CN111979246B - 长链非编码rna linc02481在抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡中的应用 - Google Patents

长链非编码rna linc02481在抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供长链非编码RNA LINC02481在抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡中的应用。本发明根据LINC02481所设计的siRNA抑制剂可以抑制胃癌细胞的增殖，并且促进胃癌细胞的凋亡，因此本发明所提供的siRNA可以应用于制备抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡的药物。

Description

长链非编码RNA LINC02481在抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌 细胞凋亡中的应用
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种胃癌相关的长非编码RNA LINC02481及其应用，原申请的申请日为： 2020-03-24，原申请的申请号为：202010212228.2。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种长链非编码RNA LINC02481在抑制胃癌细胞增殖和促进胃癌细胞凋亡中的应用。
背景技术
胃癌是消化系统常见的一种恶性肿瘤，由于胃癌的发病机制十分复杂，且患者的早期症状不明显，导致胃癌患者的早期诊断率较低。胃癌是全球第四大恶性肿瘤，虽然，最近几年胃癌的发病率有所下降，但是患者的死亡率仍然没有有效的降低，在中国胃癌患者的死亡率仍然在所有肿瘤中位列第二。胃癌分为早期胃癌和进展性胃癌，大部分胃癌患者诊断时就已处于进展期。很多的早期胃癌患者都缺乏特异性的临床症状，患者通常并不会重视，从而致使胃癌被忽视。临床数据表明，晚期胃癌患者的术后5年生存率只有30%-40%，而早期胃癌患者的术后生存率则可以达到70-80%。
长链非编码RNA是一类大约200个核苷酸，缺少完整特异性阅读框的非编码能力的RNA分子。长链非编码RNA在细胞和组织中具有较强的特异性，且具有广泛的生物学功能，并且多数的长链非编码RNA在疾病中呈现为异常表达。现有的研究显示，长链非编码RNA在染色质水平、转录水平、转录后水平、翻译水平等均具有着重要的作用。按照长链非编码RNA在基因组内与相邻蛋白编码基因的相对位置差异，将长链非编码RNA分为5类，分别是：同义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和基因间lncRNA。位置上的不同，将会使lncRNA发挥不同的作用。
研究表明，lncRNA的异常表达是影响肿瘤发生发展中的重要因素，lncRNA与肿瘤增殖、凋亡、侵袭、和迁移等息息相关，且lncRNA在肿瘤和正常组织中通常差异表达。因此，研究与胃癌相关的lncRNA标志物，对于胃癌患者的早期诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与胃癌相关的长非编码RNA分子标志物LINC02481，其次，本发明的目的在于提供一种针对LINC02481靶点的药物组合物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种与胃癌相关的长非编码RNA，所述长非编码RNA为LINC02481，所述LINC02481的序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的长链非编码RNA在NCBI中的基因ID为339988，基因的转录本为NR_147207.1（具有1821p的长度）
优选地，所述LINC02481在胃癌中高表达。
其次，本发明提供了长链非编码RNA LINC002481在用于诊断胃癌的实时荧光定量检测试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒包括用于特异性检测长链非编码RNA LINC02481表达的引物,引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述试剂盒还包括SYBR染料、RNA free水，内参基因GAPDH特异性PCR引物。
除此之外，本发明提供了一种用于治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括所述长链非编码RNA LINC02481的抑制剂。
优选地，所述长链非编码RNA LINC02481抑制剂为长链非编码RNA LINC02481的siRNA。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
本发明的有益效果在于:
本发明提供了一种胃癌诊断的新的靶点，且检测具有优异的诊断价值；其次，本发明提供了LINC02481的基因抑制剂在制备治疗胃癌药物中的应用，为胃癌药物的开发，提供了新的方向。
附图说明
图1 LINC02481在胃癌组织和癌旁组织的差异表达情况。
图2 LINC02481在胃癌组织和癌旁组织中表达水平的ROC曲线。
图3 LINC02481的siRNA对胃癌MKN45细胞中LINC02481表达水平的影响。
图4转染 si-LINC02481-2对胃癌MKN45细胞增殖的影响。
图5 转染si-LINC02481-2对胃癌MKN45增殖相关蛋白的影响。
图6 转染si-LINC02481-2对胃癌细胞Caspase3酶活力的影响。
图7 转染si-LINC02481-2对胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
