CN111235263B

CN111235263B - 诊治骨关节炎的靶基因

Info

Publication number: CN111235263B
Application number: CN202010045479.6A
Authority: CN
Inventors: 程辉光; 王军; 宋伟; 马涛; 张育民
Original assignee: Xian Honghui Hospital
Current assignee: Xian Honghui Hospital
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111235263A

Abstract

本发明提供了诊治骨关节炎的靶基因，具体的所述靶基因为RP1‑45I4.3，本发明通过检测RP1‑45I4.3的表达水平，发现RP1‑45I4.3在患者的样本中呈现显著性上调，以RP1‑45I4.3作为变量进行统计学分析发现，其具有较高的曲线下面积，说明RP1‑45I4.3作为检测靶标可以有效的区分骨关节炎患者与正常人；本发明同时通过改变RP1‑45I4.3的表达水平检测RP1‑45I4.3对软骨细胞增殖以及凋亡的影响，发现降低RP1‑45I4.3的表达可以促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，说明RP1‑45I4.3可作为新的靶标应用于骨关节炎的治疗。

Description

诊治骨关节炎的靶基因

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及诊治骨关节炎的靶基因，具体的涉及靶基因RP1-45I4.3。

背景技术

骨关节炎(OA)是以软骨丢失及关节周围骨膜反应，滑膜肿胀的关节病，我们常说的老年性关节炎、增生性关节炎、肥大性关节炎、创伤性关节炎等都是指的这种病。它是最常见的关节炎形式，同时也是世界上最常见的慢性关节疾病。骨关节炎是一种常见的退行性关节病，主要发生在老年人身上，其主要特征是关节软骨的破坏，软骨下骨病变的存在和相关的滑膜炎。OA的主要症状包括关节疼痛，关节僵硬和运动范围缩小。几个危险因素与OA的发生和发展有关，包括，肥胖，炎症，创伤，遗传和异常生物力学。已经表明，软骨细胞，骨细胞，破骨细胞和成骨细胞对于全关节内稳态和这些细胞的缺陷是必不可少的，它们的功能可以导致骨关节炎(Panoutsopoulou,K.and E.Zeggini,Advances in osteoarthritisgenetics.J Med Genet,2013.50(11):715-24.)。骨病变和相关的滑膜炎影响了大约10％的人口，特别是60岁以上的女性(Dai,J.,et al.,Kdm6b regulates cartilagedevelopment and homeostasis through anabolic metabolism.Annals of theRheumatic Diseases,2017.76(7):1295-1303.)。约有26％的OA患者伴随有严重的关节疼痛，而且他们中的42％的人他们的身体活动受到了极大的限制(Wang,A.,et al.,Nutraceuticals and osteoarthritis pain.Pharmacology&Therapeutics,2018.187:167-179.)。我国骨关节炎患者占总人口的3％，其中大部分为膝骨关节炎，55岁以上人群X射线有膝关节炎症表现者约60％,65岁以上老年人骨关节炎的发病率可达85％，75岁以上老年人中每年都有至少一个关节有骨关节炎变化。众所周知，骨关节炎在女性中比男性更常见，而且随着年龄的增长，骨关节炎的患病率急剧增加。骨关节炎是导致炎症和关节结构变化的主要原因，会导致疼痛和残疾，进而增加心血管事件的发生率及死亡率。关节疼痛及压痛是骨关节炎最为常见的临床表现，除此之外，还有关节活动受限，关节畸形，因为关节活动受限还会导致肌肉萎缩。其中疼痛和僵硬，尤其是运动后的疼痛和僵硬作为主要症状，对日常生活活动能力产生了相当大的影响，导致他们的日常生活活动能力和生活质量严重下降，同时对患者本人的身心健康造成了极大的危害，对家庭和社会也造成了一定的影响。骨关节炎目前无法根治，发病后无有效的治疗手段，对患者及其家庭和社会都造成严重的影响。近年来，如何对骨关节炎进行有效的预防和治疗成为亟待解决的问题。

