CN116254340A - 胸主动脉瘤生物标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种胸主动脉瘤生物标记物及其应用，该生物标记物为miR‑885‑3p。本发明首次研究发现，与健康对照相比，miR‑885‑3p在胸主动脉瘤患者中显著高表达(p＜0.01)，表明miR‑885‑3p能够作为胸主动脉瘤的生物标记物，用于在早期快速地辅助诊断胸主动脉瘤；同时，本发明还研究发现，抑制miR‑885‑3p的表达能够抑制主动脉直径扩张，缓解主动脉细胞凋亡，抑制血管平滑肌细胞迁移和侵袭，表明miR‑885‑3p能够作为胸主动脉瘤的治疗靶点。

Description

胸主动脉瘤生物标记物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胸主动脉瘤生物标记物及其应用。
背景技术
主动脉瘤(AA)是一种因血管壁病变而引起的心血管疾病，疾病发生时主动脉发生局部或普遍的病理性扩张(超过正常血管直径的50％)，严重威胁着人类健康。AA可局限于主动脉的某一段，如升主动脉、胸主动脉、腹主动脉等，也可以累及整个主动脉。其中，胸主动脉瘤(TAA)的发病率一直在增加。
TAA的发生与年龄和性别无关，它是一种由多种原因引起的主动脉壁结构破坏和强度减弱而引起的肿瘤样扩张的高危疾病。血管平滑肌细胞(vSMCs)是主动脉壁的主要成分之一，可分为静止收缩型和活化合成型，VSMCs的表型转换与血管疾病有关，因此也被认为是影响TAA的因素之一。
目前针对TAA的治疗方法有限，虽然主动脉置换术和血管内支架植入术可作为TAA的有效治疗手段，但手术创伤大、术后并发症复杂是影响TAA治疗效果的重要因素。因此，从TAA发病机制中寻找确切的治疗靶点已成为该领域的研究热点。
研究发现VSMCs的表型转换受到一类小的非编码RNA分子的调控，即microRNA；当microRNA序列的一部分(称为种子区域)与mRNA转录本的3′-UTR区域相互作用时，就会发生翻译抑制。如公开号为CN105925705A的中国发明申请公开了一种主动脉瘤的标记物，该标记物为miR663a；研究发现，相对于健康人对照组，主动脉瘤病人血清中miR663a含量明显升高，且miR663a与发病时间存在相关性：发病时间越短，miR663a含量越高。因此miR663a可用于辅助诊断主动脉瘤。
目前尚未见任何miR-885-3p与胸主动脉瘤相关的报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种胸主动脉瘤生物标记物及其应用，为胸主动脉瘤的辅助诊断和治疗提供了新靶点。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案为：
一种胸主动脉瘤生物标记物，该生物标记物为miR-885-3p。
本发明首次研究发现，与健康对照相比，miR-885-3p在胸主动脉瘤患者中显著高表达(p＜0.01)，表明miR-885-3p能够作为胸主动脉瘤的生物标记物，用于在早期快速地辅助诊断胸主动脉瘤。
本发明还提供了一种检测miR-885-3p表达水平的试剂，该试剂包括特异性扩增miR-885-3p的PCR引物、与miR-885-3p特异性结合的探针或固定有该探针的基因芯片；本领域技术人员能够以miR-885-3p的序列为基础开发上述试剂，只要能够准确地检测miR-885-3p表达水平即可。
作为具体实施方式的举例，所述的特异性扩增miR-885-3p的PCR引物可以包括：
上游引物：5'-CGTTAGGCAGCGGGGTGTAG-3'；
下游引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。
本发明还提供了检测miR-885-3p表达水平的试剂在制备胸主动脉瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了miR-885-3p抑制剂在制备胸主动脉瘤治疗药物中的应用。本发明研究发现，抑制miR-885-3p的表达能够抑制主动脉直径扩张，缓解主动脉细胞凋亡，抑制血管平滑肌细胞迁移和侵袭，表明miR-885-3p能够作为胸主动脉瘤的治疗靶点。
本发明还提供了另一种胸主动脉瘤生物标记物，该胸主动脉瘤生物标记物为RGS8基因或其表达产物。
本发明首次研究发现，miR-885-3p的靶向mRNA为RGS8基因，miR-885-3p通过靶向抑制RGS8基因的表达而发挥作用(即诱发胸主动脉瘤)。因此RGS8基因或其表达产物也能作为胸主动脉瘤的生物标记物，通过对RGS8基因或其表达产物的表达水平进行检测，即可辅助诊断胸主动脉瘤。
