KR20100138365A - 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11, CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후 분석용 키트, 그리고 상술한 마커들을 이용하여 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 및 전이 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암 및/또는 대장암 전이에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다. 본 발명의 마커를 이용하면 대장암 또는 전이를 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.

대장암, 전이, 마커, 진단, 치료

Description

대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝{Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same}

본 발명은 대장암 및/또는 전이에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

대장은 소화, 흡수되고 잉여의 음식물이 머무르는 곳이며, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변으로 만드는 곳임과 동시 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이지도 하다. 대장의 길이는 약 2m 정도이고, 결장, 직장 및 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이라고 한다.

현재 우리나라에서 대장암 발생률은 매우 현저하게 증가하고 있다. 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암 및 간암에 이어 네 번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조 사되었다. 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다. 우리나라는 유럽이나 미국과 비교했을 때, 발생 연령이 10살 정도 어린 경향이 있다. 5-10%의 빈도로 30대의 젊은 사람에게서도 발생하며, 이처럼 젊은 층에서 나타나는 대장암은 가족 사이에서 많이 발생하는 경향이 있기도 하다.

대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.

대장암에 걸리기 쉬운 위험인자로서는, a) 대장용종에 걸린 경험이 있는 경우; b) 가족력이 있는 경우; c) 장기간 궤양성대장염에 시달리고 있는 경우; 및 4) 고치기 어려운 치루에 걸린 경우를 포함한다.

대장암에는 Dukes분류법과 UICC의 stage 분류법이 대표적이다. 그 기준은 암의 크기에 의해서가 아니라, 대장벽 속으로 암이 들어간 깊이 정도 및 원격전이의 유무에 따라 진행도가 규정되어 있다(각 병기별 수술 후 5년 생존율을 괄호 속에 기재함).

[Dukes분류]

ㆍDukes A (90% 이상): 암이 대장벽 내에 머물러 있는 것

ㆍDukes B (60-80%): 암이 대장벽을 뚫었지만 림프절전이가 일어나지 않은 것

ㆍDukes C (20-50%) : 림프절전이가 일어난 것

ㆍDukes D (20% 이하) : 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것

[stage분류]

ㆍ0기 : 암이 점막에 머물러 있는 것

ㆍ1기 : 암이 대장벽에 머물러 있는 것

ㆍ2기 : 암이 대장벽을 넘어섰지만 인접장기까지 미치지 않은 것

ㆍ3기 : 암이 인접장기에 침윤하거나 림프절전이가 일어난 것

ㆍ4기 : 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것

상기 두 가지의 분류 방식에는 아주 작은 차이가 있을 뿐이기 때문에, Dukes A는 0기,1기에, Dukes B는 2기에, Dukes C는 3기에, Dukes D는 4기에 해당하는 것이라고 현재 통용되고 있으며, 특히 Dukes분류는 국제적으로 널리 쓰이고 있는 방법이다.

대장암은 이른 시기에 발견되면 내시경 적절제나 외과요법에 의해 완전히 치유될 수 있다. 약간 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이)했다고 하더라도 수술이 가능한 시기라면 외과요법에 의한 완치를 기대할 수 있다. 다시 말해 현재의 치료법으로는 외과요법이 가장 효과적이라 하겠다. 그러나 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 조기 진단과 치료는 필수적이라 하겠다.

종종 수술을 받은 후에 재발하는 경우가 있는데, 수술 후에는 정기적으로 (3-4개월 간격) 재발유무를 점검하기 위한 검사를 받아야 한다. 간, 폐 및 복막 이 재발하기 쉬운 장기이며, 또 절제한 부위에서 국소적으로 재발하기도 한다. 대장암은 다른 암과는 달리 빠른 시기에 재발이 발견되면, 다시 재발한 병소를 절제하여 완전히 치료할 수도 있다. 재발의 80% 이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 된다.

대장암은 조기인 경우라면 거의 100%가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것은 매우 어려우므로, 주기적인 검사가 선행 되어야 한다.

대장암의 선별검사 (screening)로서 대표적인 것은 잠혈 검사로서, 이 검사에서 양성반응이 나왔다고 해서 대장암에 걸렸다는 것은 아니며, 또 역으로 음성반응이라고 해서 대장암에 걸리지 않았다라고 말할 수 있는 것도 아니다.

