CN104830976A - 蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents

蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用。本发明研究发现了蛋白激酶Stk38能够特异性负向调控TLR9介导的炎症反应，死亡脓毒症患者全血中Stk38表达水平明显低于幸存患者。由此本发明进一步提供了Stk38在脓毒症患者预后评估中的应用。本发明提供了蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，以及相应的检测试剂盒。

Description

蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估中的应用。
背景技术
在病原生物感染机体的过程中，机体的固有免疫应答首先被激活。固有免疫应答的激活主要依赖于机体免疫细胞表面的模式识别受体(Patternrecognition receptors，PRRs)对病原生物特有成分的识别。目前发现的PRR主要分为三类：1、TLRs(Toll-like receptors)；2、RLRs(RIG-I-like receptors)；3、NLRs(Nucleotide-oligomerization domain-like receptors)。
TLRs是一种进化上高度保守的胚系编码的I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成。目前发现并克隆了十多种哺乳动物的TLRs分子，分别选择识别不同的病原体相关分子模式。TLR2特异性识别革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)，TLR3识别病毒的双链RNA，TLR4识别格兰阴性菌的脂多糖(LPS)，TLR9识别细菌和病毒的非甲基化CpG DNA等等。TLR2的活化能够促进Th2型免疫应答，而TLR9的活化则能够促进Th1型免疫应答。识别PAMPs之后，TLRs启动MyD88依赖的或者TRIF依赖的免疫反应。在TLRs家族中,TLR2、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9介导的是MyD88依赖的信号通路。TLR3介导的信号通路依赖接头蛋白TRIF。而TLR4活化的信号通路则包括以上两种。MyD88以及TRIF依赖的信号通路都会激活NF-kB与MAPKs，进而促进促炎因子的释放。作为识别保守结构的病原体成分的关键分子，Toll样受体如何检测病原体侵入，引发先天免疫反应和宿主的抗原特异性的适应性免疫抑制是免疫学研究的热点。TLRs对于宿主防御至关重要，TLRs信号与炎症和自身免疫性疾病的发病也都密切相关。
适度的TLRs活化以及炎症反应有利于机体清除入侵的病原体，但过度或者过长的持续活化以及大量促炎因子的释放可能导致自身免疫性疫病甚至肿瘤的发生。因此，为了避免过度炎症带来的损伤，机体的免疫系统能够通过多种负向调控机制调节TLRs的活化。近年来，随着研究的不断深入，不断有负向调控分子被发现。最近有研究发现，组蛋白甲基转移酶Ash11能够负向调控TLR启动的炎症反应，Ash11缺失的小鼠更易患自身免疫性疾病。尽管如此，众多的TLRs信号通路是如何被特异性活化及调节的，仍需要不断深入的阐明。
丝氨酸/苏氨酸激酶38(Serine/threonine kinase 38,Stk38),又被成为核Dbf2p相关激酶1(nuclear Dbf2p-related kinase 1,Ndr1),是属于AGC类丝/苏氨酸激酶中的NDR/LATS激酶家族，在进化中高度保守。Stk38对中心体的精确复制必不可少，并且能够促进Fas诱导的凋亡。与正常小鼠相比较，Stk38的缺失会导致小鼠更易患T细胞淋巴瘤。Stk38还能够稳定c-myc蛋白及防止p21的堆积，从而促进细胞周期中G1期的正常进行。迄今为止，Stk38是否能够在免疫反应中发挥作用仍然未知(Hergovich,A.等，NDR kinases regulate essentialcell processes from yeast to humans，Nat Rev Mol Cell Biol，7(4):253-64.)。
脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)，是重症监护过程中导致死亡的首要原因。由于其相对高发，且致死率较高，脓毒症因此成为主要的公共健康问题之一。在脓毒症发生发展过程中，机体免疫功能紊乱具有非常重要的作用。其发病机制复杂，临床表现差异大，治疗困难。脓毒症患者如果诊断延误或者不能得到及时恰当的治疗，可能发展为严重脓毒症及脓毒症休克，甚至导致死亡，病死率高达30％以上(Levy,M.M.等,Outcomes of the Surviving SepsisCampaign in intensive care units in the USA and Europe:a prospective cohortstudy The Lancet Infectious Diseases,2012,12(12),919–924)。因此，脓毒症的早期诊断和治疗成为急救医学的研究热点之一。为了更加有效地治疗和预防脓毒症，目前人们已经越来越关注脓毒症的早期诊断、治疗及病情发展预判。
TLRs识别相应特异性配体后发生构象变化，活化下游信号传导分子，诱导炎症细胞因子、趋化因子等细胞因子的表达，启动固有免疫反应。如果TLRs信号传导途径过度活化，则导致过度炎症反应，造成组织损伤。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6等炎症细胞因子的大量产生会导致血管内皮细胞高表达细胞黏附因子(ICAM)等黏附分子及一氧化氮(NO)等，招募中性粒细胞，造成血管内皮损伤，激活凝血/纤溶系统，导致组织细胞损伤。组织细胞损伤释放的危险相关信号(Danger-associated molecularpatterns，DAMP)又进一步活化TLRs，导致炎症细胞因子级联反应，严重者可导致脓毒性休克、多器官功能障碍，甚至死亡。
