KR20110069587A - 위암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 위암 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위암 진단 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다. 본 발명에서의 MMP-1은 위암에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다. 또한, 본 발명은 위암 환자의 조직에서만 특이적으로 발현이 증가되는 MMP-1을 이용하여 생물학적 시료(예컨대, 혈액이나 혈청)로부터 매우 특이적으로 위암의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

위암, MMP-1, 진단, 예후, 마커

Description

위암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 위암 진단{Biomarkers Indicative of Stomach Cancer and Diagnosis Using the Same}

본 발명은 위암에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

암 발생과 사망율이 점진적으로 감소함에도 불구하고, 위암은 전 세계적으로 4번째로 많이 발생하는 암이며 암 사망 원인 중 두 번째에 해당된다¹. 위암의 발생율은 동아시아, 동유럽 및 라틴 아메리카 일부에서 특히 높은 편이다¹. 위암 치료에 있어서 외과적 위절제술이 가장 보편적인 치료이며, 종양이 조기 단계에서 제거된 경우에 가장 효과적이다. 그러나, 종양이 전이가 된 경우 환자 생존율은 저조하게 된다. 그러므로, 위암의 조기-단계 발견은 위암환자의 생존률 증가에 있어 결정적이라고 할 수 있다. 이러한 이유로, 한국 및 일본과 같이 위암 발생률이 높은 국가에서는 X-선 형광 촬영 또는 내시경을 이용하여 위암에 대한 전반적인 스크리닝을 보편적으로 실시하고 있다².

현재 위암 고 발생 국가들 사이에서 내시경이나 X-선 형광 촬영을 이용하는 스크리닝이 사용되고 있지만, 전립선 암에 있어서의 PSA (prostate specific antigen)이나 간암에 있어서의 AFP (alpha-feto protein)와 같은 혈청 바이오마커를 이용한 테스트는 전 세계에서 실용화 될 수 있는 보다 편리한 스크리닝 방법을 제공할 것이다. 또한, 이러한 편리한 혈청 바이오마커는 위 외과적 수술 및 화학치료 후 위암 환자를 모니터링 하는데 매우 유용할 것이다. 종래에서는 위암에 대하여 CEA, CA19-9, CA72-4 및 AFP를 포함하는 몇 가지 혈청 바이오마커의 예후 유용성을 조사한 바 있다. 그러나, 이러한 바이오마커들은 만족스럽지 못한 결과를 나타내고 있는 실정이다^3-7.

최근, 많은 연구자들이 위암 환자의 스크리닝과 모니터링을 하기 위한 신규한 혈액 바이오마커를 동정에 있어서 유전자 발현 프로파일링, 프로테오믹스(proteomics) 및 에피지노믹스(epigenomics)를 적용하여 왔다. MIC-1와 CXCL5는 정상 조직과 위종양 조직과의 비교와 위암 환자의 혈청에서 유전자 발현을 통하여 유전자를 상향 조절하는 것으로 최초로 확인된 잠재적으로 신규한 혈청 바이오마커의 예라고 할 수 있다^8,9. 한편, 위암 환자 및 대조군으로부터 유래한 혈청 시료의 질량 분석법을 통하여 2개의 신규한 마커들은 보고되었다¹⁰. 또 다른 연구로, Tan 등은 잠재적 바이오마커로서 위암 환자들의 혈청 시료에서 RUNX3, p16, RASSF1A 및 CDH1과 같은 종양 억제 유전자의 메틸레이션(methylation) 상태를 조사 하였다¹¹.

하지만, 많은 바이오마커 후보들이 대용량(high-throughput)의 지노믹스와 프로테오믹스 기술을 이용하여 발굴되었음에도 불구하고, 치료학적 응용에 있어 성공적으로 적용시킨 바이오마커들은 그리 많지 않았다¹². 종양 및 정상 조직에서 다르게 발현되는 것으로 밝혀진 대부분의 후보 유전자들이 다른 많은 정상조직에서 발현됨으로써 바이오마커로서 이용하는데 부적합하였다^13,14.

하나 또는 그 이상의 몇 개 조직에서 특이적으로 발현되고 종양에서 상위 조절되는 유전자들은 잠재적으로 훌륭한 혈청 바이오마커라고 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 암 진행과정에서의 조직 특이적 성격을 잃어버리는 (de-differentiation) 과정으로 인하여 대부분의 조직-특이적 유전자들은 암에서 발현이 감소된다¹⁵. 이러한 점을 고려해 볼 때, 본 연구자들은 종양 및 정상 조직 시료의 유전자 발현 데이터베이스로부터 잠재적인 혈청 바이오마커를 검증하기 위하여 신규한 바이오정보학적 연구를 개발하였다.

