CN109371129A - hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用，本发明首次通过RNA‑seq测序发现hsa_circRNA_0000798在HCC PBMCs中较正常对照显著高表达。随后在72个HCC PBMCs中再次证明其较高的表达，并发现其对HCC有很好的诊断效果，具有作为肝癌非侵袭性的诊断生物标记物的潜力。

Description

hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标 记物的应用

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，与肺癌、胰腺癌一起被称为病死率最高的三大癌症。严重危害人民的健康。仅有少数肝癌患者被明确诊断时具有手术的机会且术后存活期较短。因此，寻找肝癌的早期诊断或预后生物标记物迫在眉睫。

近年来，HCC中发现诸如miRNA、LncRNA等非编码RNAs表达失调。大量研究表明，这些非编码RNA对HCC早期诊断、发生发展机制研究、临床转归预测、治疗靶标的寻找等具有很大的应用价值。与此相比，作为一类新的非编码RNA，环状RNA(circular RNAs， circRNAs)是一种具有环状结构、无poly(A)尾、高保守性、表达有细胞特异性、组织特异性、疾病特异性等特点。并且基于其首尾相接成环的结构特点，使其较miRNA、LncRNA而言具有非常稳定的特性，不易被RNA酶降解。提示circRNAs可能是一类新型的疾病生物标记物，在疾病诊断方面具有潜在价值。

专利申请CN 201710451830.X、CN 201710451836.7、CN 201710452232.4、CN201710452742.1中，戴等人基于芯片发现全血中hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096、 hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102347对于肝癌诊断、预后、治疗的应用。然而较芯片而言，高通量测序(RNA-seq)是开放系统，检测基因不需要依赖已知基因组或转录组的参考序列，能发现和寻找到新的信息；检测动态范围大，芯片由于非特异性杂交的影响，不能检测到低丰度的转录本，而RNA-seq的灵敏度能达到总RNA中千万分之一的表达量；RNA-seq能够提供更为丰富的序列信息；RNA-seq实验的可重复性很高。

外周血单个核细胞(PBMCs)通常指单核细胞和淋巴细胞，代表先天免疫系统和适应性免疫系统的细胞。外周血单个核细胞中某些关键基因的改变常与肿瘤及肿瘤相关免疫等疾病的状态有关，提示外周血单个核细胞中基因表达的改变对疾病的诊断及预后具有潜在的意义。 PBMCs中circRNA表达谱的改变，提示circRNA在PBMCs中的表达谱可能是发现与生理或病理事件相关的生物标志物的有前途的工具。然而，肝癌患者PBMCs细胞中核糖核酸(circRNAs)的分布如何改变，以及它们是否可用于肝癌的诊断或预后尚不清楚。

为了研究特定的疾病分子在靶组织中的作用并了解其对疾病作用的分子机制，通常组织，比如癌变肝脏、癌旁组织是最感兴趣的。然而，由于癌旁组织也存在一定的癌变可能，并不能作为最可靠的正常对照，另一方面，肝等正常对照样本通常是不可能从健康志愿者获得的。更加限制了取样的可行性。因此必须寻找一种更方便，无创性，代价小，并且能够反映疾病状态的组织来作为疾病诊断的新工具或新的补充。

与PBMCs样品相比，全血样品是一种混合的样本，包含多种物质和组分，如PBMCs、红细胞、无细胞RNA、血浆、多核细胞等。全血测序会受到样品中出现的红细胞和表达血红蛋白基因如Hbα、Hbβ、Hbδ、HbγA、HbγG、Hb zeta、Hbε、Hb珠蛋白等的影响。如果在测序的全血全转录组样本中不除去Hb，则约30-70％测序数据将映射到Hb基因上并影响测序数据的标准化，因此一般不选用全血测序。

最近有大量研究证据证明在饮食干预研究中的转录组研究中得到的信息表明PBMCs的基因表达性状具有广泛的遗传成分，更保守性。从PBMCs测量的基因转录似乎是遗传的。因此，从这些研究中的借鉴也可用于鉴定各种疾病的诊断候选基因。PBMCs在基因组学领域是一种很有潜力的目标组织，一直是对转录组学分析的临床和干预研究中非常感兴趣的组织来源。与肝等组织相比，PBMCs更容易更方便且能够重复收集，保证足够数量用于研究。并且基于PBMCs能够反映疾病状态下基因表达水平的变化，PBMCs已被用于探索各种疾病的基因表达和预测临床结果，被用作研究炎症相关基因表达的模型。在疾病相关基因标记物的研究中，PBMCs似乎是一个合适的组织或者说是一个有前途的工具。因此，在HCC临床疾病诊断标记物的研究中应用PBMCs基因表达的变化作为模型系统也更适合于理解在HCC疾病病理中该疾病相关基因异常表达的作用及背后的潜在机制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