已有研究发现脓毒症患者单核/巨噬细胞等免疫细胞高表达TLR2、TLR4及其信号转导分子，并且高表达TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子，表明TLRs信号途径异常活化参与脓毒症的发生发展。有文献报道，脓毒症发病依赖于TLR9，抑制TLR9介导的炎症反应，能够降低脓毒症造成的疾病损伤及其病死率(Plitas,G.等，Toll-like receptor 9inhibition reduces mortality in polymicrobialsepsis.J Exp Med,2008,205(6):1277-83.Yasuda,H.等，Chloroquine andinhibition of Toll-like receptor 9protect from sepsis-induced acute kidney injury.Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(5):F1050-8)。TLR9介导的炎症反应以及TLR9基因的多态性与慢性牙周炎、肺结核等疾病的发生发展也具有相关性(Ashok,N.等，Toll-like receptor 9gene polymorphism in chronic and aggressiveperiodontitis patients，J Indian Soc Periodontol.2014，18(6)，723-7；GrausteinA.D.等，TLR9gene region polymorphisms and susceptibility to tuberculosis inVietnam，Tuberculosis(Edinb).2015，95(2)，190-6)。
虽然本领域中已知某些模式识别受体与脓毒症具有一定的相关性，如TLR2、TLR4等。但本领域中已知的PRR功能各异，信号传导也不相同，如何寻找出特异性调控某条信号通路的关键分子难度很大。
目前，国内外尚无有关蛋白激酶Stk38与脓毒症相关性的研究报道。
而本领域迫切需要寻找到可有效用于脓毒症治疗、诊断和预后评估分子，并将其用于这些用途中。
如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、多器官衰竭出现比例增加、病程延长等。在预测了患者预后情况后，可结合提高Stk38分子的量的治疗方法改善患者的预后。
发明内容
本发明的目的在于提供蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用。
本发明发现了对Toll样受体9介导的炎症反应具有调控作用的分子—蛋白激酶Stk38，由此本发明进一步提供了Stk38分子在用于对象中脓毒症治疗、脓毒症预后评估中的新用途。
本发明提供了蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用。
所述的蛋白激酶Stk38来自：人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴等。
所述的蛋白激酶Stk38，Gene ID:11329。
本发明所述的蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，也即在制备脓毒症预后评估试剂盒中的应用。
所述的试剂为检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂。
所述的试剂盒包含检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂。
检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂，选自：对Stk38具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。
所述试剂优选自：SEQ ID NOs:1-4所示的序列、Stk38的反义序列、寡核苷酸，或其他引物序列等。
所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。
本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，其包含：
(i)检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的一种或多种试剂；
(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂，或使用说明书。
所述的试剂还带有可检测标记，优选的可检测标记选自：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)。
所述的检测试剂盒，检测蛋白激酶Stk38的方法选自以下任一：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印记法原位杂交法。
所述的检测试剂盒，优选以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中Stk38的表达，试剂盒包含：
(a)反转录酶；
(b)RNA酶抑制剂；
(c)反转录5×缓冲液；
(d)目的基因反转录引物和PCR上游引物和下游引物：
Stk38反转录引物为：Oligo(dT)；
