CN104105791A - 诊断和预示肠癌的标志物 - Google Patents
诊断和预示肠癌的标志物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104105791A CN104105791A CN201280066472.6A CN201280066472A CN104105791A CN 104105791 A CN104105791 A CN 104105791A CN 201280066472 A CN201280066472 A CN 201280066472A CN 104105791 A CN104105791 A CN 104105791A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- cystatin
- cst4
- sense primer
- capturing agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
Abstract
提供CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因剪切子的cDNA、CST4特异性引物对应的扩增子、CST4基因编码的CYSTATIN S蛋白和CYSTATIN S蛋白的表位肽在制备诊断和预示肠癌标志物中的应用,以及利用它们进行肠癌检测的方法和试剂盒。
Description
诊断和预示肠癌的标志物
技术领域 本发明属于生物技术和医学领域, 更具体的, 本发明涉及一种肠癌标志物及其用途, 肠癌诊断、 动态检测以及预后判断的试剂或试剂盒及其使用方法。 背景技术
据世界卫生组织 (WHO) 统计, 全世界每年约有 120 万妇女发生肠癌。 我国每年有 超过 40 万人罹患肠癌, 发病率逐年上升。 在北京、 上海等大城市, 肠癌已经升至女性恶 性肿瘤的第一位。 30年来, 上海肠癌发病率已从 17.7/10万上升至 70/10万, 居各类女性 肿瘤发病之首, 其发病率已由女性恶性肿瘤中的第 2位跃至首位, 死亡率高达 40%以上。
肠癌早期检出率和总体治愈率不断提高, 但 WHO2008年报告每年约有 54万肠癌患 者死亡, 国内致死率每年还在以 3%的速度增长。 肠癌的防治仍存在大量亟待解决的问 题, 包括如何更早期发现、 及时干预, 如何实现疗效评估和监测, 如何对术后患者做到实 时准确的复发监控。
发展具有高灵敏度、 特异性强的肠癌诊断产品, 是提高肠癌早期检出率、 改善患者预 后的关键之一。 在肿瘤发生发展过程中, 作为组织蛋白酶的天然抑制蛋白 Cystatin基因家 族与肿瘤的发生发展关系密切。 在组织和体液中, Cystatin 家族蛋白可逆性地结合半胱氨 酸蛋白酶, 防止组织蛋白酶的活性过度。 Cystatin C是组织蛋白酶 B最强的抑制蛋白, 但 是在卵巢癌和头颈部癌症中, cystatin C 的表达有不同水平的上升。 而在非小细胞肺癌 中, stefin A (cystatin家族成员) 的表达水平有所增加; 在脑膜瘤中, stefin B在 mRNA 水平上有明显降低; cystatin F (亦称为 leukocystatin或 CMAP) 在多种肿瘤中的表达水平 都有显著增加。 研究结果显示, cystatin 的几个家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上 升, 很可能是由于在肿瘤发生发展过程中需要组织蛋白酶的参与, 先诱导其表达量增加, 再激活机体本身的应激机制, 导致 cystatin 的表达量上升以抑制过盛的蛋白酶活性。 但 cystatin的表达量并不与肿瘤的发展成正相关的关系, 因为在胶质瘤中, cystatin C的低表 达意味着疾病的晚期, 病人的生存期较短, 且易于复发, 该结论在 mRNA和蛋白水平上 都得到了验证。
本发明证实 cystatin 家族成员 CST4 及其剪切子的表达水平与肠道肿瘤关系密切。 CST4, 又名 cystatin S, 是半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (cystatin) 家族成员, 含 141 个氨基
酸, 分布于多种体液和分泌物中, 如眼泪、 唾液、 血清、 血浆等。
发明内容 本发明的目的之一在于提供 CST4基因、 CST4基因的 mRNA、 CST4基因剪切 子的 cDNA、 CST4特异性引物对应的扩增子、 CST4基因编码的 CYSTATIN S蛋白 和 CYSTATIN S蛋白的表位肽的新应用, 该应用为肠癌的诊断提供了新思路。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
1. CST4基因、 CST4基因的 mRNA、 CST4基因剪切子的 cDNA、 CST4 特异性引物对应的扩增子、 CST4基因编码的 CYSTATIN S蛋白和 CYSTATIN S蛋白 的表位肽在制备诊断和预示肠癌标志物中的应用, 所述 CST4 基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 42所示。
优选的, CST4基因、 CST4基因的 mRNA、 CST4基因剪切子的 cDNA 的 探针如核苷酸序列如 SEQ ID No: 3。
优选的, 所述扩增子的特异性引物, 其上游引物如 SEQ ID No: 1, 4,6,8,10,12,14,16,18,20 ; 所 示 , 下 游 弓 I 物 如 SEQ ID No : 2, 5,7,9,11,13,15,17,19, 21 所示, 上游引物 SEQ ID No: 1 与下游引物如 SEQ ID No: 2配对; 上游引物 SEQ ID No: 4与下游引物如 SEQ ID No: 5配对; 上游引物 SEQ ID No: 6与下游引物如 SEQ ID No: 7配对; 上游引物 SEQ ID No: 8与下游引物如 SEQ ID No: 9配对; 上游引物 SEQ ID No: 10与下 游引物如 SEQ ID No: 11配对; 上游引物 SEQ ID No: 12与下游引物如 SEQ ID No: 13配对; 上游引物 SEQ ID No: 14与下游引物如 SEQ ID No: 15配 对; 上游引物 SEQ ID No: 16与下游引物如 SEQ ID No: 17配对; 上游引物 SEQ ID No: 18与下游引物如 SEQ ID No: 19配对; 上游引物 SEQ ID No: 20与下游引物如 SEQ ID No: 21配对。
优选的, 所述 CYSTATIN S蛋白的表位肽的氨基酸序列如 SEQ ID No: 50所示。 所述诊断和预示优选为: 所述诊断和预示具体为: 肠癌的转移、 微转 移、 pTNM分期、 治疗过程中的动态检测及预后判断。
本发明的目的之二在于提供若干种捕获剂, 其能和肠癌标志物特异性的结 合。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
肠癌标志物的捕获剂, 所述捕获剂为所述诊断和预示肠癌标志物的捕获剂, 所 述肠癌标志物为 CST4 基因、 CST4 基因的 mRNA、 CST4 基因剪切子的 cDNA、 CST4 特异性引物对应的扩增子、 CST4 基因编码的 CYSTATIN S蛋白和 CYSTATIN S蛋白的表位肽。
所述 3) 中的所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID No : 1 -2所示。
所述 2) 中的所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No : 3所示。
所述 3) 中的所述扩增子的核苷酸序列如 SEQ ID No : 43所示。
所述捕获剂为所述 CYSTATIN S 蛋白或识别所述 CYSTATIN S 蛋白的表位肽的特异性抗 体。
所述 CYSTATIN S表位肽的氨基酸序列如 SEQ ID No : 50所示。
本发明的目的之三在于提供捕获剂的新应用及根据该应用原理制备的试剂盒及其使用方 法; 该应用和试剂盒为检测肠癌提供了新思路, 其准确性高; 该方法操作简单, 适用于临床 大规模使用。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
所述捕获剂在制备肠癌检测试剂或试剂盒中的应用。
含有所述的捕获剂的诊断试剂盒。
所述诊断试剂盒具体为:
1 ) 为基于 Taqman 水解探针法的 CST4 mRNA 实时定量检测试剂盒, 其上游引物如 SEQ ID No:l, 其下游引物 SEQ ID No:2所示, 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No:3所 示; 或
2 ) 为基于染料法的 CST4 mRNA 实时定量检测试剂盒, 其上游引物如 SEQ ID No:l, 其下游引物 SEQ ID No:2所示; 及以内参引物, 所述内参引物的上游引物如 SEQ ID No: 30所示, 下游引物如 SEQ ID No: 31所示; 或
3) 为基于核酸序列扩增法的 CST4 mRNA定量检测试剂盒或基于转录介导的扩增的 CST4 mRNA定量检测试剂盒, 两者均含有 CST4引物和探针, 所述 CST4的上游引物如 SEQ ID No:32所示, 所述下游引物如 SEQ ID No:2所示, 所述探针如 SEQ ID NO: 3所 示; 或
4) 为基于连接酶链反应的 CST4 mRNA定量检测试剂盒, 其含有 4条探针, 所述探 针的核苷酸序列分别如 SEQ ID No:33-36的核苷酸序列所示; 或
5) 为基于适温链置换扩增的 CST4 mRNA 定量检测试剂盒, 其含有引物和探针, 所
述引物如 SEQ ID No:37-40所示, 所述探针如 SEQ ID No:41所示。
所述诊断试剂盒可优选为:
1) 双抗夹心 Elisa试剂盒, 包括固相载体、 固定在固相载体上的所述捕获剂、 生物素 标记的所述捕获剂及显色底物; 固定在固相载体上的所述捕获剂为特异性单抗, 生物素标 记的所述捕获剂为多抗;
或 2) 蛋白印迹试剂盒 包括固相载体、 捕获剂、 酶标二抗及显色底物, 捕获剂包 括特异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗;
或 3) 竞争 ELISA 试剂盒 包括固相载体、 固定在固相载体上的抗原; 生物素标记 的捕获剂及显色底物; 特异性单抗; 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗。
所述诊断试剂盒还包括阳性对照、 阴性对照或 /和空白对照。
所述双抗夹心 Elisa试剂盒中, 所述特异性单抗为鼠单抗, 抗- CYSTATIN S 蛋白, 所 述固相载体为酶标板, 所述生物素标记的特异性多克隆抗体为加入生物素标记的兔抗- CYSTATIN S 蛋白的多抗。
所述试剂盒为基于双抗夹心法的 ELISA诊断试剂盒, 所述固相载体为酶标板, 所述固 定在固相载体上的捕获剂为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单抗 (R&D, MAB1296 ) (5ug/ml), 生物 素标记的捕获剂为兔抗 - CYSTATIN S 蛋白的多抗 (1 : 1000), 显色底物为碱性磷酸酶; 或所述试剂盒为基于竞争 Elisa 法的诊断试剂盒, 所述固相载体为酶标板, 所述 CYSTATIN S 蛋白的浓度为 5ug/ml,所述特异性单抗为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单抗 ( R&D, MAB 1296, 1 : 2000), 所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗 -小鼠 IgG, 所述酶 标二抗效价为 1 : 2000 (Jackson, 1: 2000, 溶于 TBS中的 0. 3%BSA中), 所述显色底物为 碱性磷酸酶底物, 所述 CYSTATIN S蛋白、 酶标二抗及显色底物的体积比为 1 : 2;
或所述试剂盒为基于免疫印记的诊断试剂盒, 所述固相载体为硝酸纤维素膜, 捕获剂 为 CYSTATIN S 鼠单抗 (1 : 1000), 酶标二抗为缀合至过氧化物酶 (Jackson) 的山羊抗-兔 IgG , 显色底物为商品化的 TMB 溶液 ( Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. (Gaithersburg; MD)) " TMB Peroxidase Substrate" solution Cat. No。 50-76-01)。