长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，并且在多种生物学过程和疾病中都有一定的作用，包括补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控以及包括癌症，心血管疾病，神经退行性疾病，精神疾病在内的多种疾病都起到了重要的作用。已有研究表明长链非编码RNA在骨关节炎中扮演着重要的角色，LncRNAs表达水平的改变会影响软骨和成骨的形成，进而影响软骨和成骨的稳态，进而直接或者间接参与骨关节炎的发生发展。有研究表明LncRNAs可能有助于预测骨关节炎的发展和诊断，并且可能有助于发现骨关节炎治疗中的潜在候选靶点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供诊断和治疗骨关节炎的靶基因。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种检测基因的试剂，所述试剂可以检测生物样品中RP1-45I4.3的水平。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别RP1-45I4.3的探针；或特异性扩增RP1-45I4.3的引物。

进一步，所述特异性扩增RP1-45I4.3的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的RP1-45I4.3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂下调RP1-45I4.3的表达水平。其中，所述抑制剂选自：以RP1-45I4.3或其转录本为靶序列、且能够抑制RP1-45I4.3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为双链分子，该分子包括有义链及其互补反义链。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明的第四方面提供了一种筛选治疗骨关节炎的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

使测试物质与表达RP1-45I4.3基因的细胞接触；并

选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低RP1-45I4.3基因的表达水平的测试物质。

本发明的第五方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断骨关节炎的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用；

c.RP1-45I4.3在构建诊断骨关节炎的计算模型中的应用；

d.RP1-45I4.3在制备治疗骨关节炎的药物中的应用；

e.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用；

f.RP1-45I4.3在筛选治疗骨关节炎的候选药物中的应用。

附图说明

图1是RP1-45I4.3基因在样本中的表达情况图；其中，图A是血液样本，图B是组织样本；

图2是检测siRNA对RP1-45I4.3表达情况影响图。

具体的实施方式

虽然任何与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是现在描述优选的方法、装置、和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，要理解，本发明不限于本文中描述的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因为这些可依照常规实验和优化而变化。还要理解，该描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围。

术语“生物样品”或“样本”指从骨关节炎患者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、分泌物、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。本文中患者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA、miRNA、lncRNA、circRNA)。在本发明的特定的实施方式中，“表达的基因”是指转录成RNA但不翻译成多肽的基因。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的RNA的表达相比，从以患有骨关节炎特征的个体分离的样本中RNA表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的血相比，从以患有骨关节炎为特征的个体分离的样本中RNA表达水平降低的基因。

RP1-45I4.3

转录RP1-45I4.3的基因是位于人6号染色体上，本发明中的RP1-45I4.3包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的RP1-45I4.3可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的RP1-45I4.3即可。在本发明的实施例中，一种代表性的转录RP1-45I4.3基因的核苷酸序列如ENST00000454588.1所示。

根据本发明，测定在自受试者获得的血液、组织或细胞中RP1-45I4.3的表达水平，使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量RP1-45I4.3的RNA。所述检测可在芯片或阵列上实施。对检测RP1-45I4.3的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用RP1-45I4.3的序列信息制备上述探针。举例而言，RP1-45I4.3的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度检测。

本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与RP1-45I4.3的RNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

在本发明中，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，而且包括例如短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物(shD/R-NA)。在本文中，“双链分子”也称作“双链核酸”、“双链核酸分子”、“双链多核苷酸”、“双链多核苷酸分子”、“双链寡核苷酸”和“双链寡核苷酸分子”。

术语“靶序列”指靶基因的RNA或cDNA序列内的某段核苷酸序列，如果将靶向该序列的双链分子导入表达靶基因的细胞中的话，会导致靶基因的整个基因的转录受到阻抑。对于基因的某个核苷酸序列，若包含与靶序列对应的序列的双链分子抑制表达该基因的细胞中该基因的表达，可确定其为靶序列。阻抑基因表达的双链多核苷酸可以由靶序列和长度为2至5个核苷酸的3’突出端(例如uu)的组成。

