CN113462780A

CN113462780A - 一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN113462780A
Application number: CN202110745376.5A
Authority: CN
Inventors: 仓顺东; 刘莉娜; 张钧硕; 李梦园; 郭燕; 万明会; 徐登飞
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113462780B

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种用于前列腺癌辅助诊断的分子标志物——LncRNA SNHG11。LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织中高表达，在癌旁正常组织中低表达；而且，LncRNA SNHG11在前列腺癌细胞系中的表达水平显著高于正常前列腺细胞株；通过敲低LncRNA SNHG11基因的表达水平，能明显抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，LncRNA SNHG11可以作为前列腺癌辅助诊断的分子标志物；通过检测样本中LncRNA SNHG11的表达水平，可以对前列腺癌进行辅助诊断，为临床医生对前列腺癌的诊断提供参考依据。

Description

一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒。

背景技术

前列腺癌(prostate cancer)是男性常见的恶性肿瘤之一，据近年来全球癌症统计数据，世界各地每年大概有130多万前列腺癌新发患者，并且有35.9万左右患者出现死亡的情况，前列腺癌已成为世界范围内男性发病率第二的恶性肿瘤，仅次于肺癌。我国前列腺癌的发病率也呈明显升高趋势，全国恶性肿瘤调查数据显示，前列腺癌的发病率为63.4％，病死率为26.6％。早期前列腺癌的治疗方式是根治性手术，但由于早期前列腺癌多无明显症状，且缺乏特异性的诊断指标，导致多数患者发现时已是中晚期前列腺癌。因此，寻找可用于前列腺癌早期精准诊断与靶标治疗的关键分子，是目前前列腺癌患者所亟需的。

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的转录产物，最初被视为一类不起作用的转录产物，现在被视为许多疾病中潜在的标志物。在人类非编码RNA中，lncRNA占有相当大的比例，与lncRNA相关联的编码基因组基因广泛存在。目前研究表明，表达失调的lncRNA参与了许多疾病(尤其是肿瘤)的发生发展，并且与预后紧密相关。绝大部分lncRNA不参与蛋白质的编码，但少数lncRNA可以编码小肽；lncRNA可以通过表观遗传学修饰，转录水平或转录后水平调节来调控多种基因的表达，并且发挥着重要的功能和作用，这使得lncRNA有可能成为癌症中潜在的诊断和预后的生物标志物以及治疗靶标。

近年来，在人类各种肿瘤中，不断有新的异常表达的lncRNA被挖掘。从目前的研究来看，lncRNA在肿瘤中的作用贯穿肿瘤的整个发生和发展的过程。既可对癌细胞的周期、凋亡、转移等产生影响，也可在表观遗传的层面上宏观调控肿瘤细胞的很多特征。lncRNA与肿瘤的发生和发展有重要关系，因此，寻找与前列腺癌发生发展密切相关的lncRNA对前列腺癌的机制研究以及临床上的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一旨在提供一种用于前列腺癌辅助诊断的分子标志物——LncRNA SNHG11；本发明的目的之二旨在提供一种LncRNA SNHG11的检测试剂在制备用于前列腺癌辅助诊断的产品中的应用；本发明的目的之三旨在提供一种用于前列腺癌辅助诊断的试剂盒；本发明的目的之四旨在提供一种抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质在制备治疗前列腺癌的药物中的应用；本发明的目的之五旨在提供一种治疗前列腺癌的药物。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种可用于前列腺癌辅助诊断的分子标志物，所述分子标志物为LncRNA SNHG11(NCBI基因ID：128439)。

通过实时荧光定量PCR检测LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织和配对的癌旁正常组织中表达情况，发现LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织中的表达水平显著高于配对的癌旁正常组织；说明LncRNA SNHG11在前列腺癌组织中均有不同程度的表达上调。