基于此，本发明还提供了一种检测RGS8表达水平的试剂，该试剂包括特异性扩增RGS8基因的PCR引物、与RGS8基因特异性结合的探针、固定有与RGS8基因特异性结合的探针的基因芯片或与RGS8蛋白特异性结合的抗体。本领域技术人员能够以RGS8基因或RGS8蛋白为基础开发上述试剂，只要能够准确地检测RGS8基因及其表达产物的表达水平即可。
作为具体实施方式的举例，所述的特异性扩增RGS8基因的PCR引物可以包括：
上游引物：5'-GGATGCCTGTCTCACAAGTCA-3'；
下游引物：5'-CCTCGTAGCTTCTTCTGTCGATA-3'。
本发明还提供了上述检测RGS8表达水平的试剂在制备胸主动脉瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了RGS8表达促进剂在制备胸主动脉瘤治疗药物中的应用。
本发明研究发现，促进RGS8表达能够抑制主动脉直径扩张，缓解主动脉细胞凋亡，抑制血管平滑肌细胞迁移和侵袭，表明RGS8能够作为胸主动脉瘤的治疗靶点。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明首次发现，与健康对照相比，miR-885-3p在胸主动脉瘤患者中显著高表达(p＜0.01)；同时，miR-885-3p的靶向mRNA为RGS8基因，miR-885-3p通过靶向抑制RGS8基因的表达而发挥作用，这就使得与健康对照相比，RGS8在胸主动脉瘤患者中显著低表达(p＜0.001)；表明miR-885-3p和RGS8或其表达产物均能作为胸主动脉瘤的生物标记物，用于在早期快速地辅助诊断胸主动脉瘤，为胸主动脉瘤的早期快速诊断提供了新途径。
(2)本发明首次研究发现，抑制miR-885-3p的表达或促进RGS8的表达能够抑制主动脉直径扩张，缓解主动脉细胞凋亡，抑制血管平滑肌细胞迁移和侵袭，表明miR-885-3p和RGS8均能够作为胸主动脉瘤的治疗靶点，为胸主动脉瘤的治疗提供了新途径。
附图说明
图1为TAA患者主动脉组织和健康对照组中miR-885-3p的表达水平比较；
其中，Control表示健康对照，TAA表示主动脉组织；Relative miR-885-3pexpression表示miR-885-3p的相对表达水平，下同；
图2为TAA患者主动脉组织和健康对照组中RGS8基因的表达水平比较；
其中，Relative RGS8 mRNA expression表示RGS8基因mRNA的相对表达水平，下同；
图3为不同处理下大鼠主动脉的扩张情况；
其中，sham表示假手术组，model表示模型组，model+IC表示模型+
miR-885-3p抑制剂对照组，model+I表示模型+miR-885-3p抑制剂组；下同；
图4为不同处理下大鼠主动脉组织中miR-885-3p的表达水平比较；
图5为不同处理下大鼠主动脉组织的HE染色结果；
图6为不同处理下大鼠主动脉组织中相关蛋白的Western blot结果；
其中，α-SMA表示α平滑肌肌动蛋白，SM-MHC表示平滑肌肌球蛋白重链，MMP-2表示基质金属蛋白酶2，MMP-9表示基质金属蛋白酶9，GAPDH为内参；下同；
图7为不同处理下大鼠主动脉组织中相关蛋白的表达水平比较；
其中，Relative protein expression表示蛋白的相对表达水平；下同；
图8为不同处理下大鼠主动脉组织在TUNEL染色后的荧光显微镜下观察结果；
图9为不同处理下大鼠主动脉组织中细胞凋亡情况；
其中，TUNEL positive cells(％)表示TUNEL阳性细胞(百分比)；
图10为不同处理下大鼠主动脉组织中RGS8蛋白的Western blot检测结果；
图11为不同处理下大鼠主动脉组织中RGS8蛋白的表达水平比较；
其中，Relative RGS8 protein expression表示RGS8蛋白的相对表达水平，下同；
图12为不同处理下大鼠A10细胞中miR-885-3p的表达水平比较；
其中，control表示正常培养细胞组，model表示与20ng/ml的血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)共孵育12小时的细胞组，model+IC表示在转染miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组，model+I表示在转染miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组；下同；
