KR101901365B1 - 장상피세포 내 특이적 발현 아토피피부염 유전자 ptgr2 - Google Patents

장상피세포 내 특이적 발현 아토피피부염 유전자 ptgr2 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양을 비교하는 단계를 포함하는 아토피피부염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아토피 유발물질의 스크리닝 방법 또는 아토피피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 의사의 주관적 판단 방법 외에, 분변을 이용한 보다 객관적인 방법으로 아토피피부염을 진단하는 방법을 제공하며, 아토피 유발 물질이나 치료제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

장상피세포 내 특이적 발현 아토피피부염 유전자 PTGR2{Atopic Dermatitis PTGR2 Gene Specifically Expressed in Intestinal Epithelial Cell}
본 발명은 PTGR2를 이용한 아토피피부염의 체외진단에 관한 것이다.
피부염(dermatitis)은 습진(eczema)을 포함하는 피부의 염증을 의미하는 말로써 대개 유형별로 다음과 같이 분류된다: (1) 아토피피부염(atopic dermatitis), (2) 접촉성 피부염(contact dermatitis), (3) 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis). 상기 피부염의 치료에는 스테로이드 제제(예를 들어, 국소 부신피질호르몬 제제), 항히스타민제제 등을 처방하는 하는 것이 일반적인데, 접촉성 피부염의 경우 증세가 가벼울 때는 붕산아연화연고를 바르거나, 내복제로 항히스타민제, 부신피질호르몬제, 비타민 B2·비타민 B6 등을 쓰며, 지루성 피부염의 경우 습진에 준한 치료 외에, 비타민 B2·비티민 B6, 니코틴산아마이드 등을 내복한다. 아토피피부염의 경우 증세가 심할 때는 연고(항히스타민연고, 비타민 A·비타민 D 연고)를 쓰며, 지양제(antipruritics)의 내복도 함께 사용한다(두산백과).
아토피피부염은 만성적으로 악화와 호전을 반복하며 가려움증을 동반하는 피부의 염증성 질환으로 기관지 천식, 알레르기비염 등의 다른 알레르기 질환의 가족력이 있는 경우 흔히 나타난다. 흔한 피부 질환의 하나로 소아에서 20%, 성인은 1%3%의 유병률을 보이며 세계적으로 증가하는 경향이다(Lee et al., Allergy Asthma Respir Dis 4(4):271-275, July 2016). 아토피피부염은 알레르기질환(아토피피부염, 천식, 알레르기비염 등) 중에서 영유아 시기에 가장 먼저 발생하는 질환이고, 아토피피부염으로 인한 사망률은 낮지만 자살로 이어질 만큼 삶의 질을 현저하게 떨어뜨리는 질환이다.
하지만, 상기 다양한 종류의 피부염들은 치료 및 조치의 방법이 서로 다를 수 밖에 없음에도 불구하고, 환자에게 발생한 피부염이 명확히 아토피피부염임을 진단하거나 또는 아토피피부염의 발생 가능성을 예측하는 방법은 현재 오로지 의사의 주관적 판단 외에 그 어떠한 방법이 없는 상황이다. 이러한 아토피피부염의 발생 원인은 유전자와 환경의 상호작용 때문인 것으로 보고되고 있고, 아토피피부염과 관련된 유전자를 발굴하기 위하여 이제까지는 피부 조직과 혈액을 이용한 연구가 진행되었다. 하지만 아직까지 임상 현장에서 사용되고 있는 유전자를 이용한 진단 기법은 없는 현실이다.
