CN111154863A

CN111154863A - lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用

Info

Publication number: CN111154863A
Application number: CN202010061525.1A
Authority: CN
Inventors: 宋伟; 王军; 马涛; 程辉光; 张育民
Original assignee: Xian Honghui Hospital
Current assignee: Xian Honghui Hospital
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111154863B

Abstract

本发明提供了lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用，具体的提供了lncRNA RP11‑159F24.3在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用，本发明还提供了lncRNA RP11‑159F24.3在筛选治疗骨关节炎的候选药物中的应用。

Description

lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用。

背景技术

骨关节炎(OA)是最常见的关节炎形式，也是世界上最常见的慢性关节疾病，它影响了大约10％的人口，特别是60岁以上的女性(Dai,J.,et al.,Kdm6b regulatescartilage development and homeostasis through anabolic metabolism.Annals ofthe Rheumatic Diseases,2017.76(7):1295-1303.)，随着年龄的增长患病率逐渐增加，严重威肋、人类的健康。约有26％的骨关节炎患者伴随有严重的关节疼痛，并且大概有42％的人他们的身体活动受到了极大的限制(Wang,A.,et al.,Nutraceuticals andosteoarthritis pain.Pharmacology&Therapeutics,2018.187:167-179.)。骨关节炎是导致炎症和关节结构变化的主要原因，会导致疼痛、残疾和活动能力下降等症状，严重者可导致活动功能障碍，给个人、家庭和社会造成严重的负担，还严重影响到患者的心理健康。骨关节炎的症状表现为疼痛和僵硬，炎症反应，活动能力下降等。尤其是运动后的疼痛和僵硬作为主要症状，对日常生活活动能力产生了相当大的影响，导致他们的日常生活活动能力和生活质量严重下降。流行病学数据表明，骨关节炎在女性中比男性更常见，而且随着年龄的增长，骨关节炎的患病率急剧增加。

目前仍然没有一个治疗骨关节炎较为满意的方法，一些患者虽然没有发现类似骨关节炎的症状，但放射检测技术X光显示有呈现骨关节炎的变化趋势，这种症状出现与实际检测间的时间间隔导致骨关节炎发现较晚，因此治疗手段就很局限。目前应用较为广泛的是关节置换手术，但是现有的治疗方法仅限于骨关节炎晚期患者(Vonk,L.A.,et al.,Overexpression of hsa-miR-148a promotes cartilage production and inhibitscartilage degradation by osteoarthritic chondrocytes.Osteoarthritis andCartilage,2014.22(1):145-153.)。因此研究骨关节炎疾病的发病机理更有助于早期骨关节炎的预防和治疗。

LncRNA(Long non-coding RNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，很少或没有蛋白质编码潜力，来源于基因间和重叠的蛋白质编码区域，并由Polymerase II转录。而多种LncRNA已经被报道在骨关节炎患者中高表达。一些令人信服的证据表明，LncRNAs的改变与调节软骨形成和成骨(Liu,Y.,G.Li,and J.F.Zhang,The role of long non-codingRNA H19 in musculoskeletal system:A new player in an old game.Exp Cell Res,2017.360(2):61-65.)有关，并最终影响软骨和成骨的稳态(Chen,W K.,et al.,1ncRNAs:novel players in intervertebral disc degeneration and osteoarthritis.CellProlif,2017.50(1).)，从新的角度研究骨关节炎的发病机制，为骨关节炎的诊疗提供一种新的治疗方法或者检测手段具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了RP11-159F24.3的如下任一项应用：

a.制备诊断骨关节炎的产品；

b.构建诊断骨关节炎的计算模型；

c.制备治疗骨关节炎的药物组合物；

d.筛选治疗骨关节炎的候选药物。

进一步，所述产品包括检测RP11-159F24.3的表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括：特异性识别RP11-159F24.3的探针；或特异性扩增RP11-159F24.3的引物。

