CN113278698B - 环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents

环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验显示环状RNAcirc0001610及其表达产物在膀胱癌组织中表达显著上调。在人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82中，敲低环状RNAcirc0001610的表达水平显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平，即下调表达环状RNAcirc0001610可以抑制膀胱癌细胞株的生长。

Description

环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。据全国肿瘤调查估计，2015新发膀胱癌病例8万例，位列新发恶性肿瘤发病率的第11位。虽然局限性膀胱肿瘤能通过外科手术切除而得以控制，但目前对于膀胱癌术后的高复发和高转移率临床仍然缺少有效的控制手段。因此，阐明膀胱癌发生发展的分子机制，寻找调控膀胱癌侵袭转移的新靶点以及针对性抗肿瘤药物开发，对于膀胱癌的综合治疗具有重要意义。
目前对膀胱癌的发病原因和进展机制所知甚少，除了常见的流行病学和遗传学因素,许多错综复杂的分子事件是导致肿瘤细胞形成、进展和转移的深层次原因。环状RNA(circular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型的非编码RNA分子，它不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构。circRNA主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，由于其具有结构稳定、难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好、组织和发育阶段特异性表达，因此有关其功能的研究备受关注，在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
膀胱癌已成为当今社会的疾病难题，早期的临床诊断和预后有利于膀胱癌的治疗，同时膀胱癌的治疗药物有待于进一步研发。因此，有必要将环状RNA与膀胱癌相结合，为膀胱癌的诊断、预后以及治疗提供新的治疗思路。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用，环状RNAcirc0001610及其表达产物在膀胱癌组织中表达显著上调。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了环状RNAcirc0001610及其表达产物在制备诊断和治疗膀胱癌药物中的应用，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供了环状RNAcirc0001610及其表达产物在制备膀胱癌临床诊断的芯片、试剂或试剂盒中的应用，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
环状RNA Circ0001610在基因组上的定位为：chr6:47251673-47254331，相应的线性基因为TNFRSF21(TNF receptor superfamily member 21)，环化序列有1147个碱基，含有2、3两个外显子序列。发明人研究发现膀胱癌组织环状RNA circ0001610在膀胱癌组织中表达显著上调，敲低其表达水平显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平。
第三方面，本发明提供了检测环状RNAcirc0001610的试剂在制备膀胱癌临床诊断的芯片或试剂盒中的应用。
优选地，所述芯片或试剂盒包括扩增环状RNAcirc0001610的特异性引物，所述特异性引物包含如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的序列。
首先通过设计的特异性引物，PCR扩增出环状RNAcirc0001610，通过一代测序的方法测定出来了环状RNA circ0001610准确的环化位点，然后通过采用荧光定量PCR的方法检测环状RNAcirc0001610基因在膀胱癌样本中的表达差异，结果显示环状RNAcirc0001610基因在膀胱癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平。
第四方面，本发明提供了环状RNAcirc0001610抑制剂在制备治疗膀胱癌的药物中的应用，环状RNAcirc0001610对应的基因序列号为TNFRSF21，所述环状RNAcirc0001610抑制剂包括抑制基因TNFRSF21表达的载体，所述载体含有基因TNFRSF21的DNA序列。
第五方面，本发明提供了一种膀胱癌的治疗药物，所述治疗药物包括环状RNAcirc0001610抑制剂。
优选地，所述治疗药物还包括药物上可接受的载体。
在上述技术方案中，药物上可接受的载体包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在很多情况下，优选的是将等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠包括在组合物中。药学上可接受的载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。
第六方面，本发明提供了一种基于环状RNAcirc0001610的特异siRNA，所述特异siRNA包括siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，所述siRNA-1由如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的序列组成，所述siRNA-2由如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列组成，所述siRNA-3由如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的序列组成。
第七方面，本发明提供了上述特异siRNA在制备诊断和治疗膀胱癌药物中的应用。