이에, 본 연구자들은 새롭게 개발된 연구 결과를 위암에 적용하여 위암 환자에 대한 잠재적인 혈청 바이오마커로서 MMP-1을 확인하였으며, 위암 환자와 정상인 2개 군으로부터 혈청 시료에서의 가능성 있는 바이오마커로 MMP-1를 검증하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 위암을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 위암을 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 위암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 위암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 위암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 MMP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, MMP-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 위암 진단 또는 예후에 필요한 정 보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 MMP-1의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 위암을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 위암을 신속하고 정확하게 분자 진단할 수 있는 신규한 분자 마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 상술한 분자 마커가 위암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다. 특히, 본 발명의 마커는 위암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

MMP-1는 인간 기질 콜라게나아제(Interstitial collagenase)를 암호화하는 유전자이다. MMP (matrix metalloproteinase) 패밀리 단백질들은 관절염과 전이와 같은 질병 과정뿐 만 아니라 배아 발달, 재생산 및 조직 재건과 같은 정상 생리학적 과정에서 세포외 기질의 붕괴에 관여한다. 대부분의 MMP들은 세포외 프로티나아제에 의하여 절단되는 경우 활성화되는 불활성 프로프로틴으로 분비된다. 이러한 유전자들은 기질의 콜라게나아제 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ을 붕괴시키는 분비 효소를 암호화 한다. 또한, 염색체 11q22.3에 위치하는 MMP 유전자들의 클러스터의 한 부분이기도 하다(Krane SM., “Is collagenase (matrix metalloproteinase-1) necessary for bone and other connective tissue remodeling?”. Clin. Orthop. Relat. Res. (313): 4753(1995)). MMP-1 유전자의 mRNA 서열은 NM_002421로, 단백질 서열은 NP_002412로 개시되어 있다.

본 발명에서 이용되는 바이오마커 MMP-1 단백질은 프로-MMP-1(pro-MMP-1) 또는 활성 MMP-1이고, 바람직하게는 프로-MMP-1이다. 본 발명의 바람직한 바이오마 커인 프로-MMP-1은 단백질분해효소에 의해 절단되기 이전의 자이모겐 상태의 MMP-1 단백질을 의미한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 위 세포, 위 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미한다.

본 발명의 분자 마커는 위암의 발생 및 발전에 대한 지표가 될 수 있으며, 위암의 발생 및 발전의 진단에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 위암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직 하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 위암을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C₁₄, I₁₂₅, P₃₂ 및 S₃₅)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, MMP-1 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 위암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 위암으로 진단된다.

본 발명의 하기 일 실시예에 따르면, 정상 생물학적 시료에 포함된 MMP-1 단백질의 농도는 2,000-2,500 pg/㎖이 포함되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르며, 상기 본 발명의 마커 MMP-1 단백질이 생물학적 시료에 3,000-6,000 pg/㎖의 농도로 포함되어 있는 경우 위암으로 진단된다. 보다 바람직하게는 상기 생물학적 시료에 포함된 MMP-1 단백질의 농도는 3,500-5,500 pg/㎖이고, 가장 바람직하게는 4,000-5,000 pg/㎖이다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 MMP-1 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 MMP-1의 접근번호를 이용하여 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레 이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 위암 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 위암 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방 사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 위(stomach) 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세 한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼 린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 위암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 위암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 위 조직세포)보다 강하게 나오는 경우에는 위암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 위암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 위 조직, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨 대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 세포, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우에는 위암으로 진단된다.

따라서 본 발명의 위암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기 초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 위암에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포와 비교하여 2-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 위암으로 판정한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 위암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에서의 MMP-1은 위암에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 마커이다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 위암 환자의 조직에서만 특이적으로 발현이 증가되는 MMP-1을 이용하여 생물학적 시료(예컨대, 혈액이나 혈청)로부터 매우 특이적으로 위암의 조기 진단 및 예후를 판정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

실험재료 및 방법

1. 유전자 발현 데이터 분석

유전자 발현 데이터 세트를 유전자 발현 옴니버스 웹사이트로부터 얻었다¹⁶. 본 연구자들은 Affymetrix U133 플러스 2 플랫폼을 이용하여 인간 조직 유전자 발 현 데이터 세트를 수집하였으며, 데이터세트 리스트를 표 1에 나타내었다. CEL 파일로부터 각각의 데이터세트를 전처리하였다. 로(raw) CEL 파일이 없는 데이터세트가 MAS5 알고리즘을 이용하는 경우에 본 연구에 포함시켰다. CEL 파일이 있는 데이터 세트들은 affy 패키지에서 MAS5 알고리즘을 이용하여 실시하였다¹⁷. 각 시료들을 표적 평균 밀도 500으로 표준화시켰으며, 모든 세트들을 약 10,000 명의 인간 조직 시료의 단일 데이터 세트로 결합하였다.

