고, 세정ㆍ건조의 조작을 실시하였다. 이어서, Affymetrix 428 Array Scanner (어피메트릭스사 제조) 를 사용하여 Cy3 (여기파장: 532㎚, 검출파장: 570㎚) 및 Cy5 (여기파장: 635㎚, 검출파장: 660㎚) 의 형광화상을 취득하였다. 그 후, 각 스폿의 스폿 영역의 시그널 강도의 평균치와, 스폿의 주변 영역 (이하, 백그라운드 영역이라고 칭함) 의 시그널 강도의 평균치와 표준편차를 화상 정량 해석소프트 ImaGene 4.1 (Biodiscovery 사 제조) 를 사용하여 정량ㆍ산출하였다.
(4) 각 클론의 그룹화
발현 비율로부터 통계 해석에 의해 각 클론의 그룹화를 실시하기 위해서는, 신뢰성이 낮은 데이터와 유의한 변동을 나타내지 않는 클론의 데이터를 제거할 필요가 있다. 따라서, 하기의 순서에 따라 그룹화에 제공하는 클론의 범위를 축소하였다. 즉, 실시예 4-(3) 에서 얻어진 백그라운드 영역의 시그널 강도의 평균치와 표준편차로부터, 하기의 수학식에 의해 시그널 강도의 문턱치를 구하였다.
시그널 강도의 문턱치 = 백그라운드 영역의 시그널 강도의 평균치 + 2 ×
(백그라운드 영역의 시그널 강도의 표준편차)
각 스폿 영역의 시그널 강도의 평균치가 상기 문턱치보다 큰지의 여부에 의해 해당 스폿 시그널의 각 채널에서의 유의성을 판단하였다. 이어서, 4 개 샘플 전체에서 Cy3 과 Cy5 양쪽 채널에서 유효 시그널을 갖지 않는 스폿의 클론을 제외하였다. 또한, Cy3 의 시그널에 대한 Cy5 의 시그널 강도의 비율 (이하, 발현비율이라고 칭함) 을 산출하여, 모든 샘플에서 해당 비율이 2 분의 1 보다 크고 또한 2 보다 작은 클론에 대해 변동을 나타내지 않은 클론으로 하여 이후의 해석에서 제외하였다. 상기의 범위축소 결과, 740 개의 클론 중에서 227 개의 클론이 선택되었다.
이어서, 상기에서 선택된 227 클론에 대해 TPA 및 DGE 의 처리에 의해 발현이 변동된, 즉 샘플번호 3 또는 4 의 발현비율이 0.55 이하 또는 1.8 이상인 값을 갖는 클론에 대해 DGE 처리에 의한 변동의 관계로부터 이하의 4 개 그룹으로 나눌 수 있었다.
A-3 군 TPA 처리에 의해 발현이 증가하고, 또한 DGE 처리에 의해 그 발현이 저하되는 클론.
B-3 군 TPA 처리에 의해 발현이 증가하고, 또한 DGE 처리에 의해 그 발현이 증가하는 클론.
C-3 군 TPA 처리에 의해 발현이 저하되고, 또한 DGE 처리에 의해 그 발현이 저하되는 클론.
D-3 군 TPA 처리에 의해 발현이 저하되고, 또한 DGE 처리에 의해 그 발현이 증가하는 클론.
이들 클론에 대해 상동성 검색을 실시하였다. 이들 결과로부터, 4 개 그룹으로 나누워진 클론에 대해 상동성이 얻어진 염기서열명과 그 GenBank Accession No. 를 표 9 및 10 에 나타낸다. 또한, 표 9 및 10 에서 상동성이 관찰된 클론에 대해서는 GenBank 에 등록되어 있는 염기서열명을, 상동성이 관찰되지 않은 클론에 대해서는 서열목록의 서열번호를 나타냈다.
상동성이 관찰된 염기서열 GenBankAccession No.