현재 사용되고 있는 대장암 검사법은 아래와 같다.

(a) 대장 조영 검사

검사는 식사 제한 후에 장기를 충분히 비운 후 항문으로부터 바륨과 공기를 주입하여 X-ray 사진을 촬영하여 장의 모양을 검사한다.

(b) 대장내시경

현재 대장내시경에는 S-결장까지를 관찰하는 짧은 내시경과, 맹장까지 모든 대장을 관찰할 수 있는 긴 내시경이 있다. 검사와 동시 바로 용종을 절제할 수도 있기 때문에, 대장조영검사보다 정밀도가 높은 방법이다.

(c) 종양 표지자

혈액 검사를 통해 신체 어딘가에 숨어 있는 암을 진단해내는 방법이다. 그 러나 현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 종양 표지자는 아직 없다. CEA(Carcinoembryonic antigen)라고 불리는 표지자가 일반적이지만, 대장암이 있어도 약 반수가 양성을 나타낼 뿐이므로, 주로 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용되고 있다.

(4) CT, MRI, 초음파 검사

이 검사 방법들은 다른 부위의 암을 찾아내는데 매우 진보된 검사법이지만, 대장에 생긴 질환을 발견하는데 적합하지 않다. 대장암에 있어서는 원발 병소의 진전 정도와 간으로의 원격전이 여부를 알아보기 위해 사용되고 있다.

대장암의 분자마커로서 알려진 예는 다음과 같다: WO 2005/015224는 60S 산성 리보좀 단백질 P0(RLA-0)에 대한 항체를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며, WO 2004/079368는 HSP9O이 대장암 조직에서 발현이 증가됨을 개시하고 있다. WO 2004/071267은 NNMT(nicotinamide N-methyltransferase)를 이용하여 대장암을 조기에 진단하는 방법을 개시하고 있으며, WO 2005/015234는 SAHH(S-adenosylhomocysteine hydrolase) 단백질이 대장암의 진단에 이용될 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 미국 특허 제7501243호는 대장암 마커로서 TTK(Tyrosine threonine kinase)를 제시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 대장암 및/또는 대장암 전이를 신속하고 정확하게 분자 진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 대장암 및/또는 대장암 전이를 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 대장암 또는 대장암 전이의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클 레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 대장암을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 대장암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상술한 분자 마커들이 대장암 및/또는 대장암 전이를 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다. 특히, 본 발명의 마커들은 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 및 전이 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다.

본 명세서에서 용어 “대장암(colon cancer)”은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미한다.

본 발명의 분자 마커는 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이에 대한 지표가 될 수 있으며, 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예 후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커 중 하나인 PSAT1(phosphoserine aminotransferase 1)은 GenBank 접근번호 NM_021154.3, ATAD2(ATPase family, AAA domain containing 2)은 GenBank 접근번호 NM_014109.3, ASB9(ankyrin repeat and SOCS box-containing 9)은 GenBank 접근번호 NM_001031739.1, SLC7A11(solute carrier family 7, (cationic amino acid transporter, y+ system) member 11)는 GenBank 접근번호 NM_014331.3, CKAP2L(cytoskeleton associated protein 2-like)은 GenBank 접근번호 NM_152515.3에 뉴클레오타이드 서열이 개시되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 대장암 및/또는 전이 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커들의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 장암 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 대장 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 대장암 장암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 대장 상피세포)보다 강하게 나오는 경우에는 대장암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 대장암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 대장 상피세포)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오는 경우에는 대장암/전이로 진단된다.

따라서 본 발명의 장암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 대 장암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 대장암/전이를 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리 프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MLN 51 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암/전이를 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 대장암/전이로 진단된다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 마커들은 대장암/전이에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분 석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커들이 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 대장암/전이로 판정한다.

본 발명의 바이오마커들 중에서 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L은 대장암 전이를 진단하는 데 특히 유용하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a)PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암 또는 대장암 전이의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포는 인간의 대장암 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 대장암 및/또는 전이에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 동일 대장암 환자로부터 채취한 정상 대장조직, 대장암 조직 을 이용하여 발굴된 것으로서, 대장암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다.

