CN110201172B - Yy1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明的研究成果显示，在三阴性乳腺癌中，YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域，调控KTN1基因表达，而KTN1基因的表达与三阴性乳腺癌的发生正相关，且靶向沉默YY1可以显著抑制KTN1的表达，从而改善或者治疗三阴性乳腺癌；本发明公开的siRNA可靶向沉默YY1治疗三阴性乳腺癌，该siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种；本发明公开的试剂可用于监控与检测三阴性乳腺癌，具有实际应用价值。

Description

YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺上皮的一种恶性肿瘤。截止到2012年，乳腺癌已成为全球女性最常见的癌症，全球约有52万人死于乳腺癌。在中国，乳腺癌约占女性新诊断癌症的15％。据估计，到2035年，中国女性约有250万将诊断为新发乳腺癌患者，这将严重威胁到女性的健康，不容忽视。按照分子分型的不同，可将乳腺癌分为雌激素/孕激素受体(ER/PR)表达阳性的乳腺癌、Her-2受体表达阳性的乳腺癌及三阴性乳腺癌(简称TNBC)。虽然TNBC仅占乳腺癌的15％-20％，但TNBC患者死亡率明显高于其他亚型乳腺癌患者，这主要是由于TNBC转移侵袭性高所致。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC更具侵袭性，也更难治疗。放疗和化疗是TNBC患者手术后治疗的两种主要方法。标准化疗对TNBC亚型有一定疗效，但晚期患者对化疗反应一般较差。考虑到影响TNBC转移复发的原因及治疗方式，靶向治疗成为临床有效地治疗TNBC的迫切需求。因此，深入探索TNBC发生发展的分子机制，研究新型靶点药物，对TNBC患者进行个体化靶向治疗具有重要意义。
KTN1是一种膜受体蛋白，定位于14号染色体q22.1上，分子量为120KD和160KD。KTN1多数定位在内质网膜上，少量存在于线粒体中。KTN1能够通过招募黏着斑，参与内质网的延伸；也可通过与驱动蛋白(Kinesin)相互作用，增加线粒体代谢功能。KTN1在肿瘤的发生发展及转移中具有重要作用。KTN1与疾病正相关，但目前对KTN1与肿瘤相关的研究文献较少，主要研究方向与肝细胞癌相关抗原、急性白血病和宫颈癌相关。
YIN YANG-1(YY1)是一个具有激活和抑制转录的双重转录因子，进化相对保守，能够调控GL1-Kruppel class的蛋白质。人类YY1基因位于14号染色体端粒区，q32.2，编码含有414个氨基酸的蛋白。YY1C端的4个C2H2样锌指结构为重要的转录激活域，可与具有YY1接合元件的启动子相互结合进行转录调控。YY1N端为转录活化结构域，具体从N到C端分别为：一酸性区域、一段富含甘氨酸的区域、连续12个组氨酸、一段富含脯氨酸和谷氨酸的区域。176-200氨基酸残基可与转录抑制因子HDAC等结合而抑制转录。REPO结构域具有招募PRC至DNA的功能，与基因抑制有关。早期研究发现，YY1能够影响早期胚胎的发育过程，YY1的缺失会导致胚胎死亡。它能够招募如p300，HDAC1，Mdm2，Ezh2和PRMT1调控细胞进程，也可以调控许多癌症相关的基因如c-MYC和c-Fos表达，从而影响细胞增殖与分化，细胞周期进程、代谢、凋亡等生物过程。
然而，许多对于YY1在肿瘤中的研究尚处于初步阶段。比如，在三阴性乳腺癌中YY1/KTN1信号通路调控轴是如何发挥作用的研究目前尚无报道；同时，其潜在的分子生物学机制也尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
为实现以上目的，本发明第一方面提供一种YY1表达抑制剂在制备抑制KTN1基因表达药物中的应用，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子。
作为上述技术方案的进一步改进，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。
本发明第二方面提供一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子，从而下调癌细胞中KTN1基因表达。
作为上述技术方案的进一步改进，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。
作为上述技术方案的进一步改进，所述治疗乳腺癌药物为治疗三阴性乳腺癌的药物。
本发明第三方面提供一种YY1表达抑制剂，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。
本发明第四方面提供一种治疗乳腺癌药物，包括如上所述的YY1表达抑制剂。
作为上述技术方案的进一步改进，还包括可药用载体。
作为上述技术方案的进一步改进，所述治疗乳腺癌药物为治疗三阴性乳腺癌的药物。
本发明第五方面提供一种YY1蛋白与KTN1启动子结合情况检测试剂在制备乳腺癌检测及预后评估的产品中的应用，所述试剂包括用于扩增YY1蛋白与KTN1启动子结合位点的引物对，所述引物对的序列包括如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ IDNO.8所示序列中的至少一对。
本发明的有益效果：