所述的试剂盒的使用方法, 其特征在于, 具体步骤包括:
将 Corning ELISA 平板孔用 CYSTATIN S ( Abnova, cat. No H00001472-P01 ) ( 5ug/ml ) 覆盖且用 3%BSA封闭。 将包含抗- CYSTATIN S 鼠单抗 (R&D, cat. No MAB 1296) ( 1: 2000) 与 8个倍比稀释的血清样品于 4度温育过夜。 随后加至覆盖的 ELISA板中且 37度温育 1小时。 每孔用 TBS (溶于 PH=7. 5的 10 mM Tris-HCl中的 154mM的 NaCl ) 洗
涤且缀合至碱性磷酸酶中的山羊抗 -小鼠 IgG (Jackson, 1: 2000, 溶于 TBS中的 0. 3%BSA 中) 在 37度反应 1小时。 加入碱性磷酸酶底物 (KPL, lOOul每孔, Blue Phos solution cat. No 508805 Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. (Gaithersburg, MD) ), 利 用 ELISA读数器在 405nm波长处定量 0D。
本发明的目的之四在于提供一种肠癌的体外诊断方法和体外诊断试剂盒, 该方法操作 简单, 特异性和灵敏性高。
为实现上述目的, 本发明的技术方案为:
运用所述的诊断试剂盒检测或预示肠癌的方法, 用所述诊断试剂盒检测待测样品中所 述肠癌标志物的含量或表达水平, 将得到的含量或表达水平与正常人进行比 较, 判定所述待测样品是否为阳性; 或直接判定所述含量或表达水平是否超过阈 值, 当超过阈值时, 判定为阳性; 所述阈值是通过对比正常人与肠癌患者体 液或组织中标志物的含量或表达水平统计得到; 所述待测样品为血液、 尿 液、 骨髓、 肠癌细胞株或肠癌及癌旁手术组织、 淋巴结中的任一种或多种。 如所述 CYSTATIN S蛋白的阈值为在 3. 434ng/ml。
用于诊断和预示肠癌的试剂盒, 所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S 蛋白水平, 包括固 相载体、 固定在固相载体上的所述捕获剂、 生物素标记的所述捕获剂及显色底物; 固定在 固相载体上的所述捕获剂为特异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗;
或所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S 蛋白的水平, 所述试剂盒包括固相载体、 包被于 固相载体的 CYSTATIN S蛋白、 CYSTATIN S特异性鼠单抗、 酶标二抗及显色底物;
或所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S 蛋白水平, 包括固相载体、 捕获剂、 酶标二抗及 显色底物, 捕获剂包括特异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗。
所述试剂盒为基于双抗夹心法的 ELISA诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为酶 标板, 所述固定在固相载体上的捕获剂为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单抗, 生物素标记的捕 获剂为效价为 1 : 1000的兔抗 - CYSTATIN S 蛋白的多抗, 显色底物为碱性磷酸酶;
或所述试剂盒为基于竞争 Elisa法的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为酶标 板, 所述 CYSTATIN S蛋白的浓度为 5ug/ml,所述特异性单抗为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单 抗, 其效价为 1 : 2000, 所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗 -小鼠 IgG, 所述酶标二 抗效价为 1 : 2000, 所述显色底物为碱性磷酸酶底物, 所述 CYSTATIN S蛋白、 酶标二抗及 显色底物的体积比为 1 : 2;
或所述试剂盒为基于免疫印记的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为硝酸纤维
素膜, 捕获剂为效价为 1 : 1000的 CYSTATIN S鼠单抗, 酶标二抗为缀合至过氧化物酶的山 羊抗-兔 IgG , 显色底物为 TMB溶液。
本发明的主要优点在于:
1、 首次发现并证实 CST4 基因与肠癌诊断、 动态监测以及预后判断具有密切相关 性, 验证的样本量多, 结果准确。 该相关性的提出为肠癌诊断、 动态监测以及预后判断提 供了新的途径。
2、 开发了适合于肠癌诊断、 动态监测以及预后判断的试剂或试剂盒, 检测灵敏度良 好。 附图说明 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图 1 为 CST4与 Pmdl8-T重组质粒图谱。
图 2 为 CST4在人体正常组织中的表达情况 (芯片), 所述组织包括扁桃体、 垂体后 叶、 甲状腺、 唾液腺、 骨骼肌、 骨髓、 除去红细胞和血小板的外周血、 肺、 胃、 肝脏、 心 脏、 肾、 肾上腺、 肠、 结肠、 胰脏脾脏、 膀胱、 前列腺、 卵巢、 子宫、 胎盘、 睾丸以及肠 癌细胞株 SW480,caco2, 人肠上皮细胞株 ΗΝΪΕ (:。
图 3为染料法实时定量 PCR给出的 CST124; CST1 ; CST2; CST4在 20对肠癌和 癌旁组织中的表达量差异。
图 4为 Real-time PCR绝对定量法给出的 CST4在 100例肠癌和癌旁组织中的表达量 分布。
图 5为 Real-time PCR绝对定量法给出的 CST4在 36例肠癌以及 29例肠炎镜检标本 的表达量分布。 ' . ' 图 6为 Real-time PCR绝对定量法给出的 CST4在 20枚肠癌病理阳性淋巴结, 15枚病 理阴性淋巴结中表达量分布。
图 7为通过 Real-time PCR绝对定量法检测外周血游离肠癌细胞的准确度与细胞学检 测的对比。
' 图 8为通过 Real-time PCR绝对定量法检测肠癌骨髓转移的准确度与细胞学检测的对 比。
图 9A为通过 Real-time PCR绝对定量法, 肠癌病人 (50例) 血浆 Cell-free R A中 CST4量与炎 (30例) /正常人 (30例)的差异;图 9B为通过 Real-time PCR绝对定量法获得 的 ROC曲线, 区分肠癌 /炎 /正常的敏感性和特异性。 更正页(细则第 91条)
图 10 为通过连接酶链反应 (Ligase chain reaction, LC ) 方法, 肠癌病人 (50例) 血浆 Cell-free RNA中 CST4量与炎 (30例) /正常人 (30例)的差异。
图 11 为通过适温链置换反应 (thermophilic strand displacement amplification, tSDA) 方法, 肠癌病人 (50例)血桨 Cell-free RNA中 CST4量与炎 (30例) /正常人 (30例)的差异。
图 12.为通过核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA), 20例肠癌, 10例肠炎, 10例正常人尿样中 CST4的表达差异。
图 13 为通过转录介导的扩增 (Transcription-mediated amplification, TMA), 检测 80 例肠癌 (pTNM分期, Ι+Π 30例, III+IV50例) 不同分期 CST4表达量的差异。
图 14显示了 CYSTATIN S 在肠癌细胞株培养上清和正常人血清中的表达情况。
图 15显示了 CYSTATIN S 在正常人血请, 肠癌细胞培养上清中的表达情况。 .
图 16 显示了应用多克隆抗体竞争法 ELISA检测 20 例正常人、 30 例肠癌患者血清中
CYSTATIN S 的表达情况。
图 17显示了 ELISA方法检测肠癌 CYSTATIN S 蛋白和 CEA在灵敏性和特异性方面的比较。 图' 18为肠癌患者经治疗后高于 Cystatin S蛋白表达中位数组及低于该中位数组的无病 生存曲线。 具体实施方式
第一部分分子检测
下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。 下列实施例中为注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件 如 Sambrook 等人, 分子克隆: 实验室指南 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件, 或按照制造商所建议的条件。 除非另外说明, 否则百分比和 份数按重量计算。
材料和方法: .
实施例中所用标本均与病人签署知情同意书后按医院规定途径获取, 来源于北京友谊 医院。
内镜下获取的病理部位标本和非病理部位样本作为对比, 也可是非镜检方式如手术或 肠壁擦拭法获取的细胞、 手术中获取的淋巴结等样本应立即提取 RNA 或置于液氮或 RNAlater(Ambion公司产品)中保存。 、 - 外周血、 骨髓或尿液样本首先通过离心机 4000rpm, 4°C, 离心 20 分钟, 取上清,
更正页(细则第 91条)
13000rpm, 4°C, 离心 10分钟, 分离上清和沉淀, 立即提取 RNA或置于 -20°C至 -80°C保 存。
TaqMan水解探针的 Real-time PCR法: 上述样本用商业化的核酸抽提方法进行, 一个 常用的非限制性例子是酚 /氯仿抽提方法, 如用 Invitrogen 公司生产的 Trizol 方法抽提总 RNA , 并进行 RNA 质量鉴定, 相关方法可参照 《分子生物学实验》 等参考书描述。 mRNA 的逆转录过程采用商业化逆转录试剂盒并按操作说明书进行, 所得 cDNA 按比例 稀释成需要的工作浓度。 所用特异性引物经优化设计, CST4 的上下游引物设计在外显子 1 上。 制备包含 CST4扩增子的重组质粒, 所需的质粒为商业化的 Pegm-TXpromega) (图 1 ), 上下游引物设计在外显子 1, 3上。 采用基于 TaqMan水解探针的 Real-time PCR法进 行 CST4扩增。
针对 CST4的引物和探针, 最优的如下:
上游引物: gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No: 1 )
下游引物: tatcctattctcctccttgg ( SEQ ID No:2)
探针: 5'-FAM-ctccagctttgtgctctgcctctg-TAMRA-3' ( SEQ ID No:3 ) 扩增长度为 142bp。 针对制备包含 CST4扩增子的重组质粒的引物, 最优的如下:
上游引物: tgcctcgggctctcaccctcctct ( SEQ ID No :22 )
下游引物: tgggtggtggtcggtgtgactggc ( SEQ ID No:23 )
实验组, 阳性对照组, 阴性对照组与重组质粒标准品一起扩增。 依据重组质粒浓度梯 度和扩增后对应的 CP(croSS point)作标准曲线。 依据该标准曲线给出实验组、 阳性对照组 和阴性对照组的拷贝数。
染料法实时定量 PCR : 样本处理同 TaqMan水解探针的 Real-time PCR法, CST1 , 2, 4 (可以同时扩增 CST1, CST2, CST4的引物) 引物, 上游引物: agtcccagcccaacttgga ( SEQ ID No: 24) , 下游弓 I物: gggaacttcgtagatctggaaaga ( SEQ ID No: 25 ) ; CST4上游弓 | 物: agtacaacaa ggccaccgaa gat ( SEQ ID No: 4) , 下游弓 |物: agaagcaaga aggaaggagg gag ( SEQ ID No: 5 ) 或 CST4上游弓 |物: tacaacaagg ccaccgaaga tga ( SEQ ID No: 6 ) , 下游弓 I物: agaagcaaga aggaaggagg gag ( SEQ ID No: 7 ) 或 CST4上游弓 |物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 8 ) , 下游弓 |物: gtggccttgt tgtactcgct gat ( SEQ ID No: 9) 或 CST4上游弓 I物: agtacaacaa ggccaccgaa gat ( SEQ ID No: 10) , 下游弓 |物: taccaggtct attagaagca agaagga ( SEQ ID No: 11 ) 或 CST4上游弓 |物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 12 ) , 下游弓 |物: catcttcggt ggccttgttg tac ( SEQ ID
