CN113789383B - 一种用于辅助诊断结直肠癌的生物标志物及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于辅助诊断结直肠癌的生物标志物及其检测试剂盒，属于诊断学技术领域。本发明所提供的基因可以有效的区分结直肠癌和癌旁组织，因此可作为生物标志物去用于制备辅助诊断结直肠癌的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于诊断学技术领域，尤其涉及一种用于辅助诊断结直肠癌的生物标志物及其检测试剂盒。
背景技术
结直肠癌是全球第三大常见癌症，其致死率位于肿瘤的第二位，对人类的健康和生命安全产生了极大的危害。目前，结直肠癌在中国的发病率和死亡率呈现出逐年上升的趋势，大部分的患者在确诊的适合已经处于晚期，患者的生存率较低。大量的研究表明实现，实现结直肠癌患者的早发现，早诊断和早治疗可以显著的降低结直肠癌患者的死亡率。
因此，寻找新的结直肠癌相关分子将有助于我们实现结直肠癌的早发现和早诊断，并且有助于我们寻找新的治疗的靶点，从而实现结直肠癌的早诊断和提高结直肠癌患者生存率的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效诊断结直肠癌的生物标志物及其诊断试剂盒。
首先，本发明提供了检测 LINC02268表达水平的试剂在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂为LINC02268特异性PCR引物、基因芯片或探针。
优选地，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其次，本发明提供了降低LINC02268表达的试剂在制备癌症药物中的应用，所述试剂为siRNA或shRNA，所述癌症为结直肠癌。
优选地，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
其次，本发明提供了降低LINC02268表达的试剂在制备结直肠癌细胞转移抑制药物中的应用，所述试剂为siRNA。
优选地，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
本发明的有益效果在于：
本发明发现LINC02268在结直肠癌组织中的表达量要显著的高于癌旁组织中的表达量，且这种差异具有较高的AUC值，因此可以将LINC02268用于结直肠癌诊断的生物标志物和制备结直肠癌的诊断标志物。同时，本发明发现通过抑制LINC02268可以有效的抑制结直肠癌细胞的转移，因此可以将其作为结直肠癌新的治疗靶点。
附图说明
图1为LINC02268在结直肠癌和癌旁组织中的表达差异；
图2为LINC02268差异表达的ROC曲线；
图3为本发明所提供的降低LINC02268表达的siRNA的抑制效果；
图4为划痕实验的检测结果；
图5为Western Blot实验的检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）收集40例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织（距离结直肠癌组织的边缘5cm以上）置于-80℃中保存；
（2）将-80℃冻存的结直肠癌和癌变组织取出，称取20mg组织置于无酶EP管中，加入0.5ml Trizol，使用匀浆器充分裂解组织；
（3）将EP管在室温下放置10min，加入氯仿0.2ml，在震荡仪上震荡30s后，在室温下放置3min；
（4）将离心机预冷至4℃，将EP管对称放入，12000rpm离心10min，小心吸取200ul上层液至新的EP管中，加入100ul的无水乙醇，轻轻混匀后离心；
（5）将离心后的溶液转移到吸附柱中，吸附柱装配在收集管中，室温放置2min，将收集管和吸附放入到高速离心机中，12000rpm离心3min；
（6）离心结束后，取出收集管，将管中的液体倒掉；
（7）将500ul RPE Solution放入到吸附柱中，静置2min，10000rpm离心30s，将收集管中的液体倒掉，再次重复该步骤；
（8）将吸附柱安转到收集管中，10000rpm离心2min；
（9）取出吸附柱，放置在无酶EP管中，加入30ul的DEPC水溶解RNA，静置5min；
（10）置于离心机中12000rpm离心2min，弃去吸附柱，得到RNA。
实施例2
荧光定量PCR反应
（1）按照逆转录反应体系配置反应混合物，具体如下
| 总体积 | 20ul |
| 2×ES Reaction Mix | 10ul |
| RNA模板 | 1ul |
| Oligo dT引物 | 1ul |
| ES Mx | 1ul |
| ddH2O | 7ul |
逆转录反应条件：
42℃ 30min，85℃ 5min，样品置于-20℃保存。
（2）根据LINC0226的cDNA序列（SEQ ID NO.1）设计qPCR引物，引物序列如下所示：
| 引物名称 | 引物序列 | 产物大小 |
| LINC02268上游引物 | ATTCTCCTGCCACAGCCTTC，SEQ ID NO.2 | 146bp |
| LINC02268下游引物 | GCAGGCAGATCACTTGAGGT，SEQ ID NO.3 |
（3）qRT-PCR实验
按照如下体系配制反应体系：
| 成分 | 体积 |
| 2*SYBR Green Mix | 10ul |
| 上游引物 | 0.5ul |
| 下游引物 | 0.5ul |
| cDNA模板 | 4ul |
| 总体积 | 20ul |
（4）使用混合器将上述体系混合均匀，微型离心机进行瞬时离心；
（5）按照如下步骤进行PCR反应
预变性 Cycle 1：1个循环
Step 1： 95℃ 5min；
PCR循环Cycle 2：40个循环
Step1：95℃ 10s；
Step2：60℃ 30s；
（6）△△Ct 法计算基因的相对表达量。
表达差异的实验结果如图1所示，其中，结直肠癌组织中的LINC02268的相对表达量为2.243±0.844，显著高于癌旁组织中的表达量，且二者的差异具有统计学意义。
绘制结直肠癌和癌旁组织中LINC02268差异表达的ROC曲线，结果如图2所示，从图中可以看出，AUC值为0.9119，说明将LINC02268作为结直肠癌标志物来区分结直肠癌和非结直肠癌组织时具有较高的诊断价值，因此可以使用检测LINC02268表达的引物来制备辅助诊断结直肠癌的试剂盒。
实施例3
降低LINC02268对于结直肠癌SW1116细胞迁移的影响
（1）根据LINC02268的cDNA序列试剂siRNA，设计的siRNA的序列如下：
正义链：UCUUCAUUGCUUUCUGAAG，SEQ ID NO.4；
反义链：CUUCAGAAAGCAAUGAAGA,SEQ ID NO.5；
（2）将SW1116细胞接种于6孔板中，贴壁后，参照Lipofectamine2000的说明书将si-control和si-LINC02268转染至SW1116细胞中；
（3）转染48h之后，一部分细胞用于提取RNA，定量检测LINC02268的相对表达量，得到的结果如图3所示；
（4）另一部分细胞待细胞密度达到90%时，使用200ul的移液枪的枪头轻轻的滑过细胞，之后使用PBS清洗细胞去除死去的细胞，之后置于显微镜下拍摄划痕；
（5）置于培养箱中，培养24h后，再次在倒置显微镜下拍摄划痕；
抑制效果的结果如图3所示，转染si-LINC02268后SW1116细胞中的表达量为0.263±0.030，差异具有统计学意义，说明本发明所提供的si-LINC02268可以有效的降低LINC02268的表达。