本发明提供一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明的研究成果显示，在三阴性乳腺癌中，YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域，调控KTN1基因表达，而KTN1基因的表达与三阴性乳腺癌的发生正相关，且靶向沉默YY1可以显著抑制KTN1的表达，从而改善或者治疗三阴性乳腺癌；本发明公开的siRNA可靶向沉默YY1治疗三阴性乳腺癌，该siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种；本发明公开的试剂可用于监控与检测三阴性乳腺癌，具有实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1示出了本发明的实施例1的在癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库中YY1基因在乳腺癌组织与癌旁组织中的RNA表达情况；
图2示出了本发明的实施例1中qRT-PCR方法检测临床收集的TNBC临床患者肿瘤组织、癌旁组织中YY1RNA的表达情况；
图3示出了本发明的实施例2中siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染MDA-MB-231细胞和BT549细胞后，使用qRT-PCR方法检测的KTN1RNA表达情况；
图4示出了本发明的实施例2中siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染MDA-MB-231细胞0h、24h、48h和72h后，使用CCK8方法检测MDA-MB-231细胞增殖的变化图；
图5示出了本发明的实施例2中siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染BT549细胞0h、24h、48h和72h后，使用CCK8方法检测BT549细胞增殖的变化图；
图6示出了本发明的实施例3中通过TCGA数据库查询的在侵袭性乳腺癌肿瘤及癌旁中YY1基因的表达与KTN1表达的相关性；
图7示出了本发明的实施例3中siNC、siYY1_1和siYY1_2转染MDA-MB-231细胞后，使用qRT-PCR方法检测的YY1RNA与KTN1RNA表达情况；
图8示出了本发明的实施例3中siNC、siYY1_1和siYY1_2转染MDA-MB-231细胞后，使用蛋白免疫印迹分析方法检测的YY1蛋白与KTN1蛋白表达情况；
图9示出了本发明的实施例3中siNC、siYY1_1和siYY1_2转染BT549细胞后，使用qRT-PCR方法检测的YY1RNA与KTN1RNA表达情况；
图10示出了本发明的实施例3中siNC、siYY1_1和siYY1_2转染BT549细胞后，使用蛋白免疫印迹分析方法检测的YY1蛋白与KTN1蛋白表达情况；
图11示出了本发明的实施例4中使用ChIP实验分析BT549细胞中YY1蛋白与KTN1启动子区的结合情况；
图12示出了本发明的实施例4的YY1与KTN1预测的结合位点；
图13示出了本发明的实施例4的BT549细胞中YY1蛋白与KTN1启动子区的结合位点的序列；
图14示出了本发明的实施例4的BT549细胞中通过qRT-PCR产物琼脂糖水平电泳方法测得的YY1蛋白与KTN1启动子区的结合情况。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
如本文所用，术语“小干扰RNA”、“Small interfering RNA”及“siRNA”含义相同。
本发明一个实施方式提供一种YY1表达抑制剂在制备抑制KTN1基因表达药物中的应用，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子。
可选的，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。siRNA可以通过RNA干扰，从而高效、特异性地阻断体内同源基因的表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。
上述，该siRNA可以在体内靶向下调YY1基因的表达，由于YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域，从而调控KTN1基因表达，因此靶向沉默YY1可以显著抑制KTN1的表达。
可选的，所述siRNA采用磷酸骨架修饰、核糖修饰、碱基修饰和锁核酸修饰过。所述的修饰基本不改变寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。
磷酸骨架修饰：连接在RNA磷酸骨架的磷酸二酯键是核酸酶作用的关键化学键，而磷原子是核酸酶攻击的重要靶点，对磷原子稍加修改即会大大的影响酶的降解作用，如硫代修饰，硫代磷酸是用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子，即P-S键代替P-O键，能够提高siRNA抗核酸酶的能力，增加其稳定性。
核糖修饰：siRNA在体内进行水解时，在RNA酶催化下，3'磷酯键断开，与2'-OH形成环状磷酸二脂，最终形成水解产物。2'-OH不是siRNA发挥效用的必须基团，对siRNA所在单、双链的化学修饰都不会影响其基团沉默效果。因此，可以对核糖的2'位置可以进行多种修饰，如氟、甲基等，从而提高siRNA分子核酸酶抵抗力，提高其稳定性。
碱基修饰：siRNA与mRNA通过碱基互补之间形成氢键，发挥RNAi的作用，因此通过对碱基进行修饰，加强碱基与碱基之间的相互作用。在尿嘧啶的5'位点引入溴或碘是最常用的碱基修饰方法，如5-溴-尿嘧啶和5-碘-尿嘧啶可加强腺嘌呤-尿嘧啶之间的连接，从而提高碱基之间的相互作用以及与靶mRNA的相互作用。
