CN111455037A - 基于血浆外泌体环状rna的冠心病分子诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子诊断技术领域，公开了基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用。利用高通量测序和实时定量PCR实验证明，与健康人群相比，冠心病患者血浆外泌体中环状RNA hsa_circ_0005540的表达水平显著升高，hsa_circ_0005540可以作为冠心病的分子诊断标志物，通过检测受试者血浆外泌体中hsa_circ_0005540的表达水平即可判断受试者是否患有冠心病。本发明提供了可用于冠心病诊断的分子标志物hsa_circ_0005540基因表达产品，及其在制备诊断冠心病工具中的用途。作为一种无创、快速灵敏且低成本的冠心病诊断方法，该分子标志物在临床上具有广泛的应用前景。

Description

基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用。

背景技术

目前，冠心病是冠状动脉粥样硬化造成冠状动脉狭窄或阻塞，导致患者发生心肌缺血、缺氧而引起的一种心血管疾病。近年来，冠心病等老年性心血管疾病在我国的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为威胁我国公众健康的重要疾病之一。冠心病的发生发展是一个漫长的过程，受年龄、高血压、糖尿病、肥胖和生活方式等多种因素影响。外泌体(exosomes)是细胞主动向胞外分泌的30-120nm囊泡小体，通过运输蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子到靶细胞，参与细胞间的信息和物质传递。研究发现，生理或病理状态下的血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁等体液中均存在外泌体。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类具有闭合环状结构的内源性RNA分子，主要由pre-mRNA通过可变剪切加工产生。它广泛存在于各种生物细胞中，具有表达丰度高、结构稳定和组织特异性表达等特征。越来越多的研究表明，circRNA可通过在转录及转录后水平调节基因的表达，参与细胞增殖、分化、自噬和凋亡等多种生物学过程，在各种疾病发生发展过程中发挥重要作用。研究还发现circRNA在疾病诊断方面具有巨大的潜力，有望成为新型的临床分子诊断标志物。最近有研究发现，血液外泌体中含有大量circRNAs(exo-circRNAs)，提示血液外泌体中丰度高、稳定和组织特异性强的exo-circRNAs，具有成为疾病诊断分子标志物的潜力。

目前冠心病的临床诊断存在知晓率低、治疗率低和控制率低的“三低”状况，对疑诊患者缺乏规范化诊断导致冠心病误诊率和漏诊率较高。而理想的早期诊断和干预需要一个灵敏可靠的检测技术手段。目前临床上冠心病诊断的金标准是冠状动脉造影，但它具有费用较高、有创性以及有临床风险等缺点，因此研发一种无创、快速灵敏且低成本的分子诊断方法势在必行。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)目前冠心病的临床诊断存在知晓率低、治疗率低和控制率低，对疑诊患者缺乏规范化诊断导致冠心病误诊率和漏诊率较高。

(2)目前临床上冠心病诊断的金标准是冠状动脉造影，具有费用较高、有创性以及有临床风险等缺点。

解决以上问题及缺陷的难度为：目前临床上对冠心病的诊断缺少一种简易可靠、快速灵敏的诊断方法。而外泌体环状RNA作为生物分子诊断标志物，其取材方便、检测便捷的同时又有较高的灵敏度和特异性，就能解决以上问题。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明的意义在于当现有技术不足时，寻找一种诊断冠心病的外泌体环状RNA作为生物标志物，为冠心病的诊断、预后以及治疗等研究提供有利基础，对提高冠心病人群的知晓率、治疗率和控制率，以及降低冠心病人群的死亡率具有重大意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明是采用以下技术方案：

本发明提供一种检测hsa_circ_0005540的产品在制备冠心病诊断工具中的用途。

进一步，所述检测hsa_circ_0005540的产品包括检测hsa_circ_0005540的表达水平的产品。所述产品包括能够结合hsa_circ_0005540的核酸。所述核酸能够检测hsa_circ_0005540的表达水平。

