CN112921085B - Circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用 - Google Patents
Circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域,尤其涉及circ‑NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用。一种分子标志物在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,所述分子标志物为环状RNA NOLC1(circ‑NOLC1),其核苷酸序列如SEQID No.1所示。该标志物在人临床卵巢癌组织中呈现高表达现象以及在人卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3中特异性高表达。本发明提供了circ‑NOLC1在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的应用。circ‑NOLC1作为卵巢癌的诊断标志,为卵巢癌治疗的提供分子靶点,可应用于抗肿瘤的药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域,尤其涉及circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用。
背景技术
卵巢癌是女性生殖系统常见的肿瘤,发病率在妇科恶性肿瘤中居第二位。由于卵巢癌起病隐匿,病情发展迅速,病死率居妇科恶性肿瘤首位。已知有许多类型的OC,其中上皮性卵巢癌(EOC)是最常见的。EOC在早期阶段没有明显症状,大多数患者在初步诊断时处于晚期,治疗效果差,5年生存率极低。临床上若能早期诊断并治疗,合理地行根治性手术或靶向分子药物治疗等综合治疗手段,能够极大地提高OC患者的生存率、生存质量和延长生存时间。目前卵巢癌的发病机制尚不完全清楚,临床上也并没有用于卵巢癌诊治的有效的分子标志物,寻找新的分子标志物对于卵巢癌的机制研究以及临床应用都具有重要的意义。
环状RNA(circRNAs)是一种内源性非编码RNA的新类别,是由pre-RNA经反向剪接后形成的,其特征在于它们的共价闭环结构不存在5'帽或3'聚A尾,使它们对核酸外切酶具有更高的耐受性。它们通常是稳定的,丰富的和保守的RNA分子,具有复杂的组织和阶段特异性表达模式。虽然涉及circRNA产生和功能的机制尚不完全清楚,但已经有报道指出它们参与调控包括心血管疾病、系统性红斑狼疮、神经系统性疾病和肿瘤等多种人类基本病理过程。越来越多的证据表明环状RNA参与调控多种肿瘤的发生,促进肿瘤细胞的增殖、调节细胞周期进程等,也有一些环状RNA参与调控肿瘤的转移。但并没有关于Circ-NOLC1在卵巢癌组织中表达情况的相关报道,并且寻找到有效的早期发病的生物标志物,以及相关的分子机制对指导卵巢癌临床诊治、治疗及预后有重要意义。总体而言,进一步研究circRNA 在妇科恶性肿瘤特别是在卵巢癌发生发展中的作用,对于卵巢癌的早期诊断以及预后都具有非常重要的帮助。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷,为寻找卵巢癌新的诊断分子标志物及治疗靶点,本发明的目的是提供circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其治疗靶点的应用,该标志物在人临床卵巢癌组织中呈现高表达现象以及在人卵巢癌细胞系A2780和OVCAR3中特异性高表达。circ-NOLC1作为卵巢癌的诊断标志,为卵巢癌治疗的提供分子靶点,可应用于抗肿瘤的药物的制备。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种分子标志物在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,所述分子标志物为环状RNANOLC1 (circ-NOLC1),其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
所述的circ-NOLC1为线性NOLC1第2-5号外显子剪切后所形成的环状RNA,NOLC1mRNA的定位为:chr10:103916775-103917971,相应的线性基因为NOLC1(NM_004741.5),环化序列有487个碱基,包含4个外显子。
进一步地,所述的诊断卵巢癌的产品选自制剂、芯片或试剂盒,通过测定样本中circ-NOLC1的表达水平及变化进行诊断。
进一步地,所述的诊断卵巢癌的产品,所述产品能够通过检测样本中
circ-NOLC1表达水平来诊断卵巢癌的发生。
进一步地,所述的诊断卵巢癌的产品包括来扩增特异性识别环状RNA NOLC1的核酸序列的引物对。引物对包括上游引物和下游引物,上游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示;下游引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