锁核酸修饰：指siRNA中的某些核苷酸是锁核酸单体，即双环核苷或其类似物，具体来说是siRNA中的核糖部分多出了一个可连接2'-羟基上的氧原子和4'-碳原子的桥键，使得该核糖部分被固定在3'-内构形(3'-endo conformation)，因而使siRNA不易被核酸酶水解，且siRNA活性不被改变，更佳地，所述锁核酸可提高siRNA的稳定性、活性或治疗效果。
应理解，任何能够保持所述siRNA的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
本发明的再一个实施方式提供一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子，从而下调癌细胞中KTN1基因表达。
可选的，所述治疗乳腺癌药物为治疗三阴性乳腺癌的药物。
在三阴性乳腺癌中，YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域，调控KTN1基因表达，而KTN1基因的表达与三阴性乳腺癌的发生正相关，且靶向沉默YY1可以显著抑制KTN1的表达，从而改善或者治疗三阴性乳腺癌。
可选的，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。
siRNA通过靶向抑制YY1基因的表达，从而下调三阴性癌细胞中KTN1基因表达，最终改善或者治疗三阴性乳腺癌。
具体的，所述siRNA抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移与侵袭能力。
可以理解的是，通过抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移与侵袭能力，从而达到改善或者治疗三阴性乳腺癌的效果。
本发明的又一个实施方式提供一种YY1表达抑制剂，所述YY1表达抑制剂包括siRNA，所述siRNA的序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQ ID NO.2所示的序列中的至少一种。
本发明的另一个实施方式提供一种治疗乳腺癌药物，包括如上所述的YY1表达抑制剂。
通常，上述的治疗乳腺癌药物在本发明中一般以药物组合物的形式使用。该药物组合物可通过靶向抑制YY1基因的表达从而改善或治疗乳腺癌。所述药物组合物包括YY1表达抑制剂与可药用载体。
可以理解的是，可药用载体是指一种或者多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，该可药用载体适合将本发明中的siRNA应用于个体。所述可药用载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂等，和其他的适合本发明的siRNA应用的载体。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、缓冲液、葡萄糖溶液、甘油等；可口服用的载体包括甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。与此同时，作为生物学上中性的载体，应用的药理学组分中可以含有非毒性的辅助物质，包括湿化或者乳化剂、防腐剂、pH缓冲试剂、醋酸钠和单月桂酸酯等。
优选的，所述可药用载体包括糖、甘露醇、氨基酸、淀粉、脂质中的至少一种。
该药物组合物可以用于运输siRNA到期望部位如乳腺的任意方式给予。例如可以是通过肌肉内、腹膜内或静脉内注射方式来施用本实施方式的siRNA。作为一个具体实施方式，由个体四肢肌肉，如手臂或腿等某处位置将siRNA注射到个体体内。
上述，所述药物组合物靶向抑制YY1基因表达，从而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子，下调癌细胞中KTN1基因表达，达到对乳腺癌进行治疗的目的。
具体的，所述治疗乳腺癌药物为治疗三阴乳腺癌药物。
具体的，所述治疗乳腺癌药物抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移与侵袭能力。
本发明的一个实施方式还提供一种YY1蛋白与KTN1启动子结合情况检测试剂在制备乳腺癌检测及预后评估的产品中的应用，所述试剂包括用于扩增YY1蛋白与KTN1启动子结合位点的引物对，所述引物对的序列包括如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示序列中的至少一对。
上述提供的任一对引物对，其序列如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6或者SEQ IDNO.5与SEQ ID NO.6的所示，可以检测YY1蛋白是否结合到KTN1基因的启动子上，从而确定待检乳腺癌是否是三阴性乳腺癌。且通过该引物对可以对YY1蛋白与KTN1启动子结合位点进行ChIP分析，可以对治疗乳腺癌的药物的预后效果进行评估，DNA表达量高则预后效果差。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
(1)细胞组织材料：选取三阴性乳腺癌细胞系BT549细胞和MDA-MB-231细胞，在温度为37℃、质量浓度为5％的CO2孵箱条件下，分别使用质量浓度为10％的FBSDMEM培养基在培养皿中进行传代培养。
(2)YY1基因沉默模型：当MDA-MB-231和BT549细胞汇合度长至70％时，将BT549细胞和MDA-MB-231细胞分别分为3组，即siNC组、siYY1_1和siYY1_2组。
