CN111235275B - 一种肺癌的基因标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺癌的基因标志物及其应用。本发明证明长链非编码RNA LINC01801在肺癌中的表达量显著高于癌旁组织，且具有优异的诊断价值。同时，本发明通过CCK‑8实验，集落形成实验，Caspase3酶活力测定实验，Western Blot实验证明，通过LINC01801基因抑制剂可以有效的抑制肺癌细胞的增殖，并且促进肺癌细胞的凋亡，因此，LINC01801基因抑制剂可以用于制备治疗肺癌药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于肺癌的基因标志物及其应用。
背景技术
在世界范围内，肺癌的死亡率居于所有恶性肿瘤的首位，严重威胁着人类的健康和生命。目前，在中国，肺癌的发病率和死亡率呈现出逐年上升的趋势。按照临床病例类型的不同，肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中，非小细胞肺癌约占肺癌的85%，小细胞肺癌约占15%。非小细胞肺癌又分为肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌。由于目前缺乏有效的筛选手段，大部分肺癌患者被诊断时多已处于肺癌晚期，因此患者的生存期仅有15%。当前，对于肺癌的研究重点主要在于寻找更高效的癌症编码及调控基因，通过对基因作用机制的研究，进而调控和控制基因的表达来有效的抑制肺癌的发展。因此，寻找新的，更为准确的肺癌基因标志物和治疗靶点，对于肺癌患者的早期诊断以及患者的个体化治疗具有重要的意义。
长链非编码RNA是指转录本长度超过200nt，位于细胞核或细胞质内，由RNA聚合酶Ⅱ转录生成的分子。由于长链非编码RNA缺少有意义的开放阅读框，因此长链非编码RNA一般不能编码蛋白质。过去，人们通常认为长链非编码RNA是不具有任何生物学功能的暗物质，是转录过程的副产物。然而，随着研究的不断深入，科学家发现长链非编码RNA作为人类基因组重要的调控分子在生物体内起到调节作用，其功能紊乱与胃癌、肺癌、肝癌等疾病的发生发展密不可分。 一些异常表达的长链非编码RNA能够作为癌症的基因诊断靶标，并且可以作为癌症患者早期诊断以及为判断癌症类型提供新的依据。因此，进一步阐明长链非编码RNA在肺癌中的分子基础来寻找新的治疗靶点和开发新的药物，是提高肺癌有效预防和治疗的关键。
发明内容
为了弥补现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够用于准确，迅速诊断肺癌的基因标志物LINC01801，其次，本发明的目的在于提供一种用于制备治疗肺癌药物的LINC01801基因抑制剂。
为实现上述目的，本发明提供了一种长链非编码RNA LINC01801，所述LINC01801在肺癌中高表达，所述LINC01801的转录本为NR_033982.1，所述LINC01801序列如SEQ IDNO.1所示。
此外，本发明提供了检测LINC01801表达量的试剂在用于制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒为用于检测LINC01801表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。
优选地，所述荧光定量PCR试剂盒包括用于检测LINC01801表达的引物对，所述引物对的引物序列为：
正向引物5'-AGTGGTCACCTGCCATTTCTAG-3’
反向引物5'-CAGGTCAAATGTGCTTCTGTGG-3’
优选地，所述荧光定量PCR试剂盒还包括管家基因GAPDH引物对、SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液和DEPC水。
此外，本发明提供了一种治疗肺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LINC01801的基因抑制剂。
优选地，所述LINC01801的基因抑制剂为siRNA。
优选地，所述siRNA的序列为：
正义链:GUUUGUGCUAGAAGGACAAAG
反义链:UUGUCCUUCUAGCACAAACUG
此外，本发明提供了LINC01801基因抑制剂在制备抑制肺癌细胞增殖药物中的应用。
除此之外，本发明提供了LINC01801基因抑制剂在制备促进肺癌细胞凋亡药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明证明长链非编码RNA LINC01801能够作为肺腺癌的基因标志物，用于快速和准确的诊断肺腺癌患者，而且，长链非编码RNA LINC01801基因抑制剂能够通过抑制肺癌细胞的增殖和促进肺癌细胞的凋亡来有效的抑制肺癌细胞，因此，LINC01801基因抑制剂可以用于制备治疗肺癌药物。
附图说明
图1 LINC01801在肺腺癌组织和癌旁组织中的差异表达。
图2 LINC01801在肺腺癌组织和癌旁组织中差异表达的ROC曲线。
图3 LINC01801 siRNA的干扰效率检测。
