CN111235262B - 一种诊断产品及其治疗药物及其在骨关节炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断产品及其治疗药物及其在骨关节炎中的应用，具体的公开了包括检测AC093484.4表达水平的试剂的诊断产品，和包括增加AC093484.4表达水平的促进剂的治疗药物，以及该诊断产品和治疗药物在骨关节炎中的应用。

Description

一种诊断产品及其治疗药物及其在骨关节炎中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种诊断产品及其治疗药物及其在骨关节炎中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种最常见的骨关节慢性退行性疾病，其特征是关节软骨退变，软骨下骨硬化，滑膜增生以及骨赘形成(Cheng C,Zhang FJ,etal.Osteopontin inhibits HIF-2alpha mRNAexpression in osteoarthriticchondrocytes.Experimental and therapeutic medicine,2015,9(6):2415-2419.)。据统计，国外65岁以上的人群中，OA的发病率超过50％，随着中国人口的人均寿命的延长以及人口老龄化的到来，OA的发病率呈现上升趋势(Deshpande BR,Katz JN,et al.Number ofPersons With Symptomatic Knee Osteoarthritis in the US:Impact of Race andEthnicity,Age,Sex,and Obesity.Arthritis care&research,2016,68(12):1743-1750.)。OA多见于膝关节、髋关节、腰椎、远节指间关节，其常见的临床症状为疼痛、关节功能障碍和活动受限，常常大幅降低患者的生活质量(Cheng C,Gao S,Lei G.Associationof osteopontin with osteoarthritis.Rheumatology international,2014,34(12):1627-1631.)。至今为止，OA的致病原因仍然没有完全清楚，已知的相关致病因素包括年龄、性别、肥胖、遗传、机械应力等等。OA的诊断主要依据患者病史、症状以及影像学检查。早期OA的治疗以保守治疗为主，包括改变生活习惯、控制体重、物理治疗、非甾体类消炎止痛药以及关节腔玻璃酸钠注射等等，目标为缓解疼痛和控制症状进一步发展，但其临床效果差异较大，一些患者对保守治疗的效果较差，少部分患者甚至会出现药物副作用(Tonge DP,Pearson MJ,Jones SW.The hallmarks of osteoarthritis and the potential todevelop personalised disease-modifying pharmacologicaltherapeutics.Osteoarthritis and cartilage,2014,22(5):609-621.)。而晚期OA对药物以及物理治疗的效果较差，往往不得不采用如关节镜、关节置换、关节周围截骨或者关节融合等手术治疗方法，而手术治疗的花费高昂，且面临一定比例的并发症，效果仍难以令人满意。因此，探索和发现潜在的替代治疗方法就成为医学界眼下迫切的需求。进一步阐明OA的致病原因将有助于人们发现新的OA生物标志物，从而可已辅助对OA进行早期诊断和早期治疗。而对OA具体病理过程阐释将有助于人们发现新的治疗标靶，从而提高OA的临床治疗效果，改善广大OA患者的症状，提高患者生活治疗(Su W,Xie W,Shang Q,Su B.The LongNoncoding RNAMEG3 Is Downregulated and Inversely Associated with VEGF Levelsin Osteoarthritis.BioMed research international,2015,2015:356893.)。

人类基因组中大约只有1％具有蛋白编码功能。70％-90％的人类基因组转录产物与蛋白编码无关，这些转录产物称为非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)(Batista PJ,Chang HY.Long noncoding RNAs:cellular address codes in development anddisease.Cell,2013,152(6):1298-1307.)。ncRNA一度被视为没有功能的RNA，但随着研究的深入，学者们认识到ncRNA在疾病进程中也发挥着相当重要的作用。LncRNA是ncRNA的亚类，定义长度大于200个核苷酸的RNA分子，在细胞的多种功能中发挥着至关重要的作用(Bergmann JH,Spector DL.Long non-coding RNAs:modulators of nuclear structureand function.Current opinion in cell biology,2014,26:10-18.)。关节软骨是一种透明软骨，来源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，其主要成份为软骨细胞和细胞外基质。软骨ECM主要由II型胶原、蛋白多糖、蛋白聚糖组成。近年来已经有文献报道1ncRNA参与了软骨细胞的代谢，并且在OA的发生发展过程中起着重要的作用(HuynhNP,Anderson BA,Guilak F,McAlinden A.Emerging roles for long noncoding RNAs inskeletal biology and disease.Connective tissue research,2017,58(1):116-141.)，更深入的探究1ncRNA和OA的关系将有助于明确OA发病的病因，为OA的治疗提供新的靶点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诊断产品和治疗药物及其在骨关节炎中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括检测生物标志物AC093484.4的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性针对AC093484.4的探针或引物。