用PBS洗两遍细胞，使用30μl lipofectamine2000脂质体分别混合15μL siNC、siYY1_1和siYY1_2；其中，siYY1_1的序列为:5'-CGACGACTACATTGAACAA-3'，具体如SEQ IDNO.1所示；siYY1_2的序列为:5'-CCTGAAATCTCACATCTTA-3'，具体如SEQ ID NO.2所示；siNC组为阴性对照组，siNC由广州市锐博生物科技有限公司提供，其产品名称为siR NC#1，产品编号为siN0000001-1-5。再分别用无血清无抗生素DMEM培养基稀释得到三组混合液，稀释后的每组混合液总体积为400μl，混合液室温静置15min。
将混合液室温静置15min。随后在MDA-MB-231和BT549细胞的siNC组、siYY1_1和siYY1_2组的培养皿中分别加入体积为4.4ml的无血清无抗生素DMEM培养基，将三组混合液逐滴加入至对应的培养皿中，使siNC、siYY1_1和siYY1_2转染MDA-MB-231与BT549细胞，培养3-5h后弃掉培养皿中旧培养基，加入含有血清和抗生素的DMEM培养基，在温度为37℃、质量浓度为5％的CO2培养条件下继续培养得到YY1基因沉默模型构建完成的MDA-MB-231与BT549细胞。
(3)反转录(qRT-PCR)反应：分别在48h后收集YY1基因沉默模型构建完成的MDA-MB-231与BT549细胞，用PBS洗两遍，使用胰蛋白酶消化细胞，收集在1.5ml离心管中。Trizol法提取细胞内总RNA，反转录反应体系为：
试剂 使用量
Total RNA 1μg
Anchored Oligo(dT) 1μl
2×ES Reaction Mix 10μl
EasyScript RT/TI Enzyme Mix 1μl
gDNA Remover 1μl
Total volume 20μl
在温度为42℃孵育15min后，再在85℃加热5s失活反应体系中的酶混合物，最后在温度为4℃条件下孵育直至冷却。
(4)引物序列设计(注：FP/RP为一对引物，分别表示上游引物片段与下游引物片段，其他以此类推)：
YY1基因引物序列为：
hYY1_FP(SEQ ID NO.3)：5'-CTGGCATTGACCTCTCAGATC-3'；
h YY1_RP(SEQ ID NO.4)：5'-GCCGAGTTATCCCTGAACATC-3'；
YY1与KTN1结合位点设计的引物序列为：
Figure BDA0002101610430000091
(5)染色质免疫沉淀实验(ChIP)：ChIP是在全基因组范围内识别DNA与蛋白质相互作用的标准方法，最初用于组蛋白修饰研究，后来也用于转录因子。整个实验涉及到一系列蛋白质组学和分子生物学的方法，包括交联、细胞裂解、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA样品的纯化以及qRT-PCR等分析。具体包括如下步骤：
①细胞交联及裂解：每个样本使用1-2×107个BT549细胞，在每20ml培养基培养的细胞中加入终浓度为1％的新鲜甲醛，轻柔的摇晃，室温孵育10min。向交联中的BT549细胞加入10×甘氨酸，轻柔的摇晃，室温孵育5min，离心后每个培养皿中加入2ml冰冻PBS和10μl100×蛋白酶抑制剂(PIC)混合液转移细胞至1.5ml离心管。
②裂解液超声：次日，每1×107个细胞需要1ml SDS Lysis Buffer，1ml SDSLysis Buffer中加入5μl 100×PIC，超声破碎条件为：100％power，4℃water bath，30secon，30sec off，8cycles。10000×g 4℃离心10min，将上清液转移至新的EP管中，弃掉未被裂解的细胞团块。
③溶解蛋白/DNA复合物：制备完全Dilution Buffer，900μl的Dilution Buffer中加入4.5μl的100×PIC，混合后分别加入至每个样本中。细胞团块3000-5000×g 4℃离心1min，将上清转移至新EP管中。吸出10μl上清液作为Input至新的EP管中，放置冰上，直至后续实验。在每组IP样品中分别加入IgG抗体和c-MYC抗体，4℃翻转孵育过夜。次日，在每组IP样品中分别加入60μl Protein G Agarose，4℃翻转孵育1h。细胞团块3000-5000×g 4℃离心1min，弃上清。使用以下几种试剂清洗Protein GAgarose/抗体/染色质复合物：
a.Low Salt Immune Complex Wash Buffer，清洗1次；
b.High Salt Immune Complex Wash Buffer，清洗1次；
c.LiCl Immune Complex Wash Buffer，清洗1次；
d.TE Buffer，清洗2次；
每次清洗都在4℃翻转摇床上清洗3-5min。
④溶解蛋白/DNA复合物：制备200μl Elution Buffer/样品：
Figure BDA0002101610430000101
Input样品加入200μl Elution Buffer，其余IP样品分别加入100μl ElutionBuffer，室温孵育15min，3000-5000×g 4℃离心1min，将上清转移至新EP管；再向每个IP样品中加入100μl Elution Buffer，重复一遍。每个样品最后得到200μl总体积的液体。
⑤蛋白/DNA复合物解交联：Input和IP的样品分别加入8μl 5M NaCl，65℃水浴孵育4-5h或者孵育过夜，-20℃贮存。Input和IP的样品分别加入1μl RNase A，37℃水浴孵育30min。
Input和IP的样品分别加入以下样品混合液：
Figure BDA0002101610430000102
