CN114908160A - Snord60作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及SNORD60作为子宫内膜癌诊断标志物及其应用。一种分子标志物在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，所述分子标志物为SNORD60，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。该标志物在人临床子宫内膜癌组织中呈现高表达现象以及在人内膜癌细胞系HEC‑1B和Ishikawa中特异性高表达。本发明提供了SNORD60在制备治疗子宫内膜癌的药物或药物组合物中的应用。SNORD60作为子宫内膜癌诊断的标志物，为子宫内膜癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

Description

SNORD60作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及SNORD60作为子宫内膜癌诊断标志物及其应用。

背景技术

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的肿瘤之一，在我国，子宫内膜癌发病率逐年升高，在妇科恶性肿瘤中居第二位，仅次于宫颈癌。子宫内膜癌患者在早期阶段虽然症状明显，但大多数晚期子宫内膜癌患者的治疗效果及预后较差，5年生存率低，易复发转移。临床上若能早期诊断并治疗，合理地行根治性手术或靶向分子药物治疗等综合治疗手段，能够极大地提高子宫内膜癌患者的生存率、生存质量和延长生存时间。目前子宫内膜癌的病因及发病机制尚未明确，临床上也并没有用于子宫内膜癌诊治的有效的分子标志物，寻找新的分子标志物对于子宫内膜癌的机制研究以及临床应用都具有重要的意义。

snoRNA是一类广泛分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA，主要存在于蛋白编码基因与非蛋白编码基因的内含子区域，长度60-300nt，能与核糖核仁核蛋白结合形成snoRNPs复合物参与rRNA的加工处理，RNA剪切和翻译过程的调控以及氧化应激反应。snoRNA具有保守的结构元件，并以此划分为3大类：box C/D snoRNA(SNORD)、box H/ACAsnoRNA (SNORA)和MRP RNA 。其中box C/D和box H/ACA 是已知snoRNA的主要类型，以碱基配对的方式分别指导着核糖体RNA的2'-O-甲基化和假尿嘧啶化修饰。研究表明snoRNAs可能通过修饰核糖体RNA导致其功能缺陷，进而导致正常细胞转化为肿瘤细胞，参与肿瘤的发生发展过程。已经有报道指出它们参与调控包括脑肺部疾病、神经系统性疾病和肿瘤等多种人类基本病理过程。越来越多的证据表明snoRNAs参与调控多种肿瘤的发生，促进肿瘤细胞的增殖，调节细胞周期进程，参与调控肿瘤的转移等等。总体而言，进一步研究snoRNA在妇科恶性肿瘤特别是在子宫内膜癌发生发展中的作用，对于内膜癌的早期诊断以及预后都具有非常重要的帮助。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，为寻找子宫内膜癌新的诊断分子标志物及治疗靶点，本发明的目的是提供SNORD60作为子宫内膜癌诊断得标志物及其治疗靶点的应用，该标志物在人临床子宫内膜癌组织中呈现高表达现象以及在人子宫内膜癌细胞系HEC-1B和ISHIKAWA中特异性高表达。SNORD60作为子宫内膜癌的诊断标志物，为子宫内膜癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种分子标志物在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，所述分子标志物为SNORD60，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述的SNORD60为SNHG19第1号内含子剪切后所形成的小核仁RNA，SNORD60 RNA的定位为：chr16:2155023-2155105，NR_002736.1，序列有83个碱基，包含1个外显子。

进一步地，所述的产品选自制剂、芯片或试剂盒。

进一步地，所述诊断子宫内膜癌的产品能够通过检测样本中SNORD60表达水平来诊断子宫内膜癌的发生。

进一步地，所述产品包括来扩增特异性识别SNORD60的核酸序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

一种药物组合物，其特征在于，包括SNHG19基因和/或其表达产SNORD60的抑制剂。

进一步地，所述抑制剂包括针对SNHG19基因的siRNA、针对小核仁RNA SNORD60的反义寡核苷酸，用于抑制SNORD60的水平。

优选的，所述抑制剂为ASO，其核苷酸序列如SEQ ID No.4中所示，同时选用的NC对照组的ASO核苷酸序列由上海瑞博生物公司提供。

所述的分子标志物和所述的药物组合物在制备用于治疗子宫内膜癌药物中的应用。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现了与子宫内膜癌发生发展相关的生物标志物SNORD60，通过检测受试者SNORD60的变化，来实现子宫内膜癌的早期诊断。