* gse: GEO(expression omnibus)로부터의 유전자 발현 시리즈.

E-TAMB-: ArrayExpress로부터의 데이터 시리즈.

각 조직 타입에 있어서, 각 시료를 정상 또는 종양 조직으로 분류하였다. 모든 정상 인간 조직에서 각 유전자의 발현 수준을 측정하기 위하여, 각 조직 유형에 대한 각 유전자의 중간 값을 계산하였다. 그 다음, 위암 환자 및 정상 대조군에 대한 유전자 발현 값에 모든 다른 조직의 중간 값을 더하여 위암 환자 및 정상 대조군에 대한 혈청-수준 유전자 발현 값을 계산하였다(도 1). 위암 환자를 위한 잠재적인 혈청 바이오마커를 확인하기 위하여 혈청-수준 유전자 발현 값에 t-테스트를 적용하였다.

2. 시료 수집

위암 환자(n=120) 및 건강한 정상 대조군(n=120) 혈청 시료의 두 세트를 본 연구에 포함시켰다. 한양 대학교(Hanyang University: HYU) 구리 병원에서 한 개의 세트를 수집하였고, 다른 한 개의 세트는 충남 국립 대학교(Chungnam National University: CNU) 병원에서 수집하였다. HYU 시료는 40명의 환자와 40명의 건강한 대조군으로 구성되었으며, CNU 시료는 80명의 환자와 80명의 건강한 대조군으로 구성되었다. 내시경 검사 또는 외과 표본 조사를 이용하여 위선암(Gastric adenocarcinoma)으로 확진하였다. 정상 외형을 가지는 작은 위염 또는 위 점막(gastric mucosa)이 있는 건강한 대조군은 위내시경 검사를 이용하여 확인하였다. 혈액 모음 유사도의 나이와 날짜를 이용하여 실험적 시료와 대조군을 비교하였다. 모든 혈액 시료들은 각 병원의 임상연구심의위원회(Institutional Review Board)의 승인과 모든 개인으로부터 정보 수집 동의를 받아 수득된 것이다. 혈액 응고전까지 정맥 천자(venipuncture) 30분내에 혈액으로부터 시료를 분리하여 분주하고, 분석시까지 -80℃에 저장하였다. 환자 특성과 종양 상태를 표 2에 요약하였다.

3. ELISA 및 데이터 분석

프로-MMP-1(카탈로그 번호. DMP100), CXCL5(ENA-78; 카탈로그 번호. DX000) 및 모든(프로- 및 활성) MMP-3(카탈로그 번호. DMP300)의 Quantikine ELISA 키트는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. MMP-12(카탈로그 번호. E0402h)에 대한 ELISA 키트는 USCNLIFE 사이언스 & 테크놀로지(Wuhan, China)로부터 구입하였다. 프로-MMP-1을 측정하기 위한 상기 ELISA 키트에 있는 항체는 인간 프로-MMP-1에만 특이적으로 결합하는 항체로서 활성화 MMP-1과 TIMP에 결합된 MMP-1에는 결합하지 않는 항체이다.

혈청 시료를 제조사의 설명서에 따라 희석하고 제조사의 지침에 따라 면역학적 분석을 하였다. 분석 민감도를 6-95 pg/㎖(MMP-1), 15 pg/㎖(CXCL5), 156 pg/㎖(MMP-12) 및 2-45 pg/㎖(MMP-3)로 제한하였다. 위암 환자 및 정상 대조군 간 MMP-1에서 차이점을 평가하기 위하여 Student’s t-테스트를 이용하였으며, 바이오마커로서 MMP-1의 효능을 평가하기 위하여 ROC(receiver-operator characteristics) 분석을 적용하였다. 다른 혈청 MMP-1 수준을 갖는 위암 환자 간 생존 차이를 비교하기 위하여 로그 랭크 테스트(log rank test)를 적용하였으며, 예후의 일변량 분석을 위하여 Cox proportional hazards 모델을 사용하였다. R 통계학적 언어(version 2.9.2)를 이용하여 모든 통계 분석을 실시하였다.