本发明基于环状RNAcirc0001610设计出特异siRNA，实验发现，在人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82中，敲低环状RNAcirc0001610的表达水平显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平，即下调表达环状RNAcirc0001610可以抑制膀胱癌细胞株的生长。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供环状RNAcirc0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用，环状RNAcirc0001610及其表达产物在膀胱癌组织中表达显著上调；本发明首先通过设计的特异性引物，PCR扩增出环状RNAcirc0001610，通过一代测序的方法测定出来了环状RNA circ0001610准确的环化位点，然后通过采用荧光定量PCR的方法检测环状RNAcirc0001610基因在膀胱癌样本中的表达差异；在人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82中，敲低环状RNAcirc0001610的表达水平显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平，即下调表达环状RNAcirc0001610可以抑制膀胱癌细胞株的生长。
附图说明
图1为采用RT-PCR证实环状RNAcirc0001610在膀胱癌组织中的表达结果图；
图2为通过一代测序鉴环状RNAcirc0001610的环化位点图；
图3为QPCR检测膀胱癌组织和细胞中环状RNA Circ0001610的表达情况图；
图4为siRNA干扰环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞增殖的影响结果图；
图5为测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞增殖水平的影响图(其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的450nm吸光值)：
图6为测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞迁移能力的影响图；
图7为测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞细胞侵袭实验的影响图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
环状RNA Circ0001610在基因组上的定位为：chr6:47251673-47254331，相应的线性基因为TNFRSF21(TNF receptor superfamily member 21)，环化序列有1147个碱基，含有2、3两个外显子序列。
环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例1、RT-PCR反应检测环状RNAcirc0001610在膀胱癌组织中的表达
具体实验方案如下：
1.RNA提取
1)组织处理：取10mg左右的膀胱癌组织加入1mlTrizol，用匀浆机匀浆；离心15分钟，12000g，取上清。
2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
3)将静置后的上清置于4℃，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA，脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
5)取上清到新的EP管内；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，置于4℃，12000g离心10分钟。
6)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起。
7)置于4℃，12000g离心10分钟，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。
8)加入适量体积(20-30ul)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
9)取出2ul定量，测量buffer:10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录(1A260＝40μg/ml,A260/A280＝1.8～2.1)。
2.cDNA逆转录
1)实验体系
M-MLV Reverse Transcriptase：
Figure BDA0003086712850000051
3.引物：设计特异的环状RNA引物为反向引物，同时设计一对正向引物做对照，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。同时检测线性基因GAPDH作为阴性对照。
使用的引物如下表1所示(如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:9所示)：
表1
hsa_circ_0001610-divergent-F GAGTCCAGACCATTGCGAGG(SEQ ID NO:2)
hsa_circ_0001610-divergent-R GTAGTTGCAAGCGGGCCT(SEQ ID NO:3)
hsa_circ_0001610-convergent-F ACAACACAAGCTCAGCAAGG(SEQ ID NO:4)
hsa_circ_0001610-convergent-R GCACAATCATCCAGGGCAAA(SEQ ID NO:5)
Has_GAPDH convergent_F GAGTCAACGGATTTGGTCGT(SEQ ID NO:6)
hsaGAPDH convergent_R GACAAGCTTCCCGTTCTCAG(SEQ ID NO:7)
hsaGAPDH divergent_F TCCTCACAGTTGCCATGTAGACCC(SEQ ID NO:8)
hsaGAPDH divergent_R TGCGGGCTCAATTTATAGAAACCGGG(SEQ ID NO:9)
4.PCR：以GAPDH作为内对照。
PCR的反应体系：每个反应管中分别加入2μl 10×Buffer，分别加入2μl dNTP，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl cDNA模板，0.2μl Taq酶，加水至20μl。PCR反应条件如下：94℃，5分钟预变性；94℃，30秒变性；55℃，30秒退火；72℃，30秒延伸；35个循环，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图1。PCR产物送上海生工公司测序，能明确检测到环化位点，结果见图2，证实环状RNACirc0001610发生环化。
实施例2、QPCR检测膀胱癌组织中环状RNA Circ0001610的表达情况
1.RNA提取：同实施例1相同；
2.cDNA逆转录：同实施例1相同；
3.QPCR扩增实验
实验体系：
Figure BDA0003086712850000061
Figure BDA0003086712850000071