本发明提供了治疗子宫内膜癌的分子靶标，通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。本发明对子宫内膜癌的机制研究提供了一定的理论基础。

附图说明

图1是TCGA数据库中SNORD60在子宫内膜癌组织及正常组织中的表达情况。

图2是利用QPCR检测SNORD60在子宫内膜癌细胞中的表达情况。

图3是使用SNORD60质粒转染子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA后SNORD60的表达情况。

图4是人子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA细胞划痕实验结果。

图5-1至5-2是人子宫内膜癌细胞系HEC-1B及ISHIKAWA细胞凋亡实验结果。

图6是人子宫内膜癌细胞系HEC-1B及ISHIKAWA细胞增殖实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明首次发现了SNORD60与子宫内膜癌的发生发展相关，并验证了SNORD60在子宫内膜癌中高表达。SNORD60可作为子宫内膜癌的独立预测因子，也可以和其他的分子标志物联合应用。

实施例1SNORD60的鉴定及在人子宫内膜癌组织及细胞中的检测。

实验方法：将HEC-1B、HEC-1A、KLE、ISHIKAWA四种子宫内膜癌细胞系细胞重新悬浮并接种在六孔板中，当细胞生长达到80％时，使用TRIzol reagent(Japan，Shiga，Takara)从内膜癌细胞中提取总RNA。首先，将适量的氯仿添加到TRIzol中。离心后，将上层水相添加到新的离心管中，并添加相同体积的异丙醇以沉淀RNA。再次离心后，弃去上清液，并用75％乙醇洗涤RNA沉淀。然后将沉淀物干燥并溶解在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。然后使用紫外分光光度计(中国上海，Unico)测量260nm处的吸光度(OD)，以计算RNA浓度。然后，使用avian myeloblastosis virus transcriptase和SNORD60的引物(Japan，Shiga，Takara)将2μgRNA反转录为互补DNA(cDNA)。接下来，使用SybrPrimeX EX-TAQ Patent II Kit(Japan,Shig,Takara)。最后，使用2-ΔΔCt方法比较目标基因的阈值(Ct)和U6 rRNA，以确定目标基因的相对表达水平。如图2所示，SNORD60在HEC-1B细胞系中特异性高表达。

本发明首次发现了SNORD60与子宫内膜癌的发生发展相关，并验证了SNORD60在内膜癌中高表达。SNORD60可作为内膜癌的独立预测因子，也可以和其他的分子标志物联合应用。

对人内膜癌细胞系中的对应SNORD60进行了鉴定和检测，结果如图2所示，在子宫内膜癌细胞系中也存在这个snoRNA，并且在HEC-1B和ISHIKAWA细胞系中特异性高表达。

以上结果都提示SNORD60(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，chr16:2155023-2155105|NR_002736.1|SNORD60)可作为子宫内膜癌发生和转移的诊断标志物。并且可将上述子宫内膜癌诊断生物标志物制备成子宫内膜癌诊断产品，产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别SNORD60的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

作为优选实施例，上游引物序列如下(SEQ ID No.2)：

SNORD60上游引物：5’TTTGACTTCTGACACCTCGTA 3’。

下游引物序列如下(SEQ ID No.3)：

SNORD60下游引物：5’AAGCCTCAGTCTTGCTAAAT 3’。

实施例2SNORD60的表达水平直接影响子宫内膜癌细胞增殖、迁移及凋亡。

一、通过瞬时转染反义寡核苷酸(ASO)来敲低HEC-1B细胞中SNORD60的表达。

反义寡核苷酸(ASO)由上海瑞博生物公司进行构建，Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，USA)用于转染。所有试剂的剂量均基于制造商的说明。使用反义寡核苷酸(ASO)在内膜癌细胞系HEC-1B中沉默SNORD60表达，同时使用NC对对照组HEC-1B细胞系进行转染。待细胞铺板率达到60-70％时进行转染。ASO-SNORD60序列在序列表中显示(SEQ ID No.4)，ASO-NC的序列由上海瑞博生物公司提供。

