CN105177171A

CN105177171A - Akr1b10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的应用

Info

Publication number: CN105177171A
Application number: CN201510727744.8A
Authority: CN
Inventors: 任静; 常鹏; 杨承刚
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105177171B

Abstract

本发明涉及AKR1B10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的应用。发明人对急性心肌梗死患者外周血进行高通量测序分析，挑选候选基因后通过进一步分子细胞实验验证，AKR1B10在急性心肌梗死组中高表达，AKR1B10抑制剂可用于制备治疗急性心肌梗死药物。本发明提供了一种新的急性心肌梗死的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

Description

AKR1B10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及AKR1B10在制备急性心肌梗死诊疗制剂中的应用。

背景技术

心血管疾病是威胁人类健康的重要疾病之一，尤其是急性心肌梗死((AcuteMyocardialInfarction，AMI)己成为心血管疾病中死亡率不断增加的重要原因。AMI的早期治疗对患者良好的预后起着至关重要的作用。AMI的早期、及时、准确的诊断及病情估计是积极采取有效的治疗措施并保证心脏及时再灌注以减少死亡率的必要条件。目前AMI的临床诊断的血清生物标志物主要有肌酸激酶同工酶、肌红蛋白和肌钙蛋白等，上述标志物虽己在AMI早期诊断的敏感性及特异性上达到一定水平，但研究者们对高敏感性及特异性的新血清标志物的研究仍在继续，如何更早的对急性心肌梗死进行诊断及预防，一直是研究的重要课题。而随着人类基因组计划完成和基因芯片技术的发展，许多单基因疾病的致病基因被发现，并应用到疾病的诊断与治疗当中。而AMI作为一种受多种遗传与环境因素影响的疾病，遗传学在AMI发病中的作用仍未明确。具体是哪些基因，通过何种细胞过程，有哪些通路参与了AMI过程尚未明确。

本研究通过AMI的外周血RNA表达谱差异分析，来研究具体有哪些基因参与了AMI过程，为将来AMI早期基因诊断奠定基础。发明人对6例急性心肌梗死病例组和6对照组血液样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，在差异表达明显的基因中挑选出高表达的候选基因AKR1B10，现有研究中并没有AKR1B10和急性心肌梗死相关的报道，进一步，发明人进行了分子验证，证实了AKR1B10在急性心肌梗死组中高表达，AKR1B10抑制剂可用于制备治疗急性心肌梗死药物。本发明提供了一种新的急性心肌梗死的监测治疗靶点，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种急性心肌梗死诊断制剂，所述急性心肌梗死诊断制剂检测AKR1B10基因和/或AKR1B10基因的表达产物。

进一步，所述急性心肌梗死诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增AKR1B10基因的引物；所述的基因芯片中包括与AKR1B10基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测AKR1B10基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。

进一步，直接检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因和/或基因的表达产物。

进一步，所述的急性心肌梗死的诊断制剂采用免疫方法检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

进一步，所述检测AKR1B10表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的AKR1B10单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被AKR1B10单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，所述检测AKR1B10蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的AKR1B10单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗AKR1B10单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的目的在于提供上述急性心肌梗死诊断制剂在制备急性心肌梗死诊断工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种治疗急性心肌梗死的制剂，所述制剂中含有抑制AKR1B10基因的转录或表达的试剂或化合物。

进一步，所述治疗急性心肌梗死的制剂中含有激活AKR1B10的抑制基因、激活抑制AKR1B10表达的蛋白、导入抑制AKR1B10转录或表达的siRNA、激活促进AKR1B10mRNA降解的microRNA、导入促进AKR1B10蛋白降解的分子、抑制促进AKR1B10表达的因子及蛋白的表达。

优选的，所述治疗急性心肌梗死的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。更优选的，所述治疗急性心肌梗死的制剂含有siRNA序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。

本发明的目的在于提供上述治疗急性心肌梗死的制剂在制备急性心肌梗死治疗药物或试剂中的应用。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因AKR1B10基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了AKR1B10基因与急性心肌梗死的关系：AKR1B10基因在外周血中高表达，与急性心肌梗死具有很好的相关性，可用于制备急性心肌梗死辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。

