CN110878350B - 一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒，其包括：用于提取人外周血单个核细胞中RNA的RNA提取分离系统；用于检测人外周血单个核细胞中基因GPR174的mRNA表达量的GPR174基因检测系统；记载用于确定表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准时，提示患有脓毒症；反之，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量高于所述标准时，提示排除脓毒症。本发明的试剂盒能够用于判断是否罹患脓毒症、脓毒症严重程度，为早期采取临床治疗手段提供依据，提高脓毒症患者的生存率。

Description

一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒。
背景技术
脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，是导致危重病患者死亡的主要原因。根据全球脓毒症联盟(Global Sepsis Association,GSA)公布的数据显示，每年因脓毒症所致的死亡率高于前列腺癌、乳腺癌及艾滋病三种疾病的总和。据推算，全球每年新发脓毒症患者3150万例，死亡530万例。2011年，美国因脓毒症所产生的治疗费用超过200亿美元，占全美每年医疗总费用的5.2％。在低收入和中等收入的发展中国家中，脓毒症死亡率与所支出的医疗费用可能更高。因此，脓毒症是危害人类健康并造成严重公共卫生负担的重要疾病。
尽管近年来人类对于脓毒症的定义、病理生理及发病机制有了长足的进步，但由于脓毒症早期难以明确诊断，往往因治疗不及时而进展成为严重脓毒症、多器官功能衰竭而导致死亡。究其原因主要是由于脓毒症的诊断复杂，需要动态观察患者全身情况、血流动力学状态、组织细胞灌注以及各个脏器功能等指标，因而早期识别极为困难。此外，脓毒症缺乏早期客观预警标志物，目前仍然依赖临床症状、带有较强主观意识的评分表以及实验室经典检测物。IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α等炎症因子参与脓毒症疾病进展，然而其敏感性波动太大，特异性较低，C反应蛋白同样缺乏特异性。作为目前脓毒症诊断敏感性与特异性均为较佳的降钙素原(Procalcitonin，PCT)，在越来越多的报道中发现，但其在作为指导治疗的标志物时并没有对脓毒症的死亡率起到明显的改善。
发明内容
发明人在对确诊为脓毒症患者的基因型进行研究时，惊讶地发现脓毒症患者的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的基因GPR174表达水平普遍都低，明显低于非脓毒症患者比如健康人以及ICU对照病人，并呈现规律性。这一意外发现预示GPR174基因有可能作为脓毒症诊断及预后评估的生物标志物，通过临床实验统计，得到了具有统计学意义的GPR174的mRNA表达量统计结果，填补了脓毒症诊断领域的空白，从而构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒，其包括：用于提取人外周血单个核细胞中RNA的RNA提取分离系统；用于检测人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量的GPR174基因检测系统；记载用于确定表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准时，提示患有脓毒症，并且GPR174的mRNA表达量越低，脓毒症越严重；反之，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量高于所述标准时，提示排除脓毒症。
上述数学模型可以是检测GPR174基因的荧光定量PCR的△△CT计算公式：△Ct(n)＝Ct(GPR174基因)-Ct(内参基因)；△△CT(n)＝△Ct(n)-△Ct(1)，其中n为扩增反应的循环次数。
优选地，上述内参是GAPDH基因或者管家基因β-actin(β-肌动蛋白)，优选GAPDH基因。
在一种实施方式中，上述表达量高/低分界标准是△△CT值取0.20为临界值，即当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于0.20时，提示患有脓毒症；反之，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量高于0.20时，提示排除脓毒症。
优选地，上述△△CT值取0.10为脓毒症病情分类临界值，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于0.10时，提示为脓毒症病情严重，即严重脓毒症。
上述GPR174基因检测系统中GPR174基因的PCR扩增引物序列可以为：
正向引物：5’-TTGCATGACAGCATCCAACT-3’(SEQ ID NO:1)；
反向引物：5’-AAGTTCTTCCCTGTGGCTTG-3’(SEQ ID NO:2)。
上述GPR174基因检测系统中内参GAPDH基因的PCR扩增引物序列可以为：
正向引物：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO:3)，
反向引物：5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’(SEQ ID NO:4)。
在一种优选的实施方式中，上述试剂盒还可以包括选自下组的一个以上检测体系：白细胞检测体系、降钙素原(PCT)检测体系、炎症细胞因子IL-2检测体系、IL-10检测体系。
