CN112618564B - hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的抑制hsa_circ_0001400的siRNA，其正义链：5’‑AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU‑3’，反义链：5’‑ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU‑3’；其能明显促进宫颈癌SiHa、HeLa细胞凋亡，使SiHa、HeLa分裂停滞于细胞周期G1期，促进肿瘤细胞凋亡、抑制宫颈癌转移；可开发用于制备抗肿瘤药物。

Description

hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于医学材料技术和药物技术领域，具体涉及hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
子宫颈癌在全球范围内是女性癌症死亡率排名第四的恶性肿瘤，而在欠发达地区，子宫颈癌的发病率仅次于肺癌(发病率最高)。在2017年American Cancer SocietyGuidelines公布的数据中显示，2016年美国大约有12,820人被诊断为浸润型子宫颈癌，且有4210位女性将死于该种疾病。HPV感染是引起女性子宫颈癌的主要原因，虽然已有HPV疫苗用于预防女性子宫颈癌，但在高发病率的欠发达国家仍未普及，加上未筛查出的人口，而现今子宫颈癌的发病年龄呈年轻化，因此在未来50年内仍会有大量的子宫颈癌病例发生。对于癌症的早期患者，采用手术治疗基本可以使患者5年生存率达到100％，而且近几年子宫颈癌的发病年龄趋于年轻化，使得保留生育能力的需要增加。另外有数据统计表明，子宫颈癌治疗后有10％～15％的患者出现复发或者转移情况，这是造成子宫颈癌治疗失败的主要原因。因此，迫切需要阐明子宫颈癌转移的机制，开发新的抗肿瘤药物，改善宫颈癌患者生活质量，提高患者5年生存率。
环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一种通过反向剪接机制由线性RNA前体的5′端和3′端共价相接形成具有特殊环状结构的非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)，在许多生物过程中发挥调控作用，如细胞增殖、细胞衰老和细胞凋亡等。CircRNAS在肿瘤的发生发展过程中可能扮演重要角色，多项报道已经先后证明了circRNAs-miRNAsmRNA信号通路参与了各种恶性肿瘤的发生和发展。在肿瘤转移的研究中，circRNA有其独特的优势，其本身的环状结构特点决定了它的稳定性更强，应用到临床治疗上可大大减少脱靶效应的可能性。同时，大量研究发现在人体体液中同样可检测到多种circRNA，这些circRNA在转移肿瘤和非转移肿瘤中存在表达差异，预示着circRNA有望成为肿瘤非侵袭性诊断及判断预后的新靶标。
发明内容
本发明的目的是提供hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第一个目的是提供hsa_circ_0001400的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的hsa_circ_0001400的抑制剂为可以降低hsa_circ_0001400水平的制剂。
优选，所述的hsa_circ_0001400的抑制剂为抑制hsa_circ_0001400的siRNA，其正义链：5’-AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU-3’(SEQ ID NO.1)，反义链：5’-ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU-3’(SEQ ID NO.2)。
优选，所述的抗肿瘤药物为抗宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道癌、口腔癌、贲门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、牙龈癌、尿道癌、皮肤癌、直肠癌、中耳癌、骨癌、睾丸癌、内分泌系统的癌症和/或淋巴细胞性淋巴瘤的药物。
本发明的第二个目的是提供一种抗肿瘤药物，其含有hsa_circ_0001400的抑制剂。
优选，所述的抗肿瘤药物为抗宫颈癌药物。
优选，所述的hsa_circ_0001400的抑制剂为抑制hsa_circ_0001400的siRNA，其正义链：5’-AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU-3’(SEQ ID NO.1)，反义链：5’-ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明的第三个目的是提供检测hsa_circ_0001400的试剂在制备诊断宫颈癌试剂中的应用。