图4 LINC01801 siRNA对A549细胞增殖速率的影响。
图5 LINC01801 siRNA对A549细胞集落形成的影响。
图6 LINC01801 siRNA对A549细胞Csapase3酶活性的影响。
图7 LINC01801 siRNA对A549细胞凋亡相关蛋白的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
实施例1
选取20例肺腺癌组织以及相应的癌旁组织进行实验，组织来源于青岛市中心医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。肺腺癌组织经病理检测证实（肺腺癌组织切除时，患者未进行化疗，放疗等治疗）。
具体标本如下：
| 样本编号 | 肿瘤类型 | 诊断年龄 | 性别 | M分期 | N分期 |
| 1 | 肺腺癌 | 67 | 男 | M0 | N0 |
| 2 | 肺腺癌 | 78 | 女 | M0 | N1 |
| 3 | 肺腺癌 | 65 | 男 | M0 | N0 |
| 4 | 肺腺癌 | 70 | 男 | M0 | N2 |
| 5 | 肺腺癌 | 58 | 男 | M0 | N0 |
| 6 | 肺腺癌 | 75 | 女 | M0 | N2 |
| 7 | 肺腺癌 | 66 | 男 | M0 | N1 |
| 8 | 肺腺癌 | 76 | 女 | M0 | N0 |
| 9 | 肺腺癌 | 48 | 女 | M0 | N3 |
| 10 | 肺腺癌 | 74 | 女 | M0 | N0 |
| 11 | 肺腺癌 | 60 | 男 | M0 | N0 |
| 12 | 肺腺癌 | 51 | 女 | M0 | N0 |
| 13 | 肺腺癌 | 57 | 男 | M0 | N2 |
| 14 | 肺腺癌 | 68 | 男 | M0 | N2 |
| 15 | 肺腺癌 | 40 | 男 | M0 | N0 |
| 16 | 肺腺癌 | 43 | 男 | M0 | N0 |
| 17 | 肺腺癌 | 72 | 男 | M0 | N1 |
| 18 | 肺腺癌 | 59 | 女 | M0 | N0 |
| 19 | 肺腺癌 | 83 | 男 | M0 | N0 |
| 20 | 肺腺癌 | 50 | 男 | M0 | N2 |
2.组织RNA提取
（1）从-80℃冰箱中取出肺腺癌组织和癌旁组织，取50mg组织放入到研钵中，加入液氮，进行研磨；
（2）加入1ml Trizol，充分混匀，转移至离心管中，室温放置5min；
（3）置于离心机中，12000rpm离心5min，去除沉淀，保留上清；
（4）加入200μl氯仿，混匀后，室温静置15min；
（5）置于离心机中，12000rpm，离心5min；
（6）将上清转移至新的离心管中，加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰上静置10min；
（7）置于离心机中，12000rpm，离心10min，去除上清，保留沉淀；
（8）在沉淀中加入1ml 75%乙醇，振荡器混匀，置于离心机中，4℃，7500rpm，5min；
（9）去除上清，静置10分钟，干燥RNA沉淀；
（10）加入50μl DEPC水溶解沉淀，测定总RNA纯度和浓度。
3.逆转录获取cDNA
按照TAKARA反转录试剂盒进行操作
（1）去除基因组DNA
配置10μl反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1μl，TotalRNA 1μg，RNase Free dH2O up to 10μl。
PCR仪的反应条件：42℃ 2分钟，4℃。
（2）逆转录反应
配置20μl反应体系：步骤（1）的反应液 10μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μl，RNase Free dH2O 4.0μl。
PCR仪的反应条件：37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃。
4.荧光PCR检测
按照TAKARA荧光定量PCR试剂盒进行操作
配置反应试剂: SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μl，正向引物0.4μl，反向引物 0.4μl，cDNA模板 2μl，ddH2O 7.2μl。
反应条件：95℃ 5min；95℃ 15s ，60℃ 45s 40个循环。
采用2-△△Ct方法处理实时定量PCR数据，计算LINC01801的表达变化。
引物序列
LINC01801
正向引物 5'-AGTGGTCACCTGCCATTTCTAG-3’ (SEQ ID NO.2)
反向引物 5'-CAGGTCAAATGTGCTTCTGTGG-3’ (SEQ ID NO.3)
GAPDH引物为
正向引物 5’- AATGGGCAGCCGTTAGGAAA‐3’ (SEQ ID NO.4)
反向引物 5’- ATCTAGGAAAAGCATCACCCGG‐3’(SEQ ID NO.5)
实验结果
实验结果如图1所示，从图中可以看出，相较于癌旁组织，肺腺癌组织中的LINC01801的相对表达量为4.049±0.437，显著高于癌旁组织，且差异具有统计学差异（P＜0. 001）。