本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。

RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

本发明的目的在于提供一种检测急性心肌梗死的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基因AKR1B10，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为GAPDH。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

本发明目的是提供了一种急性心肌梗死蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测AKR1B10蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测急性心肌梗死的基因芯片，所述的基因芯片包括与AKR1B10基因的核酸序列杂交的探针。

附图说明

图1siRNA干扰后各组AKR1B10mRNA相对表达量

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1病例的收集

取2012年12月到2014年6月期间在医院心血管内科的初发急性心肌梗死患者6例，急性心肌梗死发病至入院时间为0.5-10小时。纳入标准符合2012年ESC大会上公布的急性心肌梗死的纳入标准。入组患者均己签署知情同意书。健康对照为医院体检中心的健康体检者6人，且与实验组患者年龄、性别等相匹配，同时参照AMI组的排除标准排除相关疾病。健康受试者知情并同意参与该项研究。

纳入标准：

参照2012年在德国慕尼黑召开的ESC大会上公布的新版心肌梗死全球统一定义的心肌梗死诊断标准，并且所有入组患者入院时间均在发病12小时内。

诊断标准即：血清心肌生化标志物(主要为血清肌钙蛋白)出现明显升高(且至少超过99％正常参考值上限)，同时合并有以下至少一项心肌缺血的临床证据：

1.心肌缺血的临床表现；

2.心电图出现新发生的缺血性心电图改变，包括新出现的ST-T的改变或新出现的左束支传导阻滞(LBBB)图形；

3.心电图表现为病理性Q波的形成；

4.影像学证据，包括新发的心肌活性丧失或新发的心肌局部室壁运动异常；

5.通过冠脉造影检查或尸检的客观证据证实冠状动脉内存在血栓。

排除标准：

1.年龄<20岁，>90岁；

2.既往曾有冠脉支架植入或者冠脉搭桥术后的患者；

3.有高心病、扩心病等其他各种心肌病，有陈旧性心肌梗死、心脏瓣膜病、心肌炎、心包炎、感染性心内膜炎、主动脉夹层等心脏病史者；

4.有全身免疫系统疾病或免疫功能紊乱、低下者；

5.近期1月内出现过发热、咳嗽、咳痰、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、尿频、尿急、尿痛等呼吸道、消化道或泌尿等其他系统感染，及有其他慢性感染性疾病的患者；

6.有重度贫血、原发血液系统疾病者；

7.有肿瘤病史者；

8.慢性肝炎、肝硬化、严重肝肾功能不全者；

9.近期有脑卒中、肺梗塞、周围血管疾病者；

10.器官或者骨髓移植患者。

AMI组：分别于患者入院当时采集肘正中静脉血3m1。

对照组：亦采集空腹肘正中静脉血3m1。

实施例2高通量测序及分析

对外周血进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组测序。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。样品合格后送往测序公司进行测序，测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序公司提供数据分析的结果结合文献我们筛选了差异表达基因AKR1B10。

实施例3急性心肌梗死组及对照组外周血AKR1B10基因表达情况

一、材料和方法

1、材料

选取48例急性心肌梗死患者组外周血及45例对照组外周血，对其进行分组及编号。两组的纳入标准及排除标准参照实施例1。

2、方法

2.1急性心肌梗死患者及对照人群外周血RNA的提取白细胞分离

(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；

(2)加入等体积无菌PBS于外周血中充分混合，形成细胞悬液；

(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；

(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm20min；

(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。

RNA提取

(1)先加lmlTrizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-l0min；

(2)加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下12000转离心15min；

(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入500,1异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

(4)4℃12000g离心l0min，弃上清液，底部可见白色物质；

(5)加入lml75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；

(6)4℃7500g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。

2.2逆转录合成cDNA

采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-TimePCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_020299.4(AKR1B10)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1引物序列

操作过程如下：

表2RealTime反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.5μl
		下游引物(10uM)	0.5μl