图13为不同处理下人VSMC细胞中miR-885-3p的表达水平比较；
图14为不同处理下大鼠A10细胞的活力比较；
其中，OD value表示OD值，下同；
图15为不同处理下人VSMC细胞的活力比较；
图16为不同处理下人VSMC细胞和大鼠A10细胞中迁移细胞的光学显微镜下影像；
图17为不同处理下人VSMC细胞和大鼠A10细胞中侵袭细胞的光学显微镜下影像；
图18为不同处理下大鼠A10细胞的相对迁移率比较；
其中，Relative migration rate(％)表示相对迁移率(百分比)，下同；
图19为不同处理下人VSMC细胞的相对迁移率比较；
图20为不同处理下大鼠A10细胞的相对侵袭率比较；
其中，Relative invasion rate(％)表示相对侵袭率(百分比)，下同；
图21为不同处理下人VSMC细胞的相对侵袭率比较；
图22为不同处理下大鼠A10细胞中RGS8基因的相对表达水平比较；
图23为不同处理下人VSMC细胞中RGS8基因的相对表达水平比较；
图24为不同处理下大鼠A10细胞中RGS8蛋白的相对表达水平比较；
图25为不同处理下人VSMC细胞中RGS8蛋白的相对表达水平比较；
图26为miR-885-3p的靶点预测结果；
图27为不同处理下大鼠A10细胞的相对荧光素酶活性比较；
其中，RGS8-WT表示RGS8野生型基因的重组载体，RGS8-MUT表示RGS8突变型基因的重组载体，M表示miR-885-3p模拟物，MC表示模拟物对照，Relative luciferase activity表示相对荧光素酶活性，下同；
图28为不同处理下人VSMC细胞的相对荧光素酶活性比较；
图29为不同处理下大鼠A10细胞中GS8基因的相对表达水平比较；
其中，control表示正常培养细胞组，siNC表示在转染siNC后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组，siRGS8表示在转染siRGS8后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组；下同；
图30为不同处理下人VSMC细胞中GS8基因的相对表达水平比较；
图31为不同处理下大鼠A10细胞中GS8蛋白的相对表达水平比较；
图32为不同处理下人VSMC细胞中GS8蛋白的相对表达水平比较；
图33为不同处理下大鼠A10细胞的活力比较；
其中，siNC+IC表示在转染siNC和miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组，siNC+I表示在转染siNC和miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组，siRGS8+IC表示在转染siRGS8和miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组，siRGS8+I表示在转染siRGS8和miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时的细胞组；下同；
图34为不同处理下人VSMC细胞的活力比较；
图35为不同处理下人VSMC细胞和大鼠A10细胞中迁移细胞的光学显微镜下影像；
图36为不同处理下大鼠A10细胞的相对迁移率比较；
图37为不同处理下人VSMC细胞的相对迁移率比较；
图38为不同处理下人VSMC细胞和大鼠A10细胞中侵袭细胞的光学显微镜下影像；
图39为不同处理下大鼠A10细胞的相对侵袭率比较；
图40为不同处理下人VSMC细胞的相对侵袭率比较；
图41为不同处理下大鼠A10细胞中相关蛋白的Western blot检测结果；
图42为不同处理下大鼠A10细胞中相关蛋白的表达水平比较；
图43为不同处理下人VSMC细胞中相关蛋白的Western blot检测结果；
图44为不同处理下人VSMC细胞中相关蛋白的表达水平比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1miR-885-3p和RGS8在TAA患者中的表达情况
(1)样本获取
本研究纳入了2018年3月至2019年3月接受住院治疗的16例TAA患者(包括8名男性和8名女性)。
纳入标准如下：(1)诊断为TAA的患者；(2)患者愿意与研究者合作。
排除标准如下：(1)其他类型的重症患者；(2)严重精神障碍患者；(3)其他类型血管疾病患者；(4)患者拒绝与研究人员合作。
同时选择8名生理状况正常的志愿者作为对照组，患者和对照组在年龄和性别上没有显著差异；本研究通过伦理委员会批准(2018020079)，所有参与者签署知情同意书。从TAA患者和健康对照中收集了主动脉标本，所有标本在使用前都保存在液氮中。