本发明提供了circ-NOLC1在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的应用。
进一步地,所述药物组合物包括NOLC1基因和/或其表达产物circ-NOLC1的抑制剂。
所述的抑制剂,包括针对NOLC1基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸,及特异性干扰环状RNANOLC1的序列。优选的抑制剂为shRNA。其核苷酸序列如SEQID No.4-5中的任一种或几种所示。
进一步地,药物复合物用于治疗卵巢癌。
与现有技术比,本发明的有益效果如下。
1) 本发明首次发现了与卵巢癌发生发展相关的生物标志物—circ-NOLC1,通过检测受试者circ-NOLC1的变化,来实现卵巢癌的早期诊断。
2) 本发明首次发现了circ-NOLC1与卵巢癌的发生发展相关,并验证了circ-NOLC1在卵巢癌中高表达。
3) circ-NOLC1可作为卵巢癌的独立预测因子,也可以和其他的分子标志物联合应用。
4) 本发明提供了治疗卵巢癌的分子靶标,通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。
5) 本发明对卵巢癌的机制研究提供了一定的理论基础。
附图说明
图1显示利用QPCR检测circ-NOLC1在卵巢癌组织中的表达情况。
图2是显示利用QPCR检测circ-NOLC1在卵巢癌细胞中的表达情况。
图3是人卵巢癌细胞系CAOV3及A2780细胞增殖实验结果。
图4是人卵巢癌细胞系CAOV3及A2780细胞划痕实验结果。
图5是人卵巢癌细胞系CAOV3及A2780细胞侵袭实验结果。
图6是人卵巢癌细胞系CAOV3及A2780细胞凋亡实验结果。
图7是在人卵巢癌细胞系CAOV3细胞通过EDU免疫荧光检测细胞增殖实验结果。
图8是在人卵巢癌细胞系A2780细胞通过EDU免疫荧光检测细胞增殖实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
实施例1circ-NOLC1的鉴定及在人卵巢癌组织及细胞中的检测。
收集人卵巢癌(样本数n=45)新鲜标本,使用TRIzolreagent(Japan,Shiga,Takara)从卵巢癌组织中中提取总RNA。首先,将适量的氯仿添加到TRIzol中。离心后,将上层水相添加到新的离心管中,并添加相同体积的异丙醇以沉淀RNA。再次离心后,弃去上清液,并用75%乙醇洗涤RNA沉淀。然后将沉淀物干燥并溶解在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。然后使用紫外分光光度计(中国上海,Unico)测量260 nm处的吸光度(OD),以计算RNA浓度。然后,使用avian myeloblastosis virus transcriptase和随机引物(Japan,Shiga,Takara)将2μgRNA反转录为互补DNA(cDNA)。接下来,使用SybrPrimeX EX-TAQ Patent IIKit(Japan,Shig, Takara)。最后,使用2-ΔΔCt方法比较目标基因的阈值(Ct)和18S rRNA(18 s)/ U6,以确定目标基因的相对表达水平。如图1所示,circ-NOLC1 在卵巢癌组织中的水平显著高于其对应的癌旁组织及正常卵巢组织,同时也高于良性卵巢肿瘤组织。
然后对人卵巢癌细胞系中的对应环状RNA进行了鉴定和检测,实际操作过程与卵巢癌组织提取鉴定环状RNA一样,结果如图2所示,结果显示在卵巢癌细胞系中也存在这个环状RNA,并且在A2780和OVCAR3细胞系中特异性高表达。
以上结果都提示circ-NOLC1(核苷酸序列如SEQID No.1所示,hsa_circ_0000257|chr10:103916775-103917971|NM_004741.5|NOLC1)可作为卵巢癌发生和转移的诊断标志物。并且可将上述卵巢癌诊断生物标志物制备成卵巢癌诊断产品,产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别环状RNA NOLC1的引物对,包括上游引物和下游引物,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;下游引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
实施例2circ-NOLC1的表达水平直接影响卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡。
1、稳定细胞株的构建及鉴定。