1)反应条件：
第一步：95℃2min；
第二步(40个循环)：95℃3秒，60℃30秒；
第三步60–95℃溶解曲线。
2)上机进行目标基因扩增
3)qPCR相对定量结果
目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
QPCR检测膀胱癌和相应癌旁组织中，以及膀胱癌细胞系及正常膀胱上皮细胞系中环状RNA Circ0001610和GAPDH的表达水平，结果显示：QPCR检测膀胱癌组织和膀胱癌细胞系中环状RNA Circ0001610表达显著上调，见图3。
实施例3、siRNA干扰环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞增殖的影响
针对环状RNA Circ0001610的环化位点构建3条特异敲低环状RNA Circ0001610的特异siRNA。特异SiRNA由苏州吉玛基因合成，特异siRNA包括siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，所述siRNA-1由如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的序列组成，所述siRNA-2由如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列组成，所述siRNA-3由如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的序列组成。分别在5637和J82细胞中转染这三条siRNA以及阴性对照片段(NC)，转染后48小时收集细胞提取RNA进行qPCR检测，对细胞的环状RNA Circ0001610进行相对定量。
表2
Figure BDA0003086712850000072
Figure BDA0003086712850000081
QPCR检测人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82的环状RNA Circ0001610的表达水平，3条siRNA均能显著降低环状RNA Circ0001610的表达，其中siRNA-3最显著，结果见图4。
实施例4、测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞增殖水平的影响
1)处于对数生长期的人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82，转染10ul的siRNA-3以及阴性对照片段(NC)，24小时后消化成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为4×104个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为4×103个，各9孔。
2)分别在不同的时间点(24h、48h、72h)加入CCK试剂，比例为1：10，即100μl培养液加入10μl检测液。
3)37℃孵育30分钟后，酶标仪检测450nm吸光值。结果见图5，下调环状RNACirc0001610的表达，膀胱癌细胞株生长速度降低。
实施例5、测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞迁移能力的影响
1)处于对数生长期的人膀胱癌细胞5637和膀胱癌细胞J82，转染10ul的siRNA-3以及阴性对照片段(NC)，24小时后消化成单细胞悬液，计数，用无血清培养基调整细胞浓度至1×106/ml。
2)加入100μl细胞悬液至小室上室，在下室中加入600μl含不同浓度胎牛血清的完全培养基。37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
3)取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，显微镜观测并拍照，结果见图6，下调环状RNA Circ0001610的表达，膀胱癌细胞株迁移能力减弱。
实施例6、测定下调环状RNA Circ0001610的表达对膀胱癌细胞细胞侵袭实验的影 响
1)将Matrigel置于4℃中过夜溶解，用预冷的基础培养基按Matrigel：培养基＝1：3的比例稀释，取40μl加入预冷的Transwell小室中，动作要慢，避免产生气泡。
2)37℃孵育2小时使Matrigel凝固。
3)分别在上下室加入100μl和600μl基础培养基，37℃水合过夜。次日吸去培养基。
4)实验细胞胰酶消化后，取适量细胞悬液，800rpm离心5分钟。
5)吸去上清，用基础培养基重悬细胞后，细胞计数并用基础培养基调整细胞浓度至1×106/ml，取100μl加入至Transwell小室上室，在下室加入600μl完全培养基。
6)放入培养箱中培养24、48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤一次，1％结晶紫染色10分钟，PBS洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔。如有穿过，终止其他实验组，拍照并统计穿过的细胞数。结果见图7，下调环状RNACirc0001610的表达，膀胱癌细胞株侵袭能力减弱。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 环状RNA circ0001610及其表达产物在诊断和治疗膀胱癌药物中的应用
<120> 清远市人民医院
<130> 2021.05.26
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1147
<212> DNA
<213> 环状RNA circ0001610的核苷酸序列
<400> 1
cttggattcc ttagcaccac cacagctcag ccagaacaga aggcctcgaa tctcattggc 60
acataccgcc atgttgaccg tgccaccggc caggtgctaa cctgtgacaa gtgtccagca 120
ggaacctatg tctctgagca ttgtaccaac acaagcctgc gcgtctgcag cagttgccct 180
gtggggacct ttaccaggca tgagaatggc atagagaaat gccatgactg tagtcagcca 240
tgcccatggc caatgattga gaaattacct tgtgctgcct tgactgaccg agaatgcact 300
tgcccacctg gcatgttcca gtctaacgct acctgtgccc cccatacggt gtgtcctgtg 360
ggttggggtg tgcggaagaa agggacagag actgaggatg tgcggtgtaa gcagtgtgct 420
