JP2015503921A - 結腸直腸癌診断および予測のためのバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
上記されている分子生物学的技術は、以下の実施例に記載されている。これらの実施例は本発明の利用を限定する代わりに本発明を明確にしていることに留意されたい。Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子クローニング:実習マニュアル)(J.Sambrookら編)におけるプロトコルは、もし示されていなければ、実験手順に厳密に従った。または取扱説明書を以下に示した。記載されていない場合、百分率および割合は、重量に基づく。
全臨床サンプルを、Beijing Friendship Hospital(北京友情医院)から得、病院の厳しい検査法規と患者の同意書を有した。
サンプルから市販キットを用いて核酸を抽出した。限定を意図しない例は、フェノール−クロロホルム抽出である。サンプル中のRNAを、Invitrogenにより製造したトリゾールキット(Trizol kit)を続けて用いて得られた。抽出したRNAの品質を、Molecular Biology Experiments(分子生物学実験)(J.Liによる)などの参考文献中のプロトコルに従って分析した。mRNAの逆転写を市販キットにより行い、その指針は以下に従った。cDNA溶液を適切な濃度勾配で調製した。生化学反応用のプライマーを最適化した。CST4用のプライマーをエクソン1に基づき設計した。CST4増幅産物を含む組み換えプラスミドは、Pegm−T(Promega(図1に示されている))から市販されている。プライマーをエクソン1および3に基づき設計した。PCRプロセスをTaqManプローブの加水分解により観測した。
サンプルの前処理は、TaqManプローブを用いるリアルタイムPCRのセクションに記載されているものと同じである。同時に増幅されるCST1、CST2およびCST4の増幅用のプライマーの配列は、
1.種々のヒト組織中のCST4
全組織サンプルを、Beijing Friendship Hospital(BFH)から得られる結腸組織を除いて購入した。種々のヒト組織サンプル中のCST4のmRNA発現をHG−U95AV Human GeneChip Array(Affymetirx)上で測定し、比較した(使用マニュアルからのプロトコルは以下の通りであった)。CST1 mRNA発現の定量化を、β−アクチン蛍光校正曲線により実現した。
TaqManプローブを有するリアルタイムPCRに基づくCST4のmRNA発現用検査キット。当該キットは以下を含有する。
結腸鏡検査サンプルは、腫瘍細胞の百分率が変動する外科サンプルと大きく異なる。癌性組織はときどき、結腸鏡検査サンプル全体の非常に小さな一部であり、または癌性組織は結腸鏡検査サンプル中に包含されない。発明者らは試験し、結腸直腸癌患者からの36個の結腸鏡検査サンプルと腸炎患者からの36個の結腸鏡検査サンプルにおけるCST4発現を比較した。癌性サンプルにおけるCST4発現の中央値は、腸炎サンプル中でのカットオフ値より14.3倍大きい。もし60.5がカットオフ値である場合、癌性腫瘍は炎症と区別され得、結腸鏡検査サンプルを用いる結腸直腸癌診断用のレファレンスを提供する。
異なるサイズの薬理学的診断された結腸直腸癌転移を含むリンパ節の20個の外科サンプルおよび初期段階の非転移性結腸直腸癌を伴う患者からの15個のリンパ節サンプルを得た。初期段階の癌患者を、検出できないリンパ節転移および得られたアーチファクトを避けるために選択した。リアルタイムPCRをCST4の発現の定量化に用い、詳細な実験手順は実施例2に記載しているようなものと同じである。図6に示されているように、CST4発現は、結腸直腸癌転移を伴うサンプルにおいて高く、癌転移を伴わないサンプルにおいて比較的ひくい。転移を伴うサンプル中のCST4発現の中央値は、乳癌の転移を伴わないサンプル中のCST4発現の中央値より23.6倍高い。もしカットオフ値が23.9のコピーである場合、癌転移を区別するのは可能である。CST4発現の2つの陽性の場合を非転移グループにおいて報告した。これらのサンプルを、注意深く研究し、そして微小転移巣を両方において発見した。これらの2つの例を転移サンプルとして考える場合、CST4のmRNA発現試験は、検査においてすべての転移性の場合を区別することができる。伝統的な薬理学的研究の可能性を超えている微小転移巣は発見され、より高い感度を示すとわかった。
結腸直腸癌患者からの生検骨髄サンプルのCST4のmRNAをリアルタイムPCRにより定量化した。得られた結果を検出用の健常な骨髄サンプルと比較した。これらの試験の結論を細胞学的研究と比較した。