进一步，特异性扩增RP11-159F24.3的引物序列如下：F：5’-GACTCAACTGATACTTACTG-3’；R：5’-GAACTGCGAATGATACTT-3’。

进一步，c中所述的药物组合物包括有效量的RP11-159F24.3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂降低RP11-159F24.3的表达水平。

进一步，所述抑制剂包括siRNA。

进一步，d中筛选治疗骨关节炎的候选药物的步骤包括：

使测试物质与表达RP11-159F24.3基因的细胞接触；并

选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低RP11-159F24.3基因的表达水平的测试物质。

本发明提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括检测RP11-159F24.3的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

进一步，所述试剂包括特异性识别RP11-159F24.3的探针；或特异性扩增RP11-159F24.3的引物。

进一步，特异性扩增RP11-159F24.3的引物序列如下：F：5’-TCCAGGTCCAAGTCAATC-3’，R：5’-AGTAGTGATGAAGCGATGA-3’。

本发明提供了一种治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括RP11-159F24.3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂降低RP11-159F24.3的表达水平。

进一步，所述包括siRNA。

附图说明

图1是RP11-159F24.3基因在样本中的表达情况图。

具体的实施方式

术语“生物样品”或“样本”指从骨关节炎患者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、分泌物、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。本文中患者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、外周血单个核细胞(PBMC)、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定RNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物RNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的RNA的表达相比，从以患有骨关节炎特征的个体分离的样本中RNA表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的血相比，从以患有骨关节炎为特征的个体分离的样本中RNA表达水平降低的基因。

在本发明中，RP11-159F24.3在骨关节患者中表达差异增加。

术语“RP11-159F24.3”的转录基因是位于人6号染色体上，本发明中的RP11-159F24.3包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的RP11-159F24.3可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的RP11-159F24.3即可。在本发明的实施例中，一种代表性的转录RP11-159F24.3基因的核苷酸序列如ENST00000505645.1所示。

根据本发明，测定在自受试者获得的血液、组织或细胞中RP11-159F24.3的表达水平，使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量RP11-159F24.3的RNA。所述检测可在芯片或阵列上实施。对检测RP11-159F24.3的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用RP11-159F24.3的序列信息制备上述探针。举例而言，RP11-159F24.3的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度检测。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对疾病检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定疾病检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的疾病检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PN、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3’末端羟基(游离3’羟基)的核酸序列，它可以与互补模板(template)形成碱基对(base pair)并充当复制模板的起点。在本发明中，可以通过以下方式预测骨关节炎：通过进行使用本发明的标记多核苷酸的有义和反义引物的PCR扩增，所需的产物是否产生。可以基于本领域已知内容修改PCR条件和有义引物和反义引物的长度。

本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与RP11-159F24.3的RNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

如本文所用，RP11-159F24.3的抑制剂选自：以RP11-159F24.3或其转录本为靶序列、且能够抑制RP11-159F24.3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。优选的，所述抑制剂为siRNA。

本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶基因的过表达。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。

本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。

在本发明中，术语“shRNA”是指：具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”。

可通过将细胞与针对RP11-159F24.3基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达RP11-159F24.3基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞以较低的速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用CCK-8、MTT细胞增殖测定。

任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因，可作为例子的细胞包括骨关节炎细胞。

在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递物质相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。

用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递物质包括Mirus Transit TKO亲脂性物质、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递物质是脂质体。

本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到目的部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。

合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。

合适的非消化道施用途径包括血管内施用，组织周围和组织内注射，皮下注射或沉积，包括皮下输注，直接施加到目标部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置，和吸入。

本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。

在本发明中，“药物”、“药物组合物”可以通用。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。

作为一种优选的实施方式，本发明的药物组合物包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如，以重量计为0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。

根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个可针对相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对RP11-159F24.3基因靶序列的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对RP11-159F24.3基因和其它基因的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