실험 결과

유전자 발현 DB 분석으로부터 잠재적인 혈청 바이오마커 검증

본 발명의 계산의 대략적인 흐름도를 도 1에 나타내었다. 본 연구의 특징은 다른 정상 조직에서의 유전자 발현 값을 고려하여 각 유전자에 대한 혈청 수준 유전자 발현 값을 계산한 것이다. 인체 내에서 혈액은 혈관을 통하여 순환하고 모든 조직과 다양한 물질을 교환하기 때문에, 혈액에서 발견되는 단백질은 모든 조직에서 유래한다고 할 수 있다. 조직 특이적인 단백질들을 제외하고, 혈액에서 발견되는 대부분의 단백질은 두 개의 분리 조직 그 이상으로부터 유래한다. 이러한 사실에 기초하여, 본 연구자들은 암 환자와 정상 대조군에서의 혈청 단백질의 발현도가 조직 수준에서 관찰된 유전자의 발현도와 현저하게 다를 것이라고 판단하였다. 292개의 위 조직 데이터 세트(249개 위암조직과 43개의 정상 위조직)에 있어서, 28개의 다른 정상 조직으로부터의 중간 발현 값을 더하여 각 유전자의 혈청 수준 유전자 발현을 계산하였다(표 2). 그 다음 각각의 수치를 log2로 변화시켰으며, t-테스트를 적용하여 다르게 발현되는 유전자를 검증하였다. 혈청 수준의 분별적으로 유전자 발현 분석에 의하여 확인된 최상위 30개의 상위 조절된 유전자를 표 3에 나타내었다. 또한, 조직 수준에서 분별적으로 발현된 유전자를 확인하기 위하여 292명의 위 조직의 본래의 유전자 발현 데이터에 t-테스트를 수행하였다. 조직 수준의 분별적인 유전자 발현 분석에 따라 확인된 최상위 30개의 상위 조절된 유전자를 표 4에 나타내었다. 예상대로, 혈청 수준의 상위 30개 유전자 리스트와 조직 수준의 상위 30개 유전자 리스트 간에 유의한 차이점들이 나타났다(표 4 및 5). 조직 수준에서 유의하게 상위 조절되는 것으로 나타난 대부분의 유전자들은 다른 정상 조직에서 유전자 발현 값을 고려한 경우 상위 조절되지 않는 것으로 나타났다. MMP-1은 혈청 수준의 상위 30개의 유전자에서 가장 높은 배율 값을 나타내었다. 도 2는 인간 암 및 정상 조직으로부터 MMP-1의 발현 프로파일을 나타낸 것이다. MMP-1 전사체는 대부분 정상 조직에서는 낮은 수준으로 발현되었으나, 위, 방광, 유방, 자궁 경부, 직장, 식도, 두경부, 폐, 췌장, 질(vagina) 및 외음부(vulva)를 포함하는 다양한 암에서 높게 발현되었다.

위암의 혈청 마커로서의 MMP-1 검정확인

상위 30개의 후보군들로부터, 추가적인 분석을 위하여 상업적으로 유용한 ELISA 키트들을 이용하여 MMP-1, CXCL5, MMP-12 및 MMP-3을 선별하였다. 본 연구자들은 HYU 군으로부터의 혈청 시료와 함께 상기 4가지 단백질에 대한 ELISA 분석을 하였다. The HYU군은 40명의 위암 환자들과 40명의 대조군들을 포함하였다(표 2). 위암 환자들에서 혈청 MMP-1의 중간 농도는 대조군 시료 농도보다 유의하게 높았다(4,813 vs 2,304 pg/㎖, P=0.0003). 이와 반대로, CXCL5 (981 vs 867 pg/㎖, P=0.3171), MMP-12 (65,126 vs 26,442 pg/㎖,P=0.4602) 및 MMP-3 (1,619 versus 1,759 pg/㎖, P=0.7368)은 위암 환자 및 대조군에서 유의한 차이점을 나타내지 아니하였다(표 2). 커브(AUC) 값 하에서 중립 선 및 영역과 실질적인 차이를 보이는 MMP-1의 ROC 곡선은 0.7524 (P=0.0001)(도 3a)이었으며, 이것은 MMP-1가 위암의 잠재적인 혈청 마커임을 나타낸 것이다. 위암 혈청 마커로서의 MMP-1을 확인하기 위하여, 80명의 위암 환자 및 80명의 건강한 대조군을 포함하는 CNU 군 시료에 대하여 ELISA를 실시하였다(표 2). 예상대로, CNU 군에서의 위암 환자에서 혈청 MMP-1의 중간 농도는 대조군 시료에서의 수준보다 유의하게 높게 나타났다(3,055 vs 2,398 pg/㎖, P=0.0002). CNU 군에서의 MMP-1에 대한 ROC 커브는 0.6949(P<0.0001)의 AUC 값을 나타내었으며(도 3b), 이는 MMP-1이 위암의 잠재적인 혈청 마커임을 확인하였다.