최근 장내 미생물과 여러 질환과의 연관성이 보고되고 있고, 아토피피부염 또한 장내 미생물과 연관되어 있다고 알려져 있다. 따라서 본 발명자는 장내 미생물이 장 내에 존재하는 유전자와 상호작용을 통해 아토피피부염 발생에 영향을 줄 것이라고 가설을 세우고 본 발명을 완성하였다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 아토피피부염을 기존의 의사의 주관적 판단 방법 외에 보다 객관적이고 간편한 방법으로 진단하는 방법을 찾고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 아토피피부염 환자의 분변으로부터 분리된 PTGR2 유전자의 발현양이 정상군과 비교하여 유의적으로 상향되어 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 아토피피부염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 아토피피부염 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아토피 유발물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아토피피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아토피피부염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 아토피피부염을 보다 객관적이고 간편한 방법으로 진단하는 방법을 찾고자 노력하였으며, 아토피피부염 환자의 분변으로부터 분리된 PTGR2 유전자의 발현양이 정상군과 비교하여 유의적으로 상향되어 있음을 확인함으로써 이를 아토피피부염에 활용하고자 하였다.
PTGR2(Prostaglandin reductase 2)는 프로스타글랜딘(prostaglandin)의 대사에 관여하는 효소로서 15-keto-prostaglandin E2을 15-keto-13,14-dihydro-prostaglandin E2으로 전환하는 역할을 담당하며, 대사와 관련된 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)의 활성에 관련되어 있다고 생각되고 있다(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/145482).
구체적으로 본 발명의 방법은 하기의 단계로 수행될 수 있다:
(a) 피검자로부터 취득한 샘플 중에 포함된 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양을 정상군 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양과 비교하는 단계; 및
(b) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양 보다 높을 경우 아토피피부염으로 진단하는 단계.
본 발명에서 피검자(또는 정상군)는 제한되지 않으며, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 방법이 포함하는 샘플은 피검자로부터 자연적 또는 인위적으로 분리되어 피검자의 PTGR2 관련 유전정보를 포함하는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 체외로 분리된 분변, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 모발 또는 뇨 등으로부터 분리될 수 있으며, 보다 바람직하게는 체외로 분리된 상피세포, 보다 더 바람직하게는 체외로 분리된 장상피세포(intestinal epithelial cell), 가장 바람직하게는 체외로 분리된 분변에 포함된 장상피세포를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 피검자의 샘플 중에 포함된 HIST1H3F(histone cluster 1, H3f), IGHV4-34(immunoglobulin heavy variable 4-34), RNU1-134P(RNA, U1 small nuclear 134, pseudogene), SNORD114-1(small nucleolar RNA, C/D box 114-1), RNU6-371P(RNA, U6 small nuclear 371, pseudogene), SNORA37(small nucleolar RNA, H/ACA box 37), PABPC1L2B(poly(A) binding protein, cytoplasmic 1-like 2B), TRBJ2-4(T cell receptor beta joining 2-4), RNU6-1230P(RNA, U6 small nuclear 1230, pseudogene), LOC102723773(serine/threonine-protein kinase SMG1-like), MIR451B(microRNA 451b) 또는 MT-RNR1(mitochondrially encoded 12S RNA)의 발현양을 조사하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 피검자의 샘플 중에 포함된 HIST1H3F, IGHV4-34, RNU1-134P 또는 SNORD114-1의 발현양은 정상군의 것과 비교하여 하향 조절(down-regulation)되어 있으며, 피검자의 샘플 중에 포함된 RNU6-371P, SNORA37, PABPC1L2B, TRBJ2-4, RNU6-1230P, LOC102723773, MIR451B 또는 MT-RNR1의 발현양은 정상군의 것과 비교하여 상향 조절(up-regulation)되어 있다(실시예, 표 2).
본 명세서에서 용어 “핵산분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 아토피피부염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 PTGR2의 존재를 확인한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 RNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생물학적 시료는, 바람직하게는 장상피세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
생물학적 시료에서 PTGR2의 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 아토피피부염이 아닌 인간의 시료)보다 상향 조절(up-regulation)되는 경우에는 아토피피부염으로 진단된다.
본 발명의 아토피피부염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 면역분석 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA), inMethodsinMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 아토피피부염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 유전자 증폭방법에 의해 실시될 수 있다. 유전자 증폭방법을 이용한 PTGR2의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 이 경우 PTGR2의 프라이머 또는 프로브가 이용될 수 있다.
프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 PTGR2의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 상기 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포)에서 상기 마커의 mRNA 양을 조사하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 결정한다.