当靶序列通过cDNA序列来显示时，使用双链cDNA的有义链序列(即RNA序列转变成DNA序列的序列)来限定靶序列。双链分子包含有义链(其具有与靶序列对应的序列)和反义链(其具有与靶序列互补的序列)，而且该反义链与该有义链在互补序列处杂交以形成双链分子。

本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶基因的过表达。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。

本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。

在本发明中，术语“shRNA”是指：具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”。

可通过将细胞与针对RP1-45I4.3基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达RP1-45I4.3基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞以较低的速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用CCK-8、MTT细胞增殖测定。

任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因，可作为例子的细胞包括骨关节炎细胞。

根据本发明的方法，为抑制细胞生长并借此治疗疾病，当施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)时，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与相同靶序列匹配的RNA。或者，多种双链分子可作用于与相同基因的不同靶序列匹配的RNA，或作用于与不同基因的不同靶序列匹配的RNA。举例而言，所述方法可使用针对RP1-45I4.3基因不同靶序列的双链分子。或者，例如，本方法可利用针对RP1-45I4.3基因和其它基因的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应RNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂。

在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递物质相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。

用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递物质包括Mirus Transit TKO亲脂性物质、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递物质是脂质体。

本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到目的部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。

合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。

合适的非消化道施用途径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到目标部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。

本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。

在本发明中，“药物”、“药物组合物”可以通用。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。

作为一种优选的实施方式，本发明的药物组合物包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如，以重量计为0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。

根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个可针对相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对RP1-45I4.3基因靶序列的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对RP1-45I4.3基因和其它基因的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

本发明的组合物可以是药物组合物。本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。

对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20wt％、优选1-10wt％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1QPCR测序验证RP1-45I4.3基因的表达情况

1、样品收集

选取进行膝关节置换手术的患者78例，其中OA患者48例，正常对照30例，收集患者的血液样本和组织样本，OA组和对照组的年龄、性别无统计学意义。

OA组：纳入标准：1)根据OA诊断标准，确诊骨关节炎患者，行膝关节置换手术；2)为初次置换。排除标准：1)合并其他炎症性关节炎或自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎、痛风、系统性红斑狼疮等者；2)膝关节严重创伤史者；3)近3个月内有类固醇药物注射史或非类固醇类药物应用史者；4)合并严重肝肾功能疾病及心血管疾病者。

对照组：纳入标准：1)肢体毁损伤截肢术的患者；2)为初次置换。排除标准：1)所取关节术前有过明确外伤、疼痛；2)有骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风病史；3)X线检查提示存在明显骨关节炎表现者。

2、Trizol法提取样本中的RNA

使用Trizol试剂从组织和血液样本中提取总RNA。向细胞中加入1ml预冷的TRizol，混匀直至透明状溶液。将裂解液转移至1.5m1离心管中，室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入氯仿，振荡，离心。吸取无色上清液移至另一离心管，向上清液中加入异丙醇，静置，离心，移去上清液，加入乙醇，离心，移去上清液，室温干燥RNA沉淀，加入适量的无酶水溶解沉淀

3、qRT-PCR检测

取总RNA500ng，应用GeneCopoeia逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，反应条件：42℃15min，95℃2min。以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃40s)×40。引物由公司合成，相关引物序列如下：RP1-45I4.3(F：5’-TCCAGGTCCAAGTCAATC-3’，SEQ ID NO.1；R：5’-TGATGAAGCGATGAGGATAA-3’，SEQ ID NO.2)；GAPDH(F：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，SEQ ID NO.3；R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，SEQ ID NO.4)，通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2^-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，所有数据用采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，P<0.05定义为差异有统计学意义。对变量RP1-45I4.3进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

5、结果

结果如图1所示，与健康对照相比，RP1-45I4.3基因在骨关节炎病患者血液和组织中的表达显著上调，上调约9.86倍和11.23倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

ROC曲线分析表明RP1-45I4.3可以作为生物标志物应用于骨关节炎的诊断，其曲线下面积为0.875(血液样本)和0.923(组织样本)，可以有效的区分骨关节炎患者与正常对照。