혈청 MMP-1 수준과 위암 환자의 임상병리학적 특성과의 조합

본 연구자는 모든 환자(n=120) 및 대조군(n=120)에서 혈청 MMP-1 수준을 비교하였다. 위암 환자에서 MMP-1의 혈청 수준은 대조군 샘플(2,352 vs 3,912 pg/㎖, P<0.0001)보다 유의하게 높았으며, ROC 커브는 0.7146 (P<0.0001)의 AUC를 나타내었다(도 4a 및 4b). 그 다음, 본 연구자들은 환자 그룹을 조기 위암(EGC) 및 진행 위암(AGC)으로 분류하였으며, 대조군 시료에서 수준과 각 그룹의 혈청 MMP-1 수준을 비교하였다. 혈청 MMP-1의 수준은 EGC (P=0.0011)와 AGC (P<0.0001)에서 모두 유의적으로 높았으며, AGC 그룹에서의 평균 혈청 MMP-1 수준은 EGC 그룹의 평균보다 높았다(3,301 vs 4,398 pg/㎖, P=0.0180)(도 4C). 또한, AGC 그룹(0.7575)에 대한 AUC 값이 EGC 그룹(0.6602)보다 높았음을 확인하였다(도 4D). ROC 분석에 있어서, 위암 환자 및 대조군(민감도 62.5%, 특이도 62.5%)에서 2,334 pg/㎖의 혈청 MMP-1 컷-오프 값이 가장 큰 차이를 나타내었다. 전체 120명의 위암 환자 중 78명(65%)은 높은 혈청의 MMP-1수준을 나타내었다(표 6). 또한, 혈청 MMP-1 수준은 연령, 성별, 병력(histology), 또는 림프절 전이와의 관련성이 없는 것을 확인하였다(표 6).

^a chi-square 테스트 분석.

혈청 MMP-1 수준과 위암 환자의 약한 생존력과의 연관성

본 연구자들은 조사된 120명의 전체 환자 중 94명의 환자에 대하여 5년 간 생존 데이터를 추적하였으며, 추적 결과 5년 이상의 생존율은 76.6%로 나타났다(94명 중 72명). Kaplan-Meier 분석을 이용하여 높거나 낮은 혈청 MMP-1 수준을 가지는 위암 환자의 생존율을 비교하였다. 로그-랭크(log-rank) 테스트에서 높은 혈청 MMP-1 수준을 가지는 환자는 낮은 혈청 MMP-1 수준을 갖는 환자보다 안 좋은 결과를 나타내었다(P=0.0101; 도 5A). 또한, 높거나 낮은 혈청 MMP-1 수준을 나타내는 진행성 위암 환자(AGCs)에서의 생존율에 있어서 차이점을 나타내는지에 대하여 테스트하였다. 역시, 높은 혈청 MMP-1 수준을 갖는 진행성 위암 환자가 낮은 혈청 MMP-1 수준을 갖는 위암 환자보다 유의적으로 안 좋은 결과를 나타내었다(P = 0.04; 도 5B). 모든 위암 환자 세트와 진행성 위암 환자 세트에 Cox 비례위험 회귀 분석(proportional hazards regression analysis)을 실시하였다. 모든 환자(EGC 및 AGC)의 분석에 있어서, 증가된 MMP-1 수준을 가지는 환자들이 MMP-1 마커의 낮은 수준의 환자들보다 1.16배의 높은 위험도를 나타내었다(95% 신뢰 구간 1.05와 1.28사이에서 위험율 1.16 ; p < 0.005). 진행된 위암 환자에서, 증가된 MMP-1 수준을 가지는 환자들은 낮은 수준의 환자들보다 1.11배 높은 사망 위험을 가졌다(95% 신뢰 구간 1.05와 1.28사이에서 위험율 1.11 ; p < 0.005)(표 7).