PCR上游引物如SEQ ID NO:1所示：5'-CAGTGATTTCACTTTCCAGA-3'(SEQ ID NO:1)；
PCR下游引物如SEQ ID NO:2所示：5'-TGTTGTACCCGGTCTGCATG-3'(SEQ ID NO:2)。
(e)内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物：
内参β-actin的反转录反应引物为：Oligo(dT)；
PCR上游引物如SEQ ID NO:3所示：5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'(SEQ ID NO:3)；
PCR下游引物如SEQ ID NO:4所示：5'-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3'(SEQ ID NO:4)；
(f)10×PCR缓冲液；
(g)dNTP；
(h)Taq DNA聚合酶。
所述的检测试剂盒，通过以下步骤可用于脓毒症预后评估：(a)检测生物样品(组织或细胞)中的蛋白激酶Stk38表达量；(b)将(a)中检测到的蛋白激酶Stk38表达量与正常对照值进行比较。
得到的检测结果显示生物样品中的Stk38分子的水平低于正常对照的，则提示所述生物样品的对象具有更高的恶化及死亡风险。
上述步骤(a)中检测的Stk38分子的水平至少比正常对照值低10-50％，优选20-40％，更优选30-35％。
所述的正常对照值为：由非脓毒症的正常生物样品中测得的Stk38分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
在本发明中，正常对照值，是经qRT-PCR检测，，并使用GraphPad Prism5中的T test计算得到的值。
本发明人经过长期而深入的研究发现：死亡的脓毒症患者全血中Stk38分子的表达水平明显低于幸存的患者。发明人在此基础上进行进一步的研究发现：Stk38分子可在体、内外有效抑制炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用。由此，发明人发现了Stk38分子在用于对象中脓毒症预后评估中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
检测试剂
如本文所用，术语“检测试剂”或“检测Stk38分子的试剂”或“检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对Stk38分子，且可用于直接或间接检测出Stk38分子的存在和/或含量的试剂。
由于Stk38分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对Stk38分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对Stk38分子具有检测特异性的探针、基因芯片、或PCR引物，如Stk38分子的反义序列、本发明实施例中所用的SEQ ID NO:2-4所示的序列、寡核苷酸或其他引物序列。
为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。
本发明的检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中Stk38分子的检测即可。例如，当本发明的检测试剂为核苷酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。
检测试剂盒和生物样品
本发明中还提供了一种检测试剂盒，其包含：(i)检测有效量的检测Stk38表达水平的一种或多种试剂；(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
本发明的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对脓毒症发展进行判断、对治疗方案进行选择和/或对预后进行评估。
采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测Stk38分子：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。
生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印迹法和原位杂交法可参考《分子印迹技术》刘朝奇等主编，化学工业出版社出版。
当然，所述试剂盒还包含临床上用于对象中脓毒症发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测Stk38分子所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。
如本文所用，术语“生物样品”或“待测样品”可互换使用，均是指获自对象且用于Stk38分子检测的样品。生物样品可以是获自对象的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液、RNA提取物等适于检测的各种形式存在，例如可在检测前抽提组织或细胞中的总RNA。
用于脓毒症治疗病情发展预判
通常，可利用本发明的检测试剂盒，采用如下方法进行脓毒症发展判断、治疗方案选择和/或预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的检测试剂接触；(c)检测该待测样品中Stk38分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行脓毒症预后评估：如检测结果显示对象组织中的Stk38分子的水平低于对照水平，则提示所述对象更可能病情恶化及死亡。