通过实时荧光定量PCR检测LncRNA SNHG11在前列腺癌细胞系DU145、PC-3、LNCaP、22RV1以及正常前列腺细胞株RWPE-1中的表达情况，发现LncRNA SNHG11在前列腺癌细胞系中的表达水平显著高于正常前列腺细胞株；说明LncRNA SNHG11在前列腺癌细胞系中均有不同程度的表达上调。

本发明第二方面提供了LncRNA SNHG11的检测试剂在制备用于前列腺癌辅助诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过实时荧光定量PCR、原位杂交、Northernblotting、芯片或高通量测序平台检测样本中LncRNA SNHG11基因的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述产品中含有扩增LncRNA SNHG11的特异性引物或与LncRNA SNHG11杂交的探针。

根据上述的应用，优选地，通过实时定量PCR检测样本中LncRNA SNHG11基因的表达水平的产品包含一对扩增LncRNA SNHG11的特异性引物。

根据上述的应用，优选地，通过原位杂交检测样本中LncRNA SNHG11的表达水平的产品包含与LncRNA SNHG11核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的应用，优选地，通过Northern blotting检测样本中LncRNA SNHG11的表达水平的产品包含与LncRNA SNHG11核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的应用，优选地，通过芯片检测样本中LncRNA SNHG11的表达水平包含与LncRNA SNHG11基因核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的应用，优选地，扩增LncRNA SNHG11基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-GGATGGCTTTGCTGGTTC-3’)和SEQ ID NO.2(5’-TGACAACTCCCATGCCTCT-3’)。

根据上述的应用，优选地，与LncRNA SNHG11基因杂交的探针的核苷酸序列如SEQID NO.3(5’-TATCCTGGAGACAGATGAC-3’)所示。

根据上述的应用，优选地，所述样本为所述样本包括(但不限于)组织、细胞、体液(血液、淋巴液)。更加优选地，所述样本为组织、血液。

根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

本发明第三方面提供了一种用于前列腺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中LncRNA SNHG11表达水平的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂包括通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LncRNA SNHG11表达水平的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，通过实时定量PCR检测LncRNA SNHG11表达水平的试剂包括一对扩增LncRNA SNHG11的特异性引物。

根据上述的试剂盒，优选地，通过原位杂交检测LncRNA SNHG11表达水平的试剂包括与LncRNA SNHG11核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的试剂盒，优选地，通过Northern blotting检测LncRNA SNHG11表达水平的试剂包括与LncRNA SNHG11核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的试剂盒，优选地，通过芯片检测LncRNA SNHG11表达水平的试剂包括与LncRNA SNHG11核苷酸序列杂交的探针。

根据上述的试剂盒，优选地，扩增LncRNA SNHG11基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-GGATGGCTTTGCTGGTTC-3’)和SEQ ID NO.2(5’-TGACAACTCCCATGCCTCT-3’)。

根据上述的试剂盒，优选地，与LncRNA SNHG11基因杂交的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3(5’-TATCCTGGAGACAGATGAC-3’)所示。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本包括(但不限于)组织、细胞、体液(血液、淋巴液)。更加优选地，所述样本为组织、血液。

本发明中，除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。本发明中，术语“引物”是指能够互补地与模板结合并使逆转录酶或DNA聚合酶能够启动模板复制的具有自由3’羟基的核酸序列。引物是具有与特定基因核酸序列互补的序列的核苷酸。

本发明第四方面提供了一种抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质在制备用于治疗前列腺癌的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA SNHG11的siRNA。

根据上述的应用，优选地，所述特异靶向LncRNA SNHG11基因的siRNA包括siRNA 1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA1正义链的序列如SEQ IDNO.4(5’-GCACUAGAGAGAGCGUCUUGU-3’)所示，siRNA 1反义链的序列如SEQ ID NO.5(5’-ACAAGACGCUCUCUCUAGUGC-3’)所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.6(5’-GGCUAUCCUGGAGACAGAUGA-3’)所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.7(5’-UCAUCUGUCUCCAGGAUAGCC-3’)所示。