优选，所述的hsa_circ_0001400在宫颈癌组织中表达上调。
以下内容中所称的hsa_circRNA_0001400即为上述的hsa_circ_0001400。
在本发明中，应用RNA测序的方法，分析人体宫颈癌组织中差异表达的circRNA。用siRNA干扰的手段，沉默高表达的hsa_circRNA_0001400，从细胞学和动物学水平，阐明hsa_circRNA_0001400/miR-326/Akt海绵在宫颈癌迁移中的分子机制，为未来临床上肿瘤转移的相关检测和治疗提供了新的技术手段。
本发明发现了hsa-circRNA_0001400/miR-326/Akt是一种新的circRNA海绵，参与肿瘤转移过程。hsa-circRNA_0001400_siRNA可能成为一种新的宫颈癌的治疗手段，hsa-circRNA_0001400可以作为诊断的生物标记物和治疗的靶点。
本发明的hsa-circRNA_0001400_siRNA能明显促进宫颈癌SiHa、HeLa细胞凋亡；使SiHa、HeLa分裂停滞于细胞周期G1期。hsa_circRNA_0001400/miR-326/Akt海绵在宫颈癌转移中起重要作用，hsa-circRNA_0001400_siRNA破坏hsa_circRNA_0001400/miR-326海绵，抑制Akt，促进肿瘤细胞凋亡、抑制宫颈癌转移。
本发明的hsa-circRNA_0001400_siRNA具有很好的hsa-circRNA_0001400抑制效果，作用于特异性的靶位点，特异性强、毒性低、副作用小和修饰半衰期长，可以与多种抗肿瘤药物合用。
附图说明
以下图中所示结果，数据用均数±标准差表示,n＝3.*P<0.05和**P<0.01,和对照组比；以下图中所标示的Akt均对应为Akt2；
图1是宫颈癌组织中差异表达CircRNA，其中，宫颈癌组织中hsa_circRNA_0001400、hsa_circ_0085362、hsa_circ_0001103、hsa_circ_0001306的表达显著升高，宫颈癌组织中hsa_circ_0078398、hsa_circ_0014866、hsa_circ_0003501表达显著降低；
图2是宫颈癌组织中差异表达CircRNAGO分析差异表达CircRNA的生物进程；
图3是宫颈癌组织中差异表达CircRNA GO分析差异表达CircRNA的细胞组成；
图4是宫颈癌组织中差异表达CircRNA GO分析差异表达CircRNA的分子功能；
图5是KEGG分析差异表达CircRNA的参与的信号通路；
图6是人阴道上皮细胞株、宫颈癌SiHa、HeLa细胞株中hsa-circRNA_0001400的表达，miR-326表达与正常细胞比较，无差异；
图7是hsa-circRNA_0001400_siRNA对宫颈癌细胞凋亡的影响；
图8是hsa-circRNA_0001400_siRNA对宫颈癌细胞周期的影响；
图9是hsa-circRNA_0001400_siRNA对宫颈癌细胞Akt、PI3K、p21蛋白表达的影响；
图10是生物信息学预测hsa-circRNA_0001400和miR-326、miR-326和Akt的直接作用位点；
图11是双荧光素酶报告基因分析hsa-circRNA_0001400和miR-326的直接相互作用；
图12是双荧光素酶报告基因分析miR-326和Akt的直接相互作用；
图13是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的细胞凋亡的回复性实验；
图14是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的细胞迁移的回复性实验；
图15是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的细胞周期的回复性实验；
图16是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的回复性实验Akt的表达；
图17是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的回复性实验中hsa-circ_0001400的表达量；
图18是hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的回复性实验中miR-326的表达量；
图19是hsa-circRNA_0001400_siRNA抑制宫颈异种移植瘤的荷瘤裸鼠和肿瘤大小；
图20是hsa-circRNA_0001400_siRNA抑制宫颈异种移植瘤的肿瘤生长曲线；
图21是肿瘤组织hsa-circRNA_0001400、miR-326的表达；
图22是肿瘤组织Akt、p21的表达；
图23是作用模式图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
一、材料和方法
1、细胞、试剂和抗体
人宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞和VK2/E6E7细胞为本实验室保存所得；胎牛血清FBS购自美国Gibco公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Transwell小室(8.0μm，美国Corning公司)；结晶紫(北京雷根生物技术有限公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、Akt、p21、PI3K、兔二抗(美国细胞信号公司，美国)。LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自中国Beyotime公司(碧云天)；CircRNA引物(hsa_circRNA_0001400-F、hsa_circRNA_0001400-R)、miR-326的引物和CircRNA siRNA(hsa_circRNA_0001400_siRNA-F、hsa_circRNA_0001400_siRNA-R)，由赛索飞生物公司(上海)合成；分析microRNA所用的加尾法试剂盒购自复能生物有限公司(上海)。
Primer：
hsa_circRNA_0001400-F：ATGTCTGTTAGTGGGGCTGA；
hsa_circRNA_0001400-R：TATCTGCTACCATCGCCTTT；
Has-miR-326-F：CCTCTGGGCCCTTCCTCAG；
has-Akt2-F:CTCAGCATCAACTGGCAGGA；
hsa-Akt2-R：GTGATGGACTGGGCGGTAAA；
hsa_circRNA_0001400_siRNA-F：5’-AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU-3’；
hsa_circRNA_0001400_siRNA-R：5’-ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU-3’；
hsa-miR-326mimic:5’-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3’；
hsa-miR-326mimic Negative Control:5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3’
hsa-miR-326inhibitor:5’-CTGGAGGAAGGGCACCGAGG-3’；
hsa-miR-326inhibitor Negative Control:5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’
2、CircRNA测序
临床组织样本：本研究中所取6例宫颈癌组织样本为2019年1月至2019年12月佛山市妇幼保健院就诊患者，所有标本均征得患者及家属的知情同意并签署知情同意书，并获得佛山市妇幼保健院伦理委员会的批准。标本经病理检查诊断为宫颈原位癌的病人。病人接受手术前未接受任何放疗、化疗及其他抗癌治疗。肿瘤组织摘取后即放入冰盒低温转移至实验室，使用PBS反复清理3次后，于-80℃冰箱或者液氮中保存，以备后续总RNA提取使用。对癌旁样本取自距离肿瘤组织边沿2厘米外的组织，经病理检测后，确定为正常组织，无非典型性增生及癌组织浸润。
使用ilumima推荐配置的建库试剂盒进行样品建库，并使用HiSeq 4000进行上机测序得到原始数据。简单的操作如下：将样品RNA逆转录为cDNA，然后3’端加上poly A,然后与试剂盒自带的测序接头进行连接，然后进行PCR扩增。最后使用HiSeq 4000进行上机检测。对Illumina高通量测序的原始图像文件进行碱基识别(Base Calling)，并转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，用于后续分析，即原始测序序列构成的集合，称为Raw Data；分析软件为bcl2fastq软件；分析结果用FASTQ文件(简称fq)展示。根据lncRNA长度的阈值，过滤掉长度短于200bp的潜在的组装转录本。对于只有一个外显子的组装转录本，保留FPKM≥2的转录本，对于多个外显子的组装转录本，保留FPKM≥0.5的转录本。当样品数大于3个时，要求至少有两个样品符合以上筛选标准。
使用Stringtie软件将组装的未知转录本用于进一步的编码能力过滤，选用CPC、CNCI和HMMER软件进行编码能力预测，三个软件预测都没有编码能力的即为novel lncRNA；用FastQC(v0.11.2)进行质控分析；用fastp(v0.14.0)过滤数据；用tophat(v2.0.13)进行对比分析；用limma(v3.32.10)和edgeR(v3.18.1)进行差异分析。
3、基于circRNA功能富集的聚类分析