A-3 군호모 사피엔스의 전사의 시그널 트랜스듀서 및 액티베이터 6 (STAT6)유전자, 엑손 15 내지 23 및 완전 cds호모 사피엔스 cDNA: FLJ22298 fis, 클론 HRC04637 AF067575AK025951
B-3 군호모 사피엔스 SUI1 이소로그 mRNA, 완전 cds호모 사피엔스 가설 단백질 (HSPC014), mRNA AF083441NM_015932
C-3 군호모 사피엔스 cDNA: FLJ22730 fis, 클론 HRI15793,AF004162 호모 사피엔스 니켈 특이적 인덕션 단백질 (Cap43) mRNA와 매우 유사호모 사피엔스 RNA 특이적 아데노신 디아미나제 (ADAR),전사물 변이체 ADAR-c, mRNA호모 사피엔스 스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 2, 145 kD(SF3B2), mRNA호모 사피엔스의 이중 가닥 RNA 결합 핵 단백질 ILF3에 대한 부분 mRNA, 대안적 전사물인간 트랜스퍼 발릴-tRNA 합성효소 mRNA, cds의 3' 말단서열목록의 서열번호 12 에 기재된 염기서열 AK026383NM_015841NM_006842AJ271747M98326없음
상동성이 관찰된 염기서열 GenBankAccession No.
D-3 군호모 사피엔스 cDNA: FLJ22297 fis, 클론 KAT11932,신장 인자 1-알파 1에 대한 HSEF1AC 인간 mRNA (클론 CEF4)와 매우 유사호모 사피엔스 리보좀 단백질 L17 (RPL17) mRNA호모 사피엔스 리보좀 단백질 L24 (RPL24) mRNA호모 사피엔스 염색체 17, 클론 hRPK. 318_A_15, 완전 서열번역적으로 조절된 종양 단백질 (TCTP)에 대한 호모 사피엔스 TPT1 유전자,엑손 1-6호모 사피엔스 유비퀴놀-사이토크롬 c 리덕타제 결합 단백질 (UQCRB) mRNA호모 사피엔스 리보좀 단백질 S15a (RPS15A) mRNA호모 사피엔스 리보좀 단백질 L27 (RPL27) mRNA AM026650NM_000985NM_000986X75755AJ400717NM_006294NM_001019NM_000988
이들 결과로부터, 각각 A-3 군, B-3 군, C-3 군, D-3 군으로 분류된 클론은 표 11 에 나타내는 유전자의 부분서열인 것으로 추정된다. 또한, 표 11 중의GenBank Accession No. 에서 유전자의 전체 염기서열이 명확하게 되어 있지 않는 것에 대해서는 표 9 및 표 10 에 기재된 염기서열의 GenBank Accession No. 를 나타냈다.
유전자명 GenBankAccession No.
A-3 군전사의 시그널 트랜스듀서 및 액티베이터 6 (STAT6)호모 사피엔스 cDNA: FLJ22298 fis, 클론 HRC04637을 포함하는 유전자 AF067575AK025951
B-3 군추정 번역 개시 인자 (SUI1)호모 사피엔스 가설 단백질 (HSPC014) AF083441NM_015932
C-3 군N-myc 하류 조절 유전자 1 (NDGR1)RNA 특이적 아데노신 디아미나제 (ADAR)스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 2 (SF3B2)인터류킨 인핸서 결합 인자 3 (ILF3)발릴-tRNA 합성효소 2 (VARS2)서열목록의 서열번호 12 에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자 NM_006096NM_015841NM_006842NM_004516NM_006295없음
D-3 군진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1 (EEF1A1)리보좀 단백질 L17 (RPL17)리보좀 단백질 L24 (RPL24)아르기닌/세린-풍부 스플라이싱 인자 2 (SFRS2)번역적으로 조절된 종양 단백질 1 (TPT1)유비퀴놀-사이토크롬 c 리덕타제 결합 단백질 (UQCRB)리보좀 단백질 S15a (RPS15A)리보좀 단백질 L27 (RPL27) NM_001402NM_000985NM_000986NM_003016NM_003295NM_006294NM_001019NM_000988
서열목록 프리텍스트
서열번호 1 의 서열은 전체 mRNA 에 대한 역전사용 프라이머의 서열이다.
서열번호 2 의 서열은 택 벡터 pLCV2 의 일부를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 3 의 서열은 택 벡터 pLCV2 의 일부를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 4 의 서열은 올리고뉴클레오티드 어댑터의 서열이다.
서열번호 5 의 서열은 올리고뉴클레오티드 어댑터의 서열이다.