癌旁组织和肺腺癌组织的ROC曲线如图2所示，AUC值为0.9375，std.Error为0.03499,95% confidence interval 0.8689 to 1.006， P ＜0. 0001，表面通过检测癌旁组织和肺腺癌组织中的LINC01801的表达量对于肺腺癌患者的诊断具有优异的价值。
实施例2
荧光定量PCR检测LINC01801 siRNA的干扰效果
si-LINC01801序列为：
正义链:GUUUGUGCUAGAAGGACAAAG（SEQ ID NO.6）
反义链:UUGUCCUUCUAGCACAAACUG（SEQ ID NO.7）
1.细胞培养
人非小细胞肺癌细胞A549,高糖DMEM培养液培养（10%胎牛血清），细胞恒温培养箱37℃，5% CO2。
2.siRNA转染
（1）转染前一天将2×105的A549细胞接种到6孔板上，培养24h，之后，参照Lipofectamine 2000说明书对细胞进行转染；
（2）实验分组为空白对照组（空转），si-NC组，si-LINC01801组，重复3次。
3.荧光定量PCR检测干扰后LINC01801基因表达情况
（1）细胞总RNA提取
在6孔细胞培养板的每孔中加入500μl Trizol，室温放置5分钟，充分裂解后，转移至离心管中；
剩余步骤与实施例1组织RNA提取步骤相同。
逆转录反应，荧光定量PCR检测同实施例1。
实验结果
实验结果如图3所示，可以看出，相较于空白对照组，si-NC组的LINC01801相对表达量无显著变化，si-LINC01801组的LINC01801相对表达量显著降低，抑制率为82.6%，说明si-LINC01801对于LINC01801的表达具有较好的抑制效果。
实施例3
CCK-8检测si-LINC01801对于A549细胞增殖的影响
（1）将5×103个分别转染si-NC和si-LINC01801的A549细胞接种于96孔板中，每孔90μl，每组设置3个复孔，置于培养箱中培养；
（2）分别在0h，24h，48h，72h，96h对细胞进行检测，检测时，每孔加入10μl CCK-8检测液，之后将细胞置于培养箱中孵育4小时；
（3）将细胞培养板置于酶标仪中，450nm处检测吸光值，绘制生长曲线。
表1 si-NC组和si-LINC01801组不同时间的OD值
| 时间 | si-NC | si-LINC01801 |
| 0h | 0.279±0.018 | 0.280±0.015 |
| 24h | 0.543±0.029 | 0.385±0.023 |
| 48h | 0.872±0.034 | 0.524±0.035 |
| 72h | 1.083±0.039 | 0.678±0.041 |
| 96h | 1.213±0.056 | 0.735±0.043 |
实验结果
实验结果如图4和表1所示，可以看出，相较于转染si-NC的A549细胞，转染si-LINC01801的A549细胞的细胞增殖速率明显降低。在96h时，si-NC组的OD值为1.213，si-LINC01801组的OD值为0.735,si-LINC01801组的OD值显著降低，且差异具有统计学意义，说明LINC01801基因抑制剂能够抑制A549细胞的增殖速率。
实施例4
检测si-LINC01801对于A549细胞的集落形成的影响
实验方法
（1）使用0.25%胰蛋白酶将分别转染si-NC和si-LINC01801的处于对数生长期的A549细胞消化并吹打成单细胞悬液；
（2）将100μl 1×104个A549细胞和1900μl DMEM培养基混合，加入6孔板中，继续培养2周，每隔4天适当更换部分新鲜的完全培养基；
（3）当6孔板中出现肉眼可见的细胞克隆时，终止细胞培养；
（4）将培养基去除，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入4% 多聚甲醛固定15分钟；
（5）将多聚甲醛固定液去除，使用结晶紫进行染色，染色15分钟，用PBS洗去染色液，室温干燥后，进行拍照。
实验结果
实验结果如图5所示，可以看出，相较于si-NC组，si-LINC01801组克隆形成的数量明显减少，说明抑制LINC01801能够有效的抑制A549细胞集落形成。
实施例5
检测si-LINC01801对于A549细胞Caspase3活性的影响
（1）根据碧云天Caspase3活性检测试剂盒说明书，使用酶标仪测定A405吸光度下的吸光值，计算si-NC组和si-LINC01801组的Caspase3酶活性。
实验结果如图6所示，从图中可以看出，抑制LINC01801之后，Caspase3酶活性明显上调，Caspase-3酶活力上调了43.6%，说明LINC01801基因抑制剂能够促进A549细胞的细胞凋亡。
实施例6 Western blot检测LINC01801基因抑制剂对于凋亡相关蛋白表达的影响
1.蛋白提取
（1）转染前一天将2×105的A549细胞接种到6孔板上，培养24h后，参照Lipofectamine 2000说明书将si-NC和si-LINC01801转染到细胞中；