如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的Stk38分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非脓毒症正常生物样品中测得的Stk38分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
可用于提示所述对象可能治疗效果较差甚至死亡的水平差异可为：待测样品中的Stk38分子水平比对照水平低10-50％，优选20-40％，更优选30-35％。
本发明的有益效果在于：
本发明揭示了Stk38分子在脓毒症预后评估中的新用途，为Stk38、乃至其它蛋白激酶的研究和开发利用提供了新的思路和途径；
本发明的Stk38分子可有效用于脓毒症预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的脓毒症诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。
附图说明
图1：全血中Stk38的表达与患者病情发展的相关性。脓毒症患者收治入ICU后5天内，幸存患者与死亡患者全血中Stk38表达水平的比较。
结果显示为平均值±标准差，**，P<0.01。
图2：Stk38表达对TLR9介导的炎症反应的作用。其中，
图2a、b为在RAW264.7细胞中稳定干扰Stk38，CpG刺激后定量PCR检测TNF-α、IL-6表达水平；
图2c、d为ELISA检测正常与Stk38缺陷的原代小鼠腹腔巨噬细胞中，CpG刺激产生的TNF-α、IL-6水平；
结果显示平均值±标准差(n＝4)；*，P<0.05；**，P<0.01。
图3：Stk38的表达与细菌感染的相关性，其中：
图3a为大肠杆菌感染模型中，正常小鼠、Stk38缺陷型小鼠总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；
P值使用GraphPad Prism中的Wilcoxon检验计算。
图3b、c为Elisa检测两组小鼠血清中炎症因子水平；
结果显示平均值±标准差(n＝4)；*，P<0.05；**，P<0.01。
图4：Stk38的表达与脓毒症的相关性，采用盲肠结扎穿刺的方法构建小鼠脓毒症模型，其中：
图4a为正常小鼠、Stk38缺陷型小鼠发病程度评分比较；
结果显示平均值±标准差(n＝4)；*，P<0.05；**，P<0.01。
图4b为脓毒症模型中，正常小鼠、Stk38缺陷型小鼠总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；
P值使用GraphPad Prism中的Wilcoxon检验计算。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：检测试剂盒的制备
按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中Stk38的表达：
(a)装有反转录酶(200U/μl)的容器；
(b)装有RNA酶抑制剂(40U/μl)的容器；
(c)装有反转录5×缓冲液(75mM KCl,500mM Tris-Cl,pH 8.3,25℃,3mMMgCl2,10mM DTT)的容器；
(d)装有目的基因反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10μM)的容器：Stk38分子反转录引物为：Oligo(dT)；
定量PCR引物为：
5'-CAGTGATTTCACTTTCCAGA-3'(上游，SEQ ID NO:1)；和
5'-TGTTGTACCCGGTCTGCATG-3'(下游，SEQ ID NO:2)；
(e)装有内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10μM)的容器：
内参β-actin的反转录反应引物为：Oligo(dT)；
定量PCR引物为：
5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'(上游，SEQ ID NO:3)；和
5'-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3'(下游，SEQ ID NO:4)；
(f)装有10×PCR缓冲液(50mM KCl,100mM Tris-Cl,pH9.0,25℃,1.0％Triton X-100)；
(g)装有dNTP(每种10mM)的容器；
(h)装有Taq DNA聚合酶(3U/μl)的容器；
(i)装有荧光染料(SYBR I)的容器；以及
(j)使用说明书。(提取全血中的mRNA，使用Oligo(dT)进行反转录后，使用实时定量PCR方法检测Stk38的mRNA表达水平。)
实施例2：Stk38体外抑制TLR9介导的炎症反应
靶向NDR1的shRNA表达质粒及对照质粒购自OriGene公司。货号：TG517168，靶向序列：5’-GCCATACCTTCGTACATGAAAGCAGCAAA-3’(SEQ ID NO:5)。
RAW264.7细胞购自ATCC(American Type Culture Collection美国菌种保藏中心)。使用jetPEI转染试剂(Polyplus公司)转染质粒，利用嘌呤霉素对细胞进行筛选，建成稳定敲低Stk38的细胞系。
全链硫代修饰的CpG ODN(5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(SEQID NO:6)由Sangon Biotech Co.(上海生工生物工程有限公司)合成。刺激浓度为10ug/ml。
细胞因子检测：实时荧光定量PCR检测炎症因子的表达。使用RNAfast200总RNA急速抽提试剂盒(220010，上海飞捷生物技术有限公司)提取总RNA，按照产品说明书步骤进行。