检测LINC02481在胃癌组织和癌旁组织表达差异
1.研究对象
20例胃癌组织和20例相应的癌旁组织，组织来源于青岛市肿瘤医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。胃癌组织经病理检测证实为胃癌（胃癌组织切除时，患者尚未进行化疗，放疗等治疗）。
具体组织情况如下
编号 性别 年龄 分期 TNM 肿瘤类型 肿瘤大小（cm）
1 男 52 III T3N1M0 中‐低分化腺癌 5×5×1.5
2 女 57 IA T1N0M0 胃底间质瘤 4×4×4.5
3 男 48 IIIC T4bN3M0 低分化腺癌 6×6×2
4 男 54 IIB T2N2M0 低分化腺癌 3×1×0.4
5 女 65 IV T4aN3M1 中分化腺癌 3×4×1.5
6 男 75 IIIA T3NOM0 粘液腺癌 4.5×4×1.5
7 男 38 IV T4N1M0 低分化腺癌 4×3×1.5
8 男 45 II T3N1M0 低分化腺癌 3×3×0.5
9 女 63 III T4N2M0 低分化腺癌 12×10×2
10 男 40 II T3N1M0 中‐低分化腺癌 4.5×3×1.7
11 男 50 III T4N3M0 低分化腺癌 5×6×1.5
12 男 62 III T3N3M0 低分化腺癌 6×6×1.5
13 女 58 IA T1N0M0 中分化腺癌 1.5×1×0.3
14 女 45 IIB T2N2M0 低分化腺癌 4.5×3.5×1.5
15 男 64 IB T2N0M0 中分化腺癌 8.5×6×1
16 女 50 IV T4aN3aM1 中分化腺癌 4×3×1
17 男 45 IIIC T4bN2M0 中‐低分化腺癌 3×3×2.2
18 男 62 IIA T2N1M0 中‐低分化腺癌 2.5×1×1.5
19 男 78 IIIA T3N2M0 低分化腺癌 6×4×1.5
20 男 60 III T4N3M0 低分化腺癌 7.5×5×2
2.组织RNA提取
（1）将50mg胃癌组织或癌旁组织放入到研钵中，加入少量的液氮，进行迅速的研磨，组织变软后，再次加入少量液氮进行研磨，重复三次；
（2）加入1mL Trizol，使用电动匀浆器匀浆2分钟，之后，将组织转移至离心管中，室温放置5分钟；
（3）离心机12000r/min离心5分钟，保留上清，去除沉淀；
（4）在离心管中加入200μl氯仿，震荡混匀后，室温放置5分钟；
（5）离心机12000r/min，4℃，离心15min；
（6）吸取上清转移至另一离心管中，加入500μl预冷的异丙醇混匀，混匀之后冰上静置10分钟；
（7）离心机12000r/min，4℃，离心10min，去除上清，保留沉淀；
（8）在沉淀中加入1ml 75%乙醇，温和的震荡离心管，悬浮沉淀；
（9）离心机8000r/min，4℃，离心5min，小心去除上清；
（10）室温静置10分钟，待RNA干燥后，使用50μl DEPC水溶解RNA，并使用微量紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。
3.荧光定量PCR检测
（1）去除基因组DNA
反应试剂：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，
gDNA Eraser 1.0μl，
Total RNA 1.0μg，
RNase Free dH2O up to 10.0μl。
反应条件：42℃ 2分钟，4℃。
（2）逆转录反应
反应试剂：步骤（1）的反应液 10.0μl，
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，
RT Primer Mix 1.0 μl，
5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，
RNase Free dH2O 4.0 μl。
反应条件：37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃。
4.荧光定量PCR检测
反应试剂: SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10.0μl，
正向引物： 0.4μl，
反向引物： 0.4μl，
cDNA模板 2.0μl，
ddH2O 7.2μl。。
反应条件：95℃ 5min；95℃ 50s，60℃ 40s 40个循环；72℃ 5min。
LINC02481引物序列为
Forward 5’‐ AGGCAGAAATGAAGGCGTCA-3’ （ SEQ ID NO:2）
Reverse 5’‐ TGACAACAGAGGCAGCGATT-3’ （ SEQ ID NO:3）
GAPDH引物序列为
Forward 5’‐ GAAGGTGAAGGTCGGAGTC -3’（ SEQ ID NO:4）
Reverse 5’‐ GAAGATGGTGATGGGATTTC -3’ （ SEQ ID NO:5）
采用2-△△ ct方法处理实时定量PCR数据，计算LINC02481的表达变化。
实验结果
根据图1可以看出，相较于癌旁组织，LINC02481在胃癌组织中的相对表达量为4.361±0.604，且差异具有统计学意义，说明LINC02481可以作为胃癌的基因标志物。
为验证LINC02481作为胃癌基因标志物的诊断价值，绘制 ROC曲线，如图2所示。ROC曲线的ACU值为0.8825（Std. Error0.05230; 95% confidence interval 0.7800 to0.9850 ；P ＜0. 0001）,说明LINC02481作为胃癌基因标志物具有较好的灵敏度和特异性。
实施例2
荧光定量PCR检测敲减后LINC02481基因的表达情况
（1）细胞培养
人胃癌细胞MKN-45采用高糖DMEM培养液培养（10%胎牛血清），置于37℃，5% CO2恒温细胞培养箱培养。
（2）si-RNA转染