研究发现，GPR174的mRNA表达量与这些白细胞水平、降钙素原(PCT)水平、炎症细胞因子比如IL-2水平和IL-10水平等呈现负相关性，即GPR174的mRNA表达量越低，脓毒症病情严重，此时白细胞水平、降钙素原(PCT)水平、IL-2水平和IL-10水平就越高。因此GPR174基因表达水平与它们的组合可以进一步提高脓毒症诊断的准确性。换句话说，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与白细胞水平负相关时，提示患有脓毒症；并且GPR174的mRNA表达量越低、白细胞水平越高，脓毒症病情越严重。
当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与降钙素原(PCT)水平负相关时，提示患有脓毒症；并且GPR174的mRNA表达量越低、降钙素原(PCT)水平越高，脓毒症病情越严重。
当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与IL-2水平或者IL-10水平负相关时，提示患有脓毒症；并且GPR174的mRNA表达量越低、IL-2或IL-10水平越高，脓毒症病情越严重。
上述白细胞检测体系可以包括用于检测白细胞的试剂和标准品。上述降钙素原(PCT)检测体系、炎症细胞因子IL-2检测体系、IL-10检测体系可以是蛋白质检测体系，比如包括用于检测蛋白质的试剂和标准品；也可以是用于检测降钙素原基因、IL-2基因、IL-10基因的PCR体系。
本发明的试剂盒通过检测不同病情程度和预后的脓毒症病人、ICU对照病人以及健康成年人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量，分析得到脓毒症早期诊断、不同病情程度及预后与GPR174-mRNA表达量之间的关系，提高了严重脓毒症诊断的灵敏度与特异性，并确定早期诊断严重脓毒症和不同预后的警戒值，为早期采取临床治疗手段提供依据，达到避免耽误脓毒症患者的治疗、提高脓毒症生存率的目的。
具体实施方式
GPR174是近年来发现的与免疫和炎症反应相关的膜蛋白，其参与T细胞和B细胞的成熟和分化。我们前期研究发现，GPR174具有调节脓毒症小鼠炎症反应的作用。并且动物实验和临床研究均发现，脓毒症患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell，PBMC)中基因GPR174的mRNA表达量与脓毒症病情程度与预后存在着一定的相关性，这提示GPR174的mRNA表达量可作为脓毒症诊断和预后评估的分子标志物。借助mRNA检测的平台和原理，通过GPR174 mRNA表达量的测定，评估患者的病情程度和预后。这为脓毒症患者的早期诊断、病情和预后评估提供了一定的帮助。
本发明首次发现了基因GPR174表达水平与脓毒症进程之间的特殊关系，从而使得GPR174的mRNA成为用于脓毒症诊断及预后评估的标志物，并建立了数学模型。
为描述简便起见，本文中可以将基因GPR174的mRNA表示为GPR174-mRNA或者GPR174 mRNA。
本文中，术语“外周血单个核细胞”和“PBMC”表示相同的含义，可以互换使用。
作为脓毒症诊断数学模型的具体应用方式，其允许以计算机软件(计算机程序)形式被输入基因检测设备比如基因测序仪的信息处理模块、或者被输入或者被输入PCR仪的信息处理模块。而且，上述数学模型还允许以计算机软件(计算机程序)形式被输入智能医疗系统、或者被输入医生的电脑中，帮助医生判断患者是否罹患了脓毒症、以及严重程度，实施相应的临床治疗方案。
在对病人的GPR174基因表达水平进行测定时，本发明试剂盒的检测目标是PBMC中GPR174的mRNA表达量。
血细胞有多种，既包括单个核细胞还包括多核细胞。外周血多核细胞和红细胞的比重相同，单个核细胞的比重不同于红细胞和多核细胞。采用梯度离心法，可以很容易地分离PBMC，多核细胞不容易分离。因此，为了提高GPR174基因检测的速度和准确度，将PBMC作为GPR174 mRNA来源是合理的。
PBMC是机体防御系统的重要组成部分，PBMC主要包括淋巴细胞(T/B)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞等，其中淋巴细胞占很大一部分。当机体发生炎症或其他疾病都可引起PBMC总数和功能的变化。
分离PBMC主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。PBMC主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度离心法。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到PBMC。
本发明的试剂盒中RNA提取分离系统包括：用于从外周血中分离PBMC的分离液比如淋巴细胞分离液、Trizol试剂等；用于从PBMC中提取分离RNA的试剂比如氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水等。GPR174基因检测系统包括用于RNA反转录的各种试剂、PCR扩增cDNA用的各种试剂、引物SEQ ID NO:1-4等。
在优选的实施方式中，本发明的试剂盒还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、U盘、网盘等。
作为用于确定GPR174的mRNA表达量高/低分界标准的数学模型，其为荧光定量PCR的△△CT计算公式。△△Ct是荧光定量计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率。Ct＝-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。△Ct(n)＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)；△△CT(n)＝△Ct(n)-△Ct(1)。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