本发明第五方面提供了一种抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质在如下任一中的应用：

(a1)制备用于抑制肿瘤生长的产品，或抑制肿瘤生长中的应用；所述肿瘤为前列腺癌；

(a2)制备用于抑制前列腺癌细胞增殖的产品，或抑制前列腺癌细胞增殖；

(a3)制备用于抑制前列腺癌细胞侵袭的产品，或抑制前列腺癌细胞侵袭；

(a4)制备用于抑制前列腺癌细胞迁移的产品，或抑制前列腺癌细胞迁移。

本发明第六方面提供了一种治疗前列腺癌的药物，所述药物中含有抑制LncRNASNHG11表达和/或功能的物质。

根据上述的药物，优选地，所述抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA SNHG11的siRNA。

根据上述的药物，优选地，所述特异靶向LncRNA SNHG11基因的siRNA包括siRNA 1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA1正义链的序列如SEQ IDNO.4(5’-GCACUAGAGAGAGCGUCUUGU-3’)所示，siRNA1反义链的序列如SEQ ID NO.5(5’-ACAAGACGCUCUCUCUAGUGC-3’)所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.6(5’-GGCUAUCCUGGAGACAGAUGA-3’)所示，siRNA2反义链的序列如SEQ ID NO.7(5’-UCAUCUGUCUCCAGGAUAGCC-3’)所示。

根据上述的药物，优选地，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体/辅料包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次发现LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织中表达量较癌旁正常组织显著上调，LncRNASNHG11在前列腺癌细胞系中的表达水平显著高于正常前列腺细胞株，因此，LncRNASNHG11可以作为前列腺癌辅助诊断的分子标志物；通过检测样本中LncRNASNHG11的表达水平，实现前列腺癌的早期诊断，为临床医生对前列腺癌的诊断提供参考依据。

(2)本发明还发现LncRNASNHG11与前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力相关，LncRNASNHG11能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，通过敲低LncRNA SNHG11基因对前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用；因此，通过抑制前列腺患者中LncRNA SNHG11的表达水平，可以达到治疗前列腺癌的效果。

(3)本发明提供的特异靶向LncRNA SNHG11基因的siRNA序列可以高效的抑制或敲低靶细胞中LncRNA SNHG11的表达，抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而抑制前列腺癌细胞的生长，因此，可以用于治疗前列腺癌，在前列腺癌治疗中具有重要的意义。

附图说明

图1为LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织中及其配对的癌旁正常组织中的表达水平图；

图2为LncRNA SNHG11在人正常前列腺细胞和前列腺癌细胞系中的表达水平图；

图3为LncRNA SNHG11的的敲低效率检测图；其中，A为人前列腺癌细胞系DU145，B为人前列腺癌细胞系PC-3；

图4为CCK8实验检测敲低lncRNA SNHG11后前列腺癌细胞增殖能力的结果图；其中，A为人前列腺癌细胞系DU145，B为人前列腺癌细胞系PC-3；

图5为克隆形成实验检测敲低LncRNA SNHG11后前列腺癌细胞增殖能力的结果图；其中，A为人前列腺癌细胞系DU145，B为人前列腺癌细胞系PC-3；

图6为LncRNA SNHG11对前列腺癌细胞系的细胞迁移的影响结果图；其中，A为人前列腺癌细胞系DU145，B为人前列腺癌细胞系PC-3；

图7为LncRNA SNHG11对前列腺癌细胞系的细胞侵袭的影响结果图；其中，A为人前列腺癌细胞系DU145，B为人前列腺癌细胞系PC-3。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例一：LncRNA SNHG11在前列腺癌的癌组织中及其配对的癌旁正常组织中的表达情况研究