GTACAGGTGAACAAAGGCAGAGTAAACTGTCACCCCAGATGCAGGTACATCAAGACAAAA CCCTGCCACCAGCTCAGTCATCAAGTGTGGGTCCAGCAGAAGCCCAGCCACAGACTGCTCAGCC TTCAGCTCAGCCCCAGCCCCAAACCCAGCCCCAGTCCCCAGCTCAGCCTGAAGTTCAGACTCAG CCTGAAGTTCAGACCCAAACAACTGTTTCATCCCATGTCCCTTCTGAAGCACAACCCACCCACG CACAGTCATCCAAGCCCCAAGTTGCAGCACAGTCTCAGCCTCAAAGTAATGTCCAAGGACAGTC TCCTGTTCGTGTCCAAAGTCCATCACAGACTCGAATACGTCCATCAACTCCATCCCAACTGTCTC CTGGACAACAATCCCAGGTTCAGACTACAACCTCACAACCGATTCCAATTCAACCACATACATCT CTTCAGATACCTTCCCAAGGCCAGCCACAGTCACAACCCCAGGTACAGTCTTCAACTCAAACTC TTTCATCAGGACAAACTTTAAATCAAGTTACTGTTTCATCCCCATCCCGTCCTCAGCTACAAATAC AGCAGCCACAGCCCCAAGTCATTGCTGTGCCTCAGCTGCAACAACAAGTCCAGGTTCTCTCTCA GATCCAGTCACAGGTTGTGGCTCAGATACAGGCTCAGCAAAGTGGTGTGCCCCAGCAAATCAAA CTCCAGTTACCTATCCAAATTCAGCAAAGCAGTGCTGTGCAGACTCACCAGATTCAGAATGTGGT TACAGTGCAGGCAGCCAGTGTGCAAGAGCAGTTGCAAAGGGTTCAGCAACTCAGGGATCAGCA GCAAAAGAAGAAACAGCAACAGATAGAAATTAAGCGTGAACACACCCTCCAAGCTTCTAATCA AAGTGAAATCATTCAGAAACAGGTGGTGATGAAGCATAATGCTGTAATAGAACATTTAAAACAGA AAAAGAGCATGACTCCAGCTGAAAGAGAAGAGAATCAAAGAATGATTGTCTGTAACCAGGTGAT GAAGTATATTTTGGATAAGATAGATAAAGAAGAAAAACAGGCAGCAAAAAAACGGAAGCGTGA AGAGAGTGTGGAGCAGAAACGTAGCAAGCAGAATGCCACTAAGCTGTCAGCTCTGCTCTTCAA GCACAAAGAGCAGCTCAGAGCCGAGATCCTGAAGAAGAGAGCACTCCTGGACAAGGATCTGCA AATTGAAGTGCAG，如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述诊断和预后评估为非侵袭性。

优选的，利用外周血单个核细胞样品进行肝癌早期诊断。

本发明的有益效果在于：

本发明首次通过RNA-seq测序发现hsa_circRNA_0000798在HCC PBMCs中较正常对照显著高表达。随后在72个HCC PBMCs中再次证明其较高的表达，并发现其对HCC有很好的诊断效果，具有作为肝癌非侵袭性的诊断生物标记物的潜力。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为qRT-PCR检测hsa_circRNA_0000798在HCC PBMCs和正常对照组PBMCs中表达变化，Control表示正常对照组；

图2为qRT-PCR检验结果，其中，A为2.5％琼脂糖凝胶鉴定hsa_circRNA_0000798qRCR 产物片段的特异性和正确性，B表示对qRCR产物进行Sanger测序鉴定hsa_circRNA_0000798 片段唯一性，M表示核酸所用的条带指示marker(货号DL0501)，两个鸟嘌呤GG表示 hsa_circRNA_0000798的剪接位点；