模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至25μl

(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，52℃45sec)×35个循环。

(二)样品RealTimePCR检测

将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二、实验结果

实时定量PCR扩增曲线光滑平稳，拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，曲线指数期斜率较大；目的基因和内参基因扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较AKR1B10基因在急性心肌梗死组外周血和对照组外周血中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中AKR1B10基因在急性心肌梗死组中的表达水平为对照组的近5倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析AKR1B10基因在急性心肌梗死患者中高表达的结果。

实施例4RNAi干扰AKR1B10表达及对心肌细胞的影响

一、材料

人原代心肌细胞(HumanCardiacMyocytes，HCM)购自美国ScienCell公司，培养于专用的心肌细胞培养基。

siRNA设计与合成依据在线设计软件，根据基因序列参照NCBI:NM_020299.4(AKR1B10)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。

表3siRNA序列列表

二、实验方法

(一)RNA干扰抑制心肌细胞AKR1B10基因的表达

细胞分组及转染

1.细胞分组

C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。

2.转染

按照Lipofectamine^TM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。

(1)心肌细胞同步化：转染前一天，取心肌细胞进行试验，使所有心肌细胞处于同步状态，减少试验干扰；

(2)5×10⁴细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；

(3)准备siRNA-Lipofectamine^TM2000复合物:

a.以250u1Opti-MEM稀释5ulLipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。

b.实验各组分别取7.5u1siRNA加入250u1Opti-MEMI中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；

c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和Lipofectamine^TM2000混合后在室温下孵育20分钟。

(4)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及siRNA-Lipofectamine^TM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；

(5)放置在37℃，CO₂培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；

(6)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：

转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％

3.应用Real-timePCR方法检测转染前后AKR1B10基因表达的变化

(1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的心肌细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于10⁴-10⁰copies/ul的DNA模板，分别加入AKR1B10基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到AKR1B10和内参的标准曲线。

(2)Real-timePCR方法检测转染前后AKR1B10基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进AKR1B10和内参的Real-timePCR反应，实验重复三次。

(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

三、实验结果

分别观察3条AKR1B10基因的siRNA及对照siRNA转染心肌细胞，结果显示在大量心肌细胞内发现绿色荧光，证明心肌细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察心肌细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。

Real-timePCR结果显示，转染非特异性的siRNA组对心肌细胞中AKR1B10基因表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的3个AKR1B10基因siRNA组都对心肌细胞中AKR1B10基因表达起到一定抑制作用，其中AKR1B10-siRNA1和AKR1B10-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达45％和68％，具体见图1。

Claims

1.一种急性心肌梗死诊断制剂，其特征在于，所述急性心肌梗死诊断制剂检测AKR1B10基因和/或AKR1B10基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的急性心肌梗死诊断制剂，其特征在于，所述急性心肌梗死诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因的表达。

3.根据权利要求2所述的急性心肌梗死诊断制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增AKR1B10基因的引物；基因芯片中包括与AKR1B10基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求2所述的急性心肌梗死诊断制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测AKR1B10基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。

5.根据权利要求1所述的急性心肌梗死诊断制剂，其特征在于，检测急性心肌梗死组织或外周血中AKR1B10基因和/或基因的表达产物。

6.权利要求1-5任意一项所述的急性心肌梗死诊断制剂在制备急性心肌梗死诊断工具中的应用。

7.一种治疗急性心肌梗死的制剂，其特征在于，所述制剂中含有抑制AKR1B10基因的转录或表达的试剂或化合物。

8.根据权利要求7所述的治疗急性心肌梗死的制剂，其特征在于，所述治疗急性心肌梗死的制剂中含有激活AKR1B10的抑制基因、激活抑制AKR1B10表达的蛋白、导入抑制AKR1B10转录或表达的siRNA、激活促进AKR1B10mRNA降解的microRNA、导入促进AKR1B10蛋白降解的分子、抑制促进AKR1B10表达的因子及蛋白的表达。

9.根据权利要求7所述的治疗急性心肌梗死的制剂，其特征在于，所述治疗急性心肌梗死的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。

10.权利要求7-9任意一项所述的治疗急性心肌梗死的制剂在制备急性心肌梗死治疗药物或试剂中的应用。