cggggtacct tctcagatgt gccttctagt gtgatgaaat gcaaagcata cacagactgt 480
ctgagtcaga acctggtggt gatcaagccg gggaccaagg agacagacaa cgtctgtggc 540
acactcccgt ccttctccag ctccacctca ccttcccctg gcacagccat ctttccacgc 600
cctgagcaca tggaaaccca tgaagtccct tcctccactt atgttcccaa aggcatgaac 660
tcaacagaat ccaactcttc tgcctctgtt agaccaaagg tactgagtag catccaggaa 720
gggacagtcc ctgacaacac aagctcagca agggggaagg aagacgtgaa caagaccctc 780
ccaaaccttc aggtagtcaa ccaccagcaa ggcccccacc acagacacat cctgaagctg 840
ctgccgtcca tggaggccac tgggggcgag aagtccagca cgcccatcaa gggccccaag 900
aggggacatc ctagacagaa cctacacaag cattttgaca tcaatgagca tttgccctgg 960
atgattgtgc ttttcctgct gctggtgctt gtggtgattg tggtgtgcag tatccggaaa 1020
agctcgagga ctctgaaaaa ggggccccgg caggatccca gtgccattgt ggaaaaggca 1080
gggctgaaga aatccatgac tccaacccag aaccgggaga aatggatcta ctactgcaat 1140
ggccatg 1147
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> hsa_circ_0001610-divergent-F
<400> 2
gagtccagac cattgcgagg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> hsa_circ_0001610-divergent-R
<400> 3
gtagttgcaa gcgggcct 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> hsa_circ_0001610-convergent-F
<400> 4
acaacacaag ctcagcaagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> hsa_circ_0001610-convergent-R
<400> 5
gcacaatcat ccagggcaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Has_GAPDH convergent_F
<400> 6
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> hsaGAPDH convergent_R
<400> 7
gacaagcttc ccgttctcag 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> hsaGAPDH divergent_F
<400> 8
tcctcacagt tgccatgtag accc 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> hsaGAPDH divergent_R
<400> 9
tgcgggctca atttatagaa accggg 26
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atggccatgc ttggattcct t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
aaggaatcca agcatggcca t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
aaggaatcca agcatggcca t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
tccaagcatg gccattgcag t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ccatgcttgg attccttagc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
tgctaaggaa tccaagcatg g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (5)

1.检测环状RNAcirc0001610表达水平的试剂在制备膀胱癌临床诊断的芯片中的应用，其特征在于，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.检测环状RNAcirc0001610表达水平的试剂在制备膀胱癌临床诊断的试剂中的应用，其特征在于，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.检测环状RNAcirc0001610表达水平的试剂在制备膀胱癌临床诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNAcirc0001610的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括扩增环状RNAcirc0001610的特异性引物；
所述特异性引物由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列组成。
5.环状RNAcirc0001610的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为特异siRNA；所述特异siRNA为siRNA-1、siRNA-2或siRNA-3，所述siRNA-1由SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的序列组成，所述siRNA-2由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列组成，所述siRNA-3由SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的序列组成。
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