基于不同分组的差异表达circRNA(或者不同差异倍数的差异表达circRNA)功能富集的聚类分析用于研究其在特定功能(GO，KEGG通路等)上存在的潜在联系和差异。首先收集所用circRNA分组富集到的功能分类信息和对应的富集P-value值，然后筛选出至少在一个circRNA分组中为显著富集(P-value<0.05)的功能分类。筛选得到的P-value数据矩阵首先经过以-log10的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用Z变换。最后将Z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。聚类关系使用R语言包gplots中的函数heatmap.2绘制出的热图进行可视化展示。
4、细胞周期
将HeLa及SiHa细胞按照1×106数量铺板于6孔板中，待细胞密度为70％时，更换新鲜培养基。准备转染。取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul siRNA(正义链：5’-AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU-3’，反义链：5’-ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU-3’，下同)，另外取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul lip 2000转染试剂，静置5min，将二者混合，轻轻摇匀，静置20min。将混合液加入各孔中进行转染。12h后更换完全培养基。培养48h，将细胞从培养箱中取出，弃去培养基，用PBS冲洗一遍，再加入0.25％胰酶之后置于37℃培养箱消化1-2min，之后加入1-2ml完全培养基终止消化，用移液枪将细胞吹打下来，转移至15ml离心管中1000rpm，离心5min，弃上清；加入1ml预冷的PBS轻柔的吹打混匀细胞，将细胞重悬起来转移至无菌无酶的1.5mlEP管中，4℃500g离心2min；弃上清，再次加入预冷的PBS洗涤一遍，同样条件离心，弃上清；加入250ul预冷的PBS将细胞轻柔重悬再加入750ul的预冷的无水乙醇，轻柔吹打混匀，4℃过夜，进行固定。固定之后将细胞于4℃500g离心2min，弃去上清，用预冷的PBS洗涤细胞，之后再次4℃500g离心2min，弃上清，再次重复洗涤一遍。洗涤之后弃去上清加入300-500ul的PBS将细胞进行重悬，再加入碘化丙啶(PI)和RNaseA至终浓度50μg/ml，37℃温浴30min；之后用流式细胞仪测定并分析细胞周期的分布。
5、细胞凋亡
将HeLa及SiHa细胞按照1×106数量铺板于6孔板中，待细胞密度为70％时，更换新鲜培养基。准备转染。取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul siRNA，另外取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul lip 2000转染试剂，静置5min，将二者混合，轻轻摇匀，静置20min。将混合液加入各孔中进行转染。12h后更换完全培养基。培养48h，用无EDTA的胰酶将细胞消化下来，终止消化之后轻柔的吹打细胞并转移到1.5ml EP管中，1000rpm离心5min，弃去上清，加入适量PBS洗轻柔冲洗然后1000rpm离心5min，冲洗三遍，之后弃上清，用500uL的BindingBuffer轻柔吹匀细胞之后加入5uL Annexin V-FITC吹打混匀后，室温避光孵育15min，之后加入5uL Propidium Iodide轻柔混匀，避光5min，在流式细胞仪中检测细胞凋亡。
6、细胞迁移
将HeLa及SiHa细胞按照1×106数量铺板于6孔板中，待细胞密度为70％时，更换新鲜培养基。准备转染。取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul siRNA，另外取250ul OPTI MEM培养基稀释10ul lip 2000转染试剂，静置5min，将二者混合，轻轻摇匀，静置20min。将混合液加入各孔中进行转染。12h后更换完全培养基。24h后，弃上清，2ml PBS漂洗一遍，加入1ml胰酶进行消化2min。加入1ml完全培养基终止消化，转移至EP管中，500g常温离心2min，弃上清，加入基础培养基2ml，使用枪头进行吹打，制备成细胞悬液，进行细胞计数，放置备用。取500ul基础培养基加入到transwell孔板中对膜浸泡30min，进行活化。活化后，将基础培养基弃去，在下室加入400ul完全培养基，轻轻放入上室，加入1×105细胞。培养36h，将板子取出弃去上室培养基，用PBS轻柔冲洗两遍。下室培养基弃去，加入600ul甲醛，上室加入200ul，室温固定15min。固定之后将甲醛弃去，用PBS轻柔洗涤3遍，之后加入1％结晶紫进行染色。
7、RNA抽提
