CN110946872B

CN110946872B - miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN110946872B
Application number: CN201911392228.9A
Authority: CN
Inventors: 何劲松; 韦伟; 李锋; 刘宝儿; 高睿; 阳莉萍
Original assignee: Peking University Shenzhen Hospital
Current assignee: Peking University Shenzhen Hospital
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110946872A

Abstract

miR‑4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。本发明提供了一种miRNA标记物，该miRNA标记物是miR‑4491。本发明利用NCBI GEO数据检索出符合要求的乳腺癌miNRA数据集和乳腺癌mRNA数据集，对上述数据集进行分析，筛选到一种与乳腺癌密切相关的miRNA‑miR‑4491。miR‑4491可用于判断乳腺癌发生风险。经检验证明，miR‑4491可有效区分乳腺癌样本与正常样本。在此基础上，miR‑4491还可以用于制备抑制乳腺癌增殖或侵袭的药物。本发明为乳腺癌的分子机理研究提供了新的思路，同时为临床在分子水平上诊断乳腺癌发生转移提供了新的诊断方法，并为乳腺癌治疗提供新的药物靶点。

Description

miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率、死亡率逐年递增，远高于全国平均增长水平，且发病年龄呈现年轻化趋势(高发年龄段比世界平均发病年龄提前了10岁)，为威胁女性健康的头号杀手。手术是目前治疗乳腺癌最有效的手段，然而，相当一部分患者诊断时已经处于中晚期，不能通过根治性手术治愈。虽然曲妥珠单抗的出现对乳腺癌患者治疗产生了革命性的影响，但是对其HER2阴性的患者无效。由于大部分乳腺癌缺乏针对性治疗靶点，目前临床上多采用传统手段进行干预，不能有效地降低其复发、转移及死亡风险，给家庭社会带来沉重负担。因此，进一步阐明乳腺癌的发病机制，寻找新的治疗靶点，对提高乳腺癌治疗、改善患者预后具有极其重要作用。

microRNA(miRNA)是一类长度21～25个核苷酸的小分子RNA。通过与mRNA 3’非翻译区互补结合，在转录后水平抑制靶基因的表达。mi RNA在肿瘤多个阶段发生过程中具有独特的表达特征和生物学功能，且具有分子小、检测途径及方式多样、灵敏度高、易于体外合成及给药等特点，在肿瘤分子诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对解决上述技术问题，提出一种抑制乳腺癌发生、转移的含有miRNA的药物组合物，为临床早期预防或治疗乳腺癌提供可能。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明通过比较正常癌旁组织及细胞和乳腺癌组织及细胞中miR-4491的表达，并通过将miR-4491转染到乳腺癌细胞中，观察促进miR-4491对乳腺癌细胞增殖侵袭的影响，进而探讨其自乳腺癌发生发展过程中的作用机制。

本发明首先提供了miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

在某些具体实施方式中所使用的是成熟miR-4491，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA(pi-miR-4491)、前体miRNA(pre-miR-4491)将可以获得与成熟miR-4491同样的技术效果，因为细胞有进一步将初始miRNA(pi-miR-4491)、前体miRNA(pre-miR-4491)加工为成熟miR-4491的能力。

优选的，所述成熟miR-4491的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述miR-4491在乳腺癌患者中表达降低。

优选的，所述应用包括制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物。

优选的，包括将miR-4491与载体结合后与抗肿瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。

优选的，所述载体为慢病毒表达载体、脂质体或壳聚糖。

进一步地，本发明提供miR-4491在制备抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移能力的药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含miR-4491或具有其生物活性的类似物，以及药学上可接受的载体。

更进一步地，本发明提供了用于乳腺癌诊断或预后的试剂盒，包含特异性扩增miR-4491的引物和说明书。

优选的，所述特异性扩增miR-4491基因的引物包括序列为SEQ ID NO:2的反转录引物，以及序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。

优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

有益效果

本发明首次发现了miR-4491表达水平与乳腺癌的发生发展相关，通过检测受试者miR-4491的表达水平，可以判断受试者是否患有乳腺癌的风险，并开发诊断乳腺癌发生风险的试剂盒，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

进一步发明人还提供miR-4491模拟物，并提供miR-4491模拟物在制备抑制乳腺癌增殖、侵袭或者预防乳腺癌增殖、侵袭的药物中的应用。

附图说明

图1qPCR检测miR-4491在正常对照和乳腺癌组织的表达；

图2为miR-4491分别在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10a(对照)中的相对含量；

图3为miR-4491对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

统计学处理:数据以

表示，采用SPSS 13.0统计软件，采用t检验，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

实施例1 芯片筛选与乳腺癌密切相关的miRNA

构建检索词("Breast cancer"AND AND"Homo sapiens"[Organism])，从GEO(GeneExpression Omnibus)数据库筛选得到mRNA数据集(GSE86374)和miRNA数据集(GSE57897)。在miRNA数据中进行比对筛选(筛选条件：p.value<0.05&/logFC/>2)，共得到19个miRNA，其中14个上调miRNA，5个下调miRNA，mRNA芯片筛选标准为：p.value<0.05&/logFC/>0.5，共筛选得到395个mRNA，其中75个上调mRNA，320个下调mRNA。