反转录PCR使用Takara反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，程序如下：42℃，59min；72℃，15min；4℃，5min。
实时荧光定量PCR：使用Takara SYBR定量PCR试剂。
所用引物为TNF-α：
上游:AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA(SEQ ID NO:7)
下游：GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG(SEQ ID NO:8)
IL-6：上游：TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC(SEQ ID NO:9)
下游：TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC(SEQ ID NO:10)
在RAW264.7细胞中转染Stk38shRNA表达质粒或对照质粒，24小时后开始使用嘌呤霉素(5ug/ml)进行筛选。2-3周后，建立稳定敲低Stk38细胞系和对照细胞系。10ug/ml CpG刺激1.5h后提取总mRNA，用Oligo(dT)进行反转录，然后用定量PCR方法检测TNF-α、IL-6mRNA表达水平。结果如图2a、b所示，稳定敲低Stk38表达水平能够促进CpG诱导的TNF-α、IL-6的表达。
Elisa检测炎症因子表达：使用6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，腹腔注射2ml 3％巯基乙酸盐溶液(已提前高压灭菌)。三天后，颈椎脱臼法处死小鼠，75％乙醇中浸泡3分钟。暴露腹膜，用20ml注射器吸取15ml无血清培养基冲洗腹腔3-5次，吸出后1000rpm离心5min。弃去上清之后，使用含10％FBS的DMEM重悬细胞并计数。腹腔巨噬细胞接种于24孔板，细胞密度为2*105/孔。次日进行刺激。6小时后收集细胞培养上清，12000rpm离心3分钟后进行Elisa检测。
Elisa试剂盒货号及来源：TNF-α(88-7324-88)，IL-6(88-7064-88)购自eBioscience。
ELISA检测正常与Stk38缺陷的原代小鼠腹腔巨噬细胞中，CpG刺激产生的TNF-α、IL-6水平；结果如图2b所示。
结果显示：在RAW264.7细胞系中，干扰Stk38能够TLR9介导的炎症因子表达；Stk38缺陷的巨噬细胞中炎症反应更强。
上述结果表明：敲低Stk38的表达水平(如图2a、b)或Stk38表达缺陷时(如图2c、d)，TLR9介导的炎症因子表达水平明显高于对照组，从而提示Stk38低表达的脓毒症患者更有可能因为炎症反应过强导致脓毒症发展恶化，高表达Stk38可能抑制炎症反应。
实施例3：Stk38在体内抑制细菌引起的炎症反应
Stk38杂合子小鼠购自美国Taconic Biosciences公司，在SPF级环境中饲养，通过杂交获得8-10周龄同窝野生型小鼠及Stk38基因缺陷型小鼠，腹腔注射大肠杆菌5*107pfu/只，细菌事先重悬于1ml PBS中。感染2小时后，通过眼球摘除法取血，Elisa方法检测小鼠血清中炎症因子水平(如图3b、c)，Stk38缺陷小鼠的血清中TNF-α和IL-6水平明显高于野生型小鼠。进行感染模型的动物放置在隔离动物房进行饲养及观察。每隔6小时，观察小鼠的生存情况(如图3a)发现Stk38缺陷小鼠生存期明显缩短。
生存曲线分析采用Kaplan and Meier分析方法作图，Wilcoxon检验计算P值，P＜0.05时，认为两组之间的差别具有统计学意义。
该结果表明：Stk38在体内抑制细菌感染引起的炎症反应，从而提示Stk38低表达的脓毒症患者更有可能因为炎症反应过强导致脓毒症发展恶化，高表达Stk38可能抑制炎症反应。
实施例4：Stk38在体内抑制脓毒症发展
Stk38杂合子小鼠购自美国Taconic Biosciences公司，在SPF级环境中饲养，通过杂交获得8-10周龄同窝野生型小鼠及Stk38基因缺陷型小鼠，采用盲肠结扎穿刺的方法构建小鼠脓毒症模型：将小鼠麻醉后，在腹部中央实行剖腹术，首先剪开皮肤，暴露腹膜；沿腹中线剪开腹膜，切口1～2cm；分离盲肠至腹外，将盲肠内容物小心挤压至末端，注意排除气体，在距末端0.5mm位置处结扎；使用21G针头穿孔一处；将盲肠回归原位，缝合腹膜。
待小鼠完全苏醒后，放回动物房继续饲养。手术完成之后分别于6、12、24小时剪尾取血，4℃离心后去除血细胞，以备ELISA检测炎症因子水平。每六小时观察小鼠症状，并进行评分，记录每只小鼠的生存期。
评分范围为0-5分，症状评分标准：清醒，灵活：0分；
轻微嗜睡：1分；
嗜睡，驼背：2分
严重嗜睡，驼背，发抖：3分；
死亡：4分。
如图4a所示，Stk38缺陷小鼠发病程度明显高于正常小鼠；如图4b所示，与正常小鼠相比，Stk38缺陷小鼠生存期明显缩短，生存率明显降低。
该结果表明：Stk38在体内抑制脓毒症发展及其造成的损伤，从而提示Stk38低表达的脓毒症患者更有可能因为炎症反应过强导致脓毒症发展恶化，高表达Stk38可能抑制炎症反应，治疗脓毒症。
上述结果表明：Stk38的表达在死亡脓毒症患者中显著降低，该结果提示了Stk38与脓毒症的发生和发展之间存在密切相关性，由此可作为脓毒症治疗、病情发展预判的标志物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂为检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂；所述的试剂盒包含检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂。