No: 13 ) 或 CST4上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 14) , 下游引物: tactcatctt cggtggcctt gtt ( SEQ ID No: 15 ) 或 CST4上游弓 |物: tgggattatc ctattctcct ccttg ( SEQ ID No: 16 ) , 下游弓 |物: ctccagcttt gtgctctgcc tct ( SEQ ID No: 17 ) 或 CST4上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 18 ) , 下游引物: ctcatcttcg gtggccttgt tgt ( SEQ ID No: 19) 或 CST4上游弓 |物: tacagtgggt gggagtgggt ggt ( SEQ ID No: 20) , 下游弓 |物: gagtgggtac agcgtgccct tea ( SEQ ID No: 21 ) ; CST2引物, 上游引物: cagaagaaacagttgtgctc ( SEQ ID No: 26 ) 下游引物: ggagtaggaggtggtcag ( SEQ ID No: 27 ) CST1弓 |物, 上游弓 |物: tctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No: 28 ) 下游弓 I物: ttatcctatcctcctccttgg ( SEQ ID No: 29) , 内参基因 β - actin, 上游弓 I物: aagatcattgctcctcctg ( SEQ ID No: 30) , 下游弓 |物: cgtcatactcctgcttgc
( SEQ ID No: 31 ) 。 癌和癌旁组织目的基因和内参基因一起扩增, 通过 2 m m ct
- 癌组织内参基因的 ct ) , (癌旁组织目的基因 ct - 癌旁组织内参基因的 ct ) >( ^ , , θ 7,
/2 , ct为荧光定量 PCR反应孔 信号刚刚突破背景时的循环数。 公式计算目的基因在癌和癌旁组织中的相对表达量。 荧光染 料如 SYBR Green, Eve Green, LC Green等。
核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的体外 RNA扩增技术: T7 RNA聚合酶, RNase H, 禽骨髓白血病病毒 (AMV) 逆转录酶, 核糖核苷酸 (NTP), 脱 氧核糖核苷酸 (dNTP), CST4上下游引物同 TaqMan水解探针的 Real-time PCR法, RNA 荧光染料 (Ribo-Green fluorescent dye)。 42度, 2小时, 可将 RNA模板扩增 2 (9 12), 反应 产物放入荧光检测仪内检测荧光强度 (U), 从而反应初始模板量。
实施例 1 CST4的表达差异
1.人体不同组织中 CST4的表达差异
所用人体组织标本除正常结肠黏膜组织为发明人从北京友谊医院收集外, 其它各组织 均从商业化机构购买。 采用 Affymetrix 的核苷酸芯片 HG-U95Av 进行各正常组织 CST4 mRNA 表达比较, 操作过程参照产品说明书。 本实验的相对表达量的值是通过管家基因 β -actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值。
结果如图 2所示, 除唾液腺中 CST4表达量较高外, 其它组织中 CST4不表达, 说 明 CST4 mRNA表达在正常组织中的背景值很低, 这对 CST4用于病理条件下检测极为 有利。 在结肠癌细胞株 SW480, Caco2中过表达, 在人正常肠上皮细胞 HNIEC不表达, 说明 CST4极有可能可作为肠癌分子诊断的 Marker。
2.肠癌及癌旁手术组织样本 CST4与 CST124, CST1 , CST2 mRNA表达量比较 通过比较 20对 (C1-C20) 肠癌及癌旁组织中 CST124, CST1 , CST2, CST4 mRNA 表达量, 发现 CST4 mRNA在肠癌和癌旁组织中表达量差异较大, 仅次于 CST1。 结果 见图 3。 上述标本均通过病理证明, 采用染料法实时定量 PCR, 阳性样本正常扩增, 阴 性样本未扩增。
基于染料法的 CST4 mRNA实时定量检测试剂盒
试剂盒中含有:
( 1 ) CST4引物, 包括:
上游弓 I物: agtacaacaa ggccaccgaa gat ( SEQ ID No:4 )
下游弓 I物: agaagcaaga aggaaggagg gag ( SEQ ID No:5 )
或
上游弓 I物: tacaacaagg ccaccgaaga tga ( SEQ ID No:6)
下游弓 I物: agaagcaaga aggaaggagg gag ( SEQ ID No:7 )
或
上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No:8 )
下游引物: gtggccttgt tgtactcgct gat ( SEQ ID No:9)
或
上游引物: agtacaacaa ggccaccgaa gat ( SEQ ID No:10 )
下游引物: taccaggtct attagaagca agaagga ( SEQ ID No: 11 )
或
上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 12 )
下游引物: catcttcggt ggccttgttg tac ( SEQ ID No: 13 )
或
上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 14 )
下游引物: tactcatctt cggtggcctt gtt ( SEQ ID No: 15 )
或
上游引物: tgggattatc ctattctcct ccttg ( SEQ ID No:16 )
下游引物: ctccagcttt gtgctctgcc tct ( SEQ ID No: 17 )
或
上游引物: tgctactcct gatggctacc ctg ( SEQ ID No: 18 )
下游引物: ctcatcttcg gtggccttgt tgt ( SEQ ID No:19)
或
上游引物: tacagtgggt gggagtgggt ggt ( SEQ ID No:20)
下游引物: gagtgggtac agcgtgccct tea ( SEQ ID No:21 )
β -actin:
上游引物: aagatcattgctcctcctg ( SEQ ID No: 30)
下游引物: cgtcatactcctgcttgc ( SEQ ID No: 31 )
( 2) 常规的核酸抽提液及逆转录试剂, SYBR Green 染料, dNTP, Taq 酶, 无 RNA 酶的水 (RNase-free H20 )、 标准品、 阳性对照品、 阴性对照品 10*Buffer, Mgcl2。
3.大肠癌及癌旁手术组织样本 CST4表达差异
使用 Taqman水解探针法的 CST4 mRNA实时定量检测试剂盒
制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 引物, 探针, 包括:
上游引物: gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No: 1 )
下游引物: tatcctattctcctccttgg ( SEQ ID No:2)
探针: 5'-fam-ctccagctttgtgctctgcctctg-tamra-3' ( SEQ ID No:3 )
(2) 常规的核酸抽提液及逆转录试剂, dNTP、 Taq 酶, 无 RNA 酶的水 (Rnase- free H20)、 CST4重组质粒标准品、 阳性对照品、 阴性对照品, 10*Buffer, Mgcl2。
通过手术取样的样本均经病理验证后才进行 RNA抽提和逆转录 cDNA, Real-time PCR绝对定量法鉴定 CST4在大肠癌和癌旁组织中的表达差异, 测试样本数为 100对。
图 4的结果表明, 结肠恶性病理条件下特异性高表达 CST4 mRNA, 而癌旁的正常 组织低表达。 癌拷贝的中位数是癌旁拷贝中位数的约 100倍, 提示 CST4 mRNA可作为 良好的肠癌分子标志物。 在 13.893073261 拷贝处划线, 可将癌与正常区分开来, 因此 13.893073261拷贝可作为大肠癌临床诊断的一个参考值。
4.肠镜下取样的肠癌、 肠炎中 CST4的表达差异。
肠镜下取样与手术取样的样本具有较大差别, 主要表现在取样组织中肠癌细胞的 比例变动很大, 有时可能仅占到整块组织的很小一部分, 有的甚至没有。 因此本发明人 统计比较了 36例肠癌以及 36例肠炎病人肠镜取样标本中 CST4的表达差异, 癌标本拷 贝数的中位数是炎标本拷贝数中位数约 14.28829倍, 如果在 60.46832281904594拷贝处
划线, 可以将癌和炎区分开来, 可为肠镜下取样胃癌诊断提供一参考值。
结果见图 5, 方法同样采用 Real-time PCR 绝对定量的方法。
5.CST4在肠癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异
手术中获得的经病理证明为肠癌转移阳性的淋巴结 20 枚, 且转移灶大小不等。 病 理阴性淋巴结 15 枚主要取自早期肠癌病人, 原因是尽可能减少病理诊断阴性但实际有 微转移存在的淋巴结, 以避免实验误差。 实验采用 Real-time PCR检测方法, 具体材料 和过程同实施例 2。
图 6 的结果表明, CST4在转移阳性淋巴结中高表达, 而在阴性淋巴结中只有较低 表达。 转移阳性淋巴结 CST4 mRNA表达量是阴性淋巴结中的 23.6517341 倍。 如果从 23.89555429 拷贝处划线, 基本可区分肠癌转移阳性和阴性淋巴结。 病理阴性淋巴结中 有两例检出 CST4弱阳性的淋巴结, 经病理医师连续切片细致观察, 鉴定有微转移的存 在。 因此, 从 CST4 mRNA表达程度划分不仅 100%区分了细胞学检测结果, 而且能检 测细胞学不能检出的有微转移存在的淋巴结, 相比细胞学检测该检测方法具有更高的灵 敏度。
6.定量 PCR检测外周血中游离肠癌细胞的准确度与细胞学检测对比
除去红细胞和血小板的外周血有核细胞提取 RNA, 经 Real-time PCR方法定量检 测 CST4 mRNA表达水平, 通过和肠炎病人和正常人表达量的对比, 判断肠癌患者的外 周血中是否有游离肠癌细胞的存在, 并和细胞学检测比对。
图 7的结果表明, 本发明的检测方法 100%确认细胞学鉴定的阳性结果, 同时可检 测出细胞学鉴定阴性的病例中有部分转移病例, 说明该方法比细胞学检测具有更高的灵 敏度, 能检测到细胞学无法检测的微转移的存在。
7.定量 PCR方法检测肠癌骨髓转移与细胞学检查结果对比
穿刺等方法获得的肠癌患者骨髓经 Real-time PCR方法定量检测 CST4 mRNA表达 水平, 通过和正常骨髓的比较判断 CST4 mRNA是否高表达, 确认骨髓是否存在转移和 微转移, 并与细胞学结果进行了比较。
图 8 的结果表明, 本发明的检测方法可 95%确认细胞学阳性结果, 同时阳性率高 于细胞学结果, 表明敏感性比细胞学检测方法要高。
8.肠癌病人血浆 Cell-free RNA中 CST4量与炎 /正常人的差异
应用商品化的试剂盒, 抽提血浆中 Cell-free RNA, Real-time PCR检测肠癌病人 (50例) 血浆 Cell-free RNA中 CST4量与炎 (30例), 正常人 (30例)的差异。
结果如图 9所示, 图 9a显示 CST4在癌中拷贝数的中位数是炎 /正常的约 6倍, 在 拷贝数 59.39896692处划线, 可将癌和炎 /正常区分开来。 图 9b 的 ROC 曲线显示基于 CST4 表达量诊断肠癌的方法具有较高的灵敏度和特异性, 因此 CST4 可作为非侵入性 的血浆样本肠癌诊断的特异性 Marker。
9.连接酶链反应 (Ligase chain reation , LCR ) 方法检测肠癌病人血样 Cell-free RNA中 CST4量与炎 /正常人的差异