⑥DNA纯化：将上述样品约200μl分别加入到2ml Phase Lock Gel Heavy收集管中，再加入300μl氯仿。10000×g室温离心15min。离心后可见有机相在Gel下，而水相在Gel上，用移液器小心吸取上层水相至新的EP管，加入2倍体积的无水乙醇，30μl 3M的醋酸钠和4-10μl糖原，-20℃过夜。次日，样品10000×g 4℃离心30min。可见EP管底有白色沉淀，弃上清。10000×g 4℃空管离心1min。EP管室温晾干，加入15-20μl灭菌DEPC水，-20℃冰箱贮存。分离出的DNA 4倍稀释用于qRT-PCR反应。
(6)实时荧光定量PCR：在EP管中配制下列PCR反应液：
SYBR reaction buffer 5μl
cDNA 3μl
Primer(R+F) 0.2μl
DEPC H<sub>2</sub>O 1.8μl
Total 10μl
在PCR仪上按下列条件进行qRT-PCR反应。
95℃ 10min
95℃ 30sec
60℃ 30sec 40cycles
72℃ 5min
72℃ 10min
4℃holding
实验结果分析方法：
反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线，基因的表达量＝2-ΔΔCt，即ΔΔct＝(实验组目的基因的Ct的平均值－实验组管家基因GAPDH的Ct的平均值)－(对照组目的基因的Ct的平均值一对照管家基因的Ct的平均值)。
(7)CCK-8方法检测细胞增殖：
分别取YY1基因沉默模型构建完成后生长状态良好的MDA-MB-231与BT549对数生长期细胞，调整细胞密度至6×104个/ml，100μl/孔接种于96孔培养板中，每组5个复孔。分别在0h、24h、48h和72h后，每孔加入10％体积的CCK-8溶液，避光放置于37℃、质量浓度为5％的CO2培养箱中培养2-4h，用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值。
(8)蛋白免疫印迹分析：每个培养皿加入100μl RIPA蛋白裂解液和200×PIC蛋白酶抑制剂，-80℃冻存裂解。次日，样品在转速为12000rpm，4℃温度条件下离心15min，然后收集上清液，即蛋白裂解液，测定浓度，进行蛋白免疫印迹分析。
(9)统计学分析使用SPSS21.0版本软件，执行独立样本单因素方差分析，三组数据比较采用方差分析，同时均进行方差齐性分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有统计学意义。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例涉及三阴性乳腺癌(TNBC)患者肿瘤组织中YY1基因的RNA表达情况：
首先，对癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库中YY1基因的表达情况进行分析，结果如图1所示；图1示出了在癌症基因组图谱计划(TCGA)数据库中YY1基因在乳腺癌组织与癌旁组织中的RNA表达情况；由图1可知，YY1基因在1085例侵袭性乳腺癌肿瘤(BRCA)中的RNA表达水平远高于癌旁组织(291例)，YY1RNA在侵袭性乳腺癌肿瘤(BRCA)中高表达。
此外，分别收集4组TNBC临床患者肿瘤组织、癌旁组织进行qRT-PCR检测，结果如图2所示(图2中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；图2表示qRT-PCR方法检测临床收集的TNBC临床患者肿瘤组织、癌旁组织中YY1RNA的表达情况；由图2可知，TNBC肿瘤组织中YY1RNA的表达量远远高于癌旁组织中YY1RNA的表达量。
结论：YY1基因与TNBC的发生相关，TNBC患者肿瘤组织中YY1RNA的表达量升高。
实施例2
本实施例涉及检测KTN1基因对TNBC细胞系MDA-MB-231和BT549细胞的增殖与KTN1RNA表达的影响。
KTN1基因沉默模型构建：当MDA-MB-231和BT549细胞汇合度长至70％时，将MDA-MB-231和BT549细胞分别分为3组，即siNC'组、siKTN1_1组和siKTN1_2组。
使用30μl lipofectamine2000脂质体分别混合50nM的15μL siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2，再分别用无血清无抗生素DMEM培养基稀释得到三组混合液，稀释后的每组混合液总体积为400μl。其中，siKTN1_1序列为:5'-GAGTGATCTTTCTAGCAAA-3'，如SEQ ID NO.1所示；siKTN1_2序列为:5'-GAAGTCTGGTGTAATACAA-3'，如SEQ ID NO.2所示；siNC'组为阴性对照组，siNC'由广州市锐博生物科技有限公司提供，其产品名称为siR NC#1，产品编号为siN0000001-1-5。
将混合液室温静置15min。随后在MDA-MB-231和BT549细胞的siNC'组、siKTN1_1组和siKTN1_2组的培养皿中分别加入体积为4.4ml的无血清无抗生素DMEM培养基，将三组混合液逐滴加入至对应的培养皿中，使siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染MDA-MB-231与BT549细胞，培养3-5h后弃掉培养皿中旧培养基，加入含有血清和抗生素的DMEM培养基，在温度为37℃、质量浓度为5％的CO2培养条件下继续培养得到KTN1基因沉默模型构建完成的MDA-MB-231与BT549细胞。