过表达质粒(pHBLV-circ-NOLC1)和circ-NOLC1短发夹RNA(shRNA)质粒由上海汉恒生物公司进行构建,Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,USA)用于转染。所有试剂的剂量均基于制造商的说明。使用Circ- NOLC1质粒在卵巢癌细胞系CAOV3中上调circ-NOLC1表达,并分别使用两个circ-NOLC1短发夹RNA(shRNA)质粒沉默A2780细胞系中的circ-NOLC1。嘌呤霉素(2ug / ml)用于选择稳定的克隆细胞系。circ-NOLC1和circ-NOLC1shRNA的序列显示在序列图中。待细胞铺板率达到90%时进行传代,同时在培养基中添加5μg/mL嘌呤霉素以筛选被稳定转染的细胞,筛选时应保持细胞的密度不超过50%。至少筛选2周。并分别检测上述CAOV3及A2780细胞系中Circ-NOLC1的表达水平及其宿主基因NOLC1的变化情况,实际操作过程与卵巢癌组织提取鉴定环状RNA相似。
2、肿瘤细胞增殖能力检测(MTT法)。
细胞重新悬浮并以每孔3000个接种在96孔板中。在细胞接种后0小时、24小时、48小时和72小时,分别用5毫克/毫升的 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐溶液(中国,北京,Solarbio)加入每个孔中,然后在5%二氧化碳中孵育2小时。然后,从每个孔中取出培养基并用150 μL二甲亚砜代替。振荡15秒后,使用微型平板分光光度计(BioTekInstruments,Winooski,VT,USA)测量490 nm处的吸光度,计算生长率并用于反映细胞活力)。
3、肿瘤细胞迁移测定(细胞划痕实验)。
细胞重新悬浮并接种在六孔板中。当细胞生长达到80%时,用200 μL移液管尖端垂直在每个孔中划宽度一致的直线。然后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗多余的悬浮细胞。然后向每个孔中加入2 mL培养基,细胞在5%二氧化碳中孵育。然后在划痕后的0小时、24小时、48小时用光学显微镜拍照,并使用Image J 软件(National Institutes of Health,Bethesda, MD, USA)进行测量。伤口愈合率的计算公式如下:(原伤口面积-不同时间的伤口面积)/原伤口面积× 100%)。
4、肿瘤细胞侵袭测定(Transwell实验)。
基质凝胶化成液体后,以1∶15的比例溶解在无血清培养基中。将制备的基质凝胶均匀地铺在在Transwell上室中,然后在培养箱中凝固4小时。计数重新悬浮的细胞,每个上室中接种含5×104个悬浮细胞的200微升无血清培养基,并将600微升10%血清浓度的细胞培养基作为引诱剂加入下室。孵育48小时后取出24孔板。用PBS清洗3次后,用4%多聚甲醛室温下固定侵入下室的细胞30分钟。然后用PBS洗涤三次,然后用结晶紫染色15分钟。最后,使用奥林巴斯荧光显微镜(日本,东京)进行细胞计数。
5、肿瘤细胞凋亡测定(流式细胞术检测)。
计数取3×105 个细胞,铺于6孔板中。 48h后收集每孔培养基,PBS洗涤后用无EDTA胰蛋白酶消化细胞,胰蛋白酶消化时间应适当,以防止假阳性。1500 r离心5 min后,细胞用预冷的PBS收集和清洗两次。细胞再悬浮于100μL 1×结合缓冲液中,加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染色液(美国,Becton,Dickinson and Company)避光染色20分钟。然后在室温黑暗条件下,再加入1×结合缓冲液的200μL。流式细胞仪检测细胞凋亡率。
6、细胞免疫荧光实验。
取适量对数生长期细胞接种于已提前放置好细胞专用爬片的24孔板各孔中,每孔加入2 m L培养基并在CO2孵箱培养48 h,待细胞长至80%左右时取出,弃培养液,加入0.5mL固定液,10 min后弃固定液并PBS清洗3遍,每次5 min。加5 μL探针在细胞爬片区域,探针和标本进行充分杂交,经洗涤和DAPI(中国上海,吉玛基因,FISH试剂盒)复染后,在荧光显微镜下检测不同组探针在标本细胞中的荧光信号。
3、实验结果。
如图3所示,使用circ-NOLC1质粒转染卵巢癌细胞系CAOV3后circ-NOLC1的表达水平明显增高,但是基本不影响其宿主基因的表达。两个短发夹RNA质粒转染A2780细胞后circ-NOLC1的表达水平与对照组相比明显下降,且基本不影响其宿主基因的表达。在人卵巢癌细胞系CAOV3中过表达circ-NOLC1与对照组细胞相比,促进了细胞增殖;并且在A2780细胞系OVCAR3中分别使用两个短发夹RNA沉默circ-NOLC1,结果均显示细胞增殖显著减慢。
如图4所示,在人卵巢癌细胞系CAOV3中过表达circ-NOLC1与对照组细胞相比,促进了细胞迁移;并且在A2780细胞中分别使用两个短发夹RNA沉默 circ-NOLC1,结果均显示细胞迁移能力明显减弱。
如图5所示,在过表达circ-NOLC1的OC细胞系CAOV3中与对照组细胞相比,增加了细胞侵袭能力;并且在A2780细胞中分别使用两个短发夹RNA沉默 circ-NOLC1,结果均显示细胞侵袭能力明显减弱。
如图6所示,在过表达circ-NOLC1的OC细胞系CAOV3中与对照组细胞相比,减少了细胞凋亡;并且在A2780细胞中分别使用两个短发夹RNA沉默 circ-NOLC1,结果显著增加了细胞凋亡。