（2）转染48h后，使用PBS洗涤细胞，每孔加入100µl RIPA细胞裂解液；
（3）充分裂解之后，将裂解液转移至离心管中，10000g/min，4℃离心10分钟，将上清转移至新的离心管中；
（4）吸取2µl，参照BCA说明书测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液调整蛋白浓度为2µg/µl，沸水水浴煮5分钟，得到制备好的蛋白样品；
2.Western Blot检测蛋白表达
（1）将电泳槽组装好，配置5%上层胶和10%下层胶；
（2）每孔加入20µg蛋白样品和蛋白Marker指示剂；
（3）在电泳槽成加入新配置的电泳缓冲液，上层胶电压80v，下层胶120v条件下进行电泳，待溴酚蓝指示剂完全跑出胶时，结束电泳；
（4）按照“三明治模型”组装转膜夹，装入电转槽中，加入电转液，120v，1.5h；
（5）将PVDF膜取出，转移至5%的脱脂奶粉中，室温，摇床封闭1h；
（6）TBST洗膜3次，每次5min，孵育Bcl-2，Bcl-XL，Caspase3，β-actin一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；
（7）TBST洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；
（8）暗室中，快速将发光液滴加至PVDF膜上，进行显像。
实验结果
实验结果如图7所示，从图中可以看出，相较于转染si-NC的细胞，转染si-LINC01801的细胞中，细胞凋亡促进蛋白Caspase3的蛋白表达量上调，而凋亡抑制蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达量下调，上述结果进一步说明LINC01801基因抑制剂能够存进A549细胞的细胞凋亡。
上述结果说明，长链非编码RNA LINC01801能够作为肺癌的基因标志物，用于快速和准确的诊断肺癌患者，其次，长链非编码RNA LINC01801基因抑制剂能够通过抑制肺癌细胞的增殖和促进肺癌细胞的凋亡来有效的抑制肺癌细胞，因此，LINC01801基因抑制剂可以用于制备治疗肺癌药物。
上述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
序列表
<110> 青岛市中心医院
<120> 一种肺癌的基因标志物及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2090
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
gtcagcagca ctgggtcagc cggtgaacgg gtgtgcagcg tcctcagcgc cgcagcagtc 60
agcacctgtg ggtgctctag ctctttccct cggggtcacc ggaggcagag cctcccctac 120
gcggagtaga ggagcagctc acatggcagc cgccacagag gacaccagat catgccaaca 180
cccccacaac tcctgcccgc ctgcaggcag ctctgggctc aggacaccgc ctgcaagaac 240
ctttatagcg cagctctcca aaccttggag gcgaggacat tctatgtgcc cgccctggaa 300
aggcctgaac ctataacatc tgggctgtga tggtttctga ggtggacacc aggaccaaca 360
cttgtcagca tggcacaatc aggcatttct cttctaagta ggatgtgcag ccaaaaactc 420
agctgtctgt gagctgtctt ctcccaggaa cgaggacata agatgtacat caggttttga 480
tattagagta atactggcct tatagaatga gttacgaaaa gttgcccctt tctccacttt 540
ctgaaagagt ttgtgtaaca caggtctgaa ctgcacagat ccacttacat gtggattttc 600
ttccactgcg gcctctcctg agacagcaag accaacccct ccttttcatc ctcctcctcc 660
tcctcagcct actcaacatg aaaatgacaa ggatgaaacc tttatgatga tccactcatc 720
cattttcttt tctctagctt attgtgaaca tcttaggcta gtgtgtcgac ttctgacttg 780
gctcatctga acccaagtcc ttggacacat tcacaaacac cccagggtct tgggcttcca 840
gtttgtgcta gaaggacaaa gggcaggtga agcttgtttg ccgtaactag aaggagcaga 900
aactgctccc agcagaacaa gatcaaatca tggggaacag tggtcacctg ccatttctag 960