1、对转染了不同浓度ASO-SNORD60的HEC-1B细胞检测SNORD60的表达水平。

将HEC-1B内膜癌细胞系细胞重新悬浮并接种在六孔板中，当细胞生长达到50～60％时，分别使用AS0-NC和25nM、50nM、75nM、100nM浓度的ASO-SNORD60进行转染，当细胞生长达到80％时，使用TRIzol reagent(Japan，Shiga，Takara)从内膜癌细胞中提取总RNA。实际操作过程与内膜癌细胞系中提取鉴定SNORD60一样，结果提示用ASO-SNORD60转染HEC-1B后，HEC-1B中SNORD60的表达水平明显下降。

2、肿瘤细胞增殖能力检测(CCK8法)。

将HEC-1B细胞重新悬浮并以每孔3000个接种在96孔板中，待细胞贴壁后，分别使用ASO-NC和ASO-SNORD60对细胞进行转染，在细胞转染后0小时、24小时、48小时和72小时，分别用10毫克/毫升的2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)(中国，上海，Yeasen)加入每个孔中，然后在5％二氧化碳中孵育2小时。振荡20秒后，使用微型平板分光光度计(BioTek Instruments，Winooski，VT，USA)测量450nm处的吸光度，计算生长率并用于反映细胞活力。

3、肿瘤细胞凋亡测定(流式细胞术检测)。

计数取3×10⁵个细胞，铺于6孔板中，待细胞贴壁后，分别使用ASO-NC和ASO-SNORD60进行转染，转染时使用无血清培养基，六孔板中液体总量为2ml。转染48h后收集每孔培养基，PBS洗涤后用无EDTA胰蛋白酶消化细胞，胰蛋白酶消化时间应适当，以防止假阳性。1500r离心5min后，细胞用预冷的PBS收集和清洗两次。细胞再悬浮于50μL 1×结合缓冲液中，加入2.5μL Annexin V-FITC和2.5μL PI染色液(美国，Becton,Dickinson andCompany)避光染色20分钟。然后在室温黑暗条件下，再加入1×结合缓冲液的200μL。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

4、实验结果。

如图5-1至5-2所示，在子宫内膜癌细胞系HEC-1B细胞中沉默SNORD60后，与对照组细胞相比，促进了细胞凋亡。

如图6所示，在子宫内膜癌细胞系HEC-1B细胞中利用寡核苷酸沉默SNORD60后，与对照组细胞相比，抑制了细胞增殖。

二、稳定细胞株的构建。

过表达质粒(pZdonor-CMV-SNORD60)和对照组空载体质粒(pZdonor-CMV)由北京合生基因生物公司进行构建，Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，USA)用于转染。所有试剂的剂量均基于制造商的说明。使用SNORD60质粒在内膜癌ISHIKAWA中上调SNORD60表达，同时使用空载体质粒转染HEC-1B作为对照。G418用于选择稳定的克隆细胞系。SNORD60序列显示在序列图中。待细胞融合度达到90％时进行传代，同时在培养基中添加500μg/ml G418以筛选被稳定转染的细胞，筛选时应保持细胞的密度不超过50％。至少筛选2周。

1、对分别转染了SNORD60质粒和CON193空载体的ISHIKAWA细胞检测SNORD60的表达水平。

将转染了SNORD60质粒和CON193空载体的ISHIKAWA细胞重新悬浮并接种在六孔板中，当细胞生长达到80％时，使用TRIzol reagent(Japan,Shiga,Takara)从ISHIKAWA细胞中提取总RNA。实际操作过程与内膜癌细胞系中提取鉴定SNORD60一样，结果如图3所示，结果显示与对照组相比，转染了SNORD60质粒的ISHIKAWA细胞SNORD60的表达水平明显升高。