結腸直腸癌患者(50例)、腸炎患者(30例)および健常者(30例)の血漿サンプルを集めた。無細胞RNAを市販キットを通して抽出した:リアルタイムPCRをCST4発現の定量化のために用いた。
CST4のmRNA発現用の検査キットは以下を含有する。
rtSDAに基づくCST4mRNA発現の定量化用の検査キットは以下を含有する:
1)
核酸ベース増幅(NASBA)に基づくCST4のmRNA発現定量化用の検査キットは、以下を含有する。
転写増幅法(TMA)に基づくCST4のmRNA発現の定量化用検査キットは以下を含有する。
80人の結腸直腸癌患者(I+IIステージの30例およびIII+IVステージの50例)からの血漿サンプル中の無細胞RNAを市販キットによって抽出した。CST4発現を、TMA(転写増幅)方法を用いて測定した。
治療を受ける結腸直腸癌患者の血清CST4発現(化学療法での6人の患者および放射線療法での4人の患者)は、リアルタイムPCRにより観測された。腫瘍成長を血液中のCST4発現レベルと比較および対応させた。
5人の処置後結腸直腸癌患者の血液CST4発現を定量的リアルタイムPCRによる治療後1月後、3月後および1年後に観測した。表2に示されているように、患者は癌が再発した。CST4発現の増加はこれらの2人の患者で観測された。癌の再発は、CSTT4発現がおよそ1000のコピーに達するまで検出されなかった。他の3人の患者は癌が再発せず、あまりCST4発現の増加は彼らに観測されなかった。したがって、CST4は癌の予後予測に良好なマーカーである。
1.CST4のmRNA発現のリアルタイム定量化のためのTaqmanプローブに基づく検査キット
1)CST4用プライマー
当該キットは以下を含有する。
1)プライマーおよびプローブ
キットは以下を含有する。
1)プライマーおよびプローブ
当該キットは、以下を含有する。
1)ハプテン標識化した4つのプローブ:
当該キットは、以下を含有する。
1)
本発明を以下の実施例に示す。これらの実施例は、本発明の利用を制限する代わりに本発明を明確にすることに留意されたい。Molecular Cloning: A Laboratory Manual(J.Sambrookら編)は、記載されていない場合、実験工程に厳密に続けられた。または、取扱説明書に従った。言及されない場合、百分率および割合は重量に基づく。
組み換えシスタチンSタンパク質をAbnovaから購入した(0.06μg/μL、カタログ番号H00001472−P01)。
ELISAプレート(コーニング)をシスタチンS溶液(5μg/mL)で被覆し、3%のBSA溶液によってバックフィルする。8つの血清サンプル(2倍希釈物)およびポリクローナルラット抗シスタチンS抗体(価数1:1000である)を一晩(4℃)でインキュベートし、および前処理したELISAプレート上にアプライする。プレートは1時間37℃でインキュベートする。サンプルの穴をTBS緩衝液(10mMのTris−HCl、154mMのNaCl、pH7.5)によって洗浄する。添加したアルカリのホスファターゼ(ALP)標識ヤギ抗マウスIgG(価数1:2000であるJacksonwi ImmunoResearch)溶液を添加し、1時間(37℃)の間インキュベートした。TMB溶液(TMB Peroxidase Substrate、Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.(ゲイザースバーグ、メリーランド)カタログ番号50−76−01)を添加し、405nmにおけるODをマイクロプレートリーダーにより定量化する。
ELISAプレート(コーニング)をモノクローナルラット抗シスタチンS溶液(5μg/mL)により被覆し、3%BSA溶液によりバックフィルした。8個の血清サンプル(2倍希釈)を1時間(37℃)プレートの穴にインキュベートした。プレートをTBS緩衝液(10mMのTris−HCl、154mMのNaCl、pH7.5)で洗浄する。ビオチン化ウサギ抗シスタチンSポリクローナル抗体(価数:1:1000)を穴にアプライし、1時間(37℃)インキュベートする。当該穴をTBS緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体(ABCコンプレックス)を加える。プレートを1時間37℃でインキュベートし、穴をTBS緩衝液で洗浄する。TMB溶液(TMB Peroxidase Substrate, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.(ゲイザースバーグ、メリーランド)カタログ番号50−76−01)を添加し、405nmにおけるODをマイクロプレートリーダーにより定量化する。
1.結腸直腸癌細胞株培養上清におけるシスタチンS検出