在过表达circ-NOLC1的OC细胞系CAOV3中与对照组细胞相比,细胞增殖活跃,如图7所示;而A2780细胞中沉默 circ-NOLC1后抑制卵巢癌细胞增殖,如图8所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)
<120>circ-NOLC1作为卵巢癌诊断标志物及其应用
<130>5
<140>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>487
<212>DNA
<213>(人工序列)
<400> 1
ACACAGCAGGATGCCAATGCCTCTTCCCTCTTAGACATCTATAGCTTCTG 50
GCTCAAGTCTGCCAAGGTCCCAGAGCGAAAGTTACAGGCAAATGGACCAG 100
TGGCTAAGAAAGCTAAGAAGAAGGCCTCATCCAGTGACAGTGAGGACAGC 150
AGCGAGGAGGAGGAGGAAGTTCAAGGGCCTCCAGCAAAGAAGGCTGCTGT 200
ACCTGCCAAGCGAGTCGGTCTGCCTCCTGGGAAGGCTGCAGCCAAAGCAT 250
CAGAGAGTAGCAGCAGTGAAGAGTCCAGTGATGATGATGATGAGGAGGAC 300
CAAAAGAAACAGCCTGTCCAGAAGGGAGTTAAGCCCCAAGCCAAGGCAGC 350
CAAAGCTCCTCCTAAGAAGGCCAAGAGCTCTGATTCTGATTCTGACTCAA 400
GCTCCGAGGATGAGCCACCAAAGAACCAGAAGCCAAAGATAACACCTGTG 450
ACAGTTAAAGCTCAGACTAAAGCCCCTCCCAAACCAG 487
<210> 2
<211>17
<212>DNA
<213>(人工序列)
<400> 2
TGAGCCACCAAAGAACC 17
<210> 3
<211>17
<212>DNA
<213>(人工序列)
<400> 3
GGCAGACTTGAGCCAGA 17
<210> 4
<211>68
<212>DNA
<213>(人工序列)
<400> 4
hsa_circRNA_100674shRNA1
GATCCGTCCCAAACCAGACACAGCAGGATTTCAAGAGAATCCTGCTGTGTCTGGTTTGGG 60
ATTTTTTC 68
<210> 5
<211>70
<212>DNA
<213>(人工序列)
<400> 5
hsa_circRNA_100674 shRNA2
GATCCGCCCCTCCCAAACCAGACACAGCAGTTCAAGAGACTGCTGTGTCTGGTTTGGGAG 60
GGGCTTTTTTC 71
Claims (7)
1.一种检测分子标志物表达水平的试剂在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,其特征在于,所述分子标志物为环状RNA NOLC1 (circ-NOLC1),所述circ-NOLC1的核苷酸序列如SEQID No.1所示;所述的circ-NOLC1为线性NOLC1 mRNA第2-5号外显子剪切后所形成的环状RNA,所述NOLC1 mRNA的定位为:chr10:103916775-103917971,所述线性NOLC1 mRNA为NM_004741.5;所述circ-NOLC1在人卵巢癌组织中的表达水平显著高于正常卵巢组织。
2.如权利要求1所述的一种检测分子标志物表达水平的试剂在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,其特征在于,所述的诊断卵巢癌的产品为制剂或芯片。
3.如权利要求1所述的一种检测分子标志物表达水平的试剂在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,其特征在于,所述的诊断卵巢癌的产品为试剂盒。
4.如权利要求1所述的一种检测分子标志物表达水平的试剂在制备诊断卵巢癌的产品中的应用,其特征在于,所述的诊断卵巢癌的产品包括特异性扩增所述circ-NOLC1的核酸序列的引物对,所述引物对包括上游引物和下游引物,所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示;所述下游引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
5.特异性干扰circ-NOLC1的shRNA在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的特异性干扰circ-NOLC1的shRNA在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的应用,其特征在于,所述shRNA的核苷酸序列如SEQID No.4或SEQID No.5所示。
7.如权利要求5所述的特异性干扰circ-NOLC1的shRNA在制备治疗卵巢癌的药物组合物中的应用,其特征在于,所述药物组合物用于治疗卵巢癌。
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