使用qRT-PCR方法分别检测KTN1基因沉默模型构建完成后的MDA-MB-231细胞和BT549细胞的siNC'组、siKTN1_1组和siKTN1_2组的KTN1RNA表达水平的变化。具体如图3所示，转染siKTN1_1和siKTN1_2后的MDA-MB-231和BT549细胞的KTN1RNA表达水平远低于对照组(siNC')的KTN1RNA表达水平，siKTN1_1和siKTN1_2沉默模型建立成功；
图4表示siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染MDA-MB-231细胞0h、24h、48h和72h后，使用CCK8方法检测MDA-MB-231细胞增殖的变化图(图中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。通过图4可知，转染siKTN1_1和siKTN1_2后，与对照组(siNC')相比，随着培养时间的延长，MDA-MB-231细胞的增殖能力减弱，说明siKTN1_1和siKTN1_2转染MDA-MB-231细胞能够减弱MDA-MB-231细胞的增殖能力。
图5表示siNC'、siKTN1_1和siKTN1_2转染BT549细胞0h、24h、48h和72h后，使用CCK8方法检测BT549细胞增殖的变化图(图中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。通过图5可知，转染siKTN1_1和siKTN1_2后，与对照组(siNC')相比，随着培养时间的延长，BT549细胞的增殖能力明显减弱，说明siKTN1_1和siKTN1_2转染BT549细胞能够减弱BT549细胞的增殖能力。
结论：KTN1基因能够调控TNBC细胞系MDA-MB-231和BT549细胞的增殖能力；且沉默KTN1基因能够抑制TNBC细胞系MDA-MB-231和BT549细胞的增殖能力。
实施例3
本实施例涉及检测敲低YY1基因对KTN1转录与翻译的影响。
首先，通过TCGA数据库查询侵袭性乳腺癌肿瘤及癌旁中YY1RNA的表达与KTN1RNA表达的相关性，图6表示在侵袭性乳腺癌肿瘤及癌旁中YY1RNA表达与KTN1RNA表达的相关性(相关系数R>0.5，P<0.001)，由图6可知，在侵袭性乳腺癌肿瘤及癌旁中，YY1RNA的表达与KTN1RNA的表达存在显著正相关(相关系数R>0.5，P<0.001)，推测YY1基因与KTN1RNA表达存在调控功能。
由于基因的表达需要受到转录因子蛋白的调控，而转录因子是一类能够与靶基因5'端启动子区特定序列专一性结合，从而调控靶基因转录。为研究KTN1启动子区可能结合的转录因子，通过生物信息学的方法在UCSC(https://genome.ucsc.edu/)上查找KTN1的启动子为：
TCAAAGTTCAAACGCCAGAAAAGCCGAAATAGGTGATACAAAGTCATCCTTTAGTATAAGCAGTAGTATGTTTTGAGAAAATCCTAAACTCCACTCATTGTCTTACTTACAAGTGCACCGAAATATTATTGCCTGTAAATGACATTGCGGTTTTACTGGTCAGGAAAATGAATGATATAAATTTTTAATTCTAACCTAAAACCTGCGTTAGTACTAACCTGAGGAAATAACATGGTTGTTTGTAAGCTAATCAAGAGCCCTTAAACTCCATTACATAAATGATACACTTACCCTTTGTATTAAGGGACTAACGGCTTCGCTTTTCAACAAAGCTGGATCTTCTGGCACACGCTCAGAAGATAGCCAGTACTTCAGAGACAGATTGCTTTGAGGGCACTGGAACCGCTGAGGGGCAGAGTAATCCTAATGAGAAAGAAAAAAGAGGACGCCTCTGGAGTTAAAATAAGACAATGCATCTGTGGAGAACACGGTGACTGAAGACTGGCAGAATTCTCAATATCTCAGGCCACTATACACTGCGCAGTTTTCATTTGTATTTTGGAGGTGCTCTAGAAAACTTAGAAATGATTAGAATAAAAAGTATGGATACTTTTAACCAGCCCATGTACAGGAAATTCTGTTGGTGTAGAAACGGTTCTGCTGTTCATTCCTTAACTGCTTCTGTTCCCACTTTGTCAGATGTAGGGCGAGGTGGTGGTGGTGAGTCCTAATTTTTTCTATCTCTATCCACAGTCTGGAATCGTTAGGATTATTTTAAGCCTTCATAACATTTGCGGACAGCTTGGAGTGTTTTGTACATGTAGTGGGGCAGTGCCTGGCCTCCTGTGAGAGATTGATCATCGGTAAACAATCCACACGAAACTCACTTGCCAGTGGACGGGGAGGATCGCTGCCATCCTTTCAGCAAAGAGCAAACGAATAAGGAGAGATCCGGGCCCATCCCTCCTCGCGCAGCAGTTTCTAGATTTTTACCCCGGCTTCATAAATGGCTACCAGCTGGCAGTCACAACACTTTCATAATGTTTGCACACAACTCATTTGGGTCGCTTTCTTTTCTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAGAAACGGAGAGTCTTACTCTCTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGAGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCTAGATTCCTGCGATTCTCCTGTCTCAGCTTCCCAAGTAGCTGGGGCTACAGGCGTGCGCCACTATGCCCAGCTAATTTTTTGTACTTTTTTTGGCAGAGACGGGTTTTACTATATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCGCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTACTGGGGTTACAGGCGTGAACCACCGCGCCCGACCATTATTTGGGTCGCTTTCTAATTTCTTTCTCCGTTTGTAGCTAGCGTTGCCCGAAGGAGATTTCAGAGAGATCCCCTGGAGAAAGGGACGGGGGATGTCGTTTTCCAGTAATTTCTGGGGGAAATCTGGGATAGTCAGGGGGTAAATCTAGTGCCGTTTGCTGAAGTTAAAAGGCGTGGGGAGCCAGGTGGTGCCCTGGAGGGAGGGCCGCGCGAGACGAGACCAACCTTCGGGACAGGGGAGAGCGGGGCTACTGAACGCAGGGGATTCCGCTGAGCCTCCAGCCCCTGAGCGTCCACCTTCGGCCCAGCTGGGGGACGCGGTCTCGGGAAGAAAGCCCGGAATCCCGAGCCGGCCAGCCGCGAGCAGCGAGTACCGGAGCGCGTGGGCAGGCGCGCGGAGGCAGAGGCGGGCCGGCGGCTGTCCCTTTAAGGGGCCGGTCTCCCGGCGCCGCCGGCCCAGACGCCAGGACGTGCCGGGTCCGCCCCGCCCCGCCCCGAAGCCGCCCGTTTCCTGCCGAGCGGCGCGACGGCACCTGAGCGACTGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCCTCGGAGCGGGCGGCCCGGGCTGTAGTGCCGGCCTTGACTTGTTCTAATTTTTATTGAGCTTTAACAGATTTCATTAGTAGTACAGATCATTGTAATTTAGAATACAGCTATTAATTGGCAACCATTCAACAA
同时通过生物信息学网站ALGGEN查找与KTN1可能相互作用的转录因子(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB＝TF_8.3)，筛选出YY1基因序列。
其次，使用qRT-PCR方法分别检测YY1基因沉默模型构建完成后的MDA-MB-231细胞的siNC组、siYY1_1组和siYY1_2组的YY1RNA与KTN1RNA表达水平的变化，具体如图7所示，转染siYY1_1和siYY1_2后的MDA-MB-231细胞的YY1RNA表达水平远低于对照组(siNC)，KTN1RNA表达水平也远低于对照组(siNC)；
使用蛋白免疫印迹分析方法分别检测YY1基因沉默模型构建完成后的MDA-MB-231细胞的siNC组、siYY1_1组和siYY1_2组的YY1蛋白与KTN1蛋白表达情况，具体如图8所示，转染siYY1_1和siYY1_2后的MDA-MB-231细胞的YY1蛋白表达水平远低于对照组(siNC)，KTN1蛋白表达水平也远低于对照组(siNC)；
使用qRT-PCR方法分别检测YY1基因沉默模型构建完成后的BT549细胞的siNC组、siYY1_1组和siYY1_2组的YY1RNA与KTN1RNA表达水平的变化，具体如图9所示，转染siYY1_1和siYY1_2后的BT549细胞的YY1RNA表达水平远低于对照组(siNC)，KTN1RNA表达水平也远低于对照组(siNC)。
使用蛋白免疫印迹分析方法分别检测YY1基因沉默模型构建完成后的BT549细胞的siNC组、siYY1_1组和siYY1_2组的YY1蛋白与KTN1蛋白表达情况，具体如图10所述，转染siYY1_1和siYY1_2后的BT549细胞的YY1蛋白表达水平远低于对照组(siNC)，KTN1蛋白表达水平也远低于对照组(siNC)。
结论：YY1基因能够调控TNBC细胞系MDA-MB-231和BT549细胞的KTN1基因的转录与翻译，且敲低YY1基因能够下调MDA-MB-231和BT549细胞的KTN1基因的转录与翻译。
实施例4
本实施例涉及对TNBC细胞中YY1蛋白与KTN1基因结合位点分析。
为了进一步明确YY1蛋白与KTN1启动子作用的结合位点，通过ChIP实验来分析。收集BT549细胞，进行交联、裂解、超声及免疫沉淀的方法提取出于YY1蛋白作用的基因组DNA，使用预先设计的包含YY1蛋白结合位点的KTN1启动子区DNA引物进行qRT-PCR反应分析，使用小鼠IgG免疫沉淀抗体作为阴性对照。结果如图11所示，可知YY1抗体组高度富集在细胞内的KTN1启动子区，YY1抗体组在细胞内的KTN1启动子区的富集度约高于IgG抗体组的8倍左右，由此可知YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域。