该公式用于本发明时，目的基因就是GPR174，内参优选为GAPDH。该数学模型中△△CT值取0.20为判断是否罹患脓毒症的临界值，并且取0.10为脓毒症是否严重的分类临界值。临床实践证明了该数学模型适用于对脓毒症患者与非脓毒症患者的区分，并且适用于判断脓毒症的病情程度和预后。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其做出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例1分离外周血单个核细胞
1.1取病人或者正常人外周静脉血2ml于6ml紫色抗凝管中置冰上，4℃、3000rpm离心5min。
1.2取离心后上层血浆至离心管中，加入生理盐水重悬，使总体积达到4ml。
1.3取2ml淋巴细胞分离液加入离心管中，并用巴斯德管将紫头管中血液，非常缓慢的加进分离液上方。
1.4在20℃、800g离心20min，升速2降速1，离心后液体分为4层，将云雾状的一层液体吸出转移至新的离心管中，加入5-6ml PBS，300g离心5min清洗。
1.5离心后去上清，留沉淀，得到PBMC。用1ml Trizol试剂重悬，转移至1.5ml EP管中，直接进行步骤6或者-80℃保存。
实施例2提取分离总RNA
采用RNA提取分离试剂盒(Trizol reagent,100ml，Invitrogen,Thermo Fisher公司)提取PBMC的RNA。包括如下步骤：
2.1于实施例1中得到的含有PBMC的1ml Trizol溶液中加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置10min，4℃、12000rpm离心20min。
2.2仔细吸取上清液，置于新的EP管中，加入等体积异丙醇，上下晃动，静置30min后在4℃、12000rpm离心15min。
2.3去上清，留沉淀，加入1ml无水乙醇使底部羽毛状的沉淀物悬浮，4℃、12000rpm离心5min。
2.4重复步骤2.3一次后去上清，留沉淀，根据沉淀物大小加入DEPC水20-50μl，静置冰上溶解沉淀30min。得到PBMC总RNA。
实施例3RNA反转录
采用试剂盒(Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time))，将RNA反转录为cDNA，包括如下步骤：
3.1去除基因组DNA反应。于冰上配制下述反应体系：
试剂 使用量
5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl
gDNA Eraser 1.0μl
实施例2所得总RNA
无RNase的dH<sub>2</sub>O 补至10μl
PCR反应条件为：42℃2min(或者室温5min*2)；4℃保持。得反应液。
3.2反转录反应。于冰上配置下述反应体系：
Figure BDA0002317073190000061
Figure BDA0002317073190000071
PCR反应条件为：37℃15min；85℃5s；4℃。得到反转录产物cDNA。
实施例4荧光定量PCR扩增目的cDNA片段
使用试剂盒(RT-PCR Takara
Figure BDA0002317073190000072
Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus))，通过荧光定量PCR扩增目的cDNA片段。包括如下步骤：
4.1按下列组分配制PCR反应液(在冰上进行)：
试剂 使用量 终浓度
SYBR Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)(2×) 10μl 1×
PCR正向引物(20uM) 0.2μl 0.2μM
PCR反向引物(20uM) 0.2μl 0.2μM
ROX Reference Dye II(50×) 0.4μl
实施例3所得cDNA模板 2μl
灭菌水 7.2μl
总体积 20μl
GPR174基因的PCR引物序列为：
正向引物：5’-TTGCATGACAGCATCCAACT-3’(SEQ ID NO:1)；
反向引物：5’-AAGTTCTTCCCTGTGGCTTG-3’(SEQ ID NO:2)。
内参GAPDH基因的PCR引物序列为：
正向引物：5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO:3)，
反向引物：5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’(SEQ ID NO:4)。
Real time PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃15s。
4.2根据荧光定量PCR值，通过△△CT法计算得到GPR174表达量。
实施例5确立脓毒症的△△CT临界值
抽取30例健康成年人、在复旦大学附属中山医院就诊的84例ICU对照和81例脓毒症患者(存活组55例，死亡组26例)的外周静脉血，其中ICU对照和脓毒症患者共收集2次血清标本(入院第1天和入院第7天)。按照实施例1-4中所述的方法，采用梯度离心法分离PBMC，Trizol溶液提取PBMC总RNA，经逆转录与荧光定量PCR检测PBMC中GPR174 mRNA表达量；并同时收集ICU对照和脓毒症患者的临床信息和相关的实验室检查信息，运用相应的统计学方法进行数据分析，研究发现：
1.脓毒症和ICU非脓毒症对照组患者入院第1天、健康对照个体的GPR174 mRNA表达量明显不同，结果见表1，脓毒症组的GPR174基因表达水平明显低于ICU对照组和健康对照组，且具有显著的统计学差异。
表1：健康对照、ICU对照和脓毒症患者GPR174 mRNA表达
组别 GPR174 mRNA表达的△△CT值，中位数(25％-75％)
ICU对照组 0.4337(0.2233-0.7463)
脓毒症组 0.1008(0.0489-0.1838)
健康对照组 0.9509(0.551-1.8321)
根据该统计结果，△△CT值取0.20为判断脓毒症的临界值是比较合理的。