따라서 본 발명은 원칙적으로 생물학적 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
우선, mRNA를 얻기 위하여 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., MolecularCloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., PlantMol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., CurrentProtocolsinMolecularBiology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.
이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcusfuriosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서의 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 유전자 증폭방법은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 유전자 증폭방법에 이용되는 프라이머는 상기 PTGR2의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 상기 마커의 cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다.
이러한 프라이머의 디자인은 상기 PTGR2의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
이렇게 증폭된 상기 마커의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 상기 마커의 유전자의 발현 정도를 조사한다.
이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 상기 유전자의 발현이 정상 시료 보다 높게 나오는 경우에는 아토피피부염으로 진단된다.
본 발명에서 PTGR2는 아토피피부염에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 생체 분자의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현(또는 과발현)” 또는 “상향 조절(up-regulation)”은 조사 대상의 생물학적 시료에서 대상 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예컨대, 상술한 진단 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 PTGR2가 정상 시료와 비교하여 10% 이상 고발현되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 아토피피부염으로 판정한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단방법이 포함하는 상기 PTGR2 유전자는 정상인과 비교하여 아토피피부염 환자에서 상향 조절(up-regulation)되어 있으며, 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상 상향 조절되어 있음을 확인하였다(실시예, 표 2).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 (b) PTGR2 단백질을 코딩하는 핵산분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 아토피피부염 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 아토피피부염의 진단 및 예후 분석용 키트는 상기 언급된 본 발명의 진단방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 아토피피부염의 진단 및 예후 분석용 키트는 공지된 다양한 종류의 키트로 제작될 수 있으며, 예컨대 면역분석(immunoassay)용 키트, 유전자 증폭 키트를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 아토피피부염의 진단 및 예후 분석용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermusthermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcusfuriosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 아토피피부염의 진단 및 예후 분석용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 아토피 유발물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 세포에 아토피 유발 후보물질을 처리하여 상기 세포에서 PTGR2의 발현양을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 아토피 유발 후보물질을 처리한 세포에서 PTGR2의 발현양이 상향 조절(up-regulation)되는 경우 아토피 유발물질로 판단하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 아토피피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 세포에 아토피피부염 치료제 후보물질을 처리하여 상기 세포에서 PTGR2의 발현양을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 아토피피부염 치료제 후보물질을 처리한 세포에서 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양이 하향 조절(down-regulation)되는 경우 아토피피부염 치료제로 판단하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법은, 예컨대 항원-항체 반응 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단계 (a)는 HIST1H3F(histone cluster 1, H3f), IGHV4-34(immunoglobulin heavy variable 4-34), RNU1-134P(RNA, U1 small nuclear 134, pseudogene), SNORD114-1(small nucleolar RNA, C/D box 114-1), RNU6-371P(RNA, U6 small nuclear 371, pseudogene), SNORA37(small nucleolar RNA, H/ACA box 37), PABPC1L2B(poly(A) binding protein, cytoplasmic 1-like 2B), TRBJ2-4(T cell receptor beta joining 2-4), RNU6-1230P(RNA, U6 small nuclear 1230, pseudogene), LOC102723773(serine/threonine-protein kinase SMG1-like), MIR451B(microRNA 451b) 또는 MT-RNR1(mitochondrially encoded 12S RNA)의 발현양을 확인하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 세포는 생체에서 채취한 세포를 포함하며, 예컨대 분변으로부터 분리된 장상피세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 아토피피부염 환자의 세포는 PTGR2를 과발현하므로, 이의 발현양을 저하시키는 물질은 새로운 아토피피부염(atopic dermatitis)의 예방 또는 치료제로서 판정될 수 있으며, 이의 발현양을 증가시키는 물질은 아토피 유발물질로서 판정될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 피검자의 샘플 중에 포함된 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양을 정상군의 것과 비교하는 단계를 포함하는 아토피피부염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
(ⅱ) 또한, 본 발명은 아토피 유발물질의 스크리닝 방법 또는 아토피피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 방법을 이용하면 기존의 의사의 주관적 판단 방법 외에 보다 객관적인 방법으로 아토피피부염을 진단할 수 있으며, 아토피 유발 물질이나 치료제의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 대조군(control)과 아토피피부염군(AD) 사이에 |fc|≥1.5 & raw. p-value<0.05 조건을 만족하는 프로브 개수를 나타낸 volcano plot을 나타낸다(초록색: 발현량이 감소된 프로브, 빨간색: 발현량이 증가된 프로브).