1.样本采集：

收集60例病理组织学确诊为原发性前列腺癌患者的癌组织及相对应>3cm的癌旁正常组织样本，为防止RNA的降解，在手术切下时立即切取标本，用PBS清洗两次后放入冻存管立即置入液氮，最后转运至-80℃冰箱长期保存。60例前列腺癌患者手术前均未进行放疗和化疗，手术是首选治疗方案。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了知情同意书。

2.实验方法

采用qRT-PCR检测60例前列腺癌患者癌组织和其对应的癌旁正常组织中LncRNASNHG11的表达水平，具体操作步骤如下：

(1)总RNA抽提：

1)将采集的前列腺癌的癌组织和其对应的癌旁正常组织样品从液氮中取出，放于冰上解冻，每管按重量加入TRIzol(50～100mg组织加1mLTRIzol)，然后加入两粒小钢珠，盖紧盖子，放入多样品组织研磨机配制的架子后放入研磨机，旋紧螺丝，调整参数60Hz，1min，使组织充分研碎。

2)将研磨好的样品取出后放冰上20min，充分裂解。

3)将TRIzol消化好的组织或细胞样品对称放入4℃离心机，12000rpm，10min，4℃。

4)用RNase喷雾清除剂喷洒桌面，停留5min后纸巾擦干。取出离心机内样品，上清转移至新的标记好的1.5mL EP管，加氯仿(1mL TRIzol浸润的组织需要加入0.2mL的氯仿)，盖紧盖子剧烈震荡15s，静置5min。

5)静置结束后重新将样品入4℃离心机，12000rpm，15min，4℃。

6)离心结束后取出样品，小心将上层水相吸出到新的EP管，遵从宁少勿多原则。

7)加入等量的异丙醇，颠倒混匀15s，置于-20℃冰箱一小时以上或者过夜；

8)1h后或次日取出EP管，放入4℃离心机，12000rpm，10min，4℃(提前用无水乙醇和DEPC水配制75％的乙醇，放置冰上预冷)。

9)离心结束后弃上清，每管加入预冷好的75％乙醇1mL，盖紧盖子，轻弹管壁，使白色沉淀脱离管壁，4℃离心机内12000rpm，5min。

10)尽量将EP管内的乙醇吸干净，将管内白色沉淀晾至半透明。

11)加入50～100μL RNase free H₂O，溶解，混匀，轻柔吹打使RNA完全溶解。

12)使用NanoDrop 2000检测RNA的浓度和纯度。

(2)逆转录合成cDNA：

1)将抽提好的RNA置于冰上解冻，按浓度计算好不超过500ng的体积。

2)将镊子在酒精灯上燃烧10s左右，冷却后从饭盒里取出RNase-free的0.2毫升的PCR管。

3)取出PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)kit中的5×gDNAEraser Buffer、5×PrimeScript RT Master Mix，短暂离心，置于冰上。

4)按表1中组份配制去除基因组DNA的反应液，在冰上进行：

表1去除基因组DNA的反应液体系、

试剂	使用量
		5×gDNAEraser Buffer	4μL
gDNA Eraser	1μL
		Total RNA	*
RNase Free dH<sub>2</sub>O	up to 10μL

上机反应条件：42℃2min，4℃∞。

5)按表2中组份配制RT反应液，在冰上进行：

表2反转录反应体系

试剂	使用量
		步骤4)的反应液	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix	1μL
		RT Primer Mix	1μL
5×PrimeScript Buffer II(for Real Time)	4μL
		RNase Free dH<sub>2</sub>O	4μL
Total	20μL

6)配置好的混合液轻柔混匀后，打开PCR仪，按下列循环设置好程序，将样品逐个放进仪器中，开始反转录反应，反转录反应程序为：37℃15min，85℃5s，4℃∞，逆转录反应完后即合成cDNA，做好标记，置于-20℃保存。反应结束后及时取出RT反应液即cDNA，1:10稀释用于qPCR反应(RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系时，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量)。

(3)荧光定量检测：

以GAPDH为内参，通过Real-Time PCR反应检测前列腺癌患者癌组织和其对应的癌旁正常组织中LncRNA SNHG11的相对表达量，测定二者之间的表达差异。

