CN109628592B - 甲状腺癌相关标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GGTLC3和LINC02560基因在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用，所述药物靶向GGTLC3和LINC02560基因；以及提供一种治疗甲状腺癌的siRNA分子，所述的siRNA分子包括抑制GGTLC3和LINC02560基因表达的siRNA。本发明发现了一种与甲状腺癌相关的分子标记物GGTLC3和LINC02560，以及该标志物的抑制剂在制备治疗甲状腺癌药物中应用；本发明为临床治疗甲状腺癌提供了新的思路，为研究甲状腺癌的基因治疗提供了新的方向。

Description

甲状腺癌相关标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及甲状腺癌相关标志物及其应用。
背景技术
甲状腺是人体内重要的内分泌器官，分泌控制心率、血压、体温和体重等与代谢相关的激素。甲状腺癌(thytoid carcinoma，TC)是由甲状腺滤泡细胞发展而成的一种常见的头颈部恶性内分泌系统肿瘤，约占全身恶性肿瘤发病总数的3％，占头颈部恶性肿瘤发病的首位，多发于青壮年，常见于45-54岁的人群中，45岁以上高发，女性多见，男女发病比例约1:3。近年来甲状腺癌的发病呈现上升的趋势，2012年，美国约有四万多名女性和一万多名男性确诊为甲状腺癌，甲状腺癌的发病率上升至恶性肿瘤发病率从的第5位；在中国，甲状腺癌发病亦呈现出逐年增加的趋势，且为近20年来中国癌症谱中女性恶性肿瘤上升速度最快的肿瘤。甲状腺癌在各地均具有较高的发病率，其已经成为最常见并且发病率快速上升的恶性肿瘤之一，其组织学类型主要包括乳头状癌(PCT)，滤泡状癌(FTC)，髓样癌(MTC)和未分化癌(ATC)。其中乳头状癌是甲状腺癌中最常见的病理类型，约占60％～80％。虽然绝大多数甲状腺癌能通过手术和碘治疗获得治疗，但仍有10％～20％病人因低分化和进展性肿瘤而死亡。甲状腺髓样癌和未分化癌的愈后更差。放疗和化疗对于甲状腺癌的疗效都较差，甚至无作用。
甲状腺癌的临床体征以结节坚硬不平整为主要表现，同时伴有颈部淋巴结肿大，患者常感颈部压迫症状，甲状腺癌早期临床症状不明显，病程进展缓慢，患者多无自觉症状，疾病晚期可出现多种症状，包括声音嘶哑、吞咽困难以及耳、颈、肩等处疼痛的表现。
随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对甲状腺癌发病机制认识不断深入，人们对甲状腺癌生物学行为的分子机制进行研究的工作日渐深入。基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分，在甲状腺癌的治疗中显示出良好的应用价值，并且取得了一定效果，日渐成为一项有前景的治疗选择。研究者希望能够找到协助诊断、治疗、甚至判断预后的肿瘤标志物，为临床寻求新的有效地甲状腺癌治疗靶点和新的治疗策略提供依据。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断或治疗甲状腺癌的分子标志物GGTLC3和LINC02560以及其在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
首先，本发明提供了GGTLC3和LINC02560基因在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用，所述药物靶向GGTLC3和LINC02560基因。
优选的，所述GGTLC3和LINC02560基因在甲状腺癌组织或细胞中表达上调。
进一步地，本发明提供了GGTLC3和LINC02560的抑制剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。
优选的，所述的抑制剂选自以GGTLC3和LINC02560转绿本为把序列、且能够抑制其基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步地，本发明提供一种治疗甲状腺癌的药物，所述药物的主要活性成分为GGTLC3和LINC02560的抑制剂；所述药物还包括药学上可接受的载体。
本发明所述药物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。
本发明的药物还可以与其他治疗甲状腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
进一步地，本发明还提供了GGTLC3和LINC02560的抑制剂在制备试剂中的应用，所述试剂用于抑制甲状腺癌细胞增殖；
所述的抑制剂选自以GGTLC3和LINC02560转绿本为把序列、且能够抑制其基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
优选的，所述的siRNA序列如SEQID NO.7-8和SEQID NO.9-10所示。
更进一步地，本发明提供了一种治疗甲状腺癌的siRNA分子，所述的siRNA分子包括抑制GGTLC3和LINC02560基因表达的siRNA。
优选的，所述抑制GGTLC3基因表达的siRNA序列如SEQID NO.7和SEQID NO.8所示；所述抑制LINC02560基因表达的siRNA序列如SEQID NO.9和SEQID NO.10所示。
再进一步地，本发明提供了GGTLC3和LINC02560基因在筛选预防或治疗甲状腺癌的候选药物中的应用，所述候选药物能降低细胞或组织中GGTLC3和LINC02560基因表达水平。
优选的，所述筛选候选药物的步骤如下：
(1)用候选物质处理甲状腺癌细胞样本；
(2)检测细胞样本中GGTLC3和LINC02560基因的表达情况；
(3)结果判定：候选物质能降低GGTLC3和LINC02560基因的表达，则表明该候选物质是预防或治疗甲状腺癌的候选药物。
优选的，所述甲状腺癌细胞包括SW579细胞、FRO细胞、TPC-1细胞。
优选的，所述甲状腺癌细胞为SW579细胞。
优选的，所述步骤(2)中检测的方法包括实时荧光定量PCR法；所述检测GGTLC3和LINC02560基因表达所用的引物如SEQID NO.1-2和SEQID NO.3-4所示。
有益效果
本发明首次发现了GGTLC3和LINC02560基因表达与甲状腺癌相关；运用siRNA技术敲低甲状腺癌细胞株中GGTLC3和LINC02560表达后，甲状腺癌细胞出现了细胞增殖下降，因此可设计合成针对GGTLC3和LINC02560靶基因的药物用于治疗甲状腺癌；本发明还公开了一种GGTLC3和LINC02560基因的抑制剂-siRNA在制备治疗甲状腺癌药物中应用；本发明为临床治疗甲状腺癌提供了新的思路，为研究甲状腺癌的基因治疗提供了新的方向。