基于连接酶链反应 (Ligase chain reation, LCR) 的 CST4 mRNA定量检测试剂盒 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 探针 4条 (半抗原标记)
gggctctggcctcgagctccaagga ( SEQ ID No:33 );
ataggataatcccaggtggcatctatgatg ( SEQ ID No :34 );
tctcctccttggagctcgaggccagagccc ( SEQ ID No:35 );
catcatagatgccacctgggattatcctat ( SEQ ID No:36 );
(2) 商业化的核酸提取试剂、 逆转录试剂, 其它试剂同 Abbott LabOTatorieS(LCX) 应用商品化的试剂盒, 抽提血浆中 Cell-free RNA, LCR检测肠癌病人 (50例) 血 浆 Cell-free RNA中 CST4表达量与炎 (30例), 正常人 (30例)的差异。
结果如图 10所示, CST4在癌中相对荧光强度 (relative light units, RLU) 的中位 数是炎的 9.96倍、 正常的 32.29倍, 在相对荧光强度 17.846RLU处划线, 可将癌和炎 / 正常区分开来。
10.适温链置换扩增 ( reverse transcription strand displacement amplification , rtSDA) 方法检测肠癌病人血样 Cell-free RNA中 CST4量与炎 /正常人的差异
适温链置换扩增 (thermophilic strand displacement amplification, tSDA) 的 CST4 mRNA定量检测试剂盒
(1)试剂盒中含有:
CST4 B 1弓 I物: cccggcctctgtgtaccctgcta ( SEQ ID No:37 )
CST4 S1 引物: gaa-ctcgagctaccctggctggggctctgg ( SEQ ID No:38 )
CST4 B2弓 I物: ggtggccttgttgtactcgctgat ( SEQ ID No:39)
CST4 S2弓 I物: get -ctcgag agtgaagggcacgctgtac ( SEQ ID No:40)
检测探针:
5, -32P-ttactcgag ctccaaggaggagaatagga-3 J ( SEQ ID No:41 )
(2)常规的核酸抽提液及逆转录试剂, dCTP a S , dATP , dGTP , dTTP , Bsob I 酶, exo-Bca E| o
应用商品化的试剂盒, 抽提血浆中 Cell-free RNA, rtSDA检测肠癌病人 (50例) 血浆 Cell-free RNA中 CST4量与炎 (30例), 正常人 (30例)的差异。
结果见图 11, CST4在癌中相对荧光强度 (relative light units, RLU) 的中位数是 炎的 20.73倍, 正常的 21.51倍, 在相对荧光强度 23.09RLU处划线, 可将癌和炎 /正常 区分开来。
11.肠癌病人尿样 Cell-free RNA中 CST4量与炎 /正常人的差异
核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)法的 CST4 mRNA定量 检测试剂盒
试剂盒中含有:
( 1 ) CST4弓 I物, 探针, 包括:
上游引物: aattctaatacgactcactataggg-gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No:32 )
下游引物: tatcctattctcctccttgg ( SEQ ID No:2)
分子信标探针:
5'-FAM-gcggcctccagctttgtgctctgcctctggccgc-dabsyl-3 ' ( SEQ ID NO: 3 )
常规的核酸抽提液及逆转录试剂, T7 RNA聚合酶, RNase H,
禽骨髓白血病病毒 (AMV ) 逆转录酶, 核糖核苷酸 (NTP ) , 脱氧核糖核苷酸 (dNTP), RNA荧光染料 (Ribo-Green fluorescent dye )。
应用商品化的试剂盒, 抽提尿液中 Cell-free RNA, 荧光检测的核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)检测肠癌病人 (30例) 尿样 Cell-free RNA中 CST4量与炎 (20例), 正常人 (20例)的差异。
结果如图 12所示, CST4在癌中荧光强度的中位数是炎 /正常的约 13.2倍, 在拷贝 数 15.02135772U 处划线, 可将癌和炎 /正常区分开来, 即可作为非侵入性的尿液样本肠 癌诊断的参考值。
实施例 2 CST4在诊断和预示肠癌中的应用
转录介导的扩增 (Transcription-mediated amplification, TMA ) 的 CST4 mRNA 定量检测试剂盒。
制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 引物, 探针, 包括:
上游引物: aattctaatacgactcactataggg-gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No:32 ) 下游引物: tatcctattctcctccttgg (SEQ ID No:2)
分子信标探针:
5'-FAM-gcggcctccagctttgtgctctgcctctggccgc-dabsyl-3' (SEQ ID NO: 3 )
(2) 其它反应试剂为 Gen-probe TMA assay中除引物和探针之外的试剂。
1. CST4表达量与肠癌 pTNM分期的关系
应用商品化的试剂盒, 抽提血浆中 Cell-free RNA, 应用 Gen-probe转录介导的扩 增 (Transcription-Mediated amplification, TMA) 方法, 检测 80例肠癌 (pTNM分期, Ι+Π 30例, III+IV50例) 不同分期 CST4表达量的差异。
结果见图 13, CST4在肠癌 III+IV中相对荧光强度 (relative light units, RLU) 的 中位数是 Ι+Π的 8.9倍, 因此 CST4表达量可用于肠癌 pTNM分期。
2. CST4表达量用于肠癌治疗过程中动态监测
应用实时定量 PCR方法, 通过检测病人血液中 CST4表达量, 实时监测肠癌化疗 病人 6人, 放疗病人 4人, 治疗效果。
结果见表 1, 治疗有效的病人 CST4表达量随着疗程的增加逐渐降低, 影像学结果 也显示, 肿块逐渐减小; 而治疗无效的病人 CST4表达量随着疗程的增加逐渐增加, 影 像学结果显示, 肿块有变大的趋势。 因此, CST4 可作为肠癌患者治疗过程中一个动态 监测的指标。 表 1为通过实时定量 PCR检测放化疗过程中肠癌患者血液中 CST4的量 病人 CST4表达量 (copy) 影像学 ( cm)
疗程 1 疗程 2 疗程 3 疗程 1 疗程 2 疗程 3 治疗 化疗 2 781.32 521.78 80.64 2.5 1.5 <1 有效 化疗 5 1533.6 1314.6 125.25 3.5 2.5 <1
化疗 6 1213.5 439.89 66.64 3 2 <1 放疗 2 1434.58 1160.33 116.83 3 1.5 1 放疗 3 2062.66 1689.44 189.65 3 2.5 1.5 治疗 化疗 1 1466.14 1984.62 2433.57 3 3 3.5 无效 化疗 3 956.92 1156.34 1846.21 2 2 2.5
化疗 5 646.2 826.7 1032.55 1 1 1.5 放疗 1 1032.4 1246.8 1989.61 2 2.5 3 放疗 4 936.4 1048 1678 1 1.5 2
3. CST4表达量与肠癌患者预后判断的关系
基于实时定量 PCR技术, 分别在术后或放化疗后的 1个月、 3个月、 1年, 跟踪 随访了 5个肠癌患者血液中 CST4表达量的情况。
结果如表 2所示, 一年后复发的 2个病人, CST4表达量随着时间的延长逐渐增 高, 当达到 1000个拷贝左右时才被影像学发现确诊; 而 1年内没有复发的病人, CST4 表达量并无明显变化, 影像学也无异常。 因此, CST4 表达量变化可作为肠癌患者预后 判断的一个指标。 表 2为通过实时定量 PCR检测手术后或放化疗后 1个月、 3个月、 1 年, 肠癌患者血液中 CST4的量。 表 2为通过实时定量 PCR检测随访过程中肠癌患者血液中 CST4的量
病人 CST4 (copy) 影像学 ( cm)
1个月 3个月 1年 1个月 3个月 1年 复发 患者 4 56.84 198.87 1135.24 无 无 1
患者 5 15.25 64.34 786.59 无 无 <1 未 复 患者 1 23.6 40.5 36.3 无 无 无
发 患者 2 52.43 39.8 48.65 无 无 无
患者 3 67.9 79.6 86.79 无 无 无 实施例 3用于诊断和预示肠癌的试剂盒
1.基于 Taqman水解探针法的 CST4 mRNA实时定量检测试剂盒
制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 引物, 探针, 包括:
上游引物: gctctcaccctcctctcctg (SEQ ID No:l )
下游引物: tatcctattctcctccttgg (SEQ ID No:2)
探针: 5'-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCTG-TAMRA-3' (SEQ ID No:3)
(2) 常规的核酸抽提液及逆转录试剂, dNTP、 Taq 酶, 无 RNA 酶的水 (Rnase- free H20) 标准品、 阳性对照品、 阴性对照品, 10*Buffer, Mgcl2。
2.基于染料法的 CST4 mRNA实时定量检测试剂盒
试剂盒中含有:
( 1 ) CST4引物, 包括:
上游引物: gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No: 1 )
下游引物: tatcctattctcctccttgg (SEQ ID No:2)
β -actin:
上游引物: aagatcattgctcctcctg (SEQ ID No: 30)
下游引物: cgtcatactcctgcttgc (SEQ ID No: 31 )
( 2) 常规的核酸抽提液及逆转录试剂, SYBR Green 染料, dNTP, Taq 酶, 无
RNA 酶的水 (RNase-free H20 )、 标准品、 阳性对照品、 阴性对照品 10*Buffer, Mgcl
3.基于核酸序列扩增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)法的 CST4 mRNA 定量检测试剂盒
试剂盒中含有:
( 1 ) CST4弓 I物, 探针, 包括:
上游引物: aattctaatacgactcactataggg-gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No:32 )
下游引物: tatcctattctcctccttgg ( SEQ ID No:2)
分子信标探针:
5'-FAM-gcggcctccagctttgtgctctgcctctggccgc-dabsyl-3 ' ( SEQ ID NO: 3 )
常规的核酸抽提液及逆转录试剂, T7 RNA聚合酶, RNase H,
禽骨髓白血病病毒 (AMV ) 逆转录酶, 核糖核苷酸 (NTP ) , 脱氧核糖核苷酸 (dNTP), RNA荧光染料 (Ribo-Green fluorescent dye )。
4.基于转录介导的扩增 (Transcription-mediated amplification , TMA ) 的 CST4 mRNA定量检测试剂盒。
制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 引物, 探针, 包括:
上游引物: aattctaatacgactcactataggg-gctctcaccctcctctcctg ( SEQ ID No:32 ) 下游引物: tatcctattctcctccttgg ( SEQ ID No:2)
分子信标探针:
5'-FAM-gcggcctccagctttgtgctctgcctctggccgc-dabsyl-3 ' ( SEQ ID NO: 3 )
(2) 其它反应试剂为 Gen- probe TMA assay中除引物和探针之外的试剂。
5.基于连接酶链反应 (Ligase chain reation, LCR) 的 CST4 mRNA定量检测试剂盒 制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 探针 4条 (半抗原标记)
gggctctggcctcgagctccaagga ( SEQ ID No:33 )
ataggataatcccaggtggcatctatgatg ( SEQ ID No:34)
tctcctccttggagctcgaggccagagccc ( SEQ ID No:35 )
catcatagatgccacctgggattatcctat ( SEQ ID No:36)
(2) 商业化的核酸提取试剂、 逆转录试剂, 其它试剂同 Abbott LaboratoriesiLCX)
6.基于适温链置换扩增 (thermophilic strand displacement amplification, tSDA) 的 CST4 mRNA定量检测试剂盒
制备试剂盒, 所述的试剂盒中含有:
( 1 ) 试剂盒中含有:
CST4 B 1弓 I物: cccggcctctgtgtaccctgcta ( SEQ ID No:37 )
CST4 S1 引物: gaa-ctcgagctaccctggctggggctctgg ( SEQ ID No:38 )
CST4 B2弓 I物: ggtggccttgttgtactcgctgat ( SEQ ID No:39)
CST4 S2弓 I物: get -ctcgag agtgaagggcacgctgtac ( SEQ ID No:40)
检测探针:
5'-32P-ttactcgag ctccaaggaggagaatagga-3 ' ( SEQ ID No:41 )
( 2) 常规的核酸抽替液及逆转录试剂, dCTP a S , dATP, dGTP, dTTP, Bsob I 酶, exo-Bca酶
第二部分蛋白质水平的检测
下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件如 Sambrook 等人, 分子克隆: 实验室指南 ( New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件, 或按照制造商所建议的条件。 除非另外说明, 否则百分比和份 数按重量计算。
就蛋白质领域中, 本发明涉及用于肠道疾病诊断和监控以及治疗效果评价的非侵入性标 记的抗体、 试剂盒、 测定法及其使用方法。
本发明 CYSTATIN S 重组蛋白购自 Abnova (浓度 0. 06ug/ul,货号 H00001472- P01); CYSTATIN S 鼠单克隆抗体购自 R&D (效价为 1 : 2000,货号 MAB 1296); CYSTATIN S兔多克隆抗 体购自 Abeam (效价为 1 : 800, 货号为 ab58515)。
本发明提供了诊断受试者样品中肠道状况的测定法及是否转移或复发; 此外, 还提供了 根据受试者样品来评价治疗是否有效的测定法。 该测定法优选检测患者样品中至少一种所选 蛋白, 优选 CYSTATIN S 蛋白 , 更优选该测定法是定量或至少半定量地检测患者样品中 CYSTATIN S 水平。 虽然任意类型的报道分子都可用于检测蛋白, 但优选该报道分子为 CYSTATIN S 特异性抗体或其片段。 任选地, 本发明的方法、 测定法和试剂盒可用于发现早
期处于无症状前或无症状的人。
测定法任选和优选利用至少一种, 且优选多种特异性结合至少一种 CYSTATIN S 表位肽 的抗体或其片段, 用于检测受试者样品中对 CYSTATIN S 的免疫反应的存在。 抗体可以是多 克隆抗体或单克隆抗体。 优选该单克隆抗体可结合至 SEQ ID NO : 50, 和 /或可由任意一个该 序列得到。 更优选 CYSTATIN S 的量是确定的。 因此, 本发明还提供了通过利用至少一种上 述抗体定量样品中对 CYSTATIN S 的免疫反应的水平而定量样品中 CYSTATIN S 的水平的测 定法。
任选和优选受试者为人, 且检测的免疫反应以抗体和人多肽为特征。 该免疫反应可任 选地通过利用任何合适的测定法而检测, 所述测定法包括但不限于 ELISA (酶联免疫吸附测 定)或免疫印迹如蛋白印迹或其组合。 优选利用竞争性 ELISA和双抗夹心 ELISA。 根据优选的实施方案, 肠道状况的诊断或监控、 肠道疾病治疗效果的监控或监控受到检 测的免疫反应定量的影响, 其代表样品中标记的多肽 ( CYSTATIN S ) 的量。 在其它任选实施方案中, 本发明还涉及检测样品中标记蛋白的检测试剂盒。 由此能诊断 或监控肠道状况、 监控肠道疾病的治疗效果或评价是否转移复发, 其中检测试剂盒包含本发 明的至少一种抗体或其片段, 其能与存在与所检查流体中的标记多肽 ( CYSTATIN S ) 反 应, 以及包含至少一种报告组分, 其能检测由抗体或其片段和标记蛋白组成的复合物。 如上 所述, 抗体可以任选为多克隆抗体或单克隆抗体的。 优选检测试剂盒, 报告组分可以是抗体, 其试剂盒中所用的抗体或其片段, 且显示标 记。 在这里, 报告组分优选为合适的 IgG抗体或合适的 IgM抗体。 标记任选和优选为能催化 显色反应的酶, 例如过氧化物酶, 以及更优选能共价结合至第二抗体。 或者, 标记可以是荧 光部分, 或比色抗体。 本发明优选的实施方案中, 检测试剂盒为 ELISA检测试剂盒。 在本发明特别优选的实施方案中, 该 ELISA检测试剂盒为如下所列实施例部分所述的竞 争性 ELISA试剂盒和双抗夹心 ELISA试剂盒。 优选至少一种抗体或其片段与所检查的样品预 温育。 优选该抗体为单克隆抗体, 且更优选为本发明如上所述的单克隆抗体。 用于生产抗- CYSTATIN S 抗体的蛋白与用作示例性固相物质的微量滴定板 (此处也称为基质) 偶联, 且 预温育的样品随后灌注平板且之前未与血清中存在的表位结合的抗体可与平板上的蛋白结
合。 报告组分由合适的免疫球蛋白组成, 尤其是抗 -IgG抗体和 /或抗 -IgM抗体, 其可检测结 合至平板的抗体, 且与催化显示的酶和 /或荧光标记偶联。 在本发明又一优选实施方案中, 该检测试剂盒为免疫印迹, 也称为蛋白印迹 (Western blot 在该特点的检测试剂盒中, 样品中的蛋白利用电泳凝胶, 例如聚丙烯酰胺凝胶转移 至固相基质上 (例如硝酸纤维素膜)。 转移可例如利用电转移进行。 随后存在于基质上的蛋白 和抗该蛋白的抗体间发生免疫反应。 优选利用单克隆抗体或其片段, 且更优选该单克隆抗体 包括本发明如上所述的抗体。 免疫反应可随后通过合适的方法检测, 例如利用酶标记的和 / 或荧光标记的抗-抗体的抗体。 在本发明的又一个优选实施方案中, 该检测试剂盒用于流通测定法。 在具有该特点的用 于测定法的试剂盒中, 抗体或其片段结合于柱上, 待测样品经过所述柱进行灌注。 如上所述 抗体可以是多克隆或单克隆的, 且优选所用的单克隆抗体包括本发明提及的上述特异性抗 体。 将待测样品灌注到柱中, 且流过所述柱。 如果样品包含特异性结合柱上的抗体或抗体级 分的蛋白, 则其将在柱中截留而不再流过。 优选一旦所有样品流体流过该柱。 结合至柱的蛋 白通过竞争性抗体流过或通过改变缓冲液条件而洗下。 优选如果不同的蛋白结合至柱上, 则 将其在不同的时期洗下。 随后测量从洗涤柱获得的或在柱洗涤特定时期发现的蛋白的量。 纯 化的可溶性蛋白定量的技术为本领域所熟知, 例如通过测量包含蛋白的流体的光密度。 在本发明进一步优选的实施方案中, 提供了测定取自受试者样品中 CYSTATIN S 水平的 检测试剂盒, 其中双指示剂指示 CYSTATIN S 水平处于正常水平还是高于正常水平。 优选取 自受试者的样品为流体样品。 该检测试剂盒优选包括容纳样品流体的容器、 特异性抗体或其 片段以及指示剂。 优选该抗体为单克隆的, 且更优选为本发明如上所述的单克隆抗体。 任选 和优选该试剂盒进一步包括进行检测所需的溶液和缓冲液, 以及任选包含进行检测和解释结 果的说明书的印刷品。 该检测试剂盒可由本领域技术人员使用, 且可用于任何实际场所, 包 括但不限于医院、 诊所和私人住宅。
本发明所针对的样品包括但不限于血清样品、 血浆样品、 尿样或血样。 血样可包括全血 样品或血液级分样品。
如上述, 本发明知道的抗体可用于肠道验证诊断或肠癌是否转移复发的评估。 本领域技 术人员熟知的一些方法可用来应用该指导, 如利用此处所述缀合至可检测部分 (例如荧光部
分) 的抗体试剂盒可用于评估获自检测个体的血清, 血浆, 尿液样品中的 CYSTATIN S 标记 水平, 并且由此确定疾病的存在 /不存在或者甚至是状态。
在参阅下列并不意欲限制的实施例后, 本发明另外的目的, 优点, 和新的特征对本领域 技术人员将是显而易见的, 另外, 上文所述以及权利要求部分请求保护的本说明的各个实施 方案和方面的每一个都将在下列实施例中找到实验性的支持。
材料和方法
CYSTATIN S重组蛋白: 购自 Abnova (浓度 0. 06ug/ul,货号 H00001472- P01);
抗体: CYSTATIN S 兔多克隆抗体, 购自 Abeam (效价为 1 : 800, 货号为 ab58515 ) ; CYSTATIN S鼠单克隆抗体购自 R&D (效价为 1: 2000,货号 MAB 1296)
免疫沉淀法: 直接通过添加 2mM PMSF, A蛋白 -琼脂糖凝胶和抗- CYSTATIN S 抗体进行 细胞上清液 (60mm皿的 1. 5mL) 的免疫沉淀, 随即在 4度旋转过夜。 利用通过庚二亚氨酸二 甲脂 (dimethl pimel imidate ) 偶联至 A 蛋白-琼脂糖凝胶的抗 -Cystatin 抗体, 以类似的 方法进行血清样品 (200ul ) 的免疫沉淀。 如早期研究所述进行免疫沉淀物的洗涤, 免疫沉 淀物用 N-糖苷酶 F的处理和 SDS_PAGE
简而言之, 为了用 N-糖苷酶处理, 洗涤免疫沉淀物且随后在 lOul用于 ίΉ=6. 0的 50mM 柠檬酸钠中的 0. 5%SDS 中煮沸, 随后加入 lOul 包含 200mM PH=8. 0 的磷酸钠, PH=8. 0 的 40mM EDTA, 3%N_辛基葡糖苷的溶液连同 40 毫单位 N-聚糖酶, 且在 37 度温育过夜, 加入 20ul 样品缓冲液且上样进行 SDS-PAGE 前煮沸样品。 除非另外说明, 在 15%聚丙烯酰胺 ( Lae l i gel ) 上进行 SDS_PAGE。 凝胶通过利用 20% 2, 5_二苯基噁唑的荧光自自显影进 行分析且通过之前所述的光密度测定法进行定量。
蛋白电转和免疫印迹: 将蛋白点转入硝酸纤维素膜上。 用溶于 PBS 中的 5%脱脂奶粉和 0. l%Brij-35在室温下进行 2小时的封闭。 封闭后用 CYSTATIN S兔多克隆抗体 4度温育过 夜。 在包含 0. 1% Brij-35 的 PBS 中洗涤印迹三次, 且用 0. 27ul 的缀合至过氧化物酶 ( Jackson) 的山羊抗-兔 IgG在 37度下温育 1小时, 印迹用溶于 PBS中的 0. l%Brij-35洗 涤 4 次, 且用 PBS 洗涤一次, 之后用商品化的 TMB 溶液 (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. ( Gaithersburg; MD ) ) " TMB Peroxidase Substrate " solution Cat. No 50-76-01 和" Peroxidase Solution B " Cat . No. 50-65-00)进行检测, 并且对 印迹照相。 或者通过 ECL 方法进行检测, 其中利用溶于 PH=8. 5 的 100 mM Tris-HCl 中的 5. 4mM双氧水混合的用于 PH=8. 5的 100 mM Tris-HCl 中的 2. 5nM 鲁米诺, 400mM对香豆酸
的新鲜制备液, 且曝光于 Agfa CP-BU膜。
竞争法 ELISA :将 Corning ELISA平板孔用 CYSTATIN S ( 5ug/ml ) 覆盖且用 3%BSA封 闭。 将包含 CYSTATIN S鼠多克隆抗体 (1 : 1000) 与 8个二重稀释的血清样品于 4度温育过 夜。 随后加至覆盖的 ELISA板中且 37度温育 1 小时。 每孔用 TBS (溶于 PH=7. 5 的 10 mM Tris-HCl 中的 154mM的 NaCl ) 洗涤且缀合至碱性磷酸酶中的山羊抗 -小鼠 IgG (Jackson, 1: 2000, 溶于 TBS 中的 0. 3%BSA 中) 在 37度反应 1 小时。 加入碱性磷酸酶底物 (KPL, lOOul 每孑 L, Blue Phos solution cat. No 508805 Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. (Gaithersburg, MD) ), 利用 ELISA读数器在 405nm波长处定量 0D。