弃去细胞培养液，PBS洗2遍，加入1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5ml EP管内，静置5min。加入200μl氯仿(三氯甲烷)，用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟；12000g，4℃，离心15min。仔细转移上层水相到1个新EP管中，不能贪多，约400-500μl。加等体积异丙醇，轻柔混合4～5次，室温放置10分钟。12000g，4℃，离心10min；轻轻倒去上清，用20μl枪轻轻吸去残液，沉淀用1ml 75％乙醇(0.75ml无水乙醇+0.25ml DEPC水，现配)洗1～2次，涡旋混匀。吸去上清，5-10分钟空气干燥RNA；加15-20μl DEPC水，吹打数次，测浓度。
8、定量PCR实验
使用All-inOneTMmiRNA qRT-PCR检测试剂盒(#AOMD-Q020,GeneCopoeia,Guangzhou,China)进行检测。反应条件按照试剂盒给定的标准程序进行设置。具体程序如下：按照配置表将各组分混匀，瞬间离心后，37℃孵育60min，85℃孵育5min进行逆转录，95℃预变性1min，95℃变性10s，53℃退火10s，72℃延伸10s，重复40个循环，使用罗氏LC96默认熔解曲线分析。miRNA每个样品中的扩增的特异性通过熔解曲线分析。相对定量使用比较周期阈值(2-ΔΔCt)方法评估靶标miRNA的表达。
对于mRNA检测，qRT-PCR使用
Figure BDA0002876927530000071
qPCR RT Kit(#2220，
Figure BDA0002876927530000072
Bioscience)进行逆转录及
Figure BDA0002876927530000073
Sybr Green qPCR Master Mix(#2043，
Figure BDA0002876927530000074
Bioscience)进行基因检测。反应条件按照试剂盒给定的标准程序进行设置。具体程序如下：按照配置表将各组分混匀，瞬间离心后，37℃孵育15min，98℃孵育5min进行逆转录，95℃预变性2min，95℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸30s，重复40个循环，使用罗氏LC96默认熔解曲线分析。mRNA每个样品中的扩增的特异性通过熔解曲线分析。相对定量使用比较周期阈值(2-ΔΔCt)方法评估靶标mRNA的表达。
9、双荧光素酶报告基因分析
取对数生长期的293T细胞(37℃，5％的CO2)，以每孔1.5×105细胞接种于24孔板中，每孔总体积500μL，于37℃培养箱中培养24h；取25μL OPTI-MEM培养基稀释1.5ul miR-326mimic、miR-326inhibitor、或miR-326negative control，25μL OPTI-MEM培养基稀释0.6ug靶基因3’UTR双报告基因载体，50μL OPTI-MEM培养基稀释2μL Lip 2000试剂，静置5min，三者混合，轻轻摇匀，静置20min；将转染混合液加入细胞前，每孔先吸走100uL培养基，然后再加入上述100uL混合液，最终每孔总体积500μL，每组设3个复孔。8h后更换500uL新鲜培养基。将报告基因细胞裂解液充分解冻混匀后，加入200ul报告基因细胞裂解液以裂解细胞。4℃10000g离心1min，保留上清。每个样品测定时，取样品上清100微升；加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂，混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100微升海肾萤光素酶检测工作液，混匀后测定RLU(relative light unit)。数据统计，计算各组的相对荧光表达量。
10、免疫印迹
样品从－80℃取出，分别加入4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂)，超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。采用BCA法(Novagen公司)进行蛋白浓度的测定；将配制好的Buffer倒入电泳槽中，将预冷好的蛋白样品和蛋白marker缓慢加入凝胶孔中。开始以80V电压跑至分离胶，之后改为110V电压直至溴酚蓝染料移至分离胶底部，停止电泳；将做好的“三明治“夹板放入电泳槽中4℃,250mA恒流条件下转膜60分钟；5％脱脂奶粉室温封闭2h；加入一抗，4℃摇床上孵育过夜；加入二抗，室温摇床上孵育1.5h；将ECL显色液滴在PVDF膜上至覆盖整张膜，室温条件下孵育3min，放入Bio-rad凝胶成像系统中成像，获得清晰条带，用软件分析各组条带灰度值，并进行统计学分析。本实验重复三次以上。
11、动物实验