本发明的组合物可以是药物组合物。本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。

对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20wt％、优选1-10wt％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 QPCR测序验证RP11-159F24.3基因的表达情况

1、样品收集

选取进行膝关节置换手术的患者78例，其中OA患者48例，正常对照30例，收集患者的血液样本和组织样本，OA组和对照组的年龄、性别无统计学意义。

OA组：纳入标准：1)根据OA诊断标准，确诊骨关节炎患者，行膝关节置换手术；2)为初次置换。排除标准：1)合并其他炎症性关节炎或自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎、痛风、系统性红斑狼疮等者；2)膝关节严重创伤史者；3)近3个月内有类固醇药物注射史或非类固醇类药物应用史者；4)合并严重肝肾功能疾病及心血管疾病者。

对照组：纳入标准：1)肢体毁损伤截肢术的患者；2)为初次置换。排除标准：1)所取关节术前有过明确外伤、疼痛；2)有骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风病史；3)X线检查提示存在明显骨关节炎表现者。

2、Trizol法提取样本中的RNA

使用Trizol试剂从组织和血液样本中提取总RNA。向细胞中加入1ml预冷的TRizol，混匀直至透明状溶液。将裂解液转移至1.5m1离心管中，室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入氯仿，振荡，离心。吸取无色上清液移至另一离心管，向上清液中加入异丙醇，静置，离心，移去上清液，加入乙醇，离心，移去上清液，室温干燥RNA沉淀，加入适量的无酶水溶解沉淀

3、qRT-PCR检测

取总RNA500ng，应用GeneCopoeia逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，反应条件：42℃15min，95℃2min。以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃40s)×40。引物由公司合成，相关引物序列如下：RP11-159F24.3(F：5’-GACTCAACTGATACTTACTG-3’，SEQ ID NO.1；R：5’-GAACTGCGAATGATACTT-3’，SEQ ID NO.2)；GAPDH(F：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，SEQ ID NO.3；R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，SEQ ID NO.4)，通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2^-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差(mean±SD)的方式来表示，两者之间的差异采用t检验，所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，认为当P<0.05时具有统计学意义。对变量RP11-159F24.3进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

5、结果

结果如图1所示，与健康对照相比，RP11-159F24.3基因在骨关节炎病患者血液和组织中的表达显著上调，上调约4.32倍和6.13倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

ROC曲线分析表明RP11-159F24.3可以作为生物标志物应用于骨关节炎的诊断，其曲线下面积为0.854(血液样本)和0.897(组织样本)，可以有效的区分骨关节炎患者与正常对照。

实施例2 RP11-159F24.3基因的沉默及对细胞的影响

1、细胞获取及培养

用含1％双抗PBS反复冲洗软OA患者的骨组织3次，无菌的眼科小剪刀将组织剪碎至1mm³大小的碎片，得到的软骨碎片放入l0cm培养皿中，加入l0ml新鲜的0.25％胰蛋白酶，37℃,5％CO₂培养箱中消化30min，除去可能附着的成纤维细胞。吸出胰酶消化液，加入l0ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打混匀终止消化，用10ml的含双抗的PBS清洗2遍。向培养皿中加入0.2％II型胶原酶l0ml，置于37℃,5％CO₂培养箱中消化4h。将游离出的含有胶原酶溶液的软骨细胞悬液用吸管吸出，70μm 200目细胞筛过滤，所得滤液移入离心管中离心1000r/min，l0min，弃去上清液。用含10％FBS的DMEM培养基吹打混匀，25cm培养瓶中进行培养。

2、转染

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对RP11-159F24.3的siRNA，具体序列为5’-UAUCAGUUGAGUCAAGUUGAU-3’，SEQ ID NO.5；反义链为5’-CAACUUGACUCAACUGAUACU-3’，SEQ ID NO.6，对照为通用的siRNA-NC。按照Lipofectamine 3000试剂说明书步骤，分别混匀脂质体和OPTI-MEM减血清培养基以及siRNA和OPTI-MEM培养基，室温放置5min，然后将脂质体、siRNA和OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min。将混合溶液加入无血清的细胞培养基中，轻轻晃动混匀，孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。