CST4のmRNAを上で論じたように結腸直腸癌腫瘍において過剰発現する。分泌タンパク質として、シスタチンSは種々の体液および分泌物中に見られうる。結腸直腸癌のマーカーとしてシスタチンSを樹立するため、CST4のmRNAの高発現を伴うSW480およびCaCO2の上清を15%ポリアクリルアミドゲル(レーン5〜6、レーン7〜8のそれぞれ、図14)に充填し、対照サンプル(健常者の血清)をゲル(レーン1〜2、レーン3〜4のそれぞれ、図14)に充填した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ペルオキシダーゼ標識抗シスタチンS抗体およびヤギ抗ウサギIgGと反応させた。TMBをタンパク質イメージ化に用いた。上記方法に従った。
セクション「1」に記載されているプロトコルは以下の通りであった。図15に示されているように、β−アクチン(内部基準)は、ゲルのボトムにある。16kDaタンパク質を有するバンドはレーン3〜6(癌性サンプル)に観測され、レーン1〜2(対照サンプル)のバンドは極めてかすかであった。
実験:シスタチンS(5μg/mL)をELISAプレートにアプライし、一晩(4℃)インキュベートした。血清サンプル(結腸直腸癌患者から30個および健常者から20個)を抗シスタチンSモノクローナル抗体(価数1:2000、3%のBSAをTBSに溶解させた)と混合し、一晩インキュベートした、当該サンプル混合物を前処理したELISAプレートにアプライし、1時間(常温)インキュベートした。当該ELISAプレートをTBS緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ウサギ抗体(0.08μg/mL,TBSに溶解させた)でインキュベートした。プレートをp−ニトロフェニルホスフェート(p−NPP、CHEMICON International)と反応させた。マイクロプレートリーダーを定量化のために用いた。
シスタチンSをセクション「3」に記載されている方法に従って測定した。CEAを市販キット(DRG、ドイツ,カタログ番号EIA5071)を用いて測定し、取扱説明書に従っている。
限定を意図せず、例証的な方法、検査キットおよびプロトコル
取得物をサンプリングし貯蔵する。血清について、血液サンプルを2時間室温で保存しまたは一晩4℃で保存する。当該サンプルを20分間(1000g)遠心分離し、上清を血清として収集する。得られた血清サンプルを−20℃または−80℃で保存かつ繰り返して解凍し、凍結しないようにすべきである。血漿について、抗凝固薬としてEDTAまたはヘパリンを用いる。当該サンプルを、血液の収集後30分未満の、15分間(2〜8℃、1000×g)遠心分離する。得られた血漿サンプルを−20℃または−80℃で保存し、解凍を繰り返して、凍結しないようにすべきである。
実験の詳細は、セクション6と同一である。結腸直腸癌患者(20個のTステージの例、30個のNステージの例および30個のMステージの例)サンプルを細胞的に80人診断する。癌の成長を表4にまとめるように、シスタチンS発現は増加し、シスタチンSタンパク質発現はpTNMステージ判定のために用いられうることを示す。
実験の詳細は、セクション6と同一である。結腸直腸癌患者50人のサンプルを細胞的に診断し、そのうち30人の患者は癌転移している。表5にまとめるように、シスタチンS発現は、癌転移をしていない患者より転移する患者において高く、シスタチンS発現が結腸直腸癌転移診断用のマーカーであることを示している。
実験の詳細は、セクション6と同一である。1000人の胃癌(N0−1ステージ)を研究した。患者を5−FU/LV(レバミゾール)レジメで4回治療した。全患者は24月続けた。シスタチンS発現を上記セラピーの最終サイクルの後測定した。当該研究において364人の場合に有効であり、シスタチンS発現の中央値は2.56ng/mLだった。図18に示されているように、中央値より高いシスタチンS発現を有する患者の疾患を有しない生存率(DFS)は30%であり、中央値より低いシスタチンS発現を有する患者の疾患を有しない生存率(50%)より低かった。
実験の詳細は、セクション6と同一である。1000人の結腸直腸癌(N0−1ステージ)を研究した。患者を5−FU/LV(レバミゾール)レジメで4回治療した。全患者は24月続けた。シスタチンS発現を上記セラピーの最終サイクルの後測定した。当該研究において364人の場合に有効であり、シスタチンS発現の中央値は2.56ng/mLだった。図18に示されているように、中央値より高いシスタチンS発現を有する患者の疾患を有しない生存率(DFS)は30%であり、中央値より低いシスタチンS発現を有する患者の疾患を有しない生存率(50%)より低かった。
Claims (21)
- 結腸直腸癌の診断および予測におけるCST4遺伝子、CST4のmRNA、CST4スプライスのcDNA、CST4特異的プライマーの対応増幅産物、CST4遺伝子によってコードされるシスタチンSタンパク質およびシスタチンSのエピトープペプチドの利用であって、前記CST4遺伝子の配列は配列番号42に示される、利用。