(2)QRT-PCR检测miR-885-3p和RGS8的表达水平
先使用miRNA提取分离试剂盒和RNA提取试剂盒从组织或细胞样品中提取总RNA，然后用NanoDrop2000(赛默飞世尔科技公司)定量总RNA的浓度；然后使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒和通用逆转录试剂盒，将总RNA逆转录为cDNA；然后，使用SYBR Green qPCRMaster Mix进行qRT-PCR反应，U6和GAPDH被视为标准化对照，qRT-PCR反应所使用的引物如表1所示。
表1QRT-PCR反应所需引物信息
Figure BDA0004030899390000071
使用2-ΔΔCt法对qRT-PCR反应结果进行分析，分析结果见图1和图2。
由图1可见，与健康对照组相比，TAA患者主动脉组织中miR-885-3p的表达显著上调(p＜0.01)。
由图2可见，与健康对照组相比，TAA患者主动脉组织中RGS8的表达显著下调(p＜0.001)。
实施例2miR-885-3p在TAA大鼠中的作用
(1)动物模型构建和分组处理
经批准，从杭州医学院购买了40只无特定病原体(SPF)级的雄性SD大鼠，SD大鼠的体重和年龄分别为250-300g和7-8周，将动物饲养在12小时昼夜循环、湿度为40-60％、温度为21-24℃的环境中。
将大鼠随机分为4组：假手术组(sham)、模型组(model)、模型+miR-885-3p抑制剂对照组(model+IC)、模型+miR-885-3p抑制剂组(model+I)，每组10只。
其中，对model组、model+IC组和model+I组的大鼠先实施TAA模型构建术：使用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠后，对大鼠进行气管切开术，用连接到小型动物呼吸机的套管对大鼠气管进行插管，呼吸机参数的呼吸频率为100次/分钟，潮气量为3毫升；在胸骨左缘的第5肋间区域通过开胸术完全暴露降胸主动脉，并将血管外膜浸泡于0.5mol/L CaCl2中20分钟；待血管明显改变和扩张后，除去棉纱，用生理盐水冲洗胸腔；适当调整呼吸机促进左肺再扩张后，保留胸腔引流管，用5-0线逐层封闭胸腔；待胸腔引流管完全排空，胸腔积液抽出后，拔除呼吸机；在充分清洁呼吸道分泌物后，使用6-0聚丙烯线封闭气管和皮肤；拔管后，将大鼠放回笼子，术后4h给大鼠喂饲料和饮水。
sham组则直接将大鼠置于盐水中20分钟。
术后28天，model+IC组和model+I组的大鼠分别通过腹腔注射4mg/kg剂量的IC-antagomir和I-antagomir，每周注射一次，持续两周；sham组和model组则不作任何处理；实验结束后，安乐死大鼠，切除主动脉组织并进行后续分析。
(2)主动脉扩张情况比较
观察各组小鼠的主动脉扩张情况，结果如图3所示。
由图3可见，与sham组相比，model组大鼠的主动脉扩张；与model+IC组相比，model+I组大鼠的主动脉扩张有所缓解。
(3)miR-885-3p表达情况比较
采用与实施例1相同的方法进行QRT-PCR，所采用的引物如表2所示。
表2QRT-PCR所需引物信息
Figure BDA0004030899390000081
检测结果如图4所示。
由图4可见，与sham组相比，model组大鼠的主动脉中miR-885-3p表达显著上调(p＜0.001)；与model+IC组相比，model+I组大鼠的主动脉中miR-885-3p表达则显著下调(p＜0.001)；表明miR-885-3p抑制剂能够显著下调主动脉中miR-885-3p的表达水平，进而抑制主动脉扩张。
(4)HE染色分析
将各组的主动脉组织包埋在石蜡中，然后切成5微米厚的切片；将切片进行常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水合，然后用苏木素染液染色5分钟；用自来水冲洗多余染色液后，使用分化液分化30秒，再用自来水冲洗；将切片与伊红染液染色1分钟，再进行常规脱水，透明，封片；最后在光学显微镜(100×)中观察染色结果，如图5所示。
由图5可见，与sham组相比，model组的主动脉逐渐扩张；与model+IC组相比，model+I组的主动脉扩张有所缓解。
(5)Western blot分析