(ⅲ) 본 발명의 마커를 이용하면 대장암을 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 대장암 및 전이 특이 마커 발굴을 위한 DNA 칩 분석 및 데이터 마이닝

정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 및/또는 전이 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하기 위하여, DNA 칩(48K 인간 마이크로어레이, Illumina사)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다. 우선, 정상 대장 상피조직 시료 및 대장암 조직 시료를 얻었다. 대장암 환자 조직 시료는, 동일한 대장암 환자로부터 대장암 원발성 종양(primary tumor) 조직 및 전이(metastasis) 조직(간 전이 조직)을 얻어, 대장암 원발성 종양뿐만 아니라 전이에 대한 분자 마커를 발굴하였다.

상기 정상 대장 상피세포, 대장암 세포 및 전이세포(즉, 간 전이 세포)로부터 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(QIAGEN사)를 이용하여 추출하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 혼성화 반응을 위하여, Illumina TotalPrep RNA Amplification 키트(Ambion사)를 이용하여 biotin-표지 cRNA를 다음과 같이 제조하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 상기 추출된 총 RNA의 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 인 비트로 전사를 실시하여 biotin-표지 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 혼성화 시켰다. 혼성화 반응 후 비특이적 혼성화를 제거하기 위하여, Illumina Gene Expression System Wash Buffer(Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공초점 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 ‘quantile’ 기능을 이용하여 보정하였다. 상기의 유전자 발현 정도를 분석하여, 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)을 이용하였다. DNA 칩 결과를 기초로 하여, 대장암 및 전이에 특이적으로 과발현되는 유전자들을 1차 선별 하였다(도 1). 대장암에서 과발현 되는 유전자들의 발현 양상을 도 2에 나타내었다. 도 2에 기재된 유전자들은 그 발현 정도가 정상조직과 비교하여 대장암 조직에서 증가하고, 대장암 조직과 비교하여 전이 조직에서 증가하거나 또는 거의 유사한 정도의 발현을 나타낸다.

DNA 칩 분석을 통하여 대장암 또는 전이에서 특이적으로 고발현되는 것으로 1차 선별된 유전자들을 대상으로 하여, 데이터마이닝을 하였고 그 결과는 도 3에 나타나 있다.

실험 및 분석 결과, PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11, CKAP2L 유전자들이 대장암에 대하여 특이적으로 고발현 되는 유전자임을 알 수 있고, 신규한 대장암 분자 마커로 사용될 수 있음을 알았다.

실시예 2: 대장암/전이 특이 유전자들에 대한 RT-PCR 분석

대장암 환자로부터 적출된 대장암 조직, 대장암 주위 비대장암 조직 각각 20개, 총 40 조직 시료를 액체 질소에 동결하고, 구아니디늄 방법에 의하여 총 RNA를 분리하고 이소프로판올에 보관/사용하였다. RNA의 정량은 스펙트로포토미터를 이용하여 실시하였고, SDS-PAGE 젤 전기영동을 통해 RNA를 확인하였다. 데이터 마이닝을 통해 선발된 유전자들이 대장암/전이 특이적으로 고발현되는지 여부를 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)로 확인하였다. 상기 조직들의 세포로부터 추출한 RNA로부터 역전사 반응을 통해 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA 합성 키트(STRATAGENE)를 이용하여 실시하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 1의 프라이머들을 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머는, NCBI의 CoreNucleotide에서 얻는 유전자 서열을 참조하여 Primer3 Program(http://frodo.wi.mit.edu/)을 이용하여 디자인하였다.