划痕实验的结果如图4所示，从图中可以看出，降低LINC02268的表达后，SW1116细胞的迁移能力收到了显著的抑制。
实施例4
（1）在转染48h后的si-control和si-LINC02268的细胞中加入100ul蛋白裂解液，使用细胞刮刀将细胞刮下后，收集至离心管中；
（2）冰上裂解30min之后，置于离心机中进行离心，离心结束后，吸取上清至新的离心管中；
（3）按照BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度，加入5×上样缓冲液调整蛋白样品浓度后，置于沸水中加热5min；
（4）配置好电泳胶之后，组装电泳槽，进行蛋白样品和蛋白Marker加样，加样后进行电泳；
（5）电泳结束后组装电转夹，进行电转，电转结束后，将膜取出置于5%的脱脂奶粉中；
（6）封闭结束后，孵育E-cadherin和N-cadherin和β-actin一抗；
（7）孵育结束后，孵育相应的二抗，洗膜后，进行显影曝光。
得到的实验结果如图5所示，可以看出降低LINC02268的表达后，N-cadherin的表达量明显降低，而E-cadherin的表达量明显升高，说明降低LINC02268能够有效的抑制结直肠癌SW1116细胞的EMT转化。
序列表
<110> 山东省千佛山医院
<120> 一种用于辅助诊断结直肠癌的生物标志物及其检测试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1328
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
aatacagtac agatctctgt actgtaaacg acaacaagga ccagtcacaa tttcagttct 60
tgttacattg ataagactcc ttcagaaagc aatgaagaga aaagctgaag tcagtgatta 120
ggagtgtctg tgtaagtaaa agcaacaggc aattactgag tgtggtgtga gaggcacgga 180
aagattggga attcagcaag aagaggaatt gaagtcaaac ctcacctact tcccagagtc 240
ttctggattt tctgttagaa gcttcagtat ctgaggaaag gactcaggca acaaataaac 300
agctaagatt ttactagagt atgaaaggga gagcactgga gtgcagtgcg gggatggaga 360
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agccactgcg cccagctaca atatattttg gatgctgact ttatatcctg tgactttgct 840
atggtcgctt attatttcta gacatttttg tttttgacag agtctcactg ttttgcttag 900
gctggagtgc agtggcacaa tcttcattca ctgcaacctc tgcctcctgg gttcaggcta 960
ttctcctgcc acagccttca gagtagctgg gactgcaggc acgcaacacc atgcccggct 1020
aatttttgta tttttagtag agacagggga atcacgatgt tggtcaggct ggtctcgaac 1080
tcctgacctc aagtgatctg cctgcctcgg cctcccaaag tgttggaatt acaggcgtga 1140
gccaccatgc ctggccacgg tttttttgat cctttaggat tttctaccaa gactgtcatg 1200
tcatctataa tcaagtactc ttttatttct ttttttccaa tttgtttgta ttttatttct 1260
tttttctcaa agcttattgt actgactaag atccccagaa taatgttgaa taaaagtatt 1320
ggaaacag 1328
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attctcctgc cacagccttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaggcagat cacttgaggt 20
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucuucauugc uuucugaag 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cuucagaaag caaugaaga 19
Claims (10)
1.检测LINC02268表达水平的试剂在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为LINC02268特异性PCR引物、基因芯片或探针。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。
5.降低LINC02268表达的试剂在制备癌症药物中的应用，其特征在于，所述试剂为siRNA，所述癌症为结直肠癌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。
8.降低LINC02268表达的试剂在制备结直肠癌细胞转移抑制药物中的应用，其特征在于，所述试剂为siRNA。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述LINC02268的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。
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Citations (3)
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| CN111485022A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-08-04 | 新乡医学院 | 一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒 |
| CN112662776A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-16 | 广东医科大学 | 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用 |
| CN112795655A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-05-14 | 青岛市中心医院 | 一种结直肠癌诊断标志物及其诊断试剂盒 |
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2021
- 2021-11-01 CN CN202111281006.7A patent/CN113789383B/zh active Active
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Also Published As
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