aggaagcttt tgcttttggt cactgaggac cctaagtctt acatgagaag aaaacaaata 1020
gggtgatgct gcatgcttct gtccccaaag aatccctgtg caggtgccga gggtgcccca 1080
aagacgaggc tgtgcttgcc gtgcccacca cagaagcaca tttgacctga tcaaaagcag 1140
gtggaaaagg tcctgaagca cagatatttt ctcagtgatg ttgttttctc caaaatgaaa 1200
gagggaaggt accctggctt aggcccctgg tgttctgatt gaaggtgaga atggaagtat 1260
cttcttcaac atgttctccc atctgactgc aacaagtgtg ctccagccac cagtgtccca 1320
gttgctctga atgatggtga gaagggtacc caaacacttg aatggtactg taccctctac 1380
ttgccatctg aatcctcact tgtggaaccc aggcactctg gctgtattcg cgagtaagca 1440
taggtgtggg actgtgtcct gccattgcac catctttaat ctggacttgt ggacctcagg 1500
ctctctgact attcatggac agaagtttct gcaggcacag gtggggtgct gtttcctccc 1560
attgtacacc tgaattcagg acttgtggac cccaggtgtt ctggctgtgt tcatgaacag 1620
aagtgtcccc cccaaacaaa cccatatatg gtgccatctc ctcccattac aggtatggtg 1680
ccatctcctc ccattgcagg cattgcactg cctatactct ggacttatgg ccctcacatg 1740
ctctgattgt attcataaac agtagtttct tcagtcacag atatggcacc agcccctcca 1800
acagaaacag atgtgctcaa gctgagtggt ccaaaggcgt ttgacagaag tcatgaacag 1860
aagtatcttg gggcacatgt ttcttctctg ttgtgcaggc ttctccagca gtaacaggtt 1920
tgcccaggcc atatgggccc caagcgctct gaccagacac aagaagagaa gacttgcagt 1980
cacaggtagt gtgttgtccc ctgctactgc aacataggtg cttggaaagg tgcaacaggg 2040
tgctctgctt gtggtggaaa cataaaggcc tccaagcata aaaaaaaaaa 2090
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtggtcacc tgccatttct ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggtcaaat gtgcttctgt gg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgggcagc cgttaggaaa 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atctaggaaa agcatcaccc gg 22
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
guuugugcua gaaggacaaa g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uuguccuucu agcacaaacu g 21
Claims (4)
1.检测LINC01801表达量的试剂在用于制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为用于检测LINC01801表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒包括用于检测LINC01801表达的引物对，所述引物对的引物序列为：
正向引物5'-AGTGGTCACCTGCCATTTCTAG-3’
反向引物5'-CAGGTCAAATGTGCTTCTGTGG-3’。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒还包括管家基因GAPDH引物对、SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液和DEPC水。
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