	프라이머명	증폭산물 크기(bp)	서열
1	PSAT1-<L>	356bp	GTC CAA GCC AGT GGA TGT TT
	PSAT1-<R>		TAT ACA GAG AGG CCC GGA TG
2	ATAD2-<L>	302bp	TAT GGA TGG ATT GGA CAG CA
	ATAD2-<R>		AGA TCT GTG GGT AGC GTC GT
3	ASB9-<L>	303bp	CAT CAT GGA TGG CAA ACA AG
	ASB9-<R>		GCT GTC ACA CCA TTC ACC TG
4	SLC7A11-<L>	304bp	GGC AGT GAC CTT TTC TGA GC
	SLC7A11-<R>		AAC TGC CAG CCC AAT AAA AA
5	CKAP2L-<L>	327bp	AAA CGG CCT CCT ATG GAA CT
	CKAP2L-<R>		TAT TGG TGT TGC CCC ATT TT

RT-PCR 결과는 도 4에 나타나 있다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 대장암/전이 마커는 대장암/전이에 대하여 특이적으로 고발현되는 것을 알 수 있다. 특히, EEF1D의 경우 전이 암세포에서만 매우 특이적으로 고발현 되어 대장암 전이 마커로서 매우 우수한 적용성을 갖는다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1는 48K 인간 마이크로어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 대장 조직, 대장암조직 및 전이조직에서 2,230개의 유전자 발현을 비교한 결과이다(p value <0.05). 도면에서, 숫자가 뒤에 있는 “DF"는 정상조직, “RC"는 재발 대장암조직에 대한 것이다. 유전자 발현이 높은 순서는, 적색, 밤색, 검정색, 황록색, 짙은 녹색, 녹색, 옅은 녹색 및 연두색 순이다.

도 2는 대장암조직에서 과발현 되는 유전자들의 발현 양상을 그래프로 나타낸 것이다.

도 3은 유전체/단백질체를 이용한 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 간암에 대한 데이터 마이닝 결과이다. 도 1에서, 유전자 발현이 높은 순서는, 적색, 밤색, 검정색, 황록색, 짙은 녹색, 녹색, 옅은 녹색 및 연두색 순이다.

도 4는 본 발명의 대장암 마커들이 정상조직, 대장암 조직에서의 발현 정도를 분석한 RT-PCR 결과이다. 홀수 레인은 정상조직에서의 각각의 마커들의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이고, 짝수 레인은 대장암 조직에서의 각각의 마커들의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5a-5e는 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L 유전자의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 진단 마커의 발현정도를 나타낸 것이다.

도 6은 10종의 대장암 세포주에서의 대장암 진단마커들의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 이미지이다. 레인 번호는 각각의 대장암 세포주를 의미한다. 1 Lane: DLD-1; 2 Lane: HT29; 3 Lane: HCT116; 4 Lane: colo205; 5 Lane: SW480; 6 Lane: SW620; 7 Lane: SNU-C1: 8 Lane: SNU-C2A; 9 Lane: KM12C; 10 Lane: KM12SM

도 7은 DLD-1, HT29, HCT116, colo205, SW480, SW620, SNU-C1 및 KM12C 대장암 세포주에서 SLC7A11 유전자의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 결과 이미지이다.

도 8a-8d는 대장암 조직과 정상조직에서의 면역조직염색법을 이용하여 PSAT1, ATAD2, ASB9 및 SLC7A11 대장암 진단마커 단백질의 발현정도를 순차적으로 각각 나타낸 결과 이미지이다.

<110> Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology <120> Biomarkers Indicative of Colon Cancer and Metastasis and Diagnosis and Screening Therapeutics Using the Same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSAT1-<L> <400> 1 gtccaagcca gtggatgttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSAT1-<R> <400> 2 tatacagaga ggcccggatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATAD2-<L> <400> 3 tatggatgga ttggacagca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATAD2-<R> <400> 4 agatctgtgg gtagcgtcgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASB9-<L> <400> 5 catcatggat ggcaaacaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASB9-<R> <400> 6 gctgtcacac cattcacctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC7A11-<L> <400> 7 ggcagtgacc ttttctgagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC7A11-<R> <400> 8 aactgccagc ccaataaaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKAP2L-<L> <400> 9 aaacggcctc ctatggaact 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKAP2L-<R> <400> 10 tattggtgtt gccccatttt 20

Claims (9)

1. PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
5. 대장암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 대장암 진단 마커를 검출하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 다음의 단계를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:

   (a) PSAT1, ATAD2, ASB9, SLC7A11 및 CKAP2L으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

   (b) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오티드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 대장암 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

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