双抗夹心 ELISA: 将 Corning ELISA 平板孔用鼠单抗抗- CYSTATIN S 蛋白 (5ug/ml ) 覆盖且用 3% BSA封闭,将 8个二重稀释的血清样品加至覆盖的 ELISA板中且 37度温育 1小 时, 每孔用 TBS (溶于 PH=7. 5的 10 mM Tris-HCl中的 154mM的 NaCl ) 洗涤, 加入生物素标 记的兔抗- CYSTATIN S 蛋白的多抗 (1 : 1000 (实验前已用生物素标记好并纯化)), 37 度 温育 1小时。 每孔用 TBS (溶于 PH=7. 5的 10 mM Tris-HCl中的 154mM的 NaCl ) 洗涤, 加入 亲合素一生物素一过氧化物酶复合物 (ABC复合物), 37度温育 1 小时。 每孔用 TBS (溶于 PH=7. 5 的 10 mM Tris-HCl 中的 154mM 的 NaCl ) 洗涤。 加入碱性磷酸酶底物 (KPL, lOOul 每孑 L, Blue Phos solution cat. No 508805 Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. (Gaithersburg, MD) ), 利用 ELISA读数器在 405nm波长处定量 0D。
实施例 1 CYSTATIN S检测
1.肠癌细胞株培养上清中 CYSTATIN S 检测
前期实验验证, CST4 mRNA在肠癌中异常高表达, 而 CYSTATIN S 为分泌蛋白, 分布于 多种体液和分泌物中, 为了确定 CYSTATIN S 是否可作为肠癌血液检测的标记, 取 CST4 mRNA 高表达的肠癌细胞株 SW480 (泳道 5_6)、 Caco2 (泳道 7_8) 的细胞上清液, 2 个供体 (S1,泳道 1-2; S2,泳道 3-4) 的正常人血清, 且进行 15%的 SDS_PAGE。 蛋白随后转入硝酸 纤维素膜且印迹与抗 CYSTATIN S 抗体反应, 随后与山羊抗兔过氧化物酶反应。 利用 TMB膜 过氧化物酶底物 (3, 3' , 5, 5, -四甲联苯胺) 进行条带的检测。 所有方法基本上如上述材 料和方法部分中所述的进行。
结果如图 14所示, 下方为内参 β -actin蛋白的条带。 在泳道 5, 6, 7, 8 中, 其分别 代表肠癌细胞株培养上清, 检测到约 16Kda 条带的存在。 泳道 1, 2, 3, 4, 则代表正常血 清样本, 仅检测到淡淡的 16Kda条带的存在。
2.肠癌病人血清中 CYSTATIN S 检测
方法同 " 1肠癌细胞株培养上清中 CYSTATIN S 检测", 结果如图 15所示, 下方为内参 β -actin蛋白的条带。 泳道 1, 2代表正常血清样本, 仅有很淡的条带; 泳道 3, 4, 5, 6代 表肠癌病人血清样本均有较明显的条带。
3. 利用单克隆抗体定量检测 CYSTATIN S 血清水平的 ELISA测定法
实验方法: 将 5 μ g/ml CYSTATIN S 肽加入 ELISA平板, 4 度过夜; 正常人血清 (20 例)、 肠癌患者血清 (30 例) 与抗 CYSTATIN S 单克隆抗体 (1 : 2000 , 溶于 TBS (溶于 PH7. 5的 10mM Tris-HCl 中的 154mM NaCl)中的 0. 3%BSA中) 预温育, 4度过夜。 随后将与 单克隆抗体温育后的样本加入包被了 CYSTATIN S 肽的 ELISA平板, 室温孵育 1小时。 随后 与溶于 TBS中的 0. 3%BSA中的 0. 08 μ g/ml缀合至 AP的山羊抗兔抗体温育, 且与憐酸对硝基 苯酯(p-NPP) (CHEMICON International) 反应。 显影的颜色随后在 ELISA读数器分光光度计中 定量。
实验结果, 如图 16 所示, 正常人血清 CYSTATIN S 浓度中位数为 1. 55ng/ml,肠癌患 者血清 CYSTATIN S浓度中位数为 3. 75 ng/ml , 在 3. 179 ng/ml处划线基本可以将癌和正常 区分开来, 因此可作为肠癌临床诊断的一个参考值。
3. 血清 /血浆中 CYSTATIN S 和 CEA检测灵敏度和特异性比较
CYSTATIN S 蛋白检测方法同 " 3 ", CEA 检测应用商品化的试剂盒 (德国 DRG,货号 EIA5071 ), 按照其说明书操作。
结果如图 17及表 3所示, CST1曲线下面积为 0. 698大于 CEA, 即 ELISA方法检测血清 / 血浆中 CYSTATIN S蛋白量比检测 CEA在灵敏性和特异性方面更具有优越性。 表 3 曲线下面枳
检验的变量: CYSTATIN S , CEA在实际阳性组与实际阴性组之间有至少一个交叉的话 i统
计可能会有偏差。
a.根据非参数假设
b.无效假设面积 = 0.5
4 测定法、 试剂盒和其使用方法
该实施例提供了本发明的许多关于测定法、 试剂盒和其使用方法的非限制性、 例证性的 实施方案。
检测肠癌疾病的方法包括: 将可溶性蛋白 CYSTATIN S 抗原固定至支持物上, 使用 R&D 抗体 (MAB1296 ) , 洗涤, 添加标记的第二抗体 (碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔 IgG,碧云 天, 货号 A0239), 洗涤且直接或间接检测和 /或测量标记, 其反应了结合至抗体的检测的目 的蛋白的量。
支持物的实例包括但不限于乳胶颗粒、 纤维素材料例如纤维素片、 塑料测定平板和颗粒
所用的抗原可任选例如通过共价结合或物理吸附固定在支持物上。 待测样品为人血清等 等。 任选和优选支持物的表面在样品添加之前通过与牛血清血蛋白(BSA)等等预温育而 "封 闭", 以至少降低样品中其他抗体非特异性结合支持物的可能性。 随后支持物用合适的缓冲 液, 例如包含表面活性剂的磷酸盐缓冲液等等进行洗涤。
标记的第二抗体的非限制性实例为标记的抗 -小鼠多克隆抗体。 有效的标记包括但不限 于各种类型的酶如碱性磷酸酶、 荧光素酶、 过氧化物酶、 β _半乳糖苷酶等等以及各种荧光 化合物如荧光素等等。 化合物如生物素、 抗生物素蛋白、 链霉抗生物素蛋白、 洋地黄苷等等 可插入抗体和标记之间。
当标记为酶时, 其存在可任选通过添加底物并且检测和 /或测量由于酶的催化作用而发 生的发光或显色和 /或通过测量光吸收的变化而检测和 /或测量。 当标记为荧光化合物时, 可 任选通过用紫外光照射该反应体系并且检测和 /或测量发射的荧光而检测和 /或测量。 如果需 要可使用感光剂。
利用本发明的结合该标记的至少一个表位 (SEQ ID NO : 50) 的抗体检测和 /或测量标记 蛋白 CYSTATIN S 的试剂优选包括抗体或其片段, 必要量的第二抗体或基质 (如果需要的 话), 以及任选一种或多种 "支持"试剂, 其为之前所述试剂作用所必需。 这些试剂任选和 优选提供于试剂盒中。 上述试剂可用作诊断肠癌症、 分期肠癌癌症、 评估是否转移、 评估治 疗效果的试剂。
例如, 试剂盒优选以特异性抗体或其片段为特征。 任选和更优选该试剂盒还以能检测到 受试者样品中标记蛋白存在的报告组分为特征。 该报告组分优选为合适第二抗体, 任选和优 选还包括检测第二抗体的标记 (如果需要)。 该试剂盒还可任选和优选以一种或多种缓冲
液, 如和基质预温育以封闭与基质和 /或固定其上的蛋白的非特异性反应的 "封闭" 缓冲 液; 以及一种或多种用于样品、 第二抗体、 基质和 /或用于在与之前所述的试剂温育之间洗 涤基质的缓冲液。 当然, 还可酌情任选其它试剂。
任选地, 该试剂盒提供用于竞争测定法, 其中对照蛋白结合固相物质。 在这种情况下, 抗体或其片段与血清样品预温育, 随后加于平板。 通过报告组分检测抗体与平板的结合, 据 此本领域技术人员可确定抗体是否结合来自血清的表位, 且优选确定结合血清中表位的抗体 的量, 以及由此确定样品中标记蛋白的量。
任选地, 该试剂盒提供用于双抗夹心测定法, 其中抗 CYSTATIN S 抗体结合固相物质, 随后标准品 CYSTATIN S 和处理过的待测样品血清分别加入平板, 通过含报告组分的抗 CYSTATIN S 多克隆抗体与平板的结合, 据此本领域技术人员可确定抗体是否结合来自血清 的表位, 且优选确定结合血清中表位的抗体的量, 以及由此确定样品中标记蛋白的量。
试剂和 /或试剂盒的类型, 和 /或对除该试剂盒之外的其他类型设备和 /或与该试剂盒组 合的其他类型设备的需求, 其每个都取决于使用该试剂盒进行的测定法的类型。 如前所述, 上述测定法非限制性的实例包括 ELISA、 蛋白印迹或流式细胞术。 用于进行 ELISA测定法的 实例性方法如上所述。 蛋白印迹常常比 ELISA更精确但操作需要更多的时间和 /或设备。
5、 例证性的试剂盒及其使用方法
标本的采集及保存 : 血清: 全血标本请于室温放置 2 小时或 4°C过夜后于 lOOOxg离 心 20 分钟, 取上清即可检测, 或将标本放于 -20 °C或 -80 °C保存, 但应避免反复冻融; 血 浆: 可用 EDTA或肝素作为抗凝剂, 标本采集后 30分钟内于 2-8°C 1000xg离心 15分钟, 或 将标本放于 -20°C或 -80°C保存, 但应避免反复冻融。
样本处理: 血清或血浆标本推荐稀释 10倍, 如: 稀释 10倍, 取 lOOuL血清或血浆加 入 900uL PBS o 标本使用 0. 1 M 的 PBS稀释 (PH=7. 0-7· 2)。
试剂盒中包含以下内容: 1 ) 酶联板, 覆膜。 2 ) 标准品: 浓度为 lOOng/ml CYSTATIN S , 先用 1%BSA 的 PBST稀释至 10 ng/ml CYSTATIN S , 再做系列倍比稀释后, 分别稀释 成 10 ng/ml CYSTATIN S , 5 ng/ml CYSTATIN S , 2. 5 ng/ml CYSTATIN S , Ing/mL CYSTATIN S, 0. 5 ng/ml CYSTATIN S, 0. 25 ng/ml 的 CYSTATIN S , 样品稀释液直接作为 标准浓度 0 ng/ml CYSTATIN S , 临用前 15分钟内配制。 如配制 4ng/ml CYSTATIN S 标 准品: 取 0. 5ml (不要少于 0. 5ml ) 8 ng/ml CYSTATIN S 的上述标准品加入含有 0. 5ml样 品稀释液的 Eppendorf 管中, 混匀即可, 其余浓度以此类推。 3 ) 3%BSA 的 PBST 封闭液。
4) 包被抗体 5 g/ml 鼠抗人 CYSTATIN S 单抗, 包被抗体稀释液 0. 05M PH=9. 0 NaHC03。
5 ) 生物素标记的兔抗人 CYSTATIN S 多抗 (1 : 200 ) , 1%BSA 的 PBST 抗体稀释液。 6 ) ABC (亲合素一生物素一过氧化物酶复合物)。 7) TMB 显色液。 8 ) PBST ( 0. 05% Tween-20 in PBS)。 9) 终止液: 2NH2S0
具体步骤包括:
1 ) 包被: 用 0. 05M PH9, 碳酸氢钠包被缓冲液将鼠抗人 CYSTATIN S 单抗稀释至蛋白 质含量为 5 g / ml, 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0. lml, 4°C过夜。 次日, 弃去孔内溶 液, 用洗涤缓冲液洗 3次, 每次 3分钟。
2) 封闭: 每孔加 200ul含 3%BSA的 PBST, 37度 lh或 4度过夜。 弃去孔内溶液, 用洗 涤缓冲液洗 3次, 每次 3分钟
3) 加样: 分别设空白孔、 标准孔、 待测样品孔。 空白孔加样品稀释液 100 μ 1, 余孔 分别加标准品或待测样品 100 μ 1, 注意不要有气泡, 加样将样品加于酶标板孔底部, 尽量 不触及孔壁, 轻轻晃动混匀, 酶标板加上盖或覆膜, 37°C反应 120分钟。 为保证实验结果有 效性, 每次实验请使用新的标准品溶液。
4) 弃去液体, 甩干, 不用洗涤。 每孔加生物素标记的兔抗人 CYSTATIN S 多抗 lOOul (在使用前用 1%BSA的 PBST 1: 200稀), 酶标板加上覆膜, 37°C反应 60分钟。
5) 温育 60分钟后, 弃去孔内液体, 甩干, 洗板 3次, 每次浸泡 1-2分钟, 大约 300 μ ΐ/每孔, 甩干 (也可轻拍将孔内液体拍干)。
6) 每孔加 ABC 100 μ L, 酶标板加上覆膜 37°C反应 60分钟。