从广东省实验动物中心，购买SPF级环境中饲养的4周龄BALB/c裸鼠30只(每组6只，动物分为5组，具体为：模型组、Negative control siRNA处理组、siRNA高剂量组、siRNA中剂量组、siRNA低剂量组)，体重约15-17g，对裸鼠左前肢近腋窝处皮肤消毒，注射无血清培养基重悬的SiHa单细胞悬液0.1mL(约含5×106个细胞)，接种完宫颈癌细胞后在原条件下继续饲养，待裸鼠皮下出现米粒大小结节时(约1周)，表示裸鼠宫颈癌皮下异种移植瘤模型构建成功。采用电子游标卡尺测量裸鼠左前肢的皮下肿瘤，待直径在0.3-0.5cm左右时，采用随机数字表法给裸鼠编号，随机分为5组，每组6只。每天密切观察裸鼠鼠及其肿瘤的生长情况，并观察肿瘤有无红肿或者溃烂以及裸鼠的皮肤是否具有光泽、精神状态是否良好等；每2天用游标卡尺测量一次裸鼠皮下肿瘤的最大径和最小径，并计算肿瘤体积V＝0.5×A×B2(V：肿瘤体积，A：肿瘤最长径，B：肿瘤最短径)。本次实验设计给药共7天，每天给药1次。药物处理结束后，采取颈椎脱臼法处死裸鼠，然后在冰上迅速剥离皮下肿瘤，使用电子天平称量每个肿瘤的重量，接着切取部分肿瘤组织于冻存管，放入液氮中保存，用于后续的实验分析。
12、统计分析
采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，资料两组间比较采用独立t检验，多组之间的比较采用多因素方差进行分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
二、结果
1、宫颈癌发病过程中差异CircRNA表达
为了探讨circRNA在宫颈癌发病中的作用，我们采用RNA测序的方法，寻找差异circRNA。我们以差异表达倍数大于1.2为标准进行筛选，发现与癌旁组织(Paracanceroustissue，图1)相比，共有48个环状RNA具有表达，其中宫颈癌组织(Tumor tissue，图1)中表达上调的28个，表达下调的20个，其中hsa_circRNA_0001400、hsa_circ_0085362、hsa_circ_0001103、hsa_circ_0001306的表达显著升高；hsa_circ_0078398、hsa_circ_0014866、hsa_circ_0003501表达显著降低(图1)。
我们首先应用生物信息学的手段，分析RNA测序结果。Gene Ontology(GO)即基因本论，是一个重要的生物信息学分析方法和工具，用于表述基因和基因产物的各种属性。GO注释分为3个大类：生物进程(Biological Process)，细胞组成(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)，从不同角度阐释蛋白的生物学作用。我们对差异表达的circRNA在GO二级注释中的分布进行了统计。我们从生物进程(Biological Process)分类结果可以发现，这些circRNA主要通过死亡受体参与细胞凋亡信号通路(图2)；从细胞组成(Cellular Component)分类结果可以发现，这些circRNA主要属于白细胞介素复合物、蛋白激酶复合物(图3)；从分子功能(Molecular Function)分类结果可以发现，这些circRNA主要具有结合功能(图4)。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等。蛋白质结构域是指在不同蛋白质分子中重复出现的某些组分，具有相似的序列、结构和功能，是蛋白质进化的单元。结构域的长度通常在25到500个氨基酸长度之间。我们从KEGG通路富集发现，差异表达的circRNA主要调节TNF信号通路(图5)。以上结果表明，circRNA可以调节凋亡信号通路，结合下游信号分子，参与宫颈癌的发病。
2、hsa-circRNA_0001400_siRNA促进宫颈癌细胞凋亡、引起细胞周期G1期阻滞
我们的测序结果显示，hsa-circRNA_0001400是一种在肿瘤组织中高表达的circRNA。我们选取hsa-circRNA_0001400进行后续研究。我们在宫颈癌细胞系中，证实了hsa_circRNA_0001400为高表达(图6)。无限增殖和永久的细胞分裂，是肿瘤细胞的特征。抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，阻滞肿瘤细胞分裂，是抑制肿瘤生长的一种重要策略。我们采用小分子干扰手段，选用hsa-circRNA_0001400_siRNA干扰hsa-circRNA_0001400表达，采用流式细胞术分析hsa-circRNA_0001400_siRNA抗肿瘤作用。我们发现，hsa-circRNA_0001400_siRNA能明显促进宫颈癌SiHa、HeLa细胞凋亡；使SiHa、HeLa分裂停滞于细胞周期G1期(图7和图8)。
PI3K/Akt信号通路是肿瘤增殖的重要信号通路，Akt处于信号通路网络的中心位置，负责多种信号转导功能，是PI3K/Akt信号通路中的关键分子。p21在细胞有丝分裂过程中起重要作用。我们分析了hsa-circRNA_0001400_siRNA对宫颈癌细胞中Akt、p21的影响。我们的结果显示，hsa-circRNA_0001400_siRNA能抑制宫颈癌HeLa细胞中Akt的表达，上调宫颈癌HeLa细胞p21的表达(图9)。