검토

최근 마이크로 어레이 유전자 발현 프로파일링 및 프로테오믹스와 같은 고-재료 처리 기술은 연구자들로 하여금 많은 신규한 혈청 바이오마커의 발견 및 임상적 이용에 대한 예측을 가능하게 하였다. 수 많은 연구자들은 유전자 발현 프로파일링과 프로테오믹스 기술을 암 스크리닝 및 모니터링을 위하여 이러한 신규한 혈청 바이오마커에 적용하였으며, 이러한 연구들은 많은 후보 바이오마커 리스트를 발생시켰다.^8-10 그러나, 이러한 고-재료 처리 기술들을 도입하는 연구에서 FDA 승인 및 임상에 이용되는 혈청 바이오마커들은 아직까지 생산되지 않고 있다. 현재, 임상에 이용되는 PSA, AFP, CEA 및 CA-19-9와 같은 혈청 바이오마커들은 고-재료 처리 기술을 이용하기 전부터 개발되어 왔다.¹²

본 연구에 있어서, 본 발명자들은 다른 정상 조직에서 유전자 발현에 대한 고려가 어떠한 질환 조직의 혈청 바이오마커 개발에 있어서 필수적이라고 제시하였다.^13,14 인체내에서 혈액은 혈관 순환을 통하여 다른 조직과 다양한 물질을 교환함으로써, 모든 조직으로부터 유래하는 물질들을 필수불가결하게 포함하고 있다.¹⁴ 이러한 사실은 몇 개의 조직-특이적 유전자를 제외하고는 조직 수순에서 흔히 관찰되는 차별적인 유전자의 고 발현이 혈청 수준에서까지 복제가 된다고 제시하는 것은 아니다.¹⁴ 아쉽게도, 종래의 대부분 전사체학-기초 혈청 마커에 대한 개발 연구에서는 다른 조직에서의 발현 패턴을 고려하고 있지 않고 있다.

조직-특이적 유전자의 발현 패턴이 조직과 혈청에서 유사하기 때문에, 조직 유전자 발현 데이터로부터 잠재적인 혈청 마커를 확인하는 유일한 방법은 조직-특이적 유전자에 초점을 마추는 것이다.^13,14 실제로 혈청 스크리닝 마커들 중 가장 성공적인 마커는 PSA(prostate specific antigen)이며, 이 유전자의 발현은 전립선 조직에 제한적이고 전립선암에서 상위 조절(upregulated) 된다.¹⁶ 효과적인 마커에 대한 다른 가능성은 종양 조직에서 과발현되거나 정상 성인 조직에서 발현되지 않는 유전자일 수 있으며, 대표적으로는 AFP (alpha-feto protein)를 들 수 있다.¹⁷ 안타깝게도, 정상 조직-특이적 기능의 손실을 가져오는 역분화(de-differentiation) 과정이기 때문에 대부분의 조직-특이적 유전자는 종양 조직에서 하위조절이 된다.¹⁵

이에 본 연구자들은 특이적인 종양 조직과 대다수의 정상 조직의 유전자 발현 데이터로부터 잠재적인 혈청 바이오마커의 동정에 대한 새롭고 단순한 계산 방법을 제시한다.

모든 정상 조직으로부터 유전자 발현의 합을 더한 특이적 종양/정상 조직 패어(pair)에 대한 혈청-수준 유전자 발현 데이터세트를 디자인하였다(도 1). 그 다음, 혈청-수준 유전자 발현을 기초로 하는 배 증가 스코어와 p-값을 계산하여 유의적으로 상위 조절된 유전자를 검증하였다. 예상 대로, 혈청-수준 유전자 발현으로부터 확인된 유전자의 리스트는 종양/정상 그룹의 전통적인 차이 분석에 의하여 확인된 유전자 리스트 보다 유의적으로 차이가 있었다. 생각컨대, 다른 정상 조직에서의 발현 패턴에 대한 고려를 하지 않았기 때문에 전통적인 전사체학-기초 연구에 의하여 동정된 종래 많은 바이오마커 후보자들이 임상학적으로 유용한 바이오마커들로 성공적으로 번역되지 아니하였다.¹⁴

MMP-1의 특이도/민감도는 위암에 대한 유일한 스크리닝 바이오마커로 이용되기에는 불충분하다(도 3). 특히, 스크리닝된 개인에서 MMP-1의 비정상적으로 증가된 발현이 관찰되는 경우 다양한 종양 타입에서 MMP-1의 과발현은 특이적 종양 사이트를 동정하는데 어렵게 한다(도 2). 또 다른 문제는 MMP-1의 과발현이 조기 위암환자보다 진행된 위암 환자에서 더 빈번하다는 것과 이러한 점이 위암의 조기 검출에 있어서 덜 매력적이게 한다(도 4). 그 대신, MMP-1은 위절제술 후 위암 환자에 대한 예후 또는 모니터링 마커로서 개발 될 수 있다고 여겼다.