3.根据权利要求2所述的蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的试剂，选自：对Stk38具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
4.根据权利要求2所述的蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂为SEQ ID NOs:1-4所示的序列、Stk38的反义序列、寡核苷酸，或引物序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的蛋白激酶Stk38在制备脓毒症预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
6.一种检测试剂盒，其包含：
(i)检测生物样品中蛋白激酶Stk38表达量的一种或多种试剂；
(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂，或使用说明书。
7.根据权利要求6所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂还带有可检测标记，所述的可检测标记选自：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子，或配体。
8.根据权利要求6所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒，检测蛋白激酶Stk38的方法选自：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法，或RNA印记法原位杂交法。
9.根据权利要求8所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒是以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中Stk38的表达，试剂盒包含：
(a)反转录酶；
(b)RNA酶抑制剂；
(c)反转录5×缓冲液；
(d)目的基因反转录引物和PCR上游引物和下游引物：
Stk38反转录引物为：OligodT；
PCR上游引物如SEQ ID NO:1所示；
PCR下游引物如SEQ ID NO:2所示；
(e)内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物：
内参β-actin的反转录反应引物为：OligodT；
PCR上游引物如SEQ ID NO:3；
PCR下游引物如SEQ ID NO:4；
(f)10×PCR缓冲液；
(g)dNTP；
(h)Taq DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的一种检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒，通过以下步骤可用于脓毒症预后评估：
(a)检测生物样品(组织或细胞)中的蛋白激酶Stk38表达量；
(b)将(a)中检测到的蛋白激酶Stk38表达量与正常对照值进行比较；
上述步骤(a)中检测的Stk38分子的水平至少比正常对照值低10-50％。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110878350A (zh) * 2019-12-13 2020-03-13 复旦大学附属中山医院 一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100260738A1 (en) * 2006-11-29 2010-10-14 Hauke Hermann Karl Cornils Uses and methods relating to ndr kinase expression and/or activity
CN102459638A (zh) * 2009-06-19 2012-05-16 默克专利有限公司 用于测定抗egfr抗体在癌症治疗中的功效的生物标记和方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100260738A1 (en) * 2006-11-29 2010-10-14 Hauke Hermann Karl Cornils Uses and methods relating to ndr kinase expression and/or activity
CN102459638A (zh) * 2009-06-19 2012-05-16 默克专利有限公司 用于测定抗egfr抗体在癌症治疗中的功效的生物标记和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEORGE PLITAS等: "Toll-like receptor 9 inhibition reduces mortality in polymicrobial sepsis", 《J. EXP. MED.》 *
温明岳: "Stk38通过靶向MEKK2抑制巨噬细胞中TLR9介导的炎症反应", 《中国免疫学会博士生论坛•论文集》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110878350A (zh) * 2019-12-13 2020-03-13 复旦大学附属中山医院 一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒
CN110878350B (zh) * 2019-12-13 2023-02-03 复旦大学附属中山医院 一种用于脓毒症诊断及预后评估的试剂盒

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