7) 温育 60分钟后, 弃去孔内液体, 甩干, 洗板 5次, 每次浸泡 1-2分钟, 300 μ !7每 孔, 甩干 (也可轻拍将孔内液体拍干)。
8) 依序每孔加底物溶液 50 L, 酶标板加上覆膜 37°C避光显色 (15 分钟内, 此时肉 眼可标准品的前 4-5孔有明显的梯度兰色, 后 4-5孔梯度不明显, 即可终止)。
9) 依序每孔加终止溶液 50 L, 终止反应, 此时蓝色立转黄色。 终止液的加入顺序应 尽量与底物液的加入顺序相同。 为了保证实验结果的准确性, 底物反应时间到后应尽快加入 终止液。
10) 用酶联仪在 405nm波长依序测量各孔的光密度 (0D值)。 在加终止液后立即进行 检测。
结果计算: 根据标准品浓度和对应的 0D值绘制散点曲线, 标出 R平方和曲线方程式。 如 R平方大于等于 0. 95, 则将待测样品的 0D值代入曲线方程式中, 算出待测样品浓度。
6. CYSTATIN S蛋白表达水平用于肠癌 pTNM分期
实验方法同上述 "5", 病理确诊的肠癌 T期病人 20人, N期病人 30人, M期病人 30, 结果如表 4 所示, 随着病程的进展, CYSTATIN S 蛋白表达水平亦随之提高, 提示, CYSTATIN S蛋白表达水平可用于肠癌 pTNM分期
表 4 不同病理分期的肠癌患者 CYSTATIN S蛋白表达水平 病例信息 CYSTATIN S 蛋白表达中位数
(ng/ml )
T期(20例) 0· 96
N期 (30例) 1. 89
M期 (30例) 4. 04
7. CYSTATIN S蛋白表达水平用于评估肠癌是否转移
实验方法同上述 "5", 病理确诊的肠癌未转移病人 20人, 转移病人 30人结果如表 5 所示, 转移患者 CYSTATIN S蛋白表达水平高于未转移者, 提示 CYSTATIN S蛋白表达水平可 用于指示肠癌是否转移。
表 5 转移与未转移肠癌患者 CYSTATIN S蛋白表达水平 病例信息 CYSTATIN S蛋白表达中位数
(ng/ml ) 未转移患者 (20例) 2. 43
转移患者 ( 30例) 3. 89
8. CYSTATIN S蛋白表达水平用于评估肠癌辅助内分泌治疗联合化疗治疗效果
实验方法同上述 " 5 ", 研究共纳入 1000 例 N0-1 期肠癌患者,行 4 个周期的 5- FU/LV (Levamisole, 左旋咪唑)方案方案化疗,随访时间为 24 个月。 检测治疗周期结束后 CYSTATIN S蛋白表达水平, 有效数据 364例, CYSTATIN S 蛋白表达中位数 2. 56ng/ml。 结
果如图 18 所示, 高于该中位数的患者无病生存 30% ( Disease-free survival , DFS ), 低 于该中位数的患者无病生存 50%。
最后说明的是, 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制, 尽管通过参照 本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述, 但本领域的普通技术人员应当理解, 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变, 而不偏离所附权利要求书所限定的本发 明的精神和范围。
Claims (1)
- 权利要求书1.CST4 基因、 CST4 基因的 mRNA、 CST4 基因剪切子的 cDNA、 CST4 特异性引物对应的扩增子、 CST4基因编码的 CYSTATIN S蛋白和 CYSTATIN S蛋白 的表位肽在制备诊断和预示肠癌标志物中的应用, 所述 CST4 基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 42所示。2.根据权利要求 1 所述的应用, 其特征在于, CST4 基因、 CST4 基因的 mRNA、 CST4基因剪切子的 cDNA的探针如核苷酸序列如 SEQ ID No: 3。3.根据权利要求 1 所述的应用, 其特征在于, 所述扩增子的特异性引物, 其上 游引物如 SEQ ID No: 1, 4,6,8,10,12,14,16,18,20; 所示, 下游引物如 SEQ ID No: 2, 5,7,9,11,13,15,17,19, 21 所示, 上游引物 SEQ ID No: 1 与下游引物 如 SEQ ID No: 2配对; 上游引物 SEQ ID No: 4与下游引物如 SEQ ID No:5配对; 上游引物 SEQ ID No: 6与下游引物如 SEQ ID No: 7配对; 上游弓 I 物 SEQ ID No: 8与下游引物如 SEQ ID No: 9配对; 上游引物 SEQ ID No: 10与下游引物如 SEQ ID No: 11配对; 上游引物 SEQ ID No: 12与下游引物 如 SEQ ID No: 13 配对; 上游引物 SEQ ID No: 14 与下游引物如 SEQ ID No: 15 配对; 上游引物 SEQ ID No: 16 与下游引物如 SEQ ID No: 17 配 对; 上游引物 SEQ ID No: 18与下游引物如 SEQ ID No: 19配对; 上游引物 SEQ ID No: 20与下游引物如 SEQ ID No: 21配对。4.根据权利要求 1 所述的应用, 其特征在于, 所述 CYSTATIN S 蛋白的表位肽的氨基 酸序列如 SEQ ID No: 50所示。5.根据权利要求 1 所述的应用, 其特征在于, 所述诊断和预示具体为: 肠癌的 转移、 微转移、 pTNM分期、 治疗过程中的动态检测及预后判断。6.肠癌标志物的捕获剂, 其特征在于: 所述捕获剂为所述诊断和预示肠癌标志 物的捕获剂, 所述肠癌标志物为 CST4基因、 CST4基因的 mRNA、 CST4基因剪 切子的 cDNA、 CST4特异性引物对应的扩增子、 CST4基因编码的 CYSTATIN S 蛋白和 CYSTATIN S蛋白的表位肽。7.根据权利要求 6 所述的捕获剂, 其特征在于, 所述 3) 中的所述引物的核苷酸 序列如 SEQ ID No: 1-2所示。8.根据权利要求 6所述的捕获剂, 其特征在于, 所述 2) 中的所述探针的核苷酸序 列如 SEQ ID No: 3所示。9.根据权利要求 6 所述的捕获剂, 其特征在于, 所述 3) 中的所述扩增子的核苷 酸序列如 SEQ ID No : 43所示。10.根据权利要求 6 所述的捕获剂, 其特征在于, 所述捕获剂为所述 CYSTATIN S 蛋白或识别所述 CYSTATIN S蛋白的表位肽的特异性抗体。11.根据权利要求 6所述的捕获剂, 其特征在于: 所述 CYSTATIN S表位肽的氨基 酸序列如 SEQ ID No : 50所示。12.所述捕获剂在制备肠癌检测试剂或试剂盒中的应用。13.含有权利要求 6所述的捕获剂的诊断试剂盒。14.根据权利要求 13所述的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述诊断试剂盒具体为:1 ) 为基于 Taqman 水解探针法的 CST4 mRNA 实时定量检测试剂盒, 其上游引物如 SEQ ID No:l, 其下游引物 SEQ ID No:2所示, 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No:3所 示; 或2 ) 为基于染料法的 CST4 mRNA 实时定量检测试剂盒, 其上游引物如 SEQ ID No:l, 其下游引物 SEQ ID No:2所示; 及内参引物, 所述内参引物的上游引物如 SEQ ID No: 30所示, 下游引物如 SEQ ID No: 31所示; 或3) 为基于核酸序列扩增法的 CST4 mRNA定量检测试剂盒或基于转录介导的扩增的 CST4 mRNA定量检测试剂盒, 两者均含有 CST4引物和探针, 所述 CST4的上游引物如 SEQ ID No:32所示, 所述下游引物如 SEQ ID No:2所示, 所述探针如 SEQ ID NO: 3所 示; 或4) 为基于连接酶链反应的 CST4 mRNA定量检测试剂盒, 其含有 4条探针, 所述探 针的核苷酸序列分别如 SEQ ID No:33-36的核苷酸序列所示; 或5) 为基于适温链置换扩增的 CST4 mRNA 定量检测试剂盒, 其含有引物和探针, 所 述引物如 SEQ ID No:37-40所示, 所述探针如 SEQ ID No:41所示。15.根据权利要求 13所述的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述诊断试剂盒具体为:1) 双抗夹心 Elisa试剂盒, 包括固相载体、 固定在固相载体上的所述捕获剂、 生物素 标记的所述捕获剂及显色底物; 固定在固相载体上的所述捕获剂为特异性单抗, 生物素标 记的所述捕获剂为多抗;或 2) 蛋白印迹试剂盒包括固相载体、 捕获剂、 酶标二抗及显色底物, 捕获剂包括特 异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗;或 3) 竞争 ELISA试剂盒包括固相载体、 固定在固相载体上的抗原; 生物素标记的捕 获剂及显色底物; 特异性单抗; 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗。16.根据权利要求 14所述的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述诊断试剂盒还包括阳性对 照、 阴性对照或 /和空白对照。17.根据权利要求 15 所述的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述双抗夹心 Elisa试剂盒 中, 所述特异性单抗为鼠单抗, 抗- CYSTATIN S 蛋白, 所述固相载体为酶标板, 所述生 物素标记的特异性多克隆抗体为加入生物素标记的兔抗- CYSTATIN S 蛋白的多抗。18.权利要求 17所述的试剂盒的使用方法, 其特征在于, 具体步骤包括:将 Corning ELISA平板孔用鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单抗覆盖且用 3% BSA封闭,将 8 个倍比稀释的血清样品加至覆盖的 ELISA板中且 37度温育; 每孔用 TBS洗涤, 加入生物 素标记的兔抗- CYSTATIN S 蛋白的多抗, 37度温育; 每孔用 TBS洗涤, 加入亲合素一生 物素一过氧化物酶复合物, 37 度温育; 每孔用 TBS 洗涤, 加入碱性磷酸酶底物, 利用 ELISA读数器在 405nm波长处定量 0D。19.运用权利要求 13 所述的诊断试剂盒检测或预示肠癌的方法, 其特征在于: 用所述 诊断试剂盒检测待测样品中所述肠癌标志物的含量或表达水平, 将得到的含量或表 达水平与正常人进行比较, 判定所述待测样品是否为阳性; 或直接判定所述含量或 表达水平是否超过阈值, 当超过阈值时, 判定为阳性; 所述阈值是通过对比 正常人与肠癌患者体液或组织中标志物的含量或表达水平统计得到; 所述待 测样品为血液、 尿液、 骨髓、 肠癌细胞株或肠癌及癌旁手术组织、 淋巴结中的任一 种或多种。20.用于诊断和预示肠癌的试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S蛋 白水平, 包括固相载体、 固定在固相载体上的所述捕获剂、 生物素标记的所述捕获剂及显 色底物; 固定在固相载体上的所述捕获剂为特异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异 性多抗; '或所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S 蛋白的水平, 所述试剂盒包括固相载体、 包被于 固相载体的 CYSTATIN S蛋白、 CYSTATIN S特异性鼠单抗、 酶标二抗及显色底物;或所述试剂盒用于检测 CYSTATIN S 蛋.白水平, 包括固相载体、 捕获剂、 酶标二抗及 显色底物, 捕获剂包括特异性单抗, 生物素标记的所述捕获剂为特异性多抗。21.根据权利要求 .20所述的用于诊断和预示肠癌的试剂盒, 所述试剂盒为基于双抗夹 心法的 ELISA诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为酶标板, 所述固定在固相载体上 的捕获剂为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单抗, 生物素标记的捕获剂为效价为 1 : 1000 的兔抗-31更正页(细则第 91条) CYSTATIN S 蛋白的多抗, 显色底物为碱性磷酸酶;或所述试剂盒为基于竞争 Elisa法的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为酶标 板, 所述 CYSTATIN S蛋白的浓度为 5ug/ml,所述特异性单抗为鼠抗- CYSTATIN S 蛋白单 抗, 其效价为 1:2000, 所述酶标二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗 -小鼠 IgG, 所述酶标二 抗效价为 1:2000, 所述显色底物为碱性磷酸酶底物, 所述 CYSTATIN S蛋白、 酶标二抗及 显色底物的体积比为 1:2;或所述试剂盒为基于免疫印记的诊断试剂盒, 其特征在于, 所述固相载体为硝酸纤维素 膜, 捕获剂为效价为 1:1000 的 CYSTATIN S 鼠单抗, 酶标二抗为缀合至过氧化物酶的山羊 抗-兔 IgG, 显色底物为 TMB溶液。32更正页(细则第 91条)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2012/070149 WO2013104103A1 (zh) | 2012-01-09 | 2012-01-09 | 诊断和预示肠癌的标志物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104105791A true CN104105791A (zh) | 2014-10-15 |