위절제술 후 재발 모니터링을 위한 위암 바이오마커로서 몇 개의 혈청 바이오마커에 대한 잠재성을 테스트하였다. 예를 들면, 최등은 AFP, CEA 및 CA19-9가 위절제술을 한 104명의 위암 환자들에 대한 재발 표시자로서 작용할 수 있는지를 테스트 하였다. 이 연구에서 3가지의 마커들이 30.8%(AFP)에서 51.9% (CEA)까지의 정확 예측 값을 나타내었다.¹⁸ 오츠카등은 근치적 위절제술을 한 169명의 환자들에서 CEA와 CA19-9을 테스트하였으며 재발 예측자로서의 이러한 마커들이 10.1% 정확률과 14.3%의 부정확률을 나타내었다.¹⁹ 오츠카의 또 다른 연구에서는 위절제술 후 CEA와 CA19-9의 재발 예측 부정확률이 23%가 되었으며, 대장 수술 후 재발에 대한 12%보다 높았다고 보고 하였다. 또한, 위절제술 후 재발 예측 정확률이 64%이었으며, 대장 수술 후 81% 재발률보다 낮았다. 이러한 연구결과는 CEA와 CA19-9가 바이오마커로서의 능력에 있어서 대장암에서보다 위암에서 더 안좋다라는 것을 의미한다.²⁰ 그러므로, 위절제술 후 재발을 모니터링하는데 CEA, CA19-9 및 AFP의 이용은 매우 만족스럽지 못하다. 안타깝게도, 수술 후 MMP-1 혈청 수준에 대한 데이터는 MMP-1의 재발 예측 능력 평가에 유용하지 않기 때문에, 본 연구자들은 재발에 대한 모니터링 마커로서 MMP-1의 능력을 평가할 수 없었다. 앞으로 위절제술 후 재발에 대한 모니터링 마커로서 MMP-1의 능력을 평가할 계획이다. 그러나, MMP-1는 세포외 메트릭스의 붕괴에 관여할 뿐 만 아니라 많은 암에 대한 전이를 암시하고 있으며, 고 혈청 MMP-1 수준은 많은 암 유형에서 종양 재발과 관련이 있을 것이라 예상한다.²¹

어떤 보고서에서는 위암에서 CEA, CA19-9, CA72-4 및 AFP을 포함하는 널리 알려진 마커의 수술 전의 혈청 수준에 대한 예후 값을 평가하였다. 예를 들면, 코치 등은 위암 환자에서 예후 요소로서 혈청 CEA 및 CA19-9 수준을 평가하고 혈청 CEA 수준이 종양 침습 및 단계와 같은 다른 임상학적 요소와 함께 다변량 분석에 있어서 독립적으로 예후라고 밝혔다.⁷ 마터등은 수술 전의 CA72-4, CEA, CA19-9 및 AFP의 혈청 수준을 측정하여 CA72-4의 수술 전의 혈청 수준이 진행된 위암 환자를 예측하는 데 있어 예측 값을 제공한다는 것을 밝혔다.⁵

로모등은 혈청 마커 CEA, CA19-9, CA72-4, CA242 및 hCGb의 예후 중요도를 평가하였으며 hCGb와 CA72-4가 독립적인 예후 요소일뿐 만 아니라 종양의 단계 및 조직학적 유형라고 판단하였지만, CEA, CA19-9 및 CA242는 예후 요소가 아니였다.⁴ 다변량 분석에 의하여 확인된 hCGb와 CA72-4의 위험 비율은 각각 1.51(95% 1.24-1.85)과 1.20(95% CI 1.07-1.35)이였다.⁴

유칼등은 수술 전의 CEA, CA19-9, CA72-4 및 AFP 수준의 예후 값을 평가하였으며 CA72-4의 고 수술전의 혈청 수준이 위암으로 인한 고 사망 위험과 관련이 있다고 밝혔다.³ 이런 결과들에 부적합할 지라도, 대다수의 종래 보고서는 수술 전의 혈청 CA72-4 수준이 위암 환자들에게 있어 가장 유용한 예후 마커라고 주장하였다.