进一步，上面所提到的检测hsa_circ_0005540表达的产品包括：通过实时定量PCR或高通量测序平台检测hsa_circ_0005540表达水平以诊断冠心病的产品。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

上面所述的核酸包括扩增hsa_circ_0005540的引物，产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增hsa_circ_0005540的引物序列，如SEQ ID NO：1(正向序列)和SEQ ID NO：2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可以包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来制备。

进一步，所述检测hsa_circ_0005540的产品可以是检测hsa_circ_0005540的试剂，也可以是包含所述试剂的试剂盒，还可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

利用前面所述的检测产品检测受试者样本中hsa_circ_0005540的表达水平，与健康人群相比，受试者样本中的hsa_circ_0005540表达水平升高，则诊断该受试者为冠心病患者。

用于诊断冠心病的hsa_circ_0005540的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得环状RNA的体液。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血浆外泌体。

本发明的另一目的在于提供一种诊断冠心病的工具，所述工具能够检测受试者样本中hsa_circ_0005540的表达水平。所述工具包括能够结合hsa_circ_0005540的核酸。所述核酸能够检测hsa_circ_0005540的表达水平。

进一步，所述核酸的性质同前面所述。

进一步，所述诊断冠心病的工具包括但不限于通过基因芯片、试剂盒或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测hsa_circ_0005540表达的产品可以应用于该平台实现对hsa_circ_0005540表达情况的检测。通过对比患者和健康人群的基因测序分析，可得到与疾病发生发展相关的基因。因此，在高通量测序中获知hsa_circ_0005540表达异常与冠心病相关也属于hsa_circ_0005540的用途，同样在本发明的保护范围之内。

进一步，所述受试者样本的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得环状RNA的体液。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血浆外泌体。

本发明还提供了一种诊断冠心病的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样本；

(2)检测受试者样本中hsa_circ_0005540的表达水平；

(3)将受试者的hsa_circ_0005540表达水平与受试者的患病与否关联起来；

(4)与对照相比，hsa_circ_0005540的表达水平升高，则该受试者被诊断为冠心病。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明首次发现了环状RNA hsa_circ_0005540表达与冠心病相关，通过检测受试者中血浆外泌体hsa_circ_0005540的表达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险，从而指导临床医生给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子诊断标记物hsa_circ_0005540，使用该分子标志物可以快速、特异和灵敏地诊断冠心病，从而降低冠心病的死亡率。本发明涉及一种基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物(hsa_circ_0005540)及其应用。

附图说明

图1本发明实施例提供的显示基因测序中差异表达circRNA的聚类分析图和火山图。

A：差异表达的circRNAs；X轴：冠心病病例组(CAD)和健康对照组(non-CAD)的分层聚类；Y轴：circRNAs表达水平的分层聚类；B：差异表达circRNA的火山图，X轴：log2(FoldChange)；Y轴：-log10(P value)。

图2本发明实施例提供的显示利用实时定量PCR检测hsa_circ_0005540在105例冠心病患者与86例健康对照组中的差异表达情况示意图。

图3本发明实施例提供的显示受试者特征工作曲线(receiver operatingcharacteristic curve，ROC)分析hsa_circ_0005540对于冠心病的诊断效能结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例的实验方案包括circRNA高通量测序筛选阶段和独立样本验证阶段。

CircRNA测序筛选阶段：收集冠心病病例及健康对照个体各3例，应用IlluminaHiSeq^TM2500 platform，基于差异倍数>4、P值<0.05筛选标准。本发明中挑选在冠心病中表达上调的hsa_circ_0005540，作为进一步验证的候选circRNA。

独立样本验证阶段：收集105例冠心病患者与86例对照组个体。应用实时定量PCR检测样本血浆外泌体中hsa_circ_0005540的表达水平，并进行受试者特征工作曲线(ROC)分析。