（1）转染前一天将2×105的MKN-45细胞接种于6孔板中，37℃，5% CO2恒温细胞培养箱培养24h，参照Lipofectamine2000说明书进行转染；
（2）实验分组为对照组，si-NC组， si-LINC02481-1，si-LINC02481 siRNA-2，si-LINC02481-3。
5’‐AUUUGUCGGAGGCAUUAUCAA-3’ （ SEQ ID NO:6）
5’‐GAUAAUGCCUCCGACAAAUAU-3’ （ SEQ ID NO:7）
si-LINC02481-2
5’‐GAAGGUGUUUGCUAGACAAAG -3’ （ SEQ ID NO:8）
5’‐UUGUCUAGCAAACACCUUCUG -3’ （ SEQ ID NO:9）
si-LINC02481-3
5’‐UCAUGAUAAAUCGAACAAGCA-3’ （ SEQ ID NO:10）
5’‐CUUGUUCGAUUUAUCAUGACC-3’ （ SEQ ID NO:11）
（3）荧光PCR检测
A.细胞总RNA提取
每孔中加入500μL Trizol，室温放置5分钟，充分裂解后，使用细胞刮刮下细胞，转移至离心管中；
其余步骤参照实施例1组织RNA提取。
实验结果
如图3所示，相较于对照组，si-NC组的LINC02481的mRNA表达量无明显变化。而，转染si-LINC02481-1，2，3的细胞中，LINC02481的表达量发生显著下调，其中，si-LINC02481-2的干扰效果最佳（抑制率87.4%），因此本发明选取其进行后续试验。
实施例3
CCK-8实验检测转染si-LINC02481-2对于胃癌细胞MKN-45增殖能力的影响
实验方法
（1）将2×103的MKN-45细胞接种于96孔板中，每孔100μl，每组设置3个复孔，37℃，5% CO2培养箱培养；
（2）MKN-45细胞分别转染si-NC，si-LINC02481-2，在24h，48h，72h时间点的培养结束前4h，每孔加入10ul CCK-8，恒温培养箱孵育4h后，450nm检测吸光值。
实验结果
通过图4可以看出，转染24h时，si-NC组和si-LINC02481-2组，无显著差异，而在48和72h时（48h：si-NC 0.649±0.035，si-LINC02481-2 0.431±0.027; 72h：si-NC 1.057±0.415 ，si-LINC02481-2 0.683±0.039），转染si-LINC02481-2的MKN-45细胞的OD值显著低于转染si-NC的MKN-45细胞的OD值，说明si-LINC02481-2能够抑制胃癌细胞的增殖能力。
实施例4
Western Blot检测转染si-LINC02481-2对于胃癌细胞MKN-45增殖相关蛋白的影响
（1）转染前一天将2×105的MKN-45细胞接种到6孔培养板上， 37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24h后，参照Lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染，实验分组为si-NC组，si-LINC02481组，每组重复3次；
（2）转染48h后，PBS洗涤细胞，每孔加入100µl RIPA细胞裂解液，裂解30分钟；
（3）充分裂解后，将裂解液转移至离心管中，10000g/min，4℃ 离心10分钟，取上清至新的离心管；
（4）吸取2µl，使用BCA法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液调整蛋白样品为2μg/μl，沸水水浴煮5分钟；
（5）12000rpm/min 离心5分钟，得到制备好的蛋白样品；
（6）组装好电泳槽，配置5%上层胶和10%下层胶；
（7）每孔加入20µg蛋白样品和蛋白Marker指示剂；
（8）电泳槽加入新配置的电泳缓冲液，按照上层胶电压80v，下层胶120v条件下开始电泳，待溴酚蓝指示剂移至胶底时，结束电泳；
（9）组装转膜夹子，装入倒满转移液的转移槽中，250mA，转膜1.5h；
（10）将转膜后的PVDF膜转移至5%的脱脂奶粉中，室温，封闭1h；
（11）TBST洗膜3次，每次5min，孵育β-actin，Cyclin-D1和P21一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；
（12）TBST洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；
（13）暗室中，快速将发光液滴加至PVDF膜上，进行显像。
实验结果
从图5可以看出，相较于si-NC组，si-LINC02481-2组的促增殖相关蛋白Cyclin-D1的表达量下调，而抑增殖相关蛋白P21的表达量上调，说明抑制LINC02481能够通过影响胃癌细胞增殖相关蛋白来抑制胃癌细胞的增殖。
实施例5
Caspase3酶活性检测
（1）转染前一天将2×105的MKN-45细胞接种到6孔培养板上， 37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24h后，参照Lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染，实验分组为si-NC组，si- LINC02481-2组，每组重复3次；
（2）转染48h后，参照碧云天Caspase3活性检测试剂盒说明书进行检测，检测结果如图6所示。
实验结果
从图6可以看出，相较于si-NC组，si-LINC02481组的Caspase3酶活性显著升高，且差异具有统计学意义，说明抑制LINC02481能够促进胃癌细胞的凋亡。
实施例5
Western Blot检测转染si-LINC02481-2对于胃癌细胞MKN-45凋亡相关蛋白的影响
实验步骤同实施例4，检测一抗替换为Bcl-2、Bcl-xl和BAX。
实验结果