通过RIPA裂解缓冲液从主动脉组织或细胞中获得总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒测定浓度；将定量的蛋白质变性后通过SDS-PAGE进行分离；将膜电转到硝酸纤维素膜上后，将膜置于5％脱脂牛奶中进行封闭；封闭后的膜与一抗在4℃过夜孵育，接着第二天与二抗在37℃孵育1小时；使用ECL试剂盒在化学发光检测系统上进行发光成像，结果见图6和图7。
由图6和图7可见，与sham组相比，model组α-SMA(α平滑肌肌动蛋白)和SM-MHC(平滑肌肌球蛋白重链)的表达显著上调(p＜0.05，p＜0.001)，而MMP-2(基质金属蛋白酶2)和MMP-9(基质金属蛋白酶9)的表达显著上调(p＜0.001)；与model+IC组相比，model+I组α-SMA和SM-MHC的表达显著上调(p＜0.05，p＜0.001)，而MMP-2和MMP-9的表达则显著下调(p＜0.001)。
(6)TUNEL检测细胞凋亡情况
使用TUNEL试剂盒(C1088，碧云天)检测各组主动脉细胞的凋亡情况。对切片进行常规脱蜡和水合后，与蛋白酶K溶液反应20分钟；用PBS洗涤3次后，切片与3％过氧化氢溶液室温孵育20分钟，然后与制备的TUNEL溶液在暗室中于37℃反应1小时；终止反应后与DAPI溶液反应；用抗荧光淬灭封片液封片后，置于荧光显微镜下观察，观察结果如图8所示，细胞凋亡情况统计结果如图9所示。
由图8和图9可见，与sham组相比，model组的主动脉细胞凋亡率显著升高(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组的主动脉细胞凋亡率则显著降低(p＜0.001)。
(7)Western blot检测RGS8蛋白的表达情况
采用与上述“(5)Western blot分析”相同的方法检测各组大鼠中RGS8蛋白的表达情况，检测结果如图10和图11所示。
由图10和图11可见，与sham组相比，model组RGS8的表达显著下调(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组RGS8的表达则显著上调(p＜0.01)。
实施例3 MiR-885-3p对大鼠或人的血管平滑肌细胞(VSMCs)生物学行为以及RGS8表达情况的影响
(1)细胞培养和分组
大鼠VSMCs(A10)和人VSMCs均从ATCC(美国)获得，将上述两种细胞分别接种在DMEM完全培养基中生长，并置于37℃，95％空气和5％CO2的加湿气氛中孵育。
将两种细胞均分成4组：control组(细胞正常培养)，model组(细胞与20ng/ml的血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)共孵育12小时)，model+IC组(细胞转染miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)和model+I组(细胞转染miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)。
(2)细胞转染
MiR-885-3p抑制剂(miR20004948-1-5)和抑制剂对照(IC，miR2N0000002-1-5)均购买自锐博公司。用Lipofectamine 2000进行A10和VSMC的转染；48小时后，进行qRT-PCR，评估转染效率；结果如图12和图13所示。
由图12和图13可见，与control组相比，model组miR-885-3p的表达水平显著上调(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组miR-885-3p的表达水平则显著下调(p＜0.001)；表明转染成功。
(3)细胞活力测试
将A10和VSMC细胞(2×104/孔)分别接种到96孔板的每个孔中，然后将其置于细胞培养箱中24小时；各组细胞按照上述“(细胞培养和分组)”中所列方式作相应处理；在培养24小时和48小时后，每孔加入10μL CCK-8溶液；孵育3小时后，通过酶标仪检查吸光度(450nm)以了解细胞活力，检测结果如图14和图15所示。
由图14和图15可见，与control组相比，model组细胞活力有所提高(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组细胞活力有所降低(p＜0.01，p＜0.001)。
(4)细胞迁移和侵袭能力测试
细胞迁移和侵袭能够通过Transwell实验评估。