- CST4遺伝子、CST4のmRNA、CST4スプライスのcDNAの検出用のプローブの配列が、配列番号3に示されている、請求項1に記載の利用。
- 前記増幅産物の特異的プライマーが、配列番号1、4、6、8、10、12、14、16、18、20(プライマー1)に示される配列および配列番号2、5、7、9、11、13、15、17、19、21(プライマー2)に示される配列を有し、配列番号1における配列は配列番号2における配列と対になり、配列番号4における配列は配列番号5における配列と対になり、配列番号6における配列は配列番号7における配列と対になり、配列番号8における配列は配列番号9における配列と対になり、配列番号10における配列は配列番号11における配列と対になり、配列番号12における配列は配列番号13における配列と対になり、配列番号14における配列は配列番号15における配列と対になり、配列番号16における配列は配列番号17における配列と対になり、配列番号18における配列は配列番号19における配列と対になり、配列番号20における配列は配列番号21における配列と対になる、請求項1に記載の利用。
- シスタチンSタンパク質のエピトープペプチドの配列が配列番号50の中に存在する、請求項1に記載の利用。
- 診断および予測が治療および腫瘍進行予測の間に結腸直腸癌の転移、微小転移巣、pTNMステージ判定、動的モニタリングを言及する、請求項1に記載の利用。
- 結腸直腸癌診断および予測のためのバイオマーカーのための結腸直腸癌マーカー用キャプチャーであり、これらのバイオマーカーは、CST4遺伝子、CST4のmRNA、CST4スプライスのcDNA、CST4特異的プライマーの対応増幅産物、CST4遺伝子によってコードされるシスタチンSタンパク質およびシスタチンSのエピトープペプチドである、結腸直腸癌マーカー用キャプチャー。
- 前記プライマー(請求項3)の配列が配列番号1〜2中に存在する、請求項6に記載のキャプチャー。
- 前記プローブ(請求項2)の配列が配列番号3に示される、請求項6に記載のキャプチャー。
- 前記増幅産物の配列(請求項3)が配列番号43中に存在する、請求項6に記載のキャプチャー。
- これらのキャプチャーが、シスタチンSまたはそのエピトープを特異的に認識する抗体である、請求項6に記載のキャプチャー。
- 前記シスタチンSのエピトープペプチドの配列が配列番号50中に示される、請求項6に記載のキャプチャー。
- 結腸直腸癌検出用の検査試薬の調製およびキットにおける請求項6〜11のいずれか1項に記載のキャプチャーの利用。
- 請求項6に記載のキャプチャーを包含する診断キット。
- 請求項13に記載の診断キットであって、1)加水分解性Taqmanプローブに基づくCST4のmRNAの定量的かつリアルタイム検出用の検査キットであり、前記プライマーの配列が配列番号1〜2中に存在し、前述プローブの配列が配列番号3中に存在し、2)蛍光色素に基づくCST4のmRNAの定量的かつリアルタイム検出用の検査キットであり、前記プライマー配列が配列番号1〜2中に存在し、内部校正プライマー用の配列は、配列番号30〜31中に示され、3)核酸ベース増幅(NASBA)または転写媒介増幅(TMA)に基づくCST4のmRNAの定量的かつリアルタイム検出用の検査キットであり、両方のキットはCST4のために配列が配列番号2、配列番号32(プライマー用)および配列番号3(プローブ用)に見られるプライマーおよびプローブを包含し、4)リガーゼ連鎖反応(LCR)に基づく前記CST4のmRNAの定量的かつリアルタイム検出用の検査キットであり、配列が配列番号33〜36中に示されて包含されている4つのプローブであり、5)好熱性鎖置換増幅(tSDA)に基づくCST4のmRNAの定量的かつリアルタイム検出用の検査キットであり、プライマー(配列番号37〜40中に示される配列)およびプローブ(配列番号41)は包含される診断キット。
- 詳細な記載は以下のとおりである請求項13に記載の検査キットであって、
1)固体基質、固体基質に固定されたキャプチャー、ビオチン化キャプチャーおよび酵素基質 (比較分析)を包含する二重抗体サンドイッチELISAキットであり、固定されたキャプチャーがモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーがポリクローナル抗体である、または
2)固体基質、キャプチャー、酵素標識化二次抗体および比色検出用酵素基質を包含しているブロッティングキットであり、前記キャプチャーはモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である、または