LncRNA SNHG11的特异性扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GGATGGCTTTGCTGGTTC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-TGACAACTCCCATGCCTCT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH的特异性扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’；

下游引物：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。

按表3的比例配置Real-time PCR反应体系(20μL体系)。

表3 Real-time PCR反应体系

名称	体积
		FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)	10.0μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
cDNA	1μL
		dH<sub>2</sub>O	至20.0μL

两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线。上机反应条件：1.预变性：95℃30s；2.PCR反应：95℃5s，60℃30s(荧光采集)，40个循环；3.Dissociation:95℃15s，60℃30s，95℃15s。上机完后，拷贝数据，根据2^-△△CT法计算LncRNA SNHG11的相对表达量。

3.数据处理及分析：

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS 18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4.实验结果

Real-Time PCR检测了60例前列腺癌患者癌组织和其对应的癌旁正常组织中LncRNA SNHG11的表达水平，其检测结果如图1所示。由图1可知，前列腺癌癌组织中LncRNASNHG11的表达水平显著高于配对的癌旁正常组织中的表达水平，差异具有显著统计学意义(P<0.001)。由此说明，LncRNA SNHG11表达水平与前列腺癌的发生相关，并且能够作为前列腺癌的分子标志物，用于前列腺癌的临床辅助诊断。

实施例二：LncRNA SNHG11在前列腺癌细胞和正常前列腺细胞株中的表达情况研究

1.细胞选取及培养：

培养人类正常前列腺细胞株RWPE-1，前列腺癌细胞系LNCaP、22RV1、DU145、PC-3；细胞常规培养于含10％的FBS、1％的青霉素和链霉素的1640细胞培养基中，其中RWPE-1用KM培养基，PC-3用F-12K培养基，而非1640培养基，五种细胞在37℃、5％CO₂以及饱和湿度的条件下培养。细胞每2天换液，按1:3传代。

2.实验方法：

采用qRT-PCR检测前列腺癌细胞和正常前列腺细胞株中LncRNA SNHG11的表达水平，具体操作步骤如下：

(1)细胞RNA提取：

采用TRIzo1法提取细胞总RNA。

收集对数期的细胞，加入1mL TRIzo1，混匀；用1mL注射器反复抽取以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min，剩余步骤同实施例一，在此不再赘述。

(2)逆转录合成cDNA：

逆转录合成cDNA的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。

(3)荧光定量检测：

荧光定量检测的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。

3.数据处理分析

所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student'st检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Prism 6Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05时认为具有显著统计学意义。

4.实验结果

qRT-PCR检测前列腺癌细胞和正常前列腺细胞株中LncRNA SNHG11基因的表达水平，其检测结果如图2所示。由图2可知，与前列腺正常细胞RWPE-1细胞相比，LncRNA SNHG11基因在前列腺癌细胞株DU145、PC-3、LNCaP、22RV1表达显著升高，说明LncRNA SNHG11基因在前列腺癌细胞中表达水平显著上调。

其中，其中，以DU145、PC-3细胞中LncRNA SNHG11基因的表达水平较高，因此，选择DU145、PC-3细胞系作为工具细胞用于后续的实验研究。

实施例三：LncRNA SNHG11基因的敲除

1.细胞培养：

人前列腺癌细胞系DU145、PC-3，分别以含10％胎牛血清和1％的青霉素和链霉素的1640细胞培养基和F-12K培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。细胞每2天换液1次，采用以消化酶进行消化传代。

2.siRNA设计

针对LncRNA SNHG11基因的siRNA序列：

阴性对照siRNA(记作siNC)序列：

siNC的正义链为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；

siNC的反义链为：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

siRNA 1：

siRNA 1的正义链为：5’-GCACUAGAGAGAGCGUCUUGU-3’(SEQ ID NO.4)；

siRNA 1的反义链为：5’-ACAAGACGCUCUCUCUAGUGC-3’(SEQ ID NO.5)。

siRNA 2：

siRNA 2的正义链为：5’-GGCUAUCCUGGAGACAGAUGA-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA 2的反义链为：5’-UCAUCUGUCUCCAGGAUAGCC-3’(SEQ ID NO.7)。