附图说明
图1GGTLC3(A)和LINC02560(B)在甲状腺癌患组织中的表达水平；
图2siRNA转染甲状腺癌细胞后，GGTLC3和LINC02560基因的表达情况；
图3siRNA转染甲状腺癌细胞后，甲状腺癌细胞增殖情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明对甲状腺癌组织样本及癌旁组织样本的RNA进行转录组测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选GGTLC3和LINC02560基因，现有研究中并没有GGTLC3和LINC02560与甲状腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了GGTLC3和LINC02560在甲状腺癌组织或细胞中表达上调。并通过RNAi干扰技术，敲低甲状腺癌细胞中的GGTLC3和LINC02560表达后，发现甲状腺癌细胞增殖受到了抑制作用。
本文使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过甲状腺癌分期确定与甲状腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患甲状腺癌或通过甲状腺癌分期确定的甲状腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平增加。根据本发明，“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高的表达增加，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高或者高于1倍，最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。
本实验数据资料应用SPSS 20.0统计软件进行分析，各组数据以
Figure BDA0001915806620000052
表示，采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1筛选与甲状腺癌相关的基因标志物
1、样本收集
取2014年10月到2018年1月期间在北京潞河医院内分泌科手术中获得组织标本25例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、甲状腺癌标本17例，编号后置-80℃低温冰箱保存。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、对组织样本进行总RNA提取
采用
Figure BDA0001915806620000051
Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，发明人对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献发明人筛选了差异表达基因GGTLC3和LINC02560，所述基因在甲状腺癌组织样本中表达上调。
实施例2Real-Time PCR验证甲状腺癌组织及癌旁组织GGTLC3和LINC02560表达情况
1、材料
选取甲状腺癌组织样本21例及癌旁组织样本8例，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。
2、方法
2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用
Figure BDA0001915806620000071
III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。
2.3Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用primerpremier5.0引物设计软件，GGTLC3(ENSG00000274252)和LINC02560(ENSG00000268307)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表1引物序列
Figure BDA0001915806620000081
操作过程如下：
表2Real Time反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
反应体系：用Power
Figure BDA0001915806620000082
Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
2.3.3样品Real Time-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
3、实验结果
根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较GGTLC3和LINC02560在甲状腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中GGTLC3和LINC02560在甲状腺癌患组织中的表达水平为癌旁组织的4-6倍(如图1)，以上结果验证了转录组测序数据的GGTLC3和LINC02560在甲状腺癌患者中表达上调的结果。
实施例3RNAi干扰GGTLC3和LINC02560表达及对甲状腺癌细胞的影响
一、材料
1、细胞来源
甲状腺癌SW579细胞株购自美国ATCC公司。
2、siRNA设计与合成
依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据GGTLC3(ENSG00000274252)和LINC02560(ENSG00000268307)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。
表3siRNA序列列表
Figure BDA0001915806620000091
二、实验方法
1、实验分组
空白对照组；转染脂质体组；转染非特异性的siRNA-NC组；转染特异性的GGTLC35-siRNA或LINC02560-siRNA组。
2、转染
按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。
(1)甲状腺癌细胞系SW579培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在饱和湿度，37℃，5％CO2孵育箱中培养至细胞融合到80％左右，进行传代。
(2)将对数生长期的SW579细胞用胰酶消化，将5x104细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；