实施例2RP1-45I4.3基因的沉默及对细胞的影响

1、细胞获取及培养

用含1％双抗PBS反复冲洗软OA患者的骨组织3次，无菌的眼科小剪刀将组织剪碎至1mm³大小的碎片，得到的软骨碎片放入l 0cm培养皿中，加入l0ml新鲜的0.25％胰蛋白酶，37℃,5％CO₂培养箱中消化30min，除去可能附着的成纤维细胞。吸出胰酶消化液，加入l0ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打混匀终止消化，用10ml的含双抗的PBS清洗2遍。向培养皿中加入0.2％II型胶原酶l0ml，置于37℃,5％CO₂培养箱中消化4h。将游离出的含有胶原酶溶液的软骨细胞悬液用吸管吸出，70μm 200目细胞筛过滤，所得滤液移入离心管中离心1000r/min，l0min，弃去上清液。用含10％FBS的DMEM培养基吹打混匀，25cm培养瓶中进行培养。

2、转染

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对RP1-45I4.3的siRNA，具体序列为5’-AUUGUGUUUCUAUUGUGUGUG-3’，SEQ ID NO.5；反义链为5’-CACACAAUAGAAACACAAUUA-3’，SEQ ID NO.6，对照为通用的siRNA-NC。按照Lipofectamine 3000试剂说明书步骤，分别混匀脂质体和OPTI-MEM减血清培养基以及siRNA和OPTI-MEM培养基，室温放置5min，然后将脂质体、siRNA和OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min。将混合溶液加入无血清的细胞培养基中，轻轻晃动混匀，孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。

3、qRT-PCR检测siRNA对RP1-45I4.3的沉默效果

使用Trizol法提取细胞总RNA，然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

4、CCK-8法检测细胞的增殖活性

取对数生长期的细胞，进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔；在72h加入CCK8试剂，100μL/孔，37℃避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长下检测吸光值(OD)。

5、流式细胞检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及流式细胞仪检测细胞凋亡。试剂配制参照细胞凋亡检测试剂盒说明书。细胞转染培养48h后，收集细胞，用100μl的Bindingbuffer溶液重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI Staining Solution，轻吹混匀，避光孵育15min。加入400μl 1×Binding buffer，使用流式细胞仪进行凋亡检测。

6、统计学分析

所有数据用采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，P<0.05定义为差异有统计学意义。

7、结果

干扰结果如图2所示，相比siRNA-NC组和空白对照组，转染siRNA-RP1-45I4.3实验组中的RP1-45I4.3基因表达水平显著下调，差异有统计学意义，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异。

CCK-8实验检测结果显示，相比转染siRNA-NC的对照组(OD值：0.926±0.0826)，转染siRNA-RP1-45I4.3的实验组的细胞增殖活性(OD值：1.425±0.11)显著增加，说明RP1-45I4.3影响软骨细胞的增殖。

细胞凋亡实验结果显示，相比转染siRNA-NC的对照组(凋亡率(％)：19.4±1.841)，转染siRNA-RP1-45I4.3实验组的细胞凋亡(凋亡率(％)：8.45±0.86)显著降低，说明降低RP1-45I4.3的表达水平可以抑制软骨细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西安市红会医院

<120> 诊治骨关节炎的靶基因

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccaggtcca agtcaatc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatgaagcg atgaggataa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctggtaaa gtggatattg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

auuguguuuc uauugugugu g 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacacaauag aaacacaauu a 21

Claims

1.如下任一项应用：

a.试剂在制备诊断骨关节炎的工具中的应用，其特征在于，所述试剂可以检测RP1-45I4.3的水平；

b.产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测RP1-45I4.3的水平的试剂；

c. RP1-45I4.3在构建诊断骨关节炎的计算模型中的应用；

d. RP1-45I4.3的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为靶向目的基因RP1-45I4.3序列的siRNA；

e.组合物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的RP1-45I4.3的抑制剂，所述抑制剂为靶向目的基因RP1-45I4.3序列的siRNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，a或b中所述试剂选自：

特异性识别RP1-45I4.3的探针；或特异性扩增RP1-45I4.3的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增RP1-45I4.3的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，b中所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。