具体地，将细胞剥夺FBS 12小时后接种到插入物中，对于迁移实验，插入物不需提前包被基质胶，而对于侵袭实验，需要提前在插入物中包被基质胶；在相应的下室添加10％FBS的培养基用来吸引细胞；然后，将24孔板放置在细胞培养箱中48小时；用棉签移除上室未侵袭或迁移的细胞，并将下室的细胞固定在4％多聚甲醛中，然后用0.1％结晶紫染色；最后，用光学显微镜(250倍)获得迁移或侵袭细胞的图像，结果如图16和图17所示；对细胞的迁移率和侵袭率进行统计，结果如图18、图19、图20和图21所示。
由图18、图19、图20和图21可见，与control组相比，model组细胞的迁移率和侵袭率均上升(p＜0.001)，而与model+IC组相比，model+I组细胞的迁移率和侵袭率则均下降(p＜0.001)；表明MiR-885-3p促进A10和VSMC细胞的迁移和侵袭，而MiR-885-3p抑制剂抑制了A10和VSMC细胞的迁移和侵袭。
(5)QRT-PCR检测RGS8基因的表达情况
采用表1和表2中所列的RGS8引物和GAPDH分别对A10细胞和VSMC细胞中RGS8基因的表达情况进行检测，结果如图22和图23所示。
由图22和图23可见，无论是A10细胞还是VSMC细胞，与control组相比，model组细胞中RGS8基因的表达水平均显著下调(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组细胞中RGS8基因的表达水平却显著上调(p＜0.001)。
(6)Western blot检测RGS8蛋白的表达情况
按与实施例2相同的方法分别检测A10细胞和VSMC细胞中RGS8蛋白的表达情况，结果如图24和图25所示。
由图24和图25可见，无论是A10细胞还是VSMC细胞，与control组相比，model组细胞中RGS8蛋白的表达水平均显著下调(p＜0.001)；而与model+IC组相比，model+I组细胞中RGS8蛋白的表达水平却显著上调(p＜0.001)。
实施例4miR-885-3p的靶基因的筛选和验
(1)生信分析
通过TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_72/)预测miR-885-3p的靶点，如图26所示。
(2)双荧光报告基因试验
将预测的野生型(RGS8-WT)和突变型(RGS8-MUT)结合位点插入到pmirGLO载体，构建RGS8-WT和RGS8-MUT重组载体；将重组载体和miR-885-3p模拟物(M，miR10004948-1-5，购自锐博公司)或模拟物对照(MC，miR01102-1-1，购自锐博公司)共转染到细胞中，转染48h后，收获细胞，并通过Dual Luciferase Reporter Assay Kit(Promega)检测荧光素酶活性；随后确定萤火虫与海肾荧光素酶活性的比率，结果如图27和图28所示。
由图27和图28可见，miR-885-3p模拟物能够抑制RGS8-WT组的相对荧光活力(p＜0.001)，而不影响RGS8-MUT组的相对荧光活力，表明miR-885-3p和RGS8具有靶向关系。
实施例5miR-885-3p通过靶向RGS8影响大鼠或人的血管平滑肌细胞(VSMCs)的生物学行为
(1)细胞分组
将A10细胞和VSMCs细胞均分成3组：control组(细胞正常培养)，siNC组(细胞转染siNC后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)，siRGS8组(细胞转染siRGS8后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)。
siRGS8购自锐博公司，序列分别为：
人：CTGACCATCCAGTTGGCAAAG(SEQ ID No.17)；
大鼠：GTGCAATGCGGCTCCATATAA(SEQ ID No.18)。
(2)细胞转染及转染效率评估
用Lipofectamine 2000进行A10和VSMC的转染；48小时后，采用与实施例3中“(5)QRT-PCR检测RGS8基因的表达情况”相同的方法进行QRT-PCR以评估转染效率；结果如图29和图30所示；同时采用与实施例3中“(6)Western blot检测RGS8蛋白的表达情况”相同的方法进行Western blot分析以评估转染效率；结果如图31和图32所示。
由图29和图30可见，与siNC组相比，siRGS8组细胞中RGS8基因的表达水平显著下调(p＜0.001)；由图31和图32可见，与siNC组相比，siRGS8组细胞中RGS8蛋白的表达水平显著下调(p＜0.001)；表明转染成功。
(3)细胞分组和转染