进一步，所述引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步，所述产品中还包括说明书，说明书中记载了当生物标志物AC093484.4表达显著下调时，受试者患有骨关节炎或者存在患骨关节炎的风险。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。

本发明的第二方面提供了本发明的第一方面所述的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括AC093484.4的促进剂

进一步，所述促进剂促进AC093484.4的表达水平。

进一步，所述促进剂包括过表达AC093484.4的载体。

进一步，所述药物组合物还包括与所述促进剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第四方面提供了本发明的第三方面所述的药物组合物在制备治疗骨关节炎的产品中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了AC093484.4基因表达与骨关节炎病相关，通过检测受试者样品中AC093484.4的表达水平，可以有效的区分骨关节炎患者与健康对照。

本发明基于AC093484.4在骨关节炎患者中表达下调，设计针对AC093484.4的过表达载体进行细胞实验，发现改变软骨细胞中的AC093484.4的表达水平可以显著的影响软骨细胞的增殖与凋亡，为骨关节炎的精准治疗提供了分子手段。

附图说明

图1是AC093484.4基因在样本中的表达情况图。

具体的实施方式

术语或“标志物”或“生物标志物”一般指其在组织或细胞中/上表达或分泌的可以通过已知的方法(或本文所披露的方法)来检测且是预测性的或以用于预测(或帮助预测)患者患病风险的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。本文中特别感兴趣的生物标志物是AC093484.4。

在本发明中，AC093484.4包括野生型、突变型或其片段。对于本发明的目的，“AC093484.4”指AC093484.4的DNA或mRNA，包括其中任意一种样品中AC093484.4检测的片段或部分。一种代表性的AC093484.4基因具有ENST00000441875.1所示的序列。

“样品”或“样本”指从骨关节炎患者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、分泌物、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。本文中患者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液。

与骨关节炎患者临床受益有关的生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中可检测的水平。这些可以通过本领域中技术人员已知的的方法来测量。这些方法包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合特性，以及与参照核酸以相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺、甲基磷酸、手性甲基磷酸、2-O-甲基核苷酸、肽核酸(PNA)。

除非另外指出，具体的核酸序列还包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生下述序列来实现，该序列中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。

如本文所用的药物组合物，它含有有效量的所述的AC093484.4的促进剂，和/或药学上可接受的载体，所述的药物组合物可用于治疗骨关节炎。

所述的AC093484.4的促进剂是指任何可提高AC093484.4基因或表达产物稳定性、上调AC093484.4的表达、增加lncRNA AC093484.4的有效作用时间或促进AC093484.4基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调AC093484.4基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗骨关节炎。

作为本发明的一种优选方式，所述的AC093484.4的促进剂是一种含有AC093484.4的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的促进剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明的药物组合物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR测序验证AC093484.4基因的表达情况

1、样品收集

选取进行膝关节置换手术的患者78例，其中OA患者48例，正常对照30例，收集患者的血液样本和组织样本，OA组和对照组的年龄、性别无统计学意义。

OA组：纳入标准：1)根据OA诊断标准，确诊骨关节炎患者，行膝关节置换手术；2)为初次置换。排除标准：1)合并其他炎症性关节炎或自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎、痛风、系统性红斑狼疮等者；2)膝关节严重创伤史者；3)近3个月内有类固醇药物注射史或非类固醇类药物应用史者；4)合并严重肝肾功能疾病及心血管疾病者。

对照组：纳入标准：1)肢体毁损伤截肢术的患者；2)为初次置换。排除标准：1)所取关节术前有过明确外伤、疼痛；2)有骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风病史；3)X线检查提示存在明显骨关节炎表现者。

2、Trizol法提取样本中的RNA

使用Trizol试剂从组织和血液样本中提取总RNA。向细胞中加入1ml预冷的TRizol，混匀直至透明状溶液。将裂解液转移至1.5m1离心管中，室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入氯仿，振荡，离心。吸取无色上清液移至另一离心管，向上清液中加入异丙醇，静置，离心，移去上清液，加入乙醇，离心，移去上清液，室温干燥RNA沉淀，加入适量的无酶水溶解沉淀

3、qRT-PCR检测

取总RNA500ng，应用GeneCopoeia逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，反应条件：42℃15min，95℃2min。以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃40s)×40。通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2^-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。引物由公司合成，相关引物序列如下：