3)固体基質、固定されたアンチゲン、ビオチン化キャプチャー、前記比色検出用酵素基質および特異的モノクローナル抗体を包含する競合ELISA キットであり、前記ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である、検査キット。 - 陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルならびにブランクサンプルが包含される、請求項14に記載の検査キット。
- 前記モノクローナル抗体がラット抗シスタチンS抗体であり、前記固体基板がELISAプレートであり、上述のビオチン化ポリクローナル抗体がビオチン化ウサギ抗シスタチンSポリクローナル抗体である、請求項15に記載の二重抗体ELISA検査キット。
- 前記詳細が以下のように記載されている請求項17に記載の検査キットのプロトコルであって、
ラット抗シスタチンS抗体によりELISAプレートをコーティングし、その後に3% のBSAでバックフィルされ、8倍に希釈したサンプルを前記プレートにアプライし、それを37℃でインキュベートし、TBSによってサンプルを含む前記穴を洗浄し、ビオチン化ウサギ抗シスタチンSポリクローナル抗体を加え、37℃で前記プレートをインキュベートし、TBSによってサンプルを含む前記穴を洗浄し、ストレプトアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体を加え、37℃で前記プレートをインキュベートし、続いて、TBSでプレートを洗浄し、最後に検体をアルカリホスファターゼ (ALP)を添加し、マイクロプレートリーダーにおけるOD(405 nm)で読まれ定量化される、検査キットのプロトコル。 - 癌の診断用およびキット用の指針であって、固相に固定された固体相担体を包含しているタンパク質レベルのシスタチンSの検出用のキットがキャプチャー試薬、ビオチン化キャプチャー試薬発色基質を支持し、キャプチャー試薬として固相担体−特異的モノクローナル抗体に固定され、ビオチン化ポリクローナル抗体を特異的にビオチン化するキャプチャー試薬、または
シスタチンSタンパク質レベルの検出用のキットであり、前記キットは、それらの固相担体バッグを包含している固相担体シスタチンSタンパク質、シスタチンS特異的マウスモノクローナル抗体、HRP 二次抗体および発色基質であり、
固相サポート、前記キャプチャー試薬およびHRP−発色基質、特異的モノクローナル抗体を含むキャプチャー試薬、特異的にビオチン化された多耐性であるキャプチャー試薬を包含するシスタチンSタンパク質レベルの検出用キットである、癌の診断用およびキット用の指針。 - 結腸直腸癌診断用または予測用の請求項13に記載の診断キットの使用方法であって、検査キットを介して測定される発現レベルまたは結腸直腸癌マーカーの定量含有量が健常者の発現レベルまたは結腸直腸癌マーカーの定量含有量と比較して、結果が陽性であるか否かを決定し、または結果がカットオフ値より高ければ陽性と解読し、カットオフ値は、結腸直腸癌患者および健常者の体液または組織 サンプル中の結腸直腸癌マーカー発現/レベルの比較を通して得られ、カットオフ値は統計的に有意であり、サンプルが以下:血液、尿、骨髄、結腸直腸癌細胞株、結腸直腸癌腫瘍および腫瘍隣接組織ならびにリンパ節組織の1以上を包含する、診断キットの使用方法。
- 請求項15に記載の二重抗体ELISA検査キットであって、
前記固体基質がELISA プレートであり、前記固定されたキャプチャー がラット抗シスタチンS抗体であり、前記ビオチン化キャプチャーがウサギ抗シスタチンSポリクローナル 抗体(価数1:1000である)でありおよび前記比色検出用基質がアルカリホスファターゼ (ALP)であり、または
前記二重抗体サンドイッチELISAキットが競合ELISAに基づき、ELISA プレートは前記固体基質であり、シスタチンS の濃度は5 μg/mLであり、前記特異的モノクローナル抗体はラット抗シスタチンS 抗体(価数1:2000である)であり、酵素標識化二次抗体はALP標識ヤギ抗マウスIgG (価数1:2000であり)であり、および前記比色検出用基質がALP基質であり、前記シスタチンS、酵素標識化二次抗体およびALP基質の体積比が1:2であり、または
キットが免疫ブロット法に基づき、前記固体基質はニトロセルロース膜であり、前記キャプチャーはモノクローナル シスタチンS抗体(価数1:1000である)であり、前記酵素標識化二次抗体はペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ウサギ IgGであり、 および前記酵素基質はTMB溶液である、二重抗体ELISA検査キット。
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