3、qRT-PCR检测siRNA对RP11-159F24.3的沉默效果

使用Trizol法提取细胞总RNA，然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

4、CCK-8法检测细胞的增殖活性

取对数生长期的细胞，进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔；在72h加入CCK8试剂，100μL/孔，37℃避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长下检测吸光值(OD)。

5、流式细胞检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及流式细胞仪检测细胞凋亡。试剂配制参照细胞凋亡检测试剂盒说明书。细胞转染培养48h后，收集细胞，用100μl的Bindingbuffer溶液重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI Staining Solution，轻吹混匀，避光孵育15min。加入400μl 1×Binding buffer，使用流式细胞仪进行凋亡检测。

6、统计学分析

所有数据用采用均数士标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图，P<0.05定义为差异有统计学意义。

7、结果

siRNA转染结果显示，以空白对照组RP11-159F24.3的表达水平作为参比设为1，相比转染空白对照组的RP11-159F24.3的表达量(相对表达量：1)与转染siRNA-NC组的RP11-159F24.3的表达量(相对表达量：0.95±0.04)，转染siRNA-RP11-159F24.3实验组的RP11-159F24.3的表达量(相对表达量：0.26±0.08)显著下调，差异具有统计学意义(实验组vs空白对照组，P＝0.0039；实验组vs siRNA-NC组，P＝0.0074)，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异(P＝0.1628)。

CCK-8实验检测结果显示，相比转染siRNA-NC的对照组(OD值：0.926±0.0826)，转染siRNA-RP11-159F24.3的实验组的细胞增殖活性(OD值：1.37±0.085)显著增加(P<0.0001)，说明RP11-159F24.3影响软骨细胞的增殖。

细胞凋亡实验结果显示，相比转染siRNA-NC的对照组(凋亡率(％)：19.4±1.841)，转染siRNA-RP11-159F24.3实验组的细胞凋亡(凋亡率(％)：10.71±1.234)显著降低(P＝0.0025)，说明降低RP11-159F24.3的表达水平可以抑制软骨细胞的凋亡。

综上，RP11-159F24.3的过表达抑制了软骨细胞的增殖，促进了软骨细胞的凋亡，其可以作为分子靶标应用于骨关节炎的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西安市红会医院

<120> lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactcaactg atacttactg 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaactgcgaa tgatactt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctggtaaa gtggatattg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uaucaguuga gucaaguuga u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacuugacu caacugauac u 21

Claims

1.RP11-159F24.3的如下任一项应用：

a.制备诊断骨关节炎的产品；

b.构建诊断骨关节炎的计算模型；

c.制备治疗骨关节炎的药物组合物；

d.筛选治疗骨关节炎的候选药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测RP11-159F24.3的表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：特异性识别RP11-159F24.3的探针；或特异性扩增RP11-159F24.3的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增RP11-159F24.3的引物序列如下：F：5’-GACTCAACTGATACTTACTG-3’；R：5’-GAACTGCGAATGATACTT-3’。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，c中所述的药物组合物包括有效量的RP11-159F24.3的抑制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低RP11-159F24.3的表达水平。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括siRNA。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，d中筛选治疗骨关节炎的候选药物的步骤包括：

使测试物质与表达RP11-159F24.3基因的细胞接触；并

9.一种诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括检测RP11-159F24.3的试剂；优选的，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条；优选的，所述试剂包括特异性识别RP11-159F24.3的探针；或特异性扩增RP11-159F24.3的引物。

10.一种治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括RP11-159F24.3的抑制剂，优选的，所述抑制剂降低RP11-159F24.3的表达水平，优选的，所述抑制剂包括siRNA。