3、hsa-circRNA_0001400、miR-326、Akt的直接相互作用
由于circRNA具有海绵作用，可以吸附microRNA，调节microRNA靶基因的功能。我们首先采用生物信息学的手段，预测了hsa-circRNA_0001400和miR-326、以及miR-326和Akt的结合位点。我们的预测结果显示，hsa-circRNA_0001400和miR-326的结合位点位于环状RNA 5’端第241位至247位；miR-326与Akt2结合的靶点位于AKT2 3'UTR区域第2224位到2234位(图10和图11)。我们接下来用荧光素酶报告基因的方法，验证了hsa-circRNA_0001400和miR-326、以及miR-326和Akt的直接相互作用。我们选用293T细胞，分别突变了环状RNA 5’端第241位至247位以及AKT2 3'UTR区域第2224位到2234位，hsa-circRNA_0001400和miR-326、以及miR-326和Akt的直接相互作用均消失(图11和图12)。
4、hsa-circRNA_0001400靶向miR-326的回复性实验(凋亡、迁移、周期+Akt)
CircRNAs具有多种生物学特性，目前研究的circRNAs作用机制主要集中在研究其对miRNA的海绵吸附功能。研究结果表明circRNAs上具有miRNAs的结合位点，通过吸附miRNAs起到miRNAs海绵的作用。circRNA含有大量miRNA应答元件(miRNA responseelement,MRE)，通过竞争性结合miRNA，阻止其与下游靶mRNA的3’UTR区域互补配对，调控mRNA基因表达。我们接下来验证hsa-circRNA_0001400对miR-326的海绵吸附功能。当hsa-circRNA_0001400被我们用hsa-circRNA_0001400_siRNA沉默后，hsa-circRNA_0001400对miR-326的海绵吸附作用被破坏，miR-326从hsa-circRNA_0001400/miR-326海绵中被释放出来，miR-326的靶基因Akt被抑制，肿瘤细胞凋亡增加(图13)、迁移被抑制(图14)、G1期细胞数目增加，细胞分裂速度减慢(图15)；当我们同时使用miR-326抑制剂时，从海绵中释放出来的游离miR-326抗肿瘤作用被抑制，又重新出现肿瘤细胞凋亡降低(图13)、细胞迁移增加(图14)、G1期细胞数目减少，细胞进入快速分裂增殖期(图15)。我们也检测了Akt的蛋白表达，发现单独使用hsa-circRNA_0001400_siRNA沉默hsa-circRNA_0001400后，Akt表达降低；当加入miR-326抑制剂后，Akt表达升高，得出了和流式细胞术一致的结论(图16)；图17、图18分别为对应实验中hsa-circ_0001400和miR-326的表达量。
5、hsa-circRNA_0001400_siRNA抑制宫颈异种移植瘤生长
肿瘤细胞源性异种移植动物模型由于该模型易于构建，肿瘤形成率高，实验周期短，在抗肿瘤药物筛选和评价中得到了广泛的应用。为了研究hsa-circRNA_0001400_siRNA对体内肿瘤的影响情况，我们利用SiHa细胞建立了BALB/c雌性裸鼠异位移植瘤模型。成功建模后，将1nM、5nM和10nM的hsa-circRNA_0001400_siRNA，对宫颈癌异种移植瘤的荷瘤小鼠连续4天瘤内注射给药，与模型组相比，10nM浓度的hsa-circRNA_0001400_siRNA治疗组小鼠肿瘤生长较慢(图19和图20)，肿瘤组织中hsa-circRNA_0001400和Akt表达降低，miR-326和p21表达增加(图21和图22)。这些结果提示hsa-circRNA_0001400_siRNA破坏了hsa-circRNA_0001400/miR-326海绵，能抑制BALB/c裸鼠宫颈癌异位移植瘤的生长(图23)。
本发明通过RNA测序，发现hsa_circRNA_0001400、hsa_circ_0085362、hsa_circ_0001103、hsa_circ_0001306的表达在肿瘤组织显著升高。我们选取hsa_circRNA_0001400进行深入研究。发现，hsa-circRNA_0001400_siRNA能明显促进宫颈癌SiHa、HeLa细胞凋亡；使SiHa、HeLa分裂停滞于细胞周期G1期；hsa_circRNA_0001400/miR-326/Akt海绵，在宫颈癌转移中起重要作用。hsa-circRNA_0001400_siRNA破坏hsa_circRNA_0001400/miR-326海绵，抑制Akt，促进肿瘤细胞凋亡、抑制宫颈癌转移。