AC093484.4：

F：5’-CTGTAGATGGTGATAGTGA-3’，SEQ ID NO.1；

R：5’-ATAATAATAATGATGCCTGACT-3’，SEQ ID NO.2；

GAPDH：

F：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，SEQ ID NO.3；

R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，SEQ ID NO.4，

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPadSoftware软件进行绘图。P<0.05定义为差异有统计学意义。对变量AC093484.4进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

5、结果

结果如图1所示，与健康对照相比，AC093484.4基因在骨关节炎病患者血液和组织中的表达显著下调，下调约3.65倍和4.57倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

ROC曲线分析表明AC093484.4可以作为生物标志物应用于骨关节炎的诊断，其曲线下面积为0.847(血液样本)和0.892(组织样本)，可以有效的区分骨关节炎患者与健康对照。

实施例2 AC093484.4基因的过表达及对细胞的影响

1、细胞获取及培养

用含1％双抗PBS反复冲洗骨关节炎患者的软骨组织3次，无菌的眼科小剪刀将组织剪碎至1mm³大小的碎片，得到的软骨碎片放入l 0cm培养皿中，加入l0ml新鲜的0.25％胰蛋白酶，37℃,5％CO₂培养箱中消化30min，除去可能附着的成纤维细胞。吸出胰酶消化液，加入l0ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打混匀终止消化，用10ml的含双抗的PBS清洗2遍。向培养皿中加入0.2％II型胶原酶l0ml，置于37℃,5％CO₂培养箱中消化4h。将游离出的含有胶原酶溶液的软骨细胞悬液用吸管吸出，70μm 200目细胞筛过滤，所得滤液移入离心管中离心1000r/min，l0min，弃去上清液。用含10％FBS的DMEM培养基吹打混匀，25cm培养瓶中进行培养。

2、转染

根据AC093484.4的序列合成特异的PCR扩增引物。以骨关节炎患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到经KpnI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-AC093484.4。按照Lipofectamine 3000试剂说明书步骤，分别混匀脂质体和OPTI-MEM减血清培养基以及质粒和OPTI-MEM培养基，室温放置5min，然后将脂质体、质粒和OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min。将混合溶液加入无血清的细胞培养基中，轻轻晃动混匀，孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。

3、qRT-PCR检测AC093484.4的转染效果

使用Trizol法提取细胞总RNA，然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

4、CCK-8法检测细胞的增殖活性

取对数生长期的细胞，进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔；在72h加入CCK8试剂，100μL/孔，37℃避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长下检测吸光值(OD)。

5、流式细胞检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及流式细胞仪检测细胞凋亡。试剂配制参照细胞凋亡检测试剂盒说明书。细胞转染培养48h后，收集细胞，用100μl的Bindingbuffer溶液重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI Staining Solution，轻吹混匀，避光孵育15min。加入400μl 1×Binding buffer，使用流式细胞仪进行凋亡检测。

6、统计学分析

所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析，P<0.05定义为差异有统计学意义。

7、结果

转染结果显示，以空白对照组AC093484.4的表达水平作为参比设为1，相比转染空载组的AC093484.4的表达水平(0.94±0.043)和空白对照组，转染pcDNA3.1-AC093484.4组的AC093484.4的表达水平(3.313±0.321)显著上调，差异具有统计学意义(空白对照VS实验组：P＝0.0064；转染空载组VS实验组：P＝0.0061)，而空白对照组和转染空载组之间则无显著变化(P＝0.1399)。

CCK-8实验检测结果显示，相比转染空载对照组的细胞活性(OD值：0.83±0.058)，转染pcDNA3.1-AC093484.4的实验组的细胞活性(OD值：1.54±0.092)显著增加，差异具有统计学意义(P<0.0001)。

细胞凋亡实验结果显示，相比转染空载对照组的细胞的凋亡率(17.69±0.79)％，转染pcDNA3.1-AC093484.4的细胞的凋亡率(9.14±0.48)％显著降低，差异具有统计学意义(P<0.0001)。

综上，AC093484.4在骨关节炎细胞的增殖和凋亡中起着重要的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西安市红会医院

<120> 一种诊断产品及其治疗药物及其在骨关节炎中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtagatgg tgatagtga 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataataataa tgatgcctga ct 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctggtaaa gtggatattg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (8)

1.产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用，其特征在于，所述产品包括检测生物标志物AC093484.4表达水平的试剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对AC093484.4的探针或引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.1~2所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中还包括说明书，说明书中记载了当生物标志物AC093484.4表达显著下调时，受试者患有骨关节炎或者存在患骨关节炎的风险。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。

6.药物组合物在制备治疗骨关节炎的产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括AC093484.4的促进剂，所述促进剂促进AC093484.4的表达水平。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述促进剂包括过表达AC093484.4的载体。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述促进剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

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