CN112359115B - 与肿瘤细胞顺铂耐药性相关的miR-517a-3p及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与肿瘤细胞顺铂耐药性相关的miR‑517a‑3p及其应用；本发明还公开了一种检测肿瘤细胞对顺铂耐药性程度的试剂盒。本发明通过建立SK‑OV‑3/DDP耐药细胞株发现miR‑517a‑3p可以作为肿瘤细胞耐药性的标志物；miR‑517a‑3p在SK‑OV‑3/DDP细胞对DDP耐药中发挥着一定的作用，通过下调miR‑517a‑3p能逆转SK‑OV‑3/DDP细胞对DDP耐药；并且能抑制卵巢癌SK‑OV‑3/DDP细胞的增殖速度，同时也抑制其克隆行成能力。从而为寻找新的分子治疗靶标，指导临床用药，并更加有效对抗顺铂耐药提供科学的依据。

Description

与肿瘤细胞顺铂耐药性相关的miR-517a-3p及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及与肿瘤细胞顺铂耐药性相关的miR-517a-3p及其应用。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)是一类常见的、严重危害人类生命健康的疾病，据世界卫生组织公布的数据显示，每年全球有大约1270万新发癌症病例，并有约760万人死于癌症，预计新发和死亡病例将继续上升，到2030年每年死于癌症的人数将有超过1310万。癌症的常规治疗手段包括外科手术、化学治疗和放射治疗。化学治疗也被人们称为药物治疗，在癌症治疗中一直发挥着重要作用，但是其治疗效果却受到其剂量依赖性毒性的影响，目前药物治疗的效果已经进入平台期。分子靶向治疗指以癌症相关分子作为靶点，将药物、抗体等有效成分靶向定位于癌细胞及相关成分，从而达到治疗癌症的目的。分子靶向治疗具有定向、定位的优势，可以减少用药剂量，提高治疗效果，减少毒副反应，正成为全世界癌症治疗的研究热点。在分子靶向治疗研究过程中，靶点分子的确具有重要意义，可以为癌症的分子靶向治疗提供理论和实践依据。然而与化疗相同，靶向治疗过程中也产生的肿瘤耐药，这成为影响肿瘤治疗效果的一大障碍。对肿瘤耐药发生机制的研究和寻找开发逆转耐药的药物是当前肿瘤防治中的重要研究领域。

为了逆转肿瘤耐药，提高化疗及靶向治疗的疗效，降低耐药风险及延长生存率，本领域迫切需要通过多种方式研究肿瘤耐药发生的机制、肿瘤耐药的关键基因靶点，并根据这些靶点设计治疗肿瘤耐药的新药，从而引导肿瘤耐药靶向性治疗。

发明内容

本发明的目的在于寻找提高肿瘤细胞对顺铂药物敏感性的关键microRNA并开发相应的治疗药物。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

首先，本发明提供了一种检测肿瘤细胞对顺铂耐药性程度的试剂盒，所述试剂盒包括miR-517a-3p的qPCR检测引物，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:2的反转录引物，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。

在一些实施方式中，所述miR-517a-3p在对顺铂耐药性的肿瘤细胞中表达量升高。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBRGreen荧光染料。

进一步地，本发明提供了miR-517a-3p的抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对顺铂耐药性药物中的应用。

在一些实施方式中，所述miR-517a-3p的抑制剂选自：能降低miR-517a-3p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物；或者小分子化合物。

进一步地，本发明还提供了miR-517a-3p抑制剂在制备肿瘤对顺铂药物敏感性的促进剂中的应用。

在一些实施方式中，所述的肿瘤包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、淋巴瘤。

更进一步地，本发明提供了一种肿瘤化疗药物，所述药物以miR-517a-3p的抑制剂和顺铂药物为主要活性成分。

在一些实施方式中，所述miR-517a-3p抑制剂能降低顺铂耐药性肿瘤细胞对顺铂的IC50。

在一些实施方式中，所述miR-517a-3p抑制剂能降低对顺铂耐药性肿瘤细胞的单克隆形成能力。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过建立SK-OV-3/DDP耐药细胞株发现miR-517a-3p可以作为肿瘤细胞耐药性的标志物；miR-517a-3p在SK-OV-3/DDP细胞对DDP耐药中发挥着一定的作用，通过下调miR-517a-3p能逆转SK-OV-3/DDP细胞对DDP耐药；并且能抑制卵巢癌SK-OV-3/DDP细胞的增殖速度，同时也抑制其克隆行成能力。从而为寻找新的分子治疗靶标，指导临床用药，并更加有效对抗顺铂耐药提供科学的依据。