图3为hsa_circRNA_0000798与HCC患者生存时间相关性评估，结果表示hsa_circRNA_0000798水平高表达的患者生存时间更短；

图4为hsa_circRNA_0000798对HCC患者临床潜在的诊断价值评估，结果显示AUC曲线下面积达到0.909，表明hsa_circRNA_0000798对HCC患者有较好的诊断价值。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

运用实验和二代测序方法鉴定hsa_circRNA_0000798的存在：

基于RNA-seq数据，以log₂FC≥1.0和FDR≤0.05(FC,fold change，差异表达倍数；FDR, false discovery ratio，错误发现率)，剪接片段长度在800-1500之间，在HCC PBMCs中高表达的外显子来源的circRNA为标准进行筛选，最终选择circRNA-BPTF(BPTF为该环状RNA 来源的mRNA名称)为候选环状RNA，其剪接长度为1226bp。通过检索现有的环状RNA数据库circBase，发现该circRNA-BPTF在circBase的收录编码为hsa_circRNA_0000798。

使用circPrimer1.2(http://www.bioinf.com.cn/)设计hsa_circRNA_0000798的引物：

F：5’-ACTCCTGGACAAGGATCTGC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

R：5’-GTACCTGCATCTGGGGTGAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

产物大小为86bp。

qRT-PCR反应程序为95℃3分钟；30个循环(95℃30s，56℃30s，72℃30s)。2.5％琼脂糖凝胶(质量体积浓度，每mL TBE缓冲液对应琼脂糖粉的质量)检测PCR产物的特异性和条带大小。

将hsa_circRNA_0000798PCR产物送往(invitrogen)公司测序，确定PCR产物正确性。

实施例2

运用实验和二代测序方法鉴定hsa_circRNA_0000798的存在

样本收集：

外周血样本收集于中国人民解放军陆军军医大学西南医院肝胆外科，健康对照组收集于西南医院健康管理中心体检门诊。每个供试者收集10毫升外周血于EDTA-抗凝管。密度梯度离心法分离获取PBMCs，如下所示：离心管中预先加入3ml人外周血淋巴细胞分离液，将抗凝血沿离心管壁缓慢加入到含人淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min，离心20min,；用吸管吸取第二层(淋巴细胞层，厚度约3mm，白色絮状)；放入另外一支预先加入5mlPBS 的离心管中，吹吸洗涤；1000r/min离心8min。溶于1mL Trizol试剂，用移液枪反复抽吸溶解细胞，冻存液氮中(-180℃)，备用。

总RNA提取与反转录：

A.将液氮冻存的PBMCs取出，室温放置3分钟溶解，每管加入0.2mL氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡试管15秒，然后室温放置3分钟。4℃、12000×g离心15分钟，将上清移至干净的无酶1.5mL EP管中；加入0.5mL异丙醇沉淀其中的RNA，室温放置7分钟，4℃、 12000×g离心10分钟；弃去上清，用1mL体积浓度75％的乙醇水溶液洗涤RNA沉淀，旋涡振荡器混匀，室温放置7分钟，4℃、500×g离心5分钟；小心倒去乙醇水溶液，将RNA 沉淀在空气中晾干(约5-10分钟)，用移液管加入20μL DEPC水，置60℃孵箱中2分钟使其溶解；NanoDrop-1000检测RNA纯度，当吸光度260/280在1.8-2.1之间认为抽提RNA纯度较高。

B.使用反转录试剂盒Prime-Script RT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反转录 cDNA，每孔反转录总RNA量为1000ng。反转录条件为(37℃15分钟，85℃5s，4℃10分钟)。 cDNA保存于-20℃，备用。

qRT-PCR检验：

根据试剂盒的说明，使用SYBR qPCR Super Mix(Novoprotein)试剂盒进行qRT-PCR。 qRT-PCR反应系统为Stratagene Mx3000P real-time PCR系统(AgilentTechnologies)。人 GAPDH基因(重庆invitrogen公司合成)作为内参控制基因。

GAPDH引物

R:5’-GGTCTGGGAGCCTGGAAAA-3’，如SEQ ID NO.4所示；

F:5’-TTCGCTCCTGGAAGATGGTAAT-3’，如SEQ ID NO.5所示。

qRT-PCR反应程序为95℃3分钟；30个循环(95℃30s，56℃30s，72℃30s)。最终以2^-ΔΔCt法计算circRNA的表达量。

最终hsa_circRNA_0000798在HCC组和正常对照组的表达统计结果如图1所示。qRT-PCR 产物经2.5％琼脂糖凝胶检测，以及通过Sanger测序鉴定产物片段的正确性和唯一性。如图2 中A所示，hsa_circRNA_0000798qRT-PCR产物片段大小为86bp，与预期一致。将qRT-PCR 产物的Sanger测序结果与RNA-seq测序的hsa_circRNA_0000798数据用blast进行比对，如图2中B所示，qRT-PCR产物跨过hsa_circRNA_0000798剪接位点，证明结果准确。