同时，根据不同的预测的结合位点设计相应的引物序列，其中预测的结合位点如图12所示，包括-1007～-1010位点、-958～-961位点、-603～-060位点、-622～-625位点、-232～-235位点与-268～-271位点，设计的引物序列包括三对，所述引物对的序列包括如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示的序列。其中SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6用于扩增-1007～-1010结合位点与-958～-961结合位点的序列，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8用于扩增-232～-235结合位点与-268～-271结合位点的序列，SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10用于扩增-603～-060结合位点与-622～-625结合位点的序列。
将siNC与siYY1_1分别转染至BT549，其中siNC作为对照组，siYY1_1组中敲低YY1表达水平；采用ChIP方法检测siNC组与siYY1组中YY1与KTN1启动子区结合位点与结合力，具体如图13所示。结果发现，在-1007～-1010，-958～-961位点中，siNC组中YY1富集度比siYY1_1组的富集度高5倍左右，因此siYY1_1组的YY1与KTN1结合力减弱；在-232～-235，-268～-271位点中，siNC组中YY1富集度比siYY1_1组的富集度高3倍左右，因此siYY1_1组的YY1与KTN1结合力减弱；而在-603～-060，-622～-625位点中未见YY1富集。因此，YY1与KTN1的结合位点分别包含为-958～-961序列CCAT和-1007～-1010序列ATGG，且进一步说明YY1蛋白能够结合KTN1启动子区进行转录调控。
与此同时，采用PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法对上述的qRT-PCR产物进行电泳，请参考图14，图14示出了qRT-PCR产物琼脂糖水平电泳的胶图，可知YY1抗体组在细胞内的KTN1启动子区的富集度远远高于IgG抗体组。
以上结果说明，YY1蛋白能够结合于KTN1启动子区域，调控KTN1转录水平。因此，通过靶向下调YY1基因的表达，可以抑制靶基因KTN1的表达，从而影响三阴性乳腺癌细胞的增殖，最终改善或治疗三阴性乳腺癌。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用
<130> 2019
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgacgactac attgaacaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
cctgaaatct cacatctta 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ctggcattga cctctcagat c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gccgagttat ccctgaacat c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caaagagcaa acgaataagg agag 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaaagcgacc caaatgagtt g 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
aacctgcgtt agtactaacc tg 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ccagaagatc cagctttgtt g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggaggtgctc tagaaaactt a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cctacatctg acaaagtggg a 21

Claims (4)

1.一种YY1表达抑制剂在制备抑制KTN1基因表达药物中的应用，其特征在于，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子；
所述YY1表达抑制剂为siRNA，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQID NO.2所示的序列中的至少一种。
2.一种YY1表达抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述YY1表达抑制剂通过抑制YY1基因表达，进而抑制YY1蛋白靶向结合KTN1启动子，从而下调癌细胞中KTN1基因表达；
所述YY1表达抑制剂为siRNA，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO.1所示的序列与如SEQID NO.2所示的序列中的至少一种。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗乳腺癌药物为治疗三阴性乳腺癌的药物。
4.一种YY1蛋白与KTN1启动子结合情况检测试剂在制备乳腺癌检测及预后评估的产品中的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增YY1蛋白与KTN1启动子结合位点的引物对，所述引物对的序列包括如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8所示序列中的至少一对。
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