서열번호 6 의 서열은 프로브벡터 pLCV 의 일부를 증폭시키기 위한 리니어 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 7 의 서열은 프로브벡터 pLCV 의 일부를 증폭시키기 위한 리니어 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 8 의 서열은 DNA 마이크로비즈 상의 cDNA 에 대한 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 9 의 서열은 DNA 마이크로비즈 상의 cDNA 에 대한 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 10 의 서열은 pT7Blue 벡터의 일부를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머의 서열이다.
서열번호 11 의 서열은 pT7Blue 벡터의 일부를 증폭시키기 위한 PCR용 프라이머의 서열이다.
본 발명은 다양한 생리활성을 갖는 DGE 와 동일한 유전자 제어활성을 갖는 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 후보물질의 스크리닝 방법, 생체의 항상성 유지에 유효한, 예컨대 스트레스의 완화 또는 예방을 목적으로 하는 유전자 제어제, 및 유전자의 제어방법을 제공한다. 본 발명에 의해, 예컨대 DGE 가 갖는 각종생리활성의 발현이 유효하게 작용하는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방효과를 기대할 수 있다.

Claims (23)

  1. 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법;
    (1) ① 피검물질, 및 ② 하기 (i) 에 기재된 화합물 및/또는 하기 (ⅱ) 에 기재된 화합물을 각각 생체에 부하시키는 공정:
    (i) 하기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 화합물, 이의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물,
    [화학식 Ⅰ]
    (식 중, X 및 Y 는 H 또는 CH2OH, 단 X 가 CH2OH 일 때 Y 는 H, X 가 H 일 때 Y 는 CH2OH 임)
    (ⅱ) 하기 화학식 Ⅱ 로 표시되는 3,6-안히드로갈락토오스, 이의 알데히드체, 이의 포수체, 및 이들의 2-O-메틸화체 및 2-O-황산화체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 및/또는 이 화합물을 환원 말단에 갖는 가용성 당화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물,
    [화학식 Ⅱ]
    (2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 ① 을 부하시킨 경우와 ② 를 부하시킨 경우로 비교하는 공정, 및
    (3) 적어도 하나의 유전자가 ② 를 부하시킨 경우와 실질적으로 동등한 발현량의 변화를 나타낸 피검물질을 선택하는 공정.
  2. 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법;
    (1) 피검물질을 생체에 부하시키는 공정,
    (2) (1) 의 생체에서의 유전자의 발현량과 해당 부하를 실시하고 있지 않는 경우의 해당 생체에서의 유전자의 발현량을 측정하고, 그 값을 양쪽으로 비교하는 공정, 및
    (3) 하기에 나타내는 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 하기에 나타내는 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 피검물질을 선택하는 공정:
    A 군:
    골형성 단백질-6 [BMP-6 (진뱅크 등록번호: NM_001718)] 유전자,
    케모카인 리셉터-1 [CCR-1 (진뱅크 등록번호: NM_001295)] 유전자,
    간세포 증식인자 [HGF (진뱅크 등록번호: X16323)] 유전자,
    세포간 부착 분자-1 [Intercellular adhesion molecule-1: ICAM-1 (진뱅크 등록번호: NM_000201)] 유전자,
    인터류킨-1β[IL-1β(진뱅크 등록번호: X02532)] 유전자,
    인터류킨-16 [IL-16 (진뱅크 등록번호: M90391)] 유전자,
    백혈병 저해인자 [LIF (진뱅크 등록번호: NM_002309)] 유전자,
    오스테오폰틴 [osteopontin (진뱅크 등록번호: NM_000582)] 유전자,
    종양 괴사인자-α[TNF-α(진뱅크 등록번호: X02910)] 유전자,
    뉴로필린-1 [Neuropilin-1 (진뱅크 등록번호: NM_003873)] 유전자,
    전사의 시그널 트랜스듀서 및 액티베이터 6 [signal transducer and activator of transcription 6: STAT6 (진뱅크 등록번호: AF067575)] 유전자, 및
    호모 사피엔스 (Homo Sapiens) cDNA: FLJ22298 fis, 클론 HRC04637 (진뱅크 등록번호: AK025951) 을 포함하는 유전자,