本发明发现miR-517a-3p表达量能够提示患者对顺铂的治疗的效果，用于指导临床用药；并且通过该microRNA的抑制剂能够增加顺铂的治疗效果，更具有临床转化价值。

附图说明

图1 qRT-PCR检测miR-517a-3p在对照细胞株和耐药性细胞株中的表达情况；

图2耐药性肿瘤细胞中转染miR-517a-3p inhibitor，分析DDP对耐药性肿瘤细胞的的半数抑制浓度；

图3耐药性肿瘤细胞中转染miR-517a-3p inhibitor，在同样浓度的药物作用下，检测耐药性肿瘤细胞的单克隆形成能力。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。

本发明所述的miR-517a-3p，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU，SEQ ID NO.1。

本发明通过qRT-PCR分析发现，与对照SK-OV-3细胞株相比，在对DDP耐药的SK-OV-3/DDP细胞中miR-517a-3p的表达显著升高。进一步观察miR-517a-3p在肿瘤细胞对DDP耐药中的可能作用，本研究将miR-517a-3p inhibitor转染SK-OV-3/DDP细胞，发现对DDP的药物敏感度出现了显著的改变，DDP对转染miR-517a-3p inhibitor后SK-OV-3/DDP细胞的IC50值较转染miR-NC的细胞显著降低。说明抑制miR-517a-3p能够增加SK-OV-3/DDP耐药细胞对DDP的敏感度。另外，研究发现抑制miR-517a-3p可以明显抑制SK-OV-3/DDP耐药细胞增殖及克隆形成。

实施例1 SK-OV-3细胞的培养及SK-OV-3/DDP耐药细胞株的建立

1、SK-OV-3细胞的培养

SK-OV-3(卵巢癌细胞)培养于含有10％的FBS的DMEM/F12培养液中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2、SK-OV-3/DDP耐药细胞株的建立

通过不断增加药物作用浓度的方法筛选肿瘤耐药细胞株。

首先，顺铂(源叶生物，B24462)在SK-OV-3细胞(卵巢癌细胞)的IC50为500nM。对数生长期SK-OV-3细胞的DDP作用浓度从500nM开始，培养3天，细胞更换新鲜培养液去掉死细胞不加药继续培养，培养1～2周后存活的细胞逐渐长成细胞团，胰酶消化传代后加药继续培养1～2周，存活的细胞可以耐受500nM的药物。细胞状态变好后，药物浓度增加至600nM，部分细胞死亡后再换液继续培养，观察无明显死亡细胞后选择对数生长期细胞进行传代，继续增加DDP药物浓度，如此反复传代，直至顺铂的IC50提高到5-10μM，相当于将IC50提高了大约10倍，则认为细胞具有明显的耐药性，得到对顺铂耐药的肿瘤细胞株。

实施例2检测miR-517a-3p在SK-OV-3野生细胞及SK-OV-3/DDP细胞中的差异表达

通过荧光定量PCR检测SK-OV-3野生细胞和耐药细胞SK-OV-3/DDP中miR-517a-3p的表达差异。

1.miRNA提取

分别收集对照组SK-OV-3野生细胞和SK-OV-3顺铂耐药细胞。使用Tiangen公司的miRNA提取试剂盒，每50mg细胞样本中加入1ml裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心2min。

2.逆转录

将10pg-1μg的RNA模板与2μl 10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl特异性反转录引物(miR-517a-3p的反转录引物如SEQ ID NO:2所示)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