将A10细胞和VSMCs细胞均分成4组：siNC+IC组(细胞转染siNC和miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)，siNC+I组(细胞转染siNC和miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)，siRGS8+IC组(细胞转染siRGS8和miR-885-3p抑制剂对照后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)和siRGS8+I组(细胞转染siRGS8和miR-885-3p抑制剂后与20ng/ml PDGF-BB共孵育12小时)；
按照上述的分组，用Lipofectamine 2000进行A10和VSMC的转染，48小时后进行后续试验。
(4)细胞活力测试
按照实施案例3(3)的方法检测细胞活力，结果如图33和图34所示。
由图33和图34可见，无论是A10细胞还是VSMC细胞，与siNC+IC相比，siNC+I组细胞活力显著降低(p＜0.01)，而siRGS8+IC组细胞活力升高(p＜0.05，p＜0.01)；而与siNC+I组相比，siRGS8+I组细胞活力显著升高(p＜0.01)；与siRGS8+IC组相比，siRGS8+I组细胞活力显著降低(p＜0.05)。
(6)细胞迁移和侵袭能力测试
按照实施案例3(4)的方法检测细胞的迁移和侵袭能力，结果如图35、图36、图37、图38、图39和图40所示。
由图35至图40可见，无论是A10细胞还是VSMC细胞，与siNC+IC相比，siNC+I组的细胞迁移率和侵袭率均显著降低(p＜0.001)，而siRGS8+IC组的细胞迁移率和侵袭率均显著升高(p＜0.01)；而与siNC+I组相比，siRGS8+I组的细胞迁移率和侵袭率均显著升高(p＜0.001)；与siRGS8+IC组相比，siRGS8+I组的细胞迁移率和侵袭率均显著降低(p＜0.01)；表明MiR-885-3p抑制剂抑制了A10和VSMC细胞的迁移和侵袭，而siRGS8则促进了A10和VSMC细胞的迁移和侵袭。
(7)Western blot检测相关蛋白的表达情况
采用与实施例2“(5)Western blot分析”相同的方法进行Western blot，以对各组细胞中α-SMA、SM-MHC、MMP-2和MMP-9蛋白的表达情况进行检测，检测结果见图41、图42、图43和图44。
由图41至图44可见，与siNC+IC相比，siNC+I组α-SMA和SM-MHC表达显著上调、MMP-2和MMP-9的表达显著上调，而siRGS8+IC组α-SMA和SM-MHC表达显著下调、MMP-2和MMP-9的表达显著上调；而与siNC+I组相比，siRGS8+I组细胞α-SMA和SM-MHC表达显著下调、MMP-2和MMP-9的表达显著上调；与siRGS8+IC组相比，siRGS8+I组α-SMA和SM-MHC表达显著上调、MMP-2和MMP-9表达显著下调。

Claims (10)

1.一种胸主动脉瘤生物标记物，其特征在于，为miR-885-3p。
2.一种检测miR-885-3p表达水平的试剂，其特征在于，包括特异性扩增miR-885-3p的PCR引物、与miR-885-3p特异性结合的探针或固定有该探针的基因芯片。
3.如权利要求2所述的检测miR-885-3p表达水平的试剂，其特征在于，所述的特异性扩增miR-885-3p的PCR引物包括：
上游引物：5'-CGTTAGGCAGCGGGGTGTAG-3'；
下游引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。
4.检测miR-885-3p表达水平的试剂在制备胸主动脉瘤诊断试剂盒中的应用。
5.miR-885-3p抑制剂在制备胸主动脉瘤治疗药物中的应用。
6.一种胸主动脉瘤生物标记物，其特征在于，为RGS8基因或其表达产物。
7.一种检测RGS8表达水平的试剂，其特征在于，包括特异性扩增RGS8基因的PCR引物、与RGS8基因特异性结合的探针、固定有与RGS8基因特异性结合的探针的基因芯片或与RGS8蛋白特异性结合的抗体。
8.如权利要求7所述的检测RGS8表达水平的试剂，其特征在于，所述的特异性扩增RGS8基因的PCR引物包括：
上游引物：5'-GGATGCCTGTCTCACAAGTCA-3'；
下游引物：5'-CCTCGTAGCTTCTTCTGTCGATA-3'。
9.检测RGS8表达水平的试剂在制备胸主动脉瘤诊断试剂盒中的应用。
10.RGS8表达促进剂在制备胸主动脉瘤治疗药物中的应用。
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