    B 군:
    헴옥시게나아제-1 [HO-1 (진뱅크 등록번호: NM_002133) 유전자,
    티오레독신 리덕타아제-1 (진뱅크 등록번호: AF106697) 유전자,
    추정 번역 개시 인자 [putative translation initiation factor: SUIl (진뱅크 등록번호: AF083441)] 유전자, 및
    호모 사피엔스 가설 단백질 [Homo sapiens hypothetical protein: HSPC014 (진뱅크 등록번호: NM_015932)] 유전자,
    C 군:
    N-myc 하류 조절 유전자 1 [N-myc downstream regulated gene 1: NDRG1 (진뱅크 등록번호: NM_006096)] 유전자,
    RNA 특이적 아데노신 디아미나제 [adenosine deaminase, RNA specific: ADAR (진뱅크 등록번호: NM_015841)] 유전자,
    스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 2 [splicing factor 3b, subunit 2: SF3B2 (진뱅크 등록번호: NM_006842)] 유전자,
    인터류킨 인핸서 결합 인자 3 [interleukin enhancer binding factor 3: ILF3 (진뱅크 등록번호: NM_004516)] 유전자,
    발릴-tRNA 합성효소 2 [valyl-tRNA synthetase 2: VARS2 (진뱅크 등록번호: NM_006295)] 유전자, 및
    서열목록의 서열번호 12 에 기재된 염기서열을 포함하는 유전자,
    D 군:
    진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1 [eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1: EEF1A1 (진뱅크 등록번호: NM_001402)] 유전자,
    리보좀 단백질 L17 [ribosomal protein L17: RPL17 (진뱅크 등록번호: NM_000985)] 유전자, 및
    리보좀 단백질 L24 [ribosomal protein L24: RPL24 (진뱅크 등록번호: NM_000986)] 유전자,
    아르기닌/세린-풍부 스플라이싱 인자 2 [splicing factor, arginine/serine-rich 2: SFRS2 (진뱅크 등록번호: NM_003016)] 유전자,
    번역적으로 조절된 종양 단백질 1 [tumor protein, translationally-controlled 1: TPT1 (진뱅크 등록번호: NM_003295)] 유전자,
    유비퀴놀-사이토크롬 c 리덕타제 결합 단백질 [ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein: UQCRB (진뱅크 등록번호: NM_006294)] 유전자,
    리보좀 단백질 S15a [ribosomal protein S15a: RPS15A (진뱅크 등록번호: NM_001019)] 유전자,
    리보좀 단백질 L27 [ribosomal protein L27: RPL27 (진뱅크 등록번호: NM_000988)] 유전자,
    E 군:
    인터류킨-2 리셉터α[IL2RA (진뱅크 등록번호: X01057)] 유전자,
    인터류킨-6 [IL6 (진뱅크 등록번호: X04430)] 유전자,
    CD166 (진뱅크 등록번호: Y10183) 유전자,
    인터페론 조절인자-1 [IRF1 (진뱅크 등록번호: X14454)] 유전자
    인터류킨-15 리셉터α[IL15RA (진뱅크 등록번호: U31628)] 유전자,
    핵 인자 카파-b p105 서브유닛 [Nuclear factor kappa-b p105 subunit: NFKB1 (진뱅크 등록번호: M58603)] 유전자,
    카스파아제-1 [CASP1 (진뱅크 등록번호: M87507)] 유전자,
    인터류킨-1β[IL1β(진뱅크 등록번호: M15330)] 유전자,
    종양 괴사인자-α[TNF-α(진뱅크 등록번호: X02910)] 유전자,
    Gro1 옹코진 [GRO1 (진뱅크 등록번호: X54489)] 유전자,
    인터류킨-1α[IL1A (진뱅크 등록번호: M28983)] 유전자,
    인히빈베타 A [INHBA (진뱅크 등록번호: J03634)] 유전자,
    인터류킨-7 리셉터 [IL7R (진뱅크 등록번호: M29696)] 유전자,
    전구 B 세포 콜로니 증강인자 [PBEF (진뱅크 등록번호: U02020)] 유전자,
    간 및 활성화 조절 케모카인 [Liver and activation regulated chemokine: LARC (진뱅크 등록번호: U64197)] 유전자, 및
    인터류킨-8 [IL8 (진뱅크 등록번호: M26383)] 유전자,
    F 군:
    콜로니 자극인자-1 리셉터 [CSF1R (진뱅크 등록번호: X03663)] 유전자,
    케모카인 (C-X-C 모티브) 리셉터-4 [CXCR4 (진뱅크 등록번호: AF147204)] 유전자, 및
    엔도글린 [ENG (진뱅크 등록번호: NM_000118)] 유전자,
    G 군:
    헴옥시게나아제-1 [HMOX1 (진뱅크 등록번호: Z82244)] 유전자.