选用2个miRNA数据库(RNA22和miRDB)预测靶向mRNA，利用Cytoscape软件构建由乳腺癌差异表达miRNA及差异表达靶基因组成的生物信息网络图。

对差异表达的基因进行GO功能富集和KEGG通路富集。KEGG通路富集的结果显示这些差异主要集中在细胞周期、细胞凋亡、细胞通讯、转录调控等信号通路。

基于乳腺癌疾病mRNA、miRNA表达数据整合分析结果，发明人可以明确乳腺癌组织的miR-4491表达水平低于正常乳腺组织。

实施例2 qPCR验证差异表达的miR-4491

1、样本

乳腺癌组织来源：从北京大学深圳医院收集乳腺癌患者的配对的癌与癌旁组织样本(n＝8)。

2、乳腺癌组织及癌旁组织RNA提取过程

向组织中加入液氮，充分研磨成粉末，加入Trizol，静置5min；加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀，室温下静置5-10min；4℃、12000rpm高速离心15min后小心吸取上清液移入新的1.5ml离心管，加入等体积的-20℃异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；4℃、12000rpm高速离心15min后，弃上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇(4℃保存)，4℃、12000rpm离心沉淀5min；弃上清，将沉淀室温晾干后加入适量DEPC处理过的水充分溶解；Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280比值在1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、逆转录

将1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μl特异性RT引物(5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTGGT-3’；即SEQ ID NO:2)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

4、qPCR反应

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI网站给出的序列：miR-4491，内参选snRNA U6，引物设计后由上海生工合成。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒操作，具体步骤按说明书进行操作，采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应重复均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green Mix 12.5μl，正向引物(5’-CGCGAATGTGGACTGGTGTG-3’，即SEQ ID NO:3)(5μM/μl)1μl，反向引物(5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，即SEQ ID NO:4)(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。以SYBR Green I作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与正常对照组相比，乳腺癌组织中miR-4491的表达水平显著降低，与实施例1中miRNA数据集整合分析结果一致。

实施例3 miR-4491在乳腺癌细胞系中的表达

1、细胞培养

将乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人正常乳腺上皮细胞MCF-10a(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，置于DMEM培养液中于37℃、5％CO₂培养箱中。

2、qPCR

利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。qPCR步骤同实施例2。

3、结果

如图2所示，在乳腺癌细胞系中，miR-4491的表达水平均明显低于正常细胞(P<0.05)。

实施例4 miR-4491mimics对miR-4491表达的促进作用

1、miR-4491mimics转染MDA-MB-231

将MDA-MB-231细胞分为三组，分别为未转染组、阴性对照组(转染阴性对照miRNA)、miR-4491模拟物组(转染miR-4491mimics)。运用转染试剂Lipofectamine TM 2000进行转染，转染方法参照说明书。阴性对照miRNA和miR-4491mimics的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

3、qPCR实验

提取细胞总RNA，进行PCR检测。结果表明与阴性对照组相比，miR-4491模拟物组的miR-4491的表达水平显著上调，提示转染成功。

实施例5 miR-4491对MDA-MB-231细胞增殖的影响

实验设置未转染组、阴性对照组、miR-4491模拟物组，每组设置3个复孔。分别于转染后24、48、72、96h进行检测，每孔加入20μl MTT试剂，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h后，每孔加入150μl DMSO溶解，震荡过夜，酶标仪测定570nm波长处光密度值。

结果显示如表1所示，与阴性对照组比较，随着作用时间延长，转染miR-4491模拟物的细胞的增殖能力逐渐减弱(P<0.05)。结果说明，miR-4491可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖。

表1转染miR-4491后乳腺癌细胞的增殖情况(吸光度)

组别	24h	48h	72h	96h
					未转染组	0.367±0.021	0.687±0.113	1.412±0.117	1.896±0.121
阴性对照组	0.347±0.023	0.692±0.113	1.365±0.042	1.856±0.060
					miR-4491模拟物	0.305±0.012	0.487±0.015	0.895±0.048	1.322±0.081

实施例6 研究miR-4491对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

MDA-MB-231细胞转染48h进行实验。实验前1d将基质胶与无血清培养基按1:8稀释后铺于培养小室上(60μl)，风干后待用。调整细胞密度为1x10⁶个/mL，每孔中加入0.2％BSA的无血清细胞悬液200μl，其下层孔板中加入完全培养基1300μl，置于37℃、5％CO₂孵箱培养24h后用70％甲醇固定，0.4％结晶紫染色，封片后随机选取4个视野计数。

结果显示(图3)，miR-4491模拟物组(miR-4491mimics)细胞降解基质胶并且迁出的数量较阴性对照组明显减少了50％(P<0.05)。表明促进miR-4491表达后，乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力明显减弱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京大学深圳医院

<120> miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

<130> P190390

<141> 2019-12-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-4491

<400> 1

aauguggacu ggugugacca aa 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactttggt 50

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgcgaatgtg gactggtgtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

agtgcagggt ccgaggtatt 20

Claims

1.miR-4491在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，所述miR-4491在乳腺癌患者中表达降低，所述应用包括制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物，所述miR-4491的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括将miR-4491与载体结合后与抗肿瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为慢病毒表达载体、脂质体或壳聚糖。