虽然宫颈癌的主要病因是HPV感染，HPV疫苗的上市，能给宫颈癌患者带来福音。但目前HPV疫苗主要用于预防肿瘤发生，治疗性疫苗尚未上市。目前治疗手段仍然是手术、化疗为主。但是，子宫颈癌治疗后有10％～15％的患者出现复发或者转移情况，这是造成子宫颈癌治疗失败的主要原因。随着高通量测序技术的发展，大量circRNAs被发现，并证实其具有转录后调控的功能后，circRNAs逐渐受到关注。研究证实circRNAs主要通过逃避生长抑制和细胞凋亡、激活侵袭转移和血管生成、以及维持增殖信号等影响肿瘤的发生、发展和侵袭转移等。在本发明中，我们首先采用RNA测序的方法，分析了宫颈癌组织中差异表达的CircRNA。我们发现hsa_circRNA_0001400在宫颈癌组织和宫颈癌细胞中都高表达。我们用hsa-circRNA_0001400_siRNA干扰hsa-circRNA_0001400表达，采用流式细胞数分析肿瘤细胞的凋亡和周期情况，我们发现，hsa-circRNA_0001400_siRNA能明显促进宫颈癌SiHa、HeLa细胞凋亡。在SiHa细胞中，hsa-circRNA_0001400_siRNA处理后，细胞凋亡率从2.01％升高为8.71％；在HeLa细胞中，hsa-circRNA_0001400_siRNA处理后，细胞凋亡率从4.48％升高为23.26％。说明hsa-circRNA_0001400_siRNA能够促进肿瘤细胞凋亡。我们也分析了各个细胞周期中细胞的百分率。我们发现，在SiHa细胞中，hsa-circRNA_0001400_siRNA处理后，细胞周期G1期细胞从5.4％降低到4.71％；在HeLa细胞中，hsa-circRNA_0001400_siRNA处理后，细胞周期G1期细胞4.9％降低到4.6％。说明hsa-circRNA_0001400使SiHa、HeLa分裂停滞于细胞周期G1期。同时，我们也发现，hsa-circRNA_0001400_siRNA能抑制宫颈癌HeLa细胞中Akt的表达，上调宫颈癌HeLa细胞p21的表达。
一般认为，circRNA的重要功能之一是通过其结合位点负调控相应的miRNA，从而影响其下游靶点分子，即所谓海绵作用。其中最具代表性的是人类circRNA小脑退化相关蛋白1转录本(CDR1as)/ciRS-7，作为miR-7海绵，包含70多个miR-7结合位点，与miR-7结合并调控其功能，该研究首次证明circRNA具有miRNA海绵的功能。但直到2017年，也仅有数种circRNA的海绵作用得到验证。我们采用了生物信息学的工具，预测了hsa-circRNA_0001400与miR-326具有海绵作用，并且我们采用荧光素酶报告基因的方法，证实了hsa-circRNA_0001400和miR-326的结合位点位于环状RNA 5’端第241位至247位；miR-326与Akt2结合的靶点位于AKT2 3'UTR区域第2224位到2234位。我们采用了回复性实验，进一步验证hsa-circRNA_0001400/miR-326/Akt的海绵作用。当我们首先抑制hsa-circRNA_0001400后，miR-326从hsa-circRNA_0001400/miR-326海绵中被释放出来，miR-326的靶基因Akt被抑制，HeLa肿瘤细胞凋亡率从3.83％增加到15.59％，G1期细胞数量从5.41％减少到4.44％；当我们同时使用miR-326抑制剂时，从海绵中释放出来的游离miR-326抗肿瘤作用被抑制，肿瘤细胞凋亡率从15.59％减少到4.9％，G1期细胞数量从4.44％增加到5.16％。我们也检测了HeLa细胞Akt的蛋白表达，发现单独使用hsa-circRNA_0001400_siRNA沉默hsa-circRNA_0001400后，Akt表达降低，；当加入miR-326抑制剂后，Akt表达升高。说明hsa-circRNA_0001400/miR-326/Akt之间，确实存在海绵作用。我们在SiHa细胞中，也发现了类似的现象。我们在体内动物实验也验证了hsa-circRNA_0001400_siRNA对宫颈异种移植瘤的生长抑制作用。总之，我们的研究，发现了hsa-circRNA_0001400/miR-326/Akt是一种新的circRNA海绵，参与肿瘤转移过程。hsa-circRNA_0001400_siRNA能成为一种新的宫颈癌的治疗手段。
序列表
<110> 佛山市妇幼保健院
<120> hsa_circ_0001400的抑制剂及其在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aguagcagcg aaugcugaug uuu 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaucagcau ucgcugcuac uuu 23

Claims (1)

1.hsa_circ_0001400的抑制剂在制备抗宫颈癌药物中的应用；所述的hsa_circ_0001400的抑制剂为抑制hsa_circ_0001400的siRNA，其正义链：5’-AGUAGCAGCGAAUGCUGAUGUUU-3’，反义链：5’-ACAUCAGCAUUCGCUGCUACUUU-3’。
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