(3)准备siRNA-LipofectamineTM 2000复合物:
a.以250μL Opti-MEM稀释5μL LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
b.实验各组分别取7.5μL siRNA加入250μL Opti-MEMI中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；
c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟。
(4)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；
(5)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；
(6)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量x100％
3、应用Real-time PCR方法检测转染前后GGTLC3和LINC02560表达的变化
提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进GGTLC3和LINC02560和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次。
三、实验结果
分别用GGTLC3和LINC02560的siRNA及对照siRNA转染甲状腺癌细胞，结果显示在大量甲状腺癌细胞内发现绿色荧光，证明甲状腺癌细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察甲状腺癌细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到70％以上。
Real-time PCR结果如图2所示，转染非特异性的siRNA-NC组对甲状腺癌细胞中GGTLC3和LINC02560表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异；转染的GGTLC3-siRNA和LINC02560-siRNA组都分别对甲状腺癌细胞中GGTLC3和LINC02560表达起到抑制作用(p<0.05)。
实施例4CCK-8法检测甲状腺癌细胞的增殖抑制情况
细胞分组：甲状腺癌细胞加非特异性的siRNA组、甲状腺癌细胞加GGTLC3-siRNA或LINC02560-siRNA组。
取对数增殖期细胞配置成1×104/mL单细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测定其450nm波长吸光度值作为零点。之后分别在12、24、48和72小时节点上，每孔加入CCK-8试剂10μL温育2h后，酶标仪测定细胞吸光度值，绘制细胞生长。
结果如图3所示，甲状腺癌细胞中GGTLC3和LINC02560表达受siRNA抑制后，细胞增殖速度变慢。差异具有统计学意义(P<0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 思泰得精准（北京）医学检验实验室有限公司
<120> 甲状腺癌相关标志物及其应用
<130> p18132
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcggagatct tcacaatgcg g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
taagaaagcg ccagggtcg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccaacctcag ggagcagatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gaatggcgga acccgaaaac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
uaacaacugg cuuuugcucu g 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gagcaaaagc caguuguuau g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aagagaaaga ggagauuggc u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccaaucuccu cuuucucuuc u 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
uuaaugacgu ccuugauggg c 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccaucaagga cgucauuaag a 21

Claims (5)

1.GGTLC3抑制剂和/或LINC02560抑制剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用，所述的抑制剂选自以GGTLC3或LINC02560转录本为靶序列、且能够抑制其基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
2.GGTLC3抑制剂和/或LINC02560抑制剂在制备试剂中的应用，其特征在于，所述试剂用于抑制甲状腺癌细胞增殖；
所述的抑制剂选自以GGTLC3或LINC02560转录本为靶序列、且能够抑制其基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制GGTLC3基因转录的siRNA序列如SEQID NO.7-8所示，所述抑制LINC02560基因转录的siRNA序列如SEQID NO.9-10所示。
4.GGTLC3和LINC02560基因在筛选预防或治疗甲状腺癌的候选药物中的应用，所述候选药物包括抑制GGTLC3基因的siRNA和/或抑制LINC02560基因的siRNA，所述siRNA能降低细胞或组织中GGTLC3或LINC02560基因表达水平。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因表达水平是通过实时荧光定量PCR法检测的，所述检测GGTLC3表达所用的引物如SEQID NO.1-2所示，所述检测LINC02560基因表达所用的引物如SEQID NO.3-4所示。
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