一、受试者选择标准

收集了191例独立验证样本，其中冠心病病例105例、健康对照组86例。本研究方案已通过医院伦理委员会批准，所有参与研究的人群对象都签署知情同意书。

冠心病患者入选标准：经冠状动脉造影证实，有一支或多支血管狭窄程度≥50％。根据下列标准排除受试者：①先天性心脏病；②冠状动脉搭桥手术经历；③射血分数异常、心脏衰竭；④急性心肌损伤。

健康对照组纳入标准：心电图正常，无个人或家族性的心血管疾病史，年龄、性别、种族与冠心病组匹配。排除标准：有动脉高压、心绞痛、冠心病史或外周动脉疾病史的人群。

冠心病患者和健康对照组的共同排除标准：①白细胞减少症；②血小板减少症；③末梢血管疾病；④严重的肝肾功能障碍；⑤涉嫌吸毒或酗酒；⑥患有急性或慢性炎症者；⑦恶性疾病的患者。

二、实验方法

本发明实施例中用到的主要实验方法包括：

(1)外周血中血浆的分离

取3mL静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，混匀后2500g，离心15分钟，分离1mL血浆至新的无RNase酶Eppendorf管中；再次2500g，离心15分钟，得到去除血小板的血浆样本。

(2)血浆外泌体总RNA的提取

1)利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi kit(Qiagen)分离并提取血浆外泌体RNA。等体积XBP与血浆混合，颠倒混匀5次后转移至离心柱，500g，离心1分钟；弃废液，接着5000g，离心1分钟；加入3.5mL XWP，5000g，离心5分钟。

2)转移柱子到新的套管，加入700μL Qiazol，放置5分钟，使样本充分裂解。

3)4℃，12000g，离心15分钟。样本会分成三层：粉红色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相小心转移上层水相至新的无RNase酶Eppendorf管中。

4)加入2倍体积无水乙醇与分离的水相轻柔吹打混匀。

5)将上清加到试剂盒配套的RNeasy MinElute spin column柱子中；室温，10000g，离心15秒，弃废液，重复该步骤直到将所有上清过柱完毕。

6)往柱子加入700μL RWT，10000g，离心15秒，弃废液；往柱子加入500μL RPE，10000g，离心15秒，弃废液；往柱子加入500μL RPE，10000g，离心2分钟，弃废液。

7)将柱子转移到新的无RNase酶Eppendorf管中，加入14μL DEPC水，关闭盖子放置1分钟，让RNA充分溶解；16000g，离心1分钟，收集得到RNA样本。

(3)逆转录

1)消除RNA中的基因组DNA：采用Takara公司的Prime script RT Reagent Kitwith gDNA Eraser试剂消除基因组DNA污染并进行逆转录。具体操作步骤及体系如下：根据Nano Drop 2000测定的RNA浓度，计算1μg RNA所需体积，如下表1所记载的体系进行配置：

表1消除RNA中的基因组DNA

2)42℃孵育2分钟，4℃保存。

3)逆转录反应体系如表2所记载。

表2逆转录反应体系

4)PCR反转录应用程序如下表3所记载。

表3 PCR反转录应用程序

(4)实时定量PCR(qRT-PCR)

使用罗氏实时定量PCR仪Light Cycler 96检测circRNAs水平，以ACTIN作为内参基因，Ct值是指当PCR反应达到平台期所在拐点时经历的PCR循环数。Ct值越小，表达量越高；反之越低。使用

方法计算circRNA相对表达水平。

计算公式如下：

即

1)根据Circbase和Genbank中环状RNA的编码序列以及ACTIN的编码序列设计实时定量PCR扩增引物，由Invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

环状RNAhsa_circ_0005540引物：

正向引物为5’-GAGGAAAACAGACTCTCTAAACAGC-3’(SEQ ID NO：1)

反向引物为5’-TGTGTAGGTCTGATAGGCGTAAA-3’(SEQ ID NO：2)