  3. 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법;
    (1) 스트레스의 생체로의 부하, 및 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하를 각각 실시하는 공정,
    (2) (1) 의 생체 및 어떤 부하도 실시하고 있지 않는 정상 생체에서의 유전자의 발현량을 각각 측정하는 공정, 및
    (3) (2) 에 의해 얻어진 유전자의 발현량을 (1) 의 생체와 정상 생체로 비교하고, 하기 (a) ∼ (g) 에 기재된 유전자의 발현 패턴에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현 패턴을 나타내는 피검물질을 선택하는 공정:
    (a) 제 2 항의 A 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
    (b) 제 2 항의 B 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 증가하고,
    (c) 제 2 항의 C 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 더욱 감소하고,
    (d) 제 2 항의 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 감소하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가하고,
    (e) 제 2 항의 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에 정상 생체보다 증가하고, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
    (f) 제 2 항의 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 감소하고,
    (g) 제 2 항의 G 군의 유전자의 발현량이 스트레스의 생체로의 부하시에는 정상 생체와 동등하며, 피검물질과 스트레스의 생체로의 부하시에 증가함.
  4. 제 3 항에 있어서, 스트레스가 포르볼 미리스테이트 아세테이트 처리이며, 유전자의 발현 패턴이 (a) ∼ (d) 에 기재된 유전자의 발현 패턴에서 선택되는 생리활성 물질의 스크리닝 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 스트레스가 리포폴리사카라이드 처리이며, 유전자의 발현 패턴이 (e) ∼ (g) 에 기재된 유전자의 발현 패턴에서 선택되는 생리활성 물질의 스크리닝 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체가 생물개체 또는 배양세포인 생리활성 물질의 스크리닝 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 발현량을 이 유전자로부터 전사되는 mRNA 양에 의해 측정하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 유전자의 발현량을 DNA 어레이를 사용한 하이브리다이제이션법에 의해 측정하는 생리활성 물질의 스크리닝 방법.
  9. 제 8 항에 기재된 생리활성 물질의 스크리닝 방법에 사용되는 DNA 어레이로서, 제 2 항의 A ∼ G 군의 유전자에서 선택되는 적어도 2 개의 유전자 또는 이의 단편이 지지체 상의 미리 정해진 위치에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 어레이.
  10. 제 2 항의 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  11. 스트레스가 부하된 생체에서, 제 2 항의 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  12. 스트레스가 부하된 생체에서, 스트레스에 의해 발현량이 증가한 제 2 항의 A 군 및 E 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  13. 스트레스가 부하된 생체에서, 스트레스에 의해 발현량이 증가한 제 2 항의 B 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  14. 스트레스가 부하된 생체에서, 스트레스에 의해 발현량이 감소된 제 2 항의 C 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  15. 스트레스가 부하된 생체에서, 스트레스에 의해 발현량이 감소된 제 2 항의 D 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 제어제.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질인 유전자 제어제.
  17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스의 완화 또는 예방을 목적으로 하는 유전자 제어제.
  18. 제 1 항의 (i) 에 기재된 화합물, (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하여 이루어지는 조성물을 생체에 투여함으로써, 제 2 항의 A 군, C 군, E 군 및 F 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 유전자의 제어방법.
  19. 제 1 항의 (i) 에 기재된 화합물, (ⅱ) 에 기재된 화합물 및 이러한 화합물들과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물, 또는 이 화합물을 함유하여 이루어지는 조성물을 스트레스가 부하된 생체에 투여함으로써, 제 2 항의 A 군, C 군, E 군 및 F 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 감소시키고/시키거나 B 군, D 군 및 G 군의 적어도 하나의 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 유전자의 제어방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 제 1 항의 (i) 에 기재된 화합물 또는 (ⅱ) 에 기재된 화합물과 적어도 하나의 유전자에 대해 실질적으로 동등한 유전자 발현 제어활성을 갖는 화합물이, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 물질인 유전자의 제어방법.
  21. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 물질.
  22. 제 21 항에 있어서, 식물 유래의 물질, 담자균 유래의 물질 또는 이들의 유도체인 물질.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 다당류, 이의 분해물 또는 이들의 유도체인 물질.
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