2.按照28天是否存活，脓毒症患者分为死亡组和存活组，发明人研究发现，脓毒症死亡组患者的GPR174 mRNA表达量明显低于存活组，具有显著的统计学差异，见表2。
表2：脓毒症存活组和死亡组患者GPR174 mRNA表达
组别 GPR174 mRNA表达的△△CT值，中位数(25％-75％)
存活组 0.2716(0.1407-0.3808)
死亡组 0.0907(0.0304-0.1696)
根据该统计结果，△△CT值取0.10为划分脓毒症病情严重程度的分类临界值是比较合理的。
3.结合常用的脓毒症判断参考指标白细胞水平、炎症细胞因子降钙素原(PCT)水平、IL-2水平、IL-10水平测定结果，发明人发现GPR174 mRNA表达与脓毒症患者的病情程度(SOFA危重病评分)和相关炎症指标具有明显的相关性(P<0.05)，见表3。
表3：GPR174表达与脓毒症患者病情程度和炎症细胞因子的相关性
相关性 SOFA评分 白细胞 PCT(降钙素原) IL-2 IL-10
GPR174mRNA 0.367 0.264 0.313 0.375 0.381
该统计结果显示，GPR174的mRNA表达量与这些常用的脓毒症判断参考指标呈现负相关性，即GPR174的mRNA表达量越低，脓毒症病情严重，此时白细胞水平、降钙素原(PCT)水平、IL-2水平和IL-10水平就越高。因此GPR174基因表达水平与它们相结合可以进一步提高脓毒症诊断的准确性。
序列表
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒
<130> SHPI1910773
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttgcatgaca gcatccaact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aagttcttcc ctgtggcttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
aaggtcggag tcaacggatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ctcctggaag atggtgatgg 20

Claims (11)

1.一种试剂盒在制备用于脓毒症诊断及预后评估试剂中的应用，所述试剂盒包括：用于提取人外周血单个核细胞中RNA的RNA提取分离系统；用于检测人外周血单个核细胞中基因GPR174的mRNA表达量的GPR174基因检测系统；记载用于确定表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准时，提示患有脓毒症；反之，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量高于所述标准时，提示排除脓毒症。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述数学模型是检测GPR174基因的荧光定量PCR的△△CT计算公式：△Ct(n)=Ct（GPR174基因）-Ct（内参基因）；△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)，其中n为扩增反应的循环次数。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内参是GAPDH。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述表达量高/低分界标准是△△CT值取0.20为临界值，即当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于0.20时，提示患有脓毒症；反之，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量高于0.20时，提示排除脓毒症。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GPR174基因检测系统中GPR174基因的PCR扩增引物序列为：
正向引物：5’ - TTGCATGACAGCATCCAACT - 3’；
反向引物：5’ - AAGTTCTTCCCTGTGGCTTG - 3’。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述GPR174基因检测系统中内参GAPDH基因的PCR扩增引物序列为：
正向引物：5’ - AAGGTCGGAGTCAACGGATT - 3’，
反向引物：5’ - CTCCTGGAAGATGGTGATGG - 3’。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一个以上检测体系：白细胞检测体系、降钙素原检测体系、炎症细胞因子IL-2检测体系、IL-10检测体系。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与白细胞水平负相关时，提示患有脓毒症。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与降钙素原水平负相关时，提示患有脓毒症。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于所述标准、且与IL-2水平或者IL-10水平负相关时，提示患有脓毒症。
11.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述数学模型中△△CT值取0.10为脓毒症是否严重的分类临界值，当人外周血单个核细胞中GPR174的mRNA表达量不高于0.10时，提示为脓毒症病情严重。
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