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
1. 시험 대상
본 시험을 위해 출생 후 6개월이 된 30명의 영유아를 선별하였다. 본 대상자들은 모두 6개월 시기에 소아호흡기알레르기 전문의에게 진단을 받은 아이들이었다. 아토피피부염으로 진단 받은 영유아는 14명이었고, 정상으로 진단 받은 영유아(대조군)는 16명이었다. 이들의 특징은 아래 표 1에 정리하였다.
시험 대상군 특징
대조군 아토피피부염군 P-value*
대상군 수 16 14
성별(남자/여자) 4/12 9/5
Total IgE (IU/mL) 16.44±7.16 63.65±29.67 0.142
Egg IgE (IU/mL) 0.08±0.02 2.22±1.17 0.886
Milk IgE (IU/mL) 0.08±0.02 0.46±0.25 0.043
호산구% 2.56±0.34 7.99±1.73 <0.001
SCORAD ND 32.92±6.27 <0.001
* P-value by Mann-Whitney
2. 장 상피세포 및 total RNA 분리
2 g 정도의 분변을 RPMI media(Welgene, 경산, 대한민국) 10 ml에 넣고 풀어준 후, 100 um cell strainer(SPL, 포천, 대한민국)에 걸러주었다. 밑으로 빠진 내용물을 lymphoprep™(Axis-Shield, Oslo, Norway) 10 ml 위에 천천히 올려주었다. 2500 rpm으로 20분 동안 brake off로 원심분리하였다. 세포 층을 거둔 후, PBS로 세척하였다. 분리된 세포는 즉시 Total RNA mini kit(Alphagene, 성남, 대한민국)로 RNA를 분리하였다.
3. 마이크로어레이
RNA는 ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop, Wilmington, USA)로 quality를 체크하였다. Transcriptome array는 GeneChip WT Pico reagent Kit를 이용하여 진행하였다. cDNA 합성은 GeneChip WT Pico Amplification kit를 이용하여 진행하였다. 이때 합성된 샘플의 농도는 833 ng/ul 이상이여야 한다. Sense cDNA를 조각내고, GeneChip WT Terminal labeling kit 내에 있는 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)로 라벨을 붙였다. 약 5.5 ug의 라벨된 DNA를 45℃에서 16시간 동안 Affymetrix GeneChip Human 2.0 ST Array에 hybridization 시켰다. Hybridization된 array는 GeneChip Fluidics Station 450에서 세척 및 염색 작업을 하고, GCS3000 Scanner(Affymetrix)로 스캔하였다. 신호는Affymetrix® GeneChip™ Command Console software로 분석하였다.
4. 통계적 방법
비교조합에서 |fc|≥1.5 & raw. p-value<0.05 인 프로브를 선별하였다. P-value는 independent t-test를 이용하였다(도 1).
결과
|fc|≥1.5 & raw. p-value<0.05 조건으로 선별한 프로브는 총 28개였다. 이중에서 gene annotation이 있는 프로브는 표 2에 제시한 것처럼 13개였다.