3.细胞转染：

根据转染试剂Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)说明书转染细胞。具体步骤如下：

(1)将细胞按2.0×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，使细胞融合度达到50％，转染前更换新鲜培养基1.8mL。

(2)转染：提前将Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)从4℃冰箱取出，将siNC、siRNA 1、siRNA 2从-20℃冰箱取出，放在冰上溶解，提前准备好EP管，并做好标记，每个EP管中分别加入150μL Opti-MEM培养基。

1)siRNA组：

a、将5μL siRNA加入含有150μL Opti-MEM培养基的EP管中(①号管)；

b、将5μL Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)加入含有100μL Opti-MEM培养基的EP管中(②号管)；

c、将①号管中的液体用移液枪全部吸出，加入到②号管中，室温孵育5min；

d、然后用移液枪将②号管中的液体全部吸出，均匀滴入10cm皿中，摇晃混匀，将10cm皿放回37℃温箱继续培养。

2)阴性对照组(siNC组)：

a、将5μL siNC加入含有150μL Opti-MEM培养基的EP管中(③号管)；

b、将5μL Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)加入含有100μL Opti-MEM培养基的EP管中(④号管)；

c、将③号管中的液体用移液枪全部吸出，加入到④号管中，室温孵育5min；

d、然后用移液枪将④号管中的液体全部吸出，均匀滴入10cm皿中，摇晃混匀，将10cm皿放回37℃温箱继续培养。

4.qRT-PCR检测LncRNA SNHG11的表达水平：

(1)细胞RNA提取：

细胞RNA提取的具体操作与实施例二相同，在此不再赘述。

(2)逆转录合成cDNA：

(3)荧光定量检测：

5.实验结果：

实验结果如图3所示。由图3可知，与阴性对照组相比，转染siRNA的实验组的LncRNA SNHG11的表达水平显著下调。

实施例四：LncRNA SNHG11对前列腺癌细胞的细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1、CCK8检测细胞增殖实验

(1)细胞培养：

细胞培养的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。

(2)细胞转染：

细胞转染的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。

(3)CCK8检测细胞增殖

1)实验分为3组，分别为阴性对照组(siNC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设4个复孔。

2)转染后的DU145细胞和PC-3细胞培养72h，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，DU145细胞数为8×10³个/mL，PC-3细胞数为1.0×10⁴个/mL，每孔加100μL；

3)避光条件下，96孔板中每孔加入10μL的CCK8试剂，晃动培养板1min，然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。

(4)实验结果

CCK8检测细胞增殖的实验结果如图4所示。由图4可知，与阴性对照组(siNC组)相比，转染siRNA 1和siRNA 2的实验组细胞增殖受到明显的抑制(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA SNHG11对DU145细胞和PC-3增殖能力有明显的抑制作用。

2、克隆形成实验

(1)细胞培养：

细胞培养的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。

(2)细胞转染：

细胞转染的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。

(3)克隆形成实验

1)实验分为3组，分别为阴性对照组(siNC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设3个复孔。

2)转染后的DU145细胞和PC-3细胞培养72h，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于6孔板中，DU145每孔铺1500个细胞，PC-3每孔铺1500个细胞，每组设置3个重复孔，每孔先加入2mL完全培养基，再根据计数浓度计算出每组需要的细胞量体积，对应加入相应孔中，混匀后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天左右换一次液，2周左右形成了肉眼可见的细胞集落。

3)去除培养基，用PBS清洗一次，每孔加入1mL预冷4％多聚甲醛PBS固定15min，固定完后，去除固定液，加入0.5％结晶紫染色20min以上，染色完后，去除结晶紫，用清水轻轻冲洗残余结晶紫，晾干后，置于明亮光线下用摄像机进行拍照。