反转录引物：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACTC-3’，SEQ ID NO:2。

3.Q-PCR

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。按照常规步骤操作，其中miR-517a-3p的cDNA扩增引物对序列分别如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl，模板cDNA 2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃20s，60℃55s)40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

正向引物：5’-ATCGTGCATCCCTTTA-3’，SEQ ID NO:3；

反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，SEQ ID NO:4。

结果如图1所示，与对照组相比，miR-517a-3p在对顺铂(DDP)耐药的人卵巢癌细胞株SK-OV-3/DDP中呈显著高表达。通过检测肿瘤细胞中miR-517a-3p的表达可以判断肿瘤细胞对顺铂耐药性程度，miR-517a-3p的表达越高，肿瘤细胞对顺铂的耐药性程度越高。

实施例3干扰miR-517a-3p对细胞耐药性的影响

通过抑制该miRNA的功能，观察是否能够降低肿瘤细胞的耐药性。

取对数生长期细胞进行细胞转染，按转染试剂lipofectamine 3000说明书的方法将miR-517a-3p inhibitor和miR-NC inhibitor(广州锐博生物科技有限公司)分别转染至SK-OV-3/DDP耐药细胞中。

(1)CCK8法检测miR-517a-3p干扰前后细胞对药物半数抑制浓度(IC50)。

细胞转染24h后，以0.25％胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液，细胞接种于96孔培养板中，6x10³个细胞/孔。细胞贴壁后，加入终浓度5nmol/L、4.5nmol/L、4nmol/L、3.5nmol/L、3nmol/L、2.5nmol/L、2nmol/L的DDP，100μl/孔。37℃，5％CO₂孵箱里连续培养48小时后，弃掉孔内培养基，每孔加入100μl的新鲜培养基和10μl的CCK8溶液，37℃培养1小时。培养结束后，将板子放入酶标仪中，以OD450nm读取每孔的吸光度值，取3个重复孔的平均吸光值(OD)值。用graphpad6.0软件根据数据绘制细胞生长抑制曲线，并计算DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)，从而分析细胞耐药性的改变情况。结果如图2所示，顺铂对转染了miR-517a-3p inhibitor的耐药细胞的IC50明显下降，即抑制miR-517a-3p导致SK-OV-3耐药细胞对顺铂的药物敏感性升高。

(2)细胞平板克隆行成实验检测转染后SK-OV-3/DDP耐药细胞的增殖能力

细胞转染24h，以0.25％胰蛋白酶消化细胞，用含有10％的FBS的DMEM/F12培养液(DDP药物终浓度5μM)制备成单细胞悬液，细胞接种于6孔板，2000个细胞/孔，分布均匀，继续培养8天，37℃、5％CO₂培养箱中培养。使用4％多聚甲醛固定15min、结晶紫染色液染色5min并拍照记录，计数克隆数量并观察克隆大小。

转染miR-517a-3p inhibitor的SK-OV-3/DDP细胞克隆较对照组的细胞克隆数目明显减少，且体积也明显减小(图3)。因此miR-517a-3p inhibitor不仅仅是抑制卵巢癌SK-OV-3/DDP细胞的增殖速度，同时也抑制其克隆形成能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北仁博科技有限公司

<120> 与肿瘤细胞顺铂耐药性相关的miR-517a-3p及其应用

<130> P200279

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> miR-517a-3p

<400> 1

aucgugcauc ccuuuagagu gu 22

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacactc 50

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atcgtgcatc ccttta 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (6)

1.miR-517a-3p检测试剂在制备检测卵巢癌细胞对顺铂耐药性程度的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括miR-517a-3p的qPCR检测引物，所述引物包括序列分别为SEQ ID NO:2的反转录引物，以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的cDNA扩增引物对。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-517a-3p在对顺铂耐药的卵巢癌细胞中表达量升高。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

4.miR-517a-3p的抑制剂在制备逆转卵巢癌细胞对顺铂耐药性药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-517a-3p的抑制剂选自：能降低miR-517a-3p表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物；或者小分子化合物。

6.miR-517a-3p抑制剂在制备卵巢癌对顺铂药物敏感性的促进剂中的应用。

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