实验结果如图7所示，从图中可以看出，相较于si-NC组，si-LINC02481-2组中，抑凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-XL的蛋白表达下调，而促凋亡相关蛋白BAX的蛋白表达上调，进一步说明抑制LINC02481能够促进胃癌细胞凋亡。
综上所述，检测LINC02481表达的试剂盒能够用于胃癌患者的诊断，其次，LINC02481的siRNA抑制剂能够抑制胃癌细胞的增殖和凋亡。
序列表
<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 一种胃癌相关的长非编码RNA LINC02481及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1821
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
caggaggttt caggaaaaca caagctatgc agtggggcag gtgaggcttg gcctgcccag 60
cctgtcctga gtgtcatggg aacagctctg gaagtgactc ctctgtcctc tggaatctgg 120
atcagatggg gccttctcca gacatctgtg ctcagcagat gcgacagacg gcccctcgag 180
tgtagcccag gatccagcac cggcccaagc aggtgggagc taaggggaaa ccgaggctca 240
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aggctgagag aggggctgtg gaacaaatca ccacaaactg gagggccgaa aacaccagca 420
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gtgacagtgg tgtgctgtgg gagccccatg gagcggctac ccaggcagga acgtcaggga 1260
ggcttcctgg aggaggtggt gcttcagatg agacttgaag gagcagaagg tgtttgctag 1320
acaaaggggc ttgcttggat gaatggtctt cagagcgtgg tcccagtaag gaaggagacc 1380
actactactc ttgctgccct cctcccccga ccttgcctag tttacaagac aggaggaaag 1440
agagaaagca aaaagttaga aaaaaaaaaa aaaaaaacag aagtaagata aatagccaga 1500
agaccttggc accaccacct ggccctggta gttaaaaaaa gtaataataa taatatcgac 1560
ccctgactta aactacttgt attatctgta aattccagac attgtaggaa aaagcattgc 1620
aaaattttct gttctgttag ctgattcatg tagcccccag tcacgttccc catgcttgtt 1680
cgatttatca tgaccctttc acgtgggccc cttagaggtg taagccctta aaagggccaa 1740
gaatttcttt ttccgggagc tcggctctta agacgcaagt ctgctgatgc tcccggctga 1800
ataaacctct tccttcttta a 1821
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcagaaat gaaggcgtca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacaacaga ggcagcgatt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auuugucgga ggcauuauca a 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gauaaugccu ccgacaaaua u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaagguguuu gcuagacaaa g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uugucuagca aacaccuucu g 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ucaugauaaa ucgaacaagc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cuuguucgau uuaucaugac c 21

Claims (2)

1.长链非编码RNA LINC02481的抑制剂在制备抑制胃癌细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为长链非编码RNA LINC02481的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示。
2.长链非编码RNA LINC02481的抑制剂在制备促进胃癌细胞凋亡药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为长链非编码RNA LINC02481的siRNA,所述siRNA的序列如SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示。
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