프로브 리스트
ProbeID AD/Control.fc p-value Gene_Symbol Gene Description
17016400 -1.675961 0.025741609 HIST1H3F histone cluster 1, H3f
16797520 -1.619162 0.028905129 IGHV4-34 immunoglobulin heavy variable 4-34
16916154 -1.599708 0.043396334 RNU1-134P RNA, U1 small nuclear 134, pseudogene
16788616 -1.529467 0.021876663 SNORD114-1 small nucleolar RNA, C/D box 114-1
16786365 1.500715 0.028166591 PTGR2 prostaglandin reductase 2
16688022 1.508957 0.004887655 RNU6-371P RNA, U6 small nuclear 371, pseudogene
16855340 1.513438 0.007262873 SNORA37 small nucleolar RNA, H/ACA box 37
17104893 1.550097 0.000300751 PABPC1L2B poly(A) binding protein, cytoplasmic 1-like 2B
17052677 1.570923 0.022986657 TRBJ2-4 T cell receptor beta joining 2-4
16971377 1.603166 0.00373837 RNU6-1230P RNA, U6 small nuclear 1230, pseudogene
16827748 1.634889 0.024439045 LOC102723773 serine/threonine-protein kinase SMG1-like
16832627 1.637728 0.036605783 MIR451B microRNA 451b
17100641 3.52487 0.014164498 MT-RNR1 mitochondrially encoded 12S RNA
이중에서 Prostaglandin reductase 2(PTGR2)는 기존의 보고에서 대사성 질환, 위암 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, PTGR2의 발현 양이 대조군에 비해 아토피피부염군에서 1.5배 증가한 것으로 확인되었다. 이를 통해, 장에서 증가된 PTGR2가 아토피피부염 발생에 영향을 준 것으로 추정되며, 정상군(대조군) 대비 상기 PTGR2의 발현량의 증가 여부를 확인함으로써 아토피피부염의 진단 또는 예후의 예측에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 하기의 단계를 포함하는 아토피피부염의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 인간 피검자의 분변으로부터 취득한 장상피세포 샘플 중에 포함된 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양을 정상군 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양과 비교하는 단계; 및
    (b) 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양이 정상군 샘플 중에 포함된 PTGR2의 발현양 보다 상향되어 있음을 확인하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 피검자의 샘플 중에 포함된 HIST1H3F(histone cluster 1, H3f), IGHV4-34(immunoglobulin heavy variable 4-34), RNU1-134P(RNA, U1 small nuclear 134, pseudogene), SNORD114-1(small nucleolar RNA, C/D box 114-1), RNU6-371P(RNA, U6 small nuclear 371, pseudogene), SNORA37(small nucleolar RNA, H/ACA box 37), PABPC1L2B(poly(A) binding protein, cytoplasmic 1-like 2B), TRBJ2-4(T cell receptor beta joining 2-4), RNU6-1230P(RNA, U6 small nuclear 1230, pseudogene), LOC102723773(serine/threonine-protein kinase SMG1-like), MIR451B(microRNA 451b) 또는 MT-RNR1(mitochondrially encoded 12S RNA)의 발현양을 조사하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 HIST1H3F, IGHV4-34, RNU1-134P 또는 SNORD114-1의 발현양은 정상군의 것과 비교하여 하향 조절(down-regulation)된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 피검자의 샘플 중에 포함된 RNU6-371P, SNORA37, PABPC1L2B, TRBJ2-4, RNU6-1230P, LOC102723773, MIR451B 또는 MT-RNR1의 발현양은 정상군의 것과 비교하여 상향 조절(up-regulation)된 것 특징으로 하는 방법.
  8. (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 (b) PTGR2 단백질을 코딩하는 핵산분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 아토피피부염 진단 또는 예후 분석용 키트.
  9. 하기의 단계를 포함하는 아토피 유발물질의 스크리닝 방법:
    (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 체외로 분리된 세포에 아토피 유발 후보물질을 처리하여 상기 세포에서 PTGR2의 발현양을 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 아토피 유발 후보물질을 처리한 세포에서 PTGR2의 발현양이 상향 조절(up-regulation)되는 경우 아토피 유발물질로 판단하는 단계.
  10. 하기의 단계를 포함하는 아토피피부염 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) PTGR2(Prostaglandin reductase 2) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 체외로 분리된 세포에 아토피피부염 치료제 후보물질을 처리하여 상기 세포에서 PTGR2의 발현양을 확인하는 단계; 및
    (b) 상기 아토피피부염 치료제 후보물질을 처리한 세포에서 PTGR2(Prostaglandin reductase 2)의 발현양이 하향 조절(down-regulation)되는 경우 아토피피부염 치료제로 판단하는 단계.
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