Family
ID=48781017
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280066472.6A Pending CN104105791A (zh) | 2012-01-09 | 2012-01-09 | 诊断和预示肠癌的标志物 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150168410A1 (zh) |
JP (1) | JP6192122B2 (zh) |
CN (1) | CN104105791A (zh) |
GB (1) | GB2513507A (zh) |
WO (1) | WO2013104103A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112379097A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-19 | 上海良润生物医药科技有限公司 | Cst1-ctsb复合物作为结肠直肠癌诊断标志物的应用 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013104104A1 (zh) * | 2012-01-09 | 2013-07-18 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 诊断和预示乳腺癌的标志物 |
CN104558116A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体和应用 |
WO2020218488A1 (ja) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | 千寿製薬株式会社 | 眼疾患マーカー |
CN113789383B (zh) * | 2021-11-01 | 2023-10-24 | 山东省千佛山医院 | 一种用于辅助诊断结直肠癌的生物标志物及其检测试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1867679A (zh) * | 2003-07-17 | 2006-11-22 | 环太平洋生物技术有限公司 | 用于胃癌检测的标记物 |
CN101985651A (zh) * | 2010-04-30 | 2011-03-16 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记 |
CN102232113A (zh) * | 2008-03-31 | 2011-11-02 | 健泰科生物技术公司 | 用于治疗和诊断哮喘的组合物和方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
AU2001259264B2 (en) * | 2000-05-01 | 2006-05-11 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide probes for detection and quantitation of candida species |
JP2004527210A (ja) * | 2000-08-02 | 2004-09-09 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 内皮細胞発現パターンの評価法 |
US20050009067A1 (en) * | 2003-05-19 | 2005-01-13 | Craig Logsdon | Expression profile of pancreatic cancer |
EP1652923B1 (en) * | 2003-08-08 | 2011-10-12 | Perseus Proteomics Inc. | Gene overexpressed in cancer |
WO2006064844A1 (ja) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Perseus Proteomics Inc. | 大腸癌および/または大腸ポリープの診断ならびに術後経過観察および再発のモニター薬 |
WO2013104104A1 (zh) * | 2012-01-09 | 2013-07-18 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 诊断和预示乳腺癌的标志物 |
-
2012
- 2012-01-09 US US14/371,088 patent/US20150168410A1/en not_active Abandoned
- 2012-01-09 JP JP2014550607A patent/JP6192122B2/ja active Active
- 2012-01-09 CN CN201280066472.6A patent/CN104105791A/zh active Pending
- 2012-01-09 WO PCT/CN2012/070149 patent/WO2013104103A1/zh active Application Filing
- 2012-01-09 GB GB1414102.2A patent/GB2513507A/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1867679A (zh) * | 2003-07-17 | 2006-11-22 | 环太平洋生物技术有限公司 | 用于胃癌检测的标记物 |
CN102232113A (zh) * | 2008-03-31 | 2011-11-02 | 健泰科生物技术公司 | 用于治疗和诊断哮喘的组合物和方法 |
CN101985651A (zh) * | 2010-04-30 | 2011-03-16 | 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 | 胃肠肿瘤诊断和预示的新分子标记 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ISEMURA S ET AL.: "Cystatin S:a cysteine proteinase inhibitor of human saliva.", 《J BIOCHEM》 * |
KOTTGEN A ET AL: "GenBank Accession:NM_001899.2", 《GENBANK》 * |
李响等: "蛋白质组学与耳鼻咽喉科疾病", 《中国医学文摘(耳鼻咽喉科学)》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112379097A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-19 | 上海良润生物医药科技有限公司 | Cst1-ctsb复合物作为结肠直肠癌诊断标志物的应用 |
CN112379097B (zh) * | 2020-10-22 | 2022-07-26 | 上海良润生物医药科技有限公司 | Cst1-ctsb复合物作为结肠直肠癌诊断标志物的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6192122B2 (ja) | 2017-09-06 |
GB2513507A (en) | 2014-10-29 |
GB201414102D0 (en) | 2014-09-24 |
JP2015503921A (ja) | 2015-02-05 |
WO2013104103A1 (zh) | 2013-07-18 |
US20150168410A1 (en) | 2015-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104136630B (zh) | 诊断和预示乳腺癌的标志物 | |
CN104039962B (zh) | 乳腺癌诊断和预示的标志物 | |
US20110251097A1 (en) | Diagnostic kit of colon cancer using colon cancer related marker and diagnostic method thereof | |
WO2022063156A1 (zh) | 乳腺癌的生物标志物及其应用 | |
CN104650234A (zh) | 抗akr1b10蛋白单克隆抗体及其应用 | |
CN104105791A (zh) | 诊断和预示肠癌的标志物 | |
KR20100121949A (ko) | 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝 | |
KR101388711B1 (ko) | 암 진단 마커로서의 보체 c9 | |
CN106461665B (zh) | 用于诊断胰腺癌的包括补体因子b蛋白的抗体和糖类抗原19-9蛋白的抗体的试剂盒 | |
CN101493463B (zh) | 胃癌诊断试剂及其用途 | |
KR101289454B1 (ko) | 소세포폐암 및 비소세포폐암 진단 마커로서의 보체 c9 | |
KR101192295B1 (ko) | 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝 | |
KR101007573B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
CN111108390A (zh) | 用于诊断胃癌的组合物和使用组合物进行诊断胃癌的方法 | |
KR101901457B1 (ko) | 간암 암 줄기세포 특성에 기초한 간암의 신규 바이오마커 및 그의 용도 | |
CN107449903A (zh) | 抗XRCC3的IgG抗体作为胃癌血清标志物的应用及其试剂盒 | |
KR100958086B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR101007574B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR100969692B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR20170074034A (ko) | 간 섬유화 진단용 바이오마커 cxcl14 | |
KR100931997B1 (ko) | 간세포암 종양 마커로서의 klk-5 유전자 및 이를 이용한간세포암 진단 방법 | |
KR101007576B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR101065027B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
CN112695090A (zh) | 标志物组合的应用 | |
KR20090097138A (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141015 |