(4)实验结果

实验结果如图5所示，与阴性对照组(siNC组)相比，转染siRNA 1和siRNA 2的实验组细胞增殖受到明显的抑制(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA SNHG11对DU145细胞和PC-3细胞增殖能力有明显的抑制作用。

3、Transwell小室迁移和侵袭实验

通过检测目的细胞在Transwell小室中向含血清培养基的迁移情况来验证目的基因对细胞迁移能力的影响。

(1)实验方法：

1)、无菌条件下Matrigel冰浴融化后用无血清1640培养基按1:7比例稀释Matrige1胶(迁移实验无需铺胶，侵袭实验需铺胶)，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后将再有Transwell孔的24孔板平移入37℃的细胞培养箱中温育或室温放至水平处至其凝固成胶状。

2)、实验分为3组，分别为阴性对照组(siNC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设3个复孔，上室加入细胞数量为5×10⁴个细胞不含血清的细胞悬液(迁移实验)、1×10⁵个细胞不含血清的细胞悬液(侵袭实验)，下室加入700μL含10％胎牛血清培养基，37℃下恒温培养箱内培养48h。

3)、取出Transwell小室，PBS清洗3遍，使用4％多聚甲醛固定30min后用PBS洗3遍，加入结晶紫染色8～12min后显微镜下观察着色强度，弃掉结晶紫溶液，用纯净水清洗，放入荧光显微镜下观察拍照并计数。

(2)数据处理及分析：

所有数据采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Prism 5Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05为差异有统计学意义。

(3)实验结果：

Transwell小室细胞迁移实验的检测结果如图6所示。由图6可知，与阴性对照组(siNC组)相比，转染siRNA 1、siRNA 2的实验组细胞迁移能力明显降低(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA SNHG11对前列腺癌细胞DU145和PC-3的迁移能力有明显抑制作用。

Transwell小室细胞侵袭实验的检测结果如图7所示。由图7中可知，与阴性对照组(siNC组)相比，转染siRNA 1、siRNA 2的实验组细胞侵袭能力明显降低(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA SNHG11对前列腺癌细胞DU145和PC-3的侵袭能力有明显抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省人民医院

<120> 一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatggcttt gctggttc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgacaactcc catgcctct 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tatcctggag acagatgac 19

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacuagaga gagcgucuug u 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaagacgcu cucucuagug c 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcuauccug gagacagaug a 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ucaucugucu ccaggauagc c 21

Claims

1.LncRNA SNHG11的检测试剂在制备用于前列腺癌辅助诊断的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测样本中LncRNA SNHG11的表达水平。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中含有扩增LncRNA SNHG11的特异性引物或与LncRNA SNHG11杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增LncRNA SNHG11的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；与LncRNA SNHG11基因杂交的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本包括组织、细胞、体液；所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

6.抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质在制备用于治疗前列腺癌的产品中的应用。

7.抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质在如下任一中的应用：

（a1）制备用于抑制肿瘤生长的产品，或抑制肿瘤生长中的应用；所述肿瘤为前列腺癌；

（a2）制备用于抑制前列腺癌细胞增殖的产品，或抑制前列腺癌细胞增殖；

（a3）制备用于抑制前列腺癌细胞侵袭的产品，或抑制前列腺癌细胞侵袭；

（a4）制备用于抑制前列腺癌细胞迁移的产品，或抑制前列腺癌细胞迁移。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA SNHG11的siRNA。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述特异靶向LncRNA SNHG11基因的siRNA包括siRNA 1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA 1正义链的序列如SEQ ID NO.4所示，siRNA 1反义链的序列如SEQ ID NO.5所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.6所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.7所示。

10.一种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述药物中含有抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质；所述抑制LncRNA SNHG11表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNASNHG11的siRNA。