본 연구에서, 본 발명자들은 위절제술 후 환자 생존률에 있어서 수술 전 혈청 MMP-1 수준이 높은 예후 인자라고 나타내었다(도 5a). 높은 혈청 MMP-1 수준을 나타내는 환자들은 낮은 혈청 MMP-1 수준을 나타내는 환자들보다 유의적으로 더 안 좋은 결과를 나타내었다. 진행된 위암 환자들로 제한하여 분석하는 경우에서도 같은 트랜드(trend)가 관찰되었다(도 5b). 그러므로, 혈청 MMP-1 수준은 종양 단계 그 이상의 예후 값을 가지며, 위암에서 가장 중요한 예후 인자 중 하나이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 본 발명에서 위암에 대한 잠재적인 혈액 마커를 동정하기 위하여 이용된 혈청-수준 분석의 흐름도를 나타낸 것이다.

도 2는 정상 및 종양 조직에서의 다양한 MMP-1 발현 패턴을 나타낸 것이다. Affymetrix U133 플러스 2 플렛폼을 이용하여 제작한 인간 조직 유전자 발현 데이터 세트를 유전자 발현 옴니버스 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)로 부터 얻었다. 각각의 시료를 표적 평균 밀도 500으로 표준화시켰으며, 대략 10,000 인간 조직 시료들의 단일 데이터세트로 결합시켰다. 플롯 상자는 중간, 25번째 및 75번째 백분위수를 나타낸 것이며 점(dot)들은 아웃라이어들(outlier)을 나타낸 것이다.

도 3a-3b는 HYU 및 CNU 군에서의 혈청 MMP-1 수준을 나타낸 것이다. 도 3a는 HYU 군에서의 혈청 MMP-1의 분포 및 ROC 곡선을 나타낸 것이다. 0.7524의 AUC를 가진 위암 환자(오른쪽; p=0.0001)의 혈청 MMP-1 수준은 대조군(왼쪽; p=0.0003)보다 유의적으로 더 높게 나타났다. 도 3b는 CNU 군에서의 혈청 MMP-1의 분포 및 ROC 곡선을 나타낸 것이다. 0.6949의 AUC를 가진 위암 환자(오른쪽; p<0.0001)의 혈청 MMP-1 수준은 대조군(왼쪽; p=0.0002)보다 유의적으로 더 높게 나타났다.

도 4a-4d는 모든 환자 및 대조군들에서의 혈청 MMP-1 수준을 나타낸 것이다. 도 4a는 환자 및 대조군에서의 혈청 MMP-1 수준의 분포를 나타낸 것이며, 위암 환자에서의 혈청 MMP-1 수준은 대조군 보다 유의적으로 높았다(p<0.0001). 도 4b는 환자 및 대조군에서의 혈청 MMP-1 수준의 ROC 곡선을 나타낸 것이며, 대조군과 0.7146의 AUC를 가진 위암 환자에서의 혈청 MMP-1 수준은 유의적으로 다르게 나타났다(p<0.0001). 도 4c는 대조군, 조기 위암(early gastric cancer: EGC) 및 진행된 위암(advanced gastric cancer: AGC)에서의 혈청 MMp-1 수준의 분포를 나타낸 것이다. 혈청 MMP-1 수준은 대조군 보다 EGC(p=0.0011) 및 AGC(p<0.0001)에서 유의적으로 높았으며, EGC(p=0.0180)보다 AGC에서 혈청 MMP-1 수준이 더 높았다. 도 4d는 EGC 및 AGC에서의 혈청 MMP-1 수준의 ROC 곡선을 나타낸 것이다. AGC 세트의 AUC 값(오른쪽; 0.7575)이 EGC 세트의 EGC 세트 AUC 값(왼쪽; 0.6602)보다 높았다.

도 5a-5b는 Kaplan-Meier 분석을 이용하여 혈청 MMP-1 수준과 관련된 위암 환자들(A: 총합 또는 B: AGC)에 대한 수술 후의 생존율 곡선을 나타낸 것이다. 높은 수준의 혈청 MMP-1을 가지는 환자들(≥ 2,334 pg/㎖; fp드)의 생존율은 낮은 수준의 혈청 MMP-1을 가지는 환자들(< 2,334 pg/㎖; 그린)의 생존율보다 유의적으로 낮았다(A: 총 위암(GC) 환자들(p = 0.0101) 또는 B: AGC(p=0.0400)).

Claims (12)

1. MMP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, MMP-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 위암 진단 또는 예후 분석용 키트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 MMP-1 단백질은 프로-MMP-1인 것을 특징으로 하는 키트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 MMP-1은 혈액, 혈장 또는 혈청 시료에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 키트.
6. 위암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 MMP-1 단백질 또는 MMP-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 위암 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 MMP-1 단백질은 프로-MMP-1인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 MMP-1 단백질은 생물학적 시료에 3,000-6000 pg/㎖의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특 징으로 하는 방법.
11. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.

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