ACTIN基因引物：

正向引物为5’-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAG-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物为5’-GCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3’(SEQ ID NO：4)

2)按照表4配置实时定量PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Takara公司。

表4实时定量PCR反应体系

3)实时定量PCR反应条件如下表5所记载：

表5实时定量PCR反应条件

(5)统计学方法分析

采用Prism Graphpad软件对结果进行统计分析及作图，实验数据结果用均数±标准差(mean±SD)表示，两样本之间的比较用Student t检验进行分析。使用SPSS统计软件中的ROC分析计算曲线下的面积，评估circRNAs的诊断价值。利用Logistic回归分析circRNAs、人群基本特征与冠心病的风险关联情况。所有统计分析以P<0.05表示差异具有统计学意义。

三、实验结果

(1)测序和验证样本的临床基本特征

表6测序样本的临床基本特征

注：连续变量为均数±标准差，分类变量用百分比表示；Systolic BP，收缩压；FPG，空腹血糖；TC，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白。

表7验证样本的临床基本特征

注：连续变量为均数±标准差，分类变量用百分比表示；Systolic BP，收缩压；FPG，空腹血糖；TC，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白。

(2)基因测序分析在冠心病患者和对照组中差异表达的circRNAs

以变化倍数>1.5且P<0.05为差异表达筛选标准，从基因测序分析的结果中筛选差异表达基因。有355个circRNAs在冠心病和对照组中差异表达；其中164个circRNAs在冠心病组显著上调，191个circRNAs在冠心病组显著下调。差异表达circRNAs聚类分析见图1A，差异表达circRNAs火山图见图1B。

(3)实时定量PCR验证差异表达的hsa_circ_0005540

以差异倍数>4、P<0.05为标准，在基因测序分析结果中挑选hsa_circ_0005540进行重复验证。应用实时定量PCR的方法，在独立验证样本中验证hsa_circ_0005540，以ACTIN作为内参，结果见图2。与对照组比较，冠心病患者血浆外泌体中hsa_circ_0005540水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

(4)ROC曲线分析血浆外泌体hsa_circ_0005540诊断冠心病的效能

利用ROC曲线评价hsa_circ_0005540诊断冠心病的特异性和敏感性。图3显示结合年龄、性别、收缩压、HDL、TC、高血压、糖尿病和吸烟八个Framingham Heart Study风险因素及hsa_circ_0005540的ROC曲线。ROC曲线及Logistic回归分析结果显示其AUC为0.853(0.799-0.906)，敏感度为0.810，特异度为0.765，提示hsa_circ_0005540可作为冠心病的分子诊断标志物。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东医科大学

<120> 基于血浆外泌体环状RNA的冠心病分子诊断标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggaaaaca gactctctaa acagc 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgtaggtc tgataggcgt aaa 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagatgaccc agatcatgtt tgag 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcagctcgta gctcttctcc ag 22

Claims (10)

1.检测环状RNA hsa_circ_0005540基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0005540的产品包括检测hsa_circ_0005540表达水平的产品。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的hsa_circ_0005540表达水平，与健康人群相比，受试者样本中hsa_circ_0005540的表达水平升高，则诊断该受试者为冠心病患者。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是血浆外泌体。

5.如权利要求1～4中任一项所述应用，其特征在于中，所述产品为能够结合hsa_circ_0005540的核酸；所述核酸能够检测hsa_circ_0005540的表达水平。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增hsa_circ_0005540的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

7.一种诊断冠心病的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测受试者样本中hsa_circ_0005540表达水平的工具。

8.如权利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合hsa_circ_0005540的核酸，所述核酸能够检测hsa_circ_0005540的表达水平。

9.如权利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增hsa_circ_0005540的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

10.如权利要求7～9中任一项所述的工具，其特征在于，所述受试者样本的来源是血浆外泌体。

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