实施例3

提供PBMCs中hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断和预后评估价值的指标

hsa_circRNA_0000798与HCC患者预后相关性

为了评估hsa_circRNA_0000798与HCC患者预后相关性，使用Kaplan-Meier方法分析hsa_circRNA_0000798的表达水平和72例HCC患者死亡病例的预后分析，并绘制了患者的预后生存曲线，如图3所示。PBMCs中hsa_circRNA_0000798高表达的HCC患者预后生存时间更短相较于hsa_circRNA_0000798低表达的HCC患者。

hsa_circRNA_0000798对HCC患者临床潜在的诊断价值

通过上面的实验结果，我们进一步使用ROC(receiver operatingcharacteristic curve)曲线对hsa_circRNA_0000798对HCC诊断的价值做了分析，分别以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制hsa_circRNA_0000798在HCC患者PBMCs的表达水平与临床参数的ROC曲线，如图4所示。曲线下面积(AUC)被用来计算hsa_circRNA_0000798 对HCC的诊断价值，AUC取值在0.5-1.0之间被认为是有意义的。越接近1，表示诊断价值越高。最终的结果表明hsa_circRNA_0000798(AUC＝0.909)对于HCC有较好的诊断价值。表明hsa_circRNA_0000798有潜能作为肝癌诊断的生物标记物。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtacaggtga acaaaggcag agtaaactgt caccccagat gcaggtacat caagacaaaa 60

ccctgccacc agctcagtca tcaagtgtgg gtccagcaga agcccagcca cagactgctc 120

agccttcagc tcagccccag ccccaaaccc agccccagtc cccagctcag cctgaagttc 180

agactcagcc tgaagttcag acccaaacaa ctgtttcatc ccatgtccct tctgaagcac 240

aacccaccca cgcacagtca tccaagcccc aagttgcagc acagtctcag cctcaaagta 300

atgtccaagg acagtctcct gttcgtgtcc aaagtccatc acagactcga atacgtccat 360

caactccatc ccaactgtct cctggacaac aatcccaggt tcagactaca acctcacaac 420

cgattccaat tcaaccacat acatctcttc agataccttc ccaaggccag ccacagtcac 480

aaccccaggt acagtcttca actcaaactc tttcatcagg acaaacttta aatcaagtta 540

ctgtttcatc cccatcccgt cctcagctac aaatacagca gccacagccc caagtcattg 600

ctgtgcctca gctgcaacaa caagtccagg ttctctctca gatccagtca caggttgtgg 660

ctcagataca ggctcagcaa agtggtgtgc cccagcaaat caaactccag ttacctatcc 720

aaattcagca aagcagtgct gtgcagactc accagattca gaatgtggtt acagtgcagg 780

cagccagtgt gcaagagcag ttgcaaaggg ttcagcaact cagggatcag cagcaaaaga 840

agaaacagca acagatagaa attaagcgtg aacacaccct ccaagcttct aatcaaagtg 900

aaatcattca gaaacaggtg gtgatgaagc ataatgctgt aatagaacat ttaaaacaga 960

aaaagagcat gactccagct gaaagagaag agaatcaaag aatgattgtc tgtaaccagg 1020

tgatgaagta tattttggat aagatagata aagaagaaaa acaggcagca aaaaaacgga 1080

agcgtgaaga gagtgtggag cagaaacgta gcaagcagaa tgccactaag ctgtcagctc 1140

tgctcttcaa gcacaaagag cagctcagag ccgagatcct gaagaagaga gcactcctgg 1200

acaaggatct gcaaattgaa gtgcag 1226

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actcctggac aaggatctgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtacctgcat ctggggtgac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtctgggag cctggaaaa 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcgctcctg gaagatggta at 22

Claims (3)

1.hsa_circRNA_0000798作为肝癌早期诊断或预后评估生物标记物的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断和预后评估为非侵袭性。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用外周血单个核细胞样品进行肝癌早期诊断。