2、肿瘤细胞增殖能力检测(CCK8法)。

将转染了SNORD60质粒和CON193空载体的ISHIKAWA细胞重新悬浮并以每孔3000个接种在96孔板中，待细胞贴壁后，在细胞转染后0小时、24小时、48小时和72小时，分别用10毫克/毫升的2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)(中国，上海，Yeasen)加入每个孔中，然后在5％二氧化碳中孵育2小时。振荡20秒后，使用微型平板分光光度计(BioTek Instruments，Winooski，VT，USA)测量450nm处的吸光度，计算生长率并用于反映细胞活力。

3、肿瘤细胞迁徙能力检测(细胞划痕实验)。

将转染了SNORD60质粒和CON193空载体的ISHIKAWA细胞重新悬浮并接种在六孔板中。当细胞生长达到80％时，用200μL移液管尖端垂直在每个孔中划宽度一致的直线。然后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗多余的悬浮细胞，细胞在5％二氧化碳中孵育。然后在划痕后的0小时、24小时、48小时用光学显微镜拍照，并使用Image J软件(National Institutesof Health,Bethesda,MD,USA)进行测量。伤口愈合率的计算公式如下：((原伤口面积-不同时间的伤口面积)/原伤口面积×100％)。

4、肿瘤细胞凋亡测定(流式细胞术检测)。

将转染了SNORD60质粒和CON193空载体的ISHIKAWA细胞计数取3×10⁵个细胞，铺于6孔板中，48h后收集每孔培养基，PBS洗涤后用无EDTA胰蛋白酶消化细胞，胰蛋白酶消化时间应适当，以防止假阳性。1500r离心5min后，细胞用预冷的PBS收集和清洗两次。细胞再悬浮于50μL 1×结合缓冲液中，加入2.5μL Annexin V-FITC和2.5μL PI染色液(美国，Becton,Dickinson and Company)避光染色20分钟。然后在室温黑暗条件下，再加入1×结合缓冲液的200μL。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5、实验结果。

如图3所示，使用SNORD60质粒转染子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA后SNORD60的表达水平明显增高，但是基本不影响其宿主基因的表达。

如图4所示，在人子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA中过表达SNORD60与对照组细胞相比，促进了细胞迁移。

如图5-1至5-2所示，在过表达SNORD60的内膜癌细胞系ISHIKAWA中与对照组细胞相比，减少了细胞凋亡。

如图6所示，在过表达SNORD60的内膜癌细胞系ISHIKAWA中与对照组细胞相比，细胞增殖活跃。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)

<120>SNORD60作为子宫内膜癌诊断的标志物及其应用

<130>4

<140>SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213>(人工序列)

<400> 1

AGTCTGTGAT GAATTGCTTT GACTTCTGAC ACCTCGTATG AAAACTGCAC GTGCAGTCTG 60

ATTATTTAGC AAGACTGAGG CTT 83

<210> 2

<211> 21

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 2

TTTGACTTCT GACACCTCGT A 21

<210> 3

<211> 20

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 3

AAGCCTCAGT CTTGCTAAAT 20

<210> 4

<211>20

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400> 4

CCTCGTATGA AAACTGCACG 20

Claims (9)

1.一种分子标志物在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物为SNORD60，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的SNORD60为SNHG19第1号内含子剪切后所形成的小核仁RNA，SNORD60 RNA的定位为：chr16: 2155023-2155105，NR_002736.1，序列有83个碱基，包含1个外显子。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断子宫内膜癌的产品选自制剂、芯片或试剂盒。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断子宫内膜癌的产品能够通过检测样本中SNORD60表达水平来诊断子宫内膜癌的发生。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断子宫内膜癌的产品包括来扩增特异性识别的核酸序列的引物对，引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括SNHG19基因和/或其表达产物SNORD60的抑制剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂包括针对SNHG19基因的ASO、shRNA、反义寡核苷酸，及特异性干扰SNORD60的序列。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂为ASO，其核苷酸序列如SEQ ID No.4中所示，同时选用的NC对照组的ASO核苷酸序列。

9.如权利要求1所述的分